（植物病理学专业论文）转Bt抗虫基因植物的酶联免疫检测技术研究.pdf

摘要 f l 杀虫基因是目前应用得最为广泛和最有潜力的个抗虫基因，在虫害的防 治中起到越来越重要的作用。目前获得的转b t 抗虫基因植物已达近7 0 种，而新 的b t 杀虫基因仍在不断的被分离和鉴定，使得转b t 抗虫基因植物的研究持续、 高速发展，因此急需找到一种快速、简便、准确的检测方法。本研究以目莳抗虫 转基因育种中研究最多的b lc r y a ( c ) 基因的表达产物为检测曰标，在提取出高纯 度抗原并制备出高特异性抗体的基础上，系统研究了两种载体上三种酶联免疫吸 刖测定方法的检测灵敏度，初步建立起快速、准确的酶联免疫检测技术。研究结 果如下： 一采用多种生化技术提取苏云会芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白，制备出了高纯度 的抗原。首先用碱液( 5 0 m mn a ，c o ，5 0 m me d t a ，3 巯基乙醇) 裂解孢晶混合物， 调节p h 至等电点沉淀出晶体杀虫蛋白，再用聚丙烯酰胺凝胶制备电泳进一步纯化 粗提的杀虫晶体蛋白，经s d s p a g e 电泳分析显示只有一条带，说明获得的分子量 约为1 3 0 k d 的杀虫晶体蛋白达到了电泳纯，为制备特异性抗体提供了条件保障。 二制备出了高特异性的b t 杀虫蛋白抗体和高质量的酶标抗体。用纯化的b t 杀虫蛋白作为抗原免疫白兔，获得了高特异性的抗血清，再经过硫酸铵沉淀和 d e a e 一5 2 柱层析纯化，提取出了较纯的i g g 。采用改良的过碘酸钠法用辣根过氧 化物酶标记1 9 6 制备出了克分子比为2 、工作浓度为l ：8 0 0 的高质量酶标抗体。 为建立高灵敏度的酶联免疫检测方法奠定了基础。 三比较了两种载体上三种酶联免疫检测方法的灵敏度，初步建立起检测b t 杀虫蛋白的高灵敏度方法。在聚苯乙烯酶标板上的测定结果表明：直接e l i s a 和 夹心e l t s a 的灵敏度相同，都为0 9 4 n g i l ，但直接e l i s a 中抗原浓度与o d 值问 的线性关系呈极显著，夹心e l i s a 中抗原浓度与o d 值间的线性关系呈显著：间接 e 1 i s a 的灵敏度较前两者低，使用i t r p i g g 的灵敏度为1 5 n g 1 j r l ，抗原浓度与o d 值间的线性关系呈显著，使用a k i 。i g g 的灵敏度为3 7 5 n g i l ，抗原浓度与o d 值 间的线性关系呈极显著。在硝酸纤维素膜上的测定结果表职：真接d o t e l i s a 和 夹心d o t e l i s a 的灵敏度相同，都为4 0 6 8 ，1 3 n g ，间接d o te l i s 的灵敏度较前 两者高，使用i t r p i g g 的灵敏度为2 0 3 4 0 6 n g ，使用a k p i g g 的灵敏度为2 0 3 n g 。 关键词：转bl 抗虫基因植物；b t 杀虫蛋白：酶标抗体：e l l s a s t u d y o ne l i s af o rd e t e c t i o no fb a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s i n s e c t i c i d a lp r o t e i ne x p r e s s e di nb t t r a n s g e n i cp l a n t s c u i l i n k a i ( s i c h u a na g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y ，y a a l ls i c h u a n ，c h i n a ，6 2 5 0 1 4 ) a b s t r a c t u p t od a t e ，s t u d yo nb t t r a n s g e n i cp l a n ti sd e v e l o p i n gq u i c k l y s oar a p i d a n da c c u r a t em e t h o di sv e r yn e c e s s a r yf o rd e t e c t i o no fb ti n s e c t i c i d a lp r o t e i n p u r i f i c a t i o no f a n t i g e n ，p r e p a r a t i o no fs p e c i f i ca n t i b o d ya n de n z y m e 1 a b e l l e d a n t i b o d y a n de l i s am e t h o dw e r es t u d i e df o rd e t e c t i o no fb ti n s e c t i c i d a l p r o t e i ne x p r e s s e di nb tt r a n s g e n i cp l a n t s t h er e s u l tw a sa sf o l l o w s 1 b ti n s e c t i c i d a l p r o t e i nw h i c hw a so fh i g hp u r i t yw i t ham o l e c u l a r w e i g h t o f13 0 k dw a s p r e p a r e db yu s i n g s e v e r a lb i o c h e m i c a lt e c h n i q u e s 2 s p e c i f i ca n t i b o d yw a sa c q u i r e db yi m m u n i z i n gw h i t er a b b i t sw i t h p u r i f i e db ti n s e c t i c i d a lp r o t e i na sa n t i g e n t h ea n t i b o d yw a sc o n j u g a t e dw i t h h i 冲b yt h es o d i u mp e r i o d a t em e t h o da n d e n z y m e - l a b e l l e da n t i b o d yw a s o b t a i n e d 3 s e n s i t i v i t y o ft h r e ee l i s am e t h o d so nt w od i f f e r e n t c a r r i e r sf o r d e t e c t i o no fp u r i f i e db ti n s e c t i c i d a l p r o t e i n w a sc o m p a r e d t h em i n i m a l d e c t e c t a b l ev a l u eo n p o l y s t y r e n e c u v e t t e s b y d i r e c te l i s aa n dd o u b l e a n t i b o d y s a n d w i c he l i s aw a s h i g h e r t h a n b y i n d i r e c te l i s a b u tt h e m i n i m a ld e c t e c t a b l ev a l u eo i ln i t r o c e l l u l o s e p a p e r sb y i n d i r e c te l i s aw a s 2 - h i g h e r t h a nb yd i r e c te l i s aa n dd o u b l ea n t i b o d ys a n d w i c he l i s a k e y w o r d s ：b tt r a n s g e n i cp l a n t ；b ti n s e c t i c i d a lp r o t e i n ；e n z y m e - l a b e l l e d a n t i b o d y ；e l i s a 前言 虫害是制约农作物高产稳产的重要因素，吐界每年因虫害造成的损失约占农作物 总产量的1 5 以上1 1 1 。常规的化学防治在减少虫害的同时引起一系列副作用，如提高 成本、污染环境、诱导害虫产生抗药性、引起次要害虫的大发生等。而通过基因工程 手段培育抗虫新品种( 系) 可从根本上解决上述问题，日对, i l i 孚l 动物和一些有益昆虫不 产生毒害作用，不造成环境污染，是一种最理想、最有前途的防治方法之一0 1 。在植 物抗虫基因工程中，由于b t 毒蛋白基因表达产生的6 一内毒素具有列昆虫毒力高、专 一性强、修饰后在植物体内表达水平高等诸多优点。b t 毒蛋白基因已成为目前应用得 最为广泛和最有潜力的一个抗虫基因”1 。目前全世界获得的转u t 抗虫基因植物有棉花、 烟草、玉米、水稻、油菜、大豆、番茄、马铃薯、紫花苜蓿、白杨等近7 0 种”。把b t 毒蛋白基因导入植物而获得转b t 抗虫基冈植物，已成为近年来生物工程研究的热点之 一。此项工作中需要对转b t 基因植物进行鉴定和筛选，确定眦基因是否表达、表达 水平如何，因此找到一种简便、快速、准确的检测方法具有十分重要的实践意义。 苏云金杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s 即眦) 是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，在 形成芽孢的过程中，会在菌体的端或两端产生一至多个菱形、方形或不规则形的伴 孢晶体，常被称为杀虫晶体蛋白( n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n 即i c p ) ，它们具 有特异的杀虫活性。1 9 0 1 年，闩本学者i s h i w a t a 首先在患猝倒病的家蚕巾发现b t 。 接着1 9 1 1 年，b e r l i n e r 从德国苏云会省一个面粉厂的一批染病地中海粉螟中分离出 b t ，并正式定名为苏云余杆菌。此后的很长一段时问，虽然人们知道f 3 t 能导致一些昆 虫死亡，但却并不明白b t 杀虫的本质。直到1 9 5 3 年， a n n a y 第一次发现b t 的杀虫 活性与伴孢晶体有关。随后，不少学者证实了伴孢晶体对昆虫有毒性，而这种毒性是 由昆虫中肠液消化( 或在碱性条件下由蛋白酶降解) 伴孢晶体而释放的一种蛋白质毒 素所引起的从而揭示了b t 的杀虫本质。“。” 苏云会杆菌用作微生物杀虫剂，是目前用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，也 是至今为止最为成功的生物杀虫荆。已有6 0 多个国家登记了1 2 0 多个品种，其产量在 国外占生物杀虫剂总量的9 0 - - 9 5 ，国内则占9 8 ，广泛用于防治农业、林业和贮藏 害虫以及医学昆虫”。二十世纪的最后二十多年星，生物技术得以迅速发展，而转基 因技术则更是现代生物技术的主流。目前植物转基因技术已发展有电击法、基因枪 法( 粒子轰击法) ”、农杆菌介导法、花粉管介导法i 、予房注剩法“等手段，利 用这些手段将目标基因导入植物中，使其在寄主细胞内稳定的遗传和表达，从而改良 植物的某些遗传特性。山于b t 毒蛋白基凶表达j “q - f j j6 一内蘸素刘鳞翅f 1 、鞘翅日、 双翅曰等多种昆虫具有很强的毒杀作用，与其它抗虫基因相比，在同等表达量之下t 1 3 t 毒蛋白基因表达产物的抗虫能力最强旧，且具有很强的专一陆，对非靶标昆虫( 尤 其是天敌昆虫) 和人畜无毒害作用n 再加 i 经过人 ：的不断修饰和改造能使b t 毒蛋 白基因在植物体内达到高水平的表达”怖】。bl 毒蛋白撼i 嗣成为f _ 1 前麻_ j 得最为f “泛和 最有潜力的一个抗虫基因。已发现有高抗鳞翅目昆虫的c r y l 类，抗鳞翅目和双翅目昆 虫的c r y l i 类，高抗鞘翅目昆虫的c r y l l i 类，抗双翅目昆虫的c r y l v 类”。兼抗鳞翅 目和鞘翅目昆虫的c r y v 类和抗线虫的c r y v l 类”，最近儿年又发现r 具有抗膜翅目 昆虫和螨类的i c f ) 【_ 1 3 。将b t 毒蛋白基因导入植物，获得转bl 抗虫基因植物，排除了 b t 杀虫剂的稳定性问题，在虫害防治中作用日益突出，成为近年来生物工程研究的热 点之一。1 9 8 1 年，s c h n e p f 等”首次从苏云会杆菌中克隆出了i n 毒蛋臼基网，揭丌了 利用b t 毒蛋白基因培育抗虫植物的序幕。世界卜第一个成功的例子是由比利时 m o n t a g u 实验室的v e a c k 等“”于1 9 8 7 年报道的，他们用b lc r y i k ( b ) 基因与n p t i i 基 吲融合转化烟草，结果用全长的c r y l a ( b ) 基因转化烟草所得到的转基因植株，检测不 到基因的表达，也无抗虫性。但用3 一端缺失的c r y i a ( b ) 基因转化得到了抗虫的转基 吲植株。同年，美国m o n s a n t o 公司的f is h h o l l r 等”1 用37 一端缺失的c r yj ( h ) 基因转 化番茄，也得到了抗虫的转基因植株。之后，美国a g r a c e t u s 公司的i f j a r t o n 等”“用 37 一端缺失的c r y i a ( a ) 基因转化烟草，获得了抗虫的转基因植株。以卜获得的转b t 基因植株虽然经生物测定具有一定的抗虫性，但都难以或儿乎检测不到杀虫晶体蛋白 的表达。经研究分析”“2 ”，主要原因是在杀虫晶体蛋白基因的编码区内有些特殊序 列存在，使杀虫晶体蛋白基因在植物体内转录后加工的效率不高，m r n a 转运过快造成 m r n a 不稳定，或因含量过底而检测不到全长的m r n a 。在此理论基础上，1 9 9 1 年，p e r l a k 等”在不改变i c p 氨基酸序列的情况下，通过两种途径( d n a 点突变和d n a 人工全合 成方法) 对c r y i k 基因迸行修饰，结果使6 一内毒紊在烟草和番茄中的表达量比野生 型提高了1 0 倍和1 0 0 倍，获得了良好的抗虫效果。迄今，已有许多实验室和科研单位 用不同的b t 毒蛋白基因和转化方法获得了近7 0 种转f 3 t 抗虫基因植物。在国内，相关 的研究起步较晚，但进展较快。1 9 9 1 年，谢道听等。”首次报道将b t 杀虫蛋白基因导 入棉花：1 9 9 2 年底，郭三堆等m 1 首先合成了眦c r y 【 结构基因；阳颖川领导的研究 组也合成了b tc r y l a 结构基因，并导入娴草，获得了抗虫的转基冈植株：赵荣敏等“” 将人工合成的c p t i 基因和经人工改造的b t 毒蛋门綦因转化烟草，获得了高抗虫的转 双基因烟草。目前，获得的转1 3 1 抗虫基阗植物有棉花、烟草、k 米、水稻、忖蓝、 欧洲黑杨等”。2 5 ”。2 9 ，其中，转b t 耩因抗虫棉花已商品化，转b t 基i 捌抗虫玉米、 水稻也已进行了环境释放试验。 在转基因育种的过程中，转基因植株的鉴定、筛选是其中f ：l 一个重要环节。一个 转基因的植株获得后，通常还要对其后代进行暴因纯合、遗传稳定性的研究、农艺和 经济性状的筛选，甚至还要进行基因的转育、产、l k 化过程巾的种性保持、转基因抗虫 作物种子检测等一系列工作。所有这些过程都需要列目的基因进行跟踪调查，目前常 用的方法有两类”：一是检测是否有外源基因( d n a ) ，该方法主要基1 二p c r 技术和核 酸探针的杂交检测技术。能准确、快速地检测转基因作物( g e n e t c a l l ym o d i l i e d c r o p s ，g m c ) 中是否有外来基因( 包括目的基因、标记基因和引物) ；二是检测是否有 外源蛋白质( 转基因表达的产物) ，主要采用化学分机、凝胶电泳、酶联免疫测定和生 物测定等方法。对于转b t 抗虫基因植物具体的检测方法有以一f ) l 种：生物测定法： 1 i 物测定法是利用不同昆虫对毒蛋白的不同敏感性或者同一昆虫的不同死c ：率来进行 的，相对简单易行，能够比较直观反映抗虫植物的抗虫性。但需要大量饲养供试昆虫， 统一虫源、虫龄。统一饲养条件，统一取样部位，试验占用空间大，测定所需时问长， 操作复杂，难以对大量的样品进行检测。大阳鉴定易受环境和气候条件的影响。只能 定性分析，不能定量比较；分予检测技术：如p c r 扩增、s o i j i ，h e m 杂交、n o r t h e r n 杂交等遗传分析间接测定，采用分子检测技术虽然灵敏度高，但需要昂贵的仪器设备 和高深的技术，一般育种单位无法采用。同时只能检测转基因成功与否，不能检测转 基因表达与否及表达产物量：标记基因检测法：利用与目的基因连锁的植物选择标 记基因，采用组织培养技术，在加有相应筛选试剂的培养基上对转基因植物进行培养、 筛选或者通过转连锁基因的转基因抗虫植物对筛选试剂的抗性反映等级进行筛选，如 n p t i i ( k a n a m y c i n 卡那霉素) 、h t p ( h y g r o m y c i n b 细胞潮霉素) 等。此方法在理论上是 完全可行的，但要注意剔除植物本身不同生育期不同部位对筛选试剂的抗性不i 司、抗 性范围内不同个体的高差异表现以及超出连锁基因表达物抗性范围的显症等情况。故 选择合适的起始筛选浓度、浓度范围以及筛选时期显得至关重要。对目的基因而言也 只能是定性分析，不能直接检测目的基因的表达产物量；免疫测定法( 包括e l 。i s a 、 w e s t e r nb l o t 、试纸条法) ：免疫测定法利用抗原一抗体的特异性结合和酶的高效催化 原理。测定时间短，操作程序标准，检测极限商，可对大量样品进行测定。仪器设备 要求相对低，测定结果司以长期保存，并且可以对转基因表达产物进行定量分析。 研究表明：转l i t 基因植物的抗虫性与转b l 基因植物体内表达的b t 毒蛋白量成 f 相关，表达量越商，抗虫效果越好。凶此对转b t 基因植物体内转基因的表达产物进 行定量测定选择表达量高的植株后代材料，足转基因工程中非常关键的环节。此外， 外源基凶虽然转入植株体内，但在转基因植株中的表达往往因多种因素( 转基因的甲 基化、转基凶的拷贝数、插入位点、基因同源性等) 会引起沉默。面对大量的转基因 育种后代材料的检测，常规的生物检测技术已不能满足育种工作的需要。分子检测技 术只能检测转基凶成功与否，不能检测转基因表达与否及表达产物量。而酶联免疫检 测技术克服了l 二述缺点，不仅i t ，应用于有关转b t 基因植物后代的筛选检测，大大：l j 速 育种i ：作进程。i 司时还可应刚这利- 快速检测技术于1 3 t 毒蛋白基因表达和遗传传递规 律、抗性鉴定和材判筛选以及划种子纯度和质量的监控等方面的研究。 目i ；i 国内外均在积极开展此方面的研究工作，西方发达国家如美国已初步研制成 功，检测极限值达到了4 - - 2 0 n g g f w ，制备出了试验用检测试剂盒，并已有商品化试 剂盒出售，但价格昂贵，国内难以承受。在国内这方面也有个别几个单位在开展研究 工作。在转b t 基因棉中杀虫蛋白的检测方面江苏省农业科学院陈松等。”。蚓报道，其 所建立的兴心e l 。i s a 对b t 伴孢品体杀虫蛋白提纯品的最低可检测值为2 0 n g m l ；随后 的进一步研究将对b t 伴孢晶体杀虫蛋白提纯品的最低可检测值提升为1 u g j 。，线性范 围11 5 u g l ，板内洪差c v ( 5 ，板问误差c v 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 从表2 可以看出，随着酶标抗体稀释度的增加阳性x , j n 的o d 值在不断下降而 阴性对照的o d 值电有下降趋辫，但1 8 0 0 以后的o d 值基本不再下降。在保待较低的 本底值的情况f ，为秩得较高的灵敏度，需要盼陡对照的o d 值处于一个较高的水平， 综合考虑确定酶标抗体的工作浓度为1 8 0 0 。 4 1 3 央心e l i s a 中的i g g 包被浓度确定 用l u g l n l 、2l i g m l 、4 u g m l 、8 u g m l 的i g g 包被酶标板，按照央心e l i s a 程序 进行测定，测定结果见表3 。 表3 兴心e l ，i s a 中 g g 包被浓度选择的测定结墨 对照 ! 箜竺鱼墨! ! ! 堡! ! 一l!jli一 阳性( p ) 0 3 5 0 4 10 4 40 4 4 阴性( n ) 0 0 7 0 0 80 0 8 0 0 8 从表3f q 。以看t jl g c 的包被浓度达4 u g m l 以上后，阳性对照的0 d 值不再增加， 说明l g g 的包被量己达饱和。而对应阴性对照的o d 值也较底，因此确定i g g 的包被浓 度为4 u g m l 。 4 1 ，4 ，间接e l i s a 中的一一抗稀释度确定 将纯化的抗体按照一定的浓度梯度( 1 2 0 0 、1 4 0 0 、1 8 0 0 、1 1 6 0 0 、1 3 2 0 0 、 1 6 4 0 0 ) 稀释后，按照间接e l 。i s a 程序进行测定，测定结果见表4 。 表4 唰接e 【，i s a 中一抗稀释度选择的测定结果( 二抗为1 1 0 0 0 0h r p i g g ) 对照 一抗稀释度 l 2 q ql 皇q ql 8 q q l z l 蠡q q1 2 3 2 q 0l z 曼4 q q 阳性( p ) 0 9 2 0 9 40 9 70 9 20 9 00 8 5 阴性( n ) 0 2 0 0 1 40 1 10 1 00 0 6 0 0 5 从表4 可以看出，一抗稀释度为1 2 0 0 1 1 6 0 0 时o d 值处于一个较高的水平，而 稀释度1 1 6 0 0 时奉底值较低，因此确定一抗稀释度为1 1 6 0 0 。 4 2 i 种e l i s a 检测方法的灵敏度及相关性分析 4 2 1 ，直接e l i s a 的灵敏度及相关性分析 _ h ：|系列等倍稀释的标准抗原( 6 0 n g 7 l 、3 0 n g 孑h 、1 5 n g 孔、7 5 n g j h 、3 7 5 n g 孔、1 8 8 n g i h 、0 9 4 n g j h 、0 4 7 a g f h ) 包被酶标板，按照直接e l i s a 程序进行测定， 测定结果见表5 。 表5 直接e i i s a 灵敏度的测定结果 标准抗原浓度 吸收值( 0 d m 。)平均吸收值 ( n g 4 l ) 匝复l重复2重复3重复4 ( o d m ) 00 0 60 0 6o ，0 50 0 50 0 5 5 o 4 70 0 50 0 8o 0 70 0 60 0 6 5 0 9 40 0 9o 0 9o 0 8o 0 8 0 0 8 5 l8 80 1 lo ，1 2o 1 2o 1 1o 1 1 5 37 5o 1 60 1 6o 1 8o 1 8 0 1 7 0 7 50 2 60 2 8o ，2 9 0 2 7 0 2 7 5 1 5o 3 7o 4 1o 4 10 3 90 3 9 5 3 0o 4 80 4 80 4 8o 4 6o 4 7 5 6 00 5 4o 5 50 5 30 5 30 5 3 7 5 表6 直接e 1 i s a 测定结果的差异显著性及与抗原量的相关性分析 注：同| j _ l 方稃和相关系数是枉商接e l i s a 的最低可检测值09 4 n g 孑l 丰对应的o d 值及其以r 数据 的基础上计算 测定结果的差异显著性分析( 表6 ) 表明： 标准抗原浓度为0 4 7 n g 孑l 的o d 值 与0n g i l 的o d 值在a = 0 0 5 和n = o o l 的水平上均无显著差异。标准抗原浓度增加 到0 9 4 n g 孔时，其o d 值与0n g i l 的0 d 值在n = o 0 5 和d ：o 0 l 的水平上均呈现极 显著差异，因此，直接e 1 i s a 的最低可检测值为0 9 4 n g l 孑l , 。标准抗原浓度与对应o d 值平均数的回归方程为y = o 0 0 6 7 x + 0 1 9 5 7 ，其相关系数为o 8 8 4 6 ，f 检验极显著，表 明标准抗原浓度与对应o d 值之间存在极显著的线性关系。 4 2 2 夹心e l i s a 的灵敏度及相关性分析 将标准抗原一系列等倍稀释( 6 0 n g & 、3 0 n g t 7 l 、t s n g 子l , 、7 5 n g 7 l 、3 7 5 n g 孔、1 8 8 n g f l 、0 9 , 1 n g i l , 、0 4 7 n g t ：l ) ，按照央心e l i s a 程序进行测定，测定结果 见表7 。 表7 夹心e l i s a 灵敏度的测定结果 标准抗原浓度吸收值( o d w 。) 平均吸收值 ( n g j l )重复1重复2 重复3重复4 ( o d m 。) 0o 0 80 t lo 1 2o 0 90 1 o 4 70 0 9o ，1 2o 1 0o 0 90 1 09 40 1 2o ，1 80 1 50 1 3o 1 4 5 1 8 801 401 90 1 9o 1 80 1 7 5 3 7 50 1 90 2 40 2 5o 2 20 2 2 5 7 5o 2 4o 2 9o 3 0o 2 40 2 6 7 5 1 50 2 9o 3 00 3 lo 3 00 3 3 0( ) 3 3o 3 3o 3 50 3 30 3 3 5 6 0 0 3 6o 3 80 3 6 o 3 7 0 3 6 7 5 垂! 墨：堂! ! ! ! ! 型塞堕墨盟董墨星董堕垦量亟堕垦丛塑苤丝坌堑 标准抗原浓度平均吸收值差异显著性f 检验回归方程相关系数 ( n g f l ) ( o d 。)5 1 注：i i 1 1 ) 方 ! 干i 1 关系数娃住夹心e l 。 s a 的晟低可检测值09 4 n g 孔利对应的o d 值及其以f 数据 的基础上讨算 测定结果的筹异显著性分析( 表8 ) 表明：标准抗原浓度为0 4 7 n g 孑l 的0 d 值 与on g 彳l 的o d 值在a - 0 0 5 利n = o o l 的水平上均无显著差异。标准抗原浓度增加 到0 9 4 n g ：f l l t ；f ，其0 1 ) 值与0n g ：f l 的o d 值在o = 0 0 5 和= o 0 l 的水平上均呈现极 显著差异，因此，央心队 s a 的最低可检测值为0 9 4 n g 孑l 。标准抗原浓度与对应0 d 值平均数的回归方程为t - o 0 0 3 3 x + 0 2 0 3 8 ，其相关系数r = o 8 5 2 9 ，f 检验显著，表明 标准抗原浓度与列应o d 值之间存在显著的线性关系。 4 2 3 州接e 1 i s a 的灵敏度及相关性分析 用一系列等倍稀释的标准抗原( 6 0 n g j l 、3 0 n g 7 l 、1 5 n g 孑l 、7 5 n g ：f l 、3 7 5 r i g 孔、1 8 8 n g j b 、0 9 4 n g ? l 、0 4 7 n g ：于l ) 包被酶标板，使用两种酶标二抗( h r p i g g 和a k p l g g ) ，按_ 【 1 日j 接e l i s a 程序进行测定，测定结果见表9 和表1 1 。 表9 间接e l i s a 灵敏度的测定结果( 1 1 1 0 0 0 0h r p i g g ) 标准抗原浓度 吸收值( 0 d 9 0 。) 平均吸收值 ( n g i b )重复l重复2重复3重复4( o d 4 9 0 啪) 0 o 1 00 1 20 0 9o 1 20 1 0 7 5 o 4 7o 0 90 儿o 1 20 0 90 1 0 2 5 0 9 4o 1 00 1 20 1 1o 1 00 1 0 7 5 l8 80 1 00 1 lo 1 10 1 l 0 1 0 7 5 37 5 o 1 00 1 0o 1 20 1 2o 1 l 7 5 0 1 2o 1 2o 1 3o 1 1o 1 2 1 5o 1 50 2 3 o 1 8o 1 3o 1 7 2 5 3 0 0 3 2 o 3 6 0 4 00 3 10 。3 4 7 5 6 00 6 2 o 5 9o 5 20 5 1o 5 6 表l o 问接e i l s a 测定结果的差异显著性及与抗原量的相关性分析 ( 1 1 0 0 0 0t t r p i g g ) 标准抗原浓度 平均吸收值 薹星星董壁 f 检验回归方程 相关系薮 ( n g 7 l ) ( o d 。)5 1 o 0 4 7 0 9 4 1 8 8 3 7 5 7 5 1 5 3 0 o 1 0 7 5 0 1 0 2 5 o 1 0 7 5 0 1 0 7 5 o 1 l 0 1 2 o 1 7 2 5 0 3 4 7 5 ：1 2 6 1 4 9 * y 枷= 0 , 嘶0 0 8 。4 0 9 9 1 0 a b x + u u b b 0 6 0 0 5 6dd 珏巧而丽丽蕊藏蕊丽丽瓜而丽瓣雨孑莉面丽面面酉而甄丽 基础上计算 使用i i r p l g g 测定结果的差异显著性分析( 表1 0 ) 表明：0 4 7n g 孔、0 9 4n g 孔、1 8 8n g 孔、3 7 5n g j l 、7 5 n g j ：l 的o d 值与0n g i l 的0 d 值在a = o 0 5 和= o 叭 的水3 ff ：均无显著差异，标准抗原浓度增加刽1 5 n g 孔时，其0 0 值与0n g 孔的o d 值任o2 0 0 5 和“= 0 0 1 的水平上均呈现极显著差异，因此，使用1 1 0 0 0 0h r p i g g 为酶标二抗，m 接队【s a 的最低可检测值为1 5 n g 孔。标准抗原浓度与对应o d 值平均 数的回归方稗为y = o 0 0 8 4 x + 0 0 6 6 3 ，其相关系数r = o 9 9 1 0 ，f 检验显著，表明标准抗 2 4 a a a a a a b c 原浓度与对成o d 值之阃存在垃著的线性关系。 表1 1 州接e 1 s a 灵敏度的测定结果( 1 1 0 0 0a p i g g ) 标准抗原浓度吸收值( o d ) 平均吸收值 ( l g 孔) 亟复1亚复2重复3重复4 ( 0 d 4 1 0 n m ) oo 1 20 0 7o 0 90 0 80 0 9 0 4 70 10 1 20 10 0 60 0 9 5 0 9 4o 1 lo 0 6o 0 60 10 0 8 2 5 1 8 8 0 1 3o 0 0 7o 0 70 0 9 5 37 50 1 6o 1 70 1 70 1 3 o 1 5 7 5 了5o 3 7o 3 5o 3 3o 3 20 3 4 2 5 1 50 7 3o 7 5o ，7 20 ，7 4 0 7 3 5 ：1 0 1 0 71 0 81 0 61 0 3 1 0 6 6 01 2 51 2 31 2 8 1 2 61 2 5 5 表1 2 问接e li s a 测定结果的差异显著性及与抗原量的相关性分析 ( i 1 0 0 0a k l l 一 9 6 ) 注：问门方程和相芙系数是穰：间接e l s a 的最低w 检测值3 ，7 5 n g 孔和对应的o d 值及其以r 数据 的毖 i f 【 上计算 使用a k p i g g 测定结果的差异显著性分析( 表1 2 ) 表明；0 4 7n g 7 l 、0 9 4n g 孔、i 8 8n g j l 的o d 值与0n g ；f _ l 的o d 值在n ：0 0 5 和a = 0 0 l 的水平上均无显著 差异，标准抗原浓度增加到3 7 5n g _ 子l 时，其o d 值与0n g 孑l 的o d 值在o = 0 0 5 和 a 0 0 1 的水3 f 上均呈现极显著差异，因此，使用1 1 0 0 0a k p - i g g 为酶标二抗，问接 e 【j l s a 的最低可检测值为3 7 5 n g f l 。标准抗原浓度与对应0 d 值平均数的回归方程为 y - o 0 1 8 5 x + 0 2 7 9 5 ，就相关系数r = o ，9 1 3 l ，f 检验极显著，表明标准抗原浓度与对应 ( ) 1 ) 值之川存在拔丝著的线性关系。 4 2 1 直接d o t e l i s a 的灵敏度 将一系列等倍稀释的标准抗原2 u l 点样( 1 3 0 n g 点、6 5n g 点、3 2 5n g 点、1 6 2 5 n g 点、8 1 ： r , g d ：e 、4 0 6n g 点、2 0 3n g , 点) 于n c 膜，按照直接d o t e s a 程序 进行测定，测定结果见图8 。 图8 直接d o t e l i s a 灵敏度的测定结果 从圈8 刊以看出，随着标准抗原浓度的降低，斑点的颜色逐渐变浅，在标准抗原 813 n g 点样点的斑点清晰可见，而4 0 6 n g 点样点的斑点较模糊。因此，直接d o 卜u l i s a 的最低可检测值为4 0 6 8 1 3 n g 。 4 2 5 央心d o t e l i s a 的灵敏度 将一系列等倍稀释的标准抗原2 u l 点样( 1 3 0 n g 点、6 5n g 点、3 2 5n g 点、j 6 2 5 n g 点、8 1 3n g 点、4 0 6n g 点、2 0 3h a 点) 于n c 膜，按照夹心d o te l i s a 程序 进行测定，测定结果见图9 。 图9 夹心d o t e l i s a 灵敏度的测定结果 从图9 可以看出，夹心d o t e l i s a 的测定结果与直接d ( ) 卜e l i s a 相似，但存褶周 浓度条件f ，火心d o te l i s a 的斑点颜色要比直接d o t e l i s a 的浅一些。标准抗原 8 1 3 n g 点样点的斑点仍清晰可见，4 0 6 r i g 点样点的斑点较模糊，因此央心d o te l ，i s a 的最低可检测值为4 0 6 8 i 3 r i g 。 为确定央心d o t e l i s a 中封闭这一步是否可省略，上述测定的同h , 3 设置了另一处 理：包被i g g 后未封闭，直接点样。结果( 图1 0 ) 表明：两者的测定结果几乎完全相 同，火心d ( ) 卜e l i s a 中封闭这步是可以省略的。 图1 0 夹心d o t e l i s a 灵敏度的测定结果( 未封闭) 1 2 6 间接d o t e i i s a 的灵敏度 将系列等倍稀释的标准抗原2 u l 点样( 1 3 0 n g , 点、6 5n g 点、3 2 5n g 点、1 62 5 n g 点、8 - 1 3n g 点、4 0 6n g , i 、2 0 3n g 点) 于n c 膜，使用两种酶标二抗( pi g g 和a k pi g g ) ，按照间接d o t e l i s a 程序进行测定，测定结果见图1 1 和图1 2 。 幽1 1 1 1 日j 接d o te l i s a 灵敏度的测定结果( 1 1 0 0 0 0h r p i g g ) 从图l l 可以看出，使用h r p l g g 为酶标二抗的间接d o t f l i s a 测定结果中，标 准抗原1 3 0 n g 一1 0 6 n g 点样点的斑点都清晰可见，2 0 3 n g 点样点的斑点较模糊。因此， 以i i r l 一i g ( 、为酶标二抗的f h j 接d o t e l ，i s a 的最低可检测值可达2 0 34 0 6 n g 。 图1 2 间接d o l e l i s a 灵敏度的测定结果( 1 1 0 0 0a k p i g g ) 从图12 可以看出，使用a k p i g g 为酶标二抗的间接d o t e l i s a 测定结果中，标 准抗原1 3 0 r i g 一2 0 3 n g 点样点的斑点都清晰叫见，且颜色较深。因此，以a k p i g g 为酶 标抗的间接d o te l i s a 的最低可检测值可达2 0 3 n g 。 结论与讨论 1 抗原的制备 转l j t 抗虫基因植物中表达的杀虫蛋白大多是c r y l a ( c ) ，是经过改造的分子量为 6 0 7 0 k d 具有杀虫活性的片段。目前抗原的制备通常是用碱液裂解伴孢晶体得到分_ 了 量约1 3 0 k d 的杀虫蛋白( c r y i a ( e ) ) ，或在此基础上，用胰蛋白酶进一步降解为分子量 约6 7 k d 的杀虫蛋白( c r y i a ( c ) ) 。山于转b t 抗虫基因植物中表达的杀虫蛋白是 c r y i a ( c ) ，因此用6 7 k d 的杀虫蛋白作为抗原制备的抗体来进行e l i s a 检测是可行和准 确的，砸1 3 0 k d 的杀虫蛋白虽然与6 7 k d 的杀虫蛋白有较高的同源性，但毕竟是两种不 同的蛋向，用1 3 0 k d 的杀虫蛋白作为抗原制备的抗体来检测c i y l a ( c ) 是否可行需要进 行验证。福建农林火学的秦崇涛硕士【6 2 | 对此进行了研究，用c r y l a ( e ) 的抗体分别检测 了c 1 1 y i a ( c ) 和c r y l a ( e ) ，发现用c r y l a ( e ) 的抗体与两种蛋白反应的回归曲线的斜率 与截距均相差不人，阕此认为用c r y i a ( e ) 的抗体去检测c r y i a ( c ) 是可行的。四川农业 人学的严吉明”和山东农业大学的沈法富等。采用含1 3 0 k d 杀虫蛋白的粗提蛋白作为 抗原制备出b l 抗体，中国农业大学的王保民等“”采用纯化的1 3 0 k d 杀虫蛋白作为抗原 制备出b t 抗体，用于检测转b t 棉花中的表达产物时，都获得了良好效果。但南京农 业大学的陈松等i3 5 l 提出，i j i 毒岽蛋白( 1 3 0 k d 的杀虫蛋白) 在溶液中不稳定，一方面易 被蛋白水解酶降群：另力面易通过分子问的二硫键形成聚合蛋白，因此用毒素蛋白 ( 6 7 k d 的杀虫蛋白) 作为抗原是首选。本研究应用纯化的1 3 0 k d 杀虫蛋白制备b t 抗体 用于检测，也获得了良好效果。因此综合考虑两种蛋白的免疫原性、稳定性以及用 其建立的检测方法的准确性等方面，用那一种蛋白作为抗原更好还有待今后进一步的 研究。 i 1 l l e y 等驯用葡聚糖凝胶过滤分离纯化出6 7 k d 的杀虫蛋白，国内中国农业科学 院的佤宁二 三等1 6 4 1 和南京农业大学的陈松等1 6 5 1 分别用d e a e s e p h a d e x 柱和s e p h 8 d e x ( 卜1 0 0 柱分离纯化得到了分子量约6 7 k d 和6 8 k d 的杀虫蛋白。b u l a 等 6 6 1 用 b i0 - g e l 柱分离纯化得n 7 分子量约1 3 0 k d 的杀虫蛋白，国内中国农业大学的王 保民等7 j 采用制备电泳的方法纯化出了1 3 0 k d 的杀虫蛋白。本研究也用该方法制备出 r 商纯度的1 3 0 k o 杀虫蛋白，f l i 该方法存在匹f 收率低、一次制备量少，需要进行多次 提取等不足。 2 抗体的酶标记 过碘酸钠法是由n a k a n e 等1 68 j 在1 9 7 4 创建，原理是先利用过碘酸钠氧化h r p 分子 卜糖链中的羟基，使之变成醛基，再与抗体蛋臼上的游离氨基反应，生成s c h i f f 碱。 最后经氢硼化钠还原形成稳定的酶标抗体复合物。本法为防止生成的醛基与酶蛋白氨 基自身交联预先用二硝基氟苯处理h r p 。封闭酶蛋白中残存的n 一、一氨基。由 于该方法中的酶和抗体的利用率高而被广泛应用。之后w i l s o n 等改进此法，采用 将过碘酸钠氧化i i r p 在低p h 下进行，省去了经典法中用二硝基氟苯封闭h r p 的步骤。 郭舂祥等1 5 川在此基础上进一步改进，用乙二醇灭活过碘酸钠后，直接加入抗体对p h 9 5 碳酸缓冲液透析并使之结合，不但省略了加抗体前先对p h 4 4 醋酸缓冲液透析平衡的 步骤，也不必再用碳酸盐渊节1 ) i 值。本研究采用改进后的方法用h r p 标电了抗体i g g ， 结果表明：改进后的方法不仅步骤简单，所用设备简易，而且标记效果良好，是一种 很好的酶标记方法，非常适合一般实验室应用。