（森林培育专业论文）马尾松苗木渗透调节物质与耐旱性关系研究.pdf

摘要 本文研究了马尾松萤木内渗透调节物质鹩动态分布及其与毳| 旱性的关系，荠 结合菌木的生长和生理状况，对不同种源马尾松苗木的抗旱能力进行综合评价。 结果如下： 1 、一年生马是松萤木针时蠹松醇含量随燕本的生长逐渐增燕，并在硬纯麓 达到最高；而二年生黼木针叶内松醇含量随菌木生长却下降，只在硬化期有所增 加。舰醇、半乳糖和麦芽糖含量的变化较为复杂，均没有规律性。葡萄糖含量的 变化比较平稳，二年生苗木葡萄糖含量在8 月份明显高于一年生苗木。 2 、一、二年生马尾松萤本松簿和舰醇含爨均以茎中最高，根和针靖其次， 但各器官松醇酶绝对含量甓显高予飘醇。蔻萄糖戮茎和针时内含量最多，根串最 少。半乳糖与麦芽糖均以茎中含量最高，针叶其次。根中没有检测到麦芽糖。 3 ：松酵、葡萄糖和艟氨酸与马尾松菌本抗旱性关系较密切，它们的含量隆 干旱胁迫程度加深和胁遣时阀延长均星上暑趋势。飘醇、睾乳耱、麦芽糖和游离 氨基酸与马尾松萤木抗旱性关系表现均不稳定，干旱胁迫下它们的含蹩虽有上升 趋势，毽随胁迫时闻延长上升趋势不明显。 4 、水分胁迫下，各种源马尾松蓖木生长及生理等指标均受到显蕊影响。结 含生长及生理指标，逮瘸抗旱隶属嚣数法综合谨赞，得窭不阉耩源马尾松菡本抗 旱能力强弱的排序为；湖南汝城广东信宜 湖北大悟 浙江江山 重庆黔江。 关键词：马尾梭菌本；永分胁追；渗透谖节物质；动态分布 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行的研究工作 所取得的成果尽我所知，除文中已经特别注明引用的内容和致谢的地方外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式注明并表示感谢本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者( 本人签名) 剥垄夏易衍月矿日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南京林业大学有关保留，使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版( 中国科学技术 信息研究所；国家图书馆等) ，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京林业大学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以汇编和综合 为学校的科技成果，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论 文全部或部分内容 保密口，在年解密后适用本授权书本学位论文属于不保密彰 ( 请在以上方框内打“ ” ) 学位论文作者( 本人签名) 多j 撅 指导教师( 本人签名) 昏团 沙呓冬a ? 8 ，睫 勿旁年石月f ，岳日 1 上j l 刖舌 植物生长的环境并非总是适宜的，在自然条件下，由于不同的地理位置和气 候条件以及人类活动等多方面的原因，造成了各种不良环境。如果这些不良环境 条件超出了植物正常生长发育所能忍受的范围，其正常生长就会受到影响，甚至 死亡。对林业生产来说，各种不良环境是影响林木产量和质量的最直接、最重要 因素。因此，加强苗木逆境生理的研究，掌握林木在不良环境下的生命活动规律， 从而采取切实可行的人为调控措施，对培育高产优质的林木具有重要意义。 在诸多环境因子中，水分亏缺是最普遍的不良环境因子。干旱、低温和盐渍 等都会引起水分亏缺而导致植物生长发育受损害。但是在水分胁迫情况下，植物 体内也会发生一系列相应的生理生化变化来抵御或减轻胁迫造成的损伤，主要表 现有：生长受到抑制、细胞膜结构遭到破坏、光合作用减弱、内源激素代谢失调、 氮代谢异常、酶系统和糖代谢发生变化等。其中，细胞内小分子渗透调节物质的 积累是植物适应水分胁迫的重要机制之一，备受研究者的关注( 彭立新等，2 0 0 2 ) 。 已有研究表明，在不同逆境条件下，植物代谢反应的总趋势是基本一致的， 即水解作用增强，合成作用减弱，从而使植物体内淀粉、蛋白质等大分子物质降 解为可溶性糖或氨基酸等小分子物质。如许多针叶树种苗木在遭受水分胁迫时， 其细胞内淀粉、蛋白质和核酸等大分子物质会分解，而葡萄糖、脯氨酸等分子量 较小的渗透调节物质会积累，从而降低细胞水势，达到保持水分的目的。如果有 目的地对苗木进行渗透调节，即通过胁迫诱导，提高细胞内葡萄糖等小分子渗透 调节物质的含量，则苗木适应干旱的能力会得到提高，并最终提高苗木质量 ( k o p p e n a a l 等，1 9 9 1 ) 。在对小分子渗透调节物质充分认识的基础上，应用基因 工程技术，克隆相关基因，转入目的植物中并使其得到表达，将在更大程度上提 高苗木的抗旱能力( 杜金友等，2 0 0 4 ) 。 马尾松( p 砌材了肌口s s 彻f 口以口l ) 是我国南方主要造林树种，每年造林用苗量 约为5 亿多株( 周政贤，2 0 0 1 ) 。马尾松苗木质量的好坏，特别是耐旱能力的强 弱，是关系到我国南方马尾松造林成败的重要因素之一。但是在育苗过程中，由 于干旱、杂草竞争等原因，马尾松苗木常会遭受水分胁迫，从而影响苗木质量， 严重时甚至影响苗木的死活。因此，研究马尾松苗木的耐旱机理及寻求提高苗木 抗旱能力的方法十分必要。然而，以往对马尾松苗木耐早性的研究主要集中在苗 木生物量( 施积炎，2 0 0 1 ) 、脱氢酶活性和电导率( y up f 口f 2 0 0 3 ) 、水分参数( 谢 寅峰，2 0 0 l ；y up f 口z 2 0 0 3 ；施积炎，2 0 0 4 ) 、气体交换和水分利用效率( 喻方圆 等，2 0 0 4 ) 等方面，这些研究为初步了解马尾松苗木的耐旱能力和耐旱机理，在 一定程度上提高苗木的耐早能力提供了依据。但是，要进一步揭示马尾松苗木的 耐早机理，上述研究的深度仍然不够。特别是在渗透调节物质方面，小分子渗透 调节物质的积累有其独特和重要的作用，必须加以研究。 本文在已有研究的基础上，对马尾松苗木小分子渗透调节物质的动态分布进 行系统研究；同时选择5 个种源马尾松苗木进行水分胁迫处理，对水分胁迫下小 分子渗透调节物质积累、苗木生长和其它生理指标变化等方面进行深入研究，以 期通过研究，进一步揭示马尾松苗木适应干旱的机理，为采取科学措施，培育高 质量马尾松苗木提供理论依据。 2 1 文献综述 多种逆境都会对植物产生直接或间接的水分胁迫。水分胁迫时植物体内主要 积累各种有机和无机物质来提高细胞液浓度，降低渗透势，提高细胞保水力，从 而适应水分胁迫环境，这种现象称为渗透调节( o s m o t i cr e g u l a t i o no ro s m o t i c a d j u s t m e n t ) 。渗透调节是在细胞水平上进行，即由细胞通过合成和吸收积累对细 胞无害的溶质来完成。通过渗透调节可使植物在干旱条件下维持一定的膨压，从 而维持细胞原有的生理过程，如细胞伸长、气孔开放、植物生长、光合作用以及 其它一些生理生化过程。因此，渗透调节是植物适应水分胁迫的一种重要机制。 渗透调节物质的种类很多，且小分子类物质居多，目前大致分为两大类：一 类是由外界进入细胞的无机离子；另一类是在细胞合成中的有机溶质，主要有甘 露醇、脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱、海藻糖、果聚糖、肌醇、多胺等小分子有机化 合物( b i a n c h ip r 口z 1 9 9 3 ，c r o w e l 9 8 4 ) 。相对于蛋白质、核酸和多糖等生物大分 子而言，这些小分子有机物的分子量通常不超过1 0 0 0 ，如脯氨酸“5 ，甜菜碱 1 1 7 ，可溶性糖1 5 0 7 2 0 ，游离氨基酸7 5 1 4 4 ，多元醇1 3 5 1 0 0 0 。通常在植 物受到干旱等非生物逆境胁迫时，渗透调节物质会在细胞内大量积累，进而增强 植物的保水能力，稳定体内的渗透压平衡，使植物能够忍耐失水所带来的负面影 响。但是，高浓度的无机离子常引起代谢紊乱。相比之下，脯氨酸、甜菜碱等小 分子有机物的大量积累不仅不会破坏生物大分子的结构和功能，反而表现出良好 的亲和性并具有较强的渗透调节作用。 在水分胁迫条件下，细胞内小分子渗透调节物质的积累对植物适应干旱具有 重要生理意义。现有研究发现，植物体内能起渗透调节作用的小分子渗透调节物 质有多种，其中以脯氨酸、甜菜碱、游离氨基酸、可溶性糖类物质和多元醇类物 质最为重要。5 类物质中，脯氨酸、甜菜碱、游离氨基酸和可溶性糖类物质的代 谢目前研究较多，而对多元醇类物质的研究却很鲜见。为了能够从总体上把握这 些研究的最新进展，对近年来国内外研究小分子渗透调节物质的积累与水分胁迫 关系的成果进行综述。 。 1 1 脯氨酸的积累与水分胁迫 脯氨酸是植物蛋白质组成成分之一，以游离状态广泛存在于植物体内。脯氨 酸对细胞的渗透调节起重要作用，是植物体的防脱水剂。在水分胁迫条件下，植 物体内游离脯氨酸含量增加。脯氨酸含量的增加与植株水势下降呈负相关，植物 体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物体内的水分情况，因而可以作为检验植 物缺水情况的参考性生理指标。自k e m p l e 等人( 1 9 5 4 ) 首先发现在受旱的多年 生黑麦草( 三d j f “所p d ，p v p ) 叶片中有游离脯氨酸积累后，脯氨酸积累与水分胁迫 的关系得到了广泛的研究。 水分胁迫下，不同的植物品种之间脯氨酸的积累存在差异。k n i p p 等( 2 0 0 6 ) 研究水分胁迫对几个经过基因改良并能够产生果聚糖的马铃薯品种( 肋肠疗”聊 3 f 甜6 e l l o j 朋l ) 叶片中脯氨酸积累的影响，结果显示，水分亏缺下所有马铃薯品 种叶片孛脯氨酸的含量都增加，但是不同品种之问差异骧显，其中果聚耱分子聚 合强度越高的转基因马铃薯品种在水分亏缺下，脯氨酸的含量越低。相关研究还 有很多，例如对高粱的不同品种( z a i 主翥蓁i 主主e f 以1 9 9 7 ；a l k 塞囊a i i i8 f 口z ，1 9 9 6 ) ， 大亟的不同品种( a l k a 譬譬k i 群口| i 1 9 9 6 ) ，玉米的不同品种( c a r c e l l e r 甜口f 1 9 9 9 ) ， 豇豆的不同品种( c h i u l e l e 甜口z 2 0 0 4 ) ，沙棘的不同品种( 刘瑞香等，2 0 0 5 ) 和 胡麻的不露品种( 斯钦墨特和额尔登桑，薹9 9 9 ) 等，这些研究结果都表臻，。水分 胁迫下积累脯氨酸的含量因品种不同而存在差异。 在植物生长的不同阶段遭受水分胁迫后，脯氨酸的积累也存在差异。薛告全 等( 2 0 0 0 ) 研究玉米( 磊擅俄妒l ) 不同生育期水分胁迫条件下脯氨酸含量的变 化，发现苗期3 个品种脯氨酸的含量基本上没有多大变化。但是孕穗期、抽雄期3 个品种出现差异。从积累游离脯氨酸绝对含量看，蒴襄水分胁迫条锋下时片脯氨 酸含量在1 0 0 4 0 0 肛g g 。d w 之间变化，拔节期在l o o 8 0 0 p g g q d w 之间变化，孕 穗期在3 0 0 4 5 0 0 雌萎；i d w 之间变化，抽雄期在5 0 0 4 5 0 0 l l g g 。d w 之问变化。 。近年来，也有不少学者对水分胁迫下根系中脯氨酸积累的情况进行研究。李 春香等( 2 0 0 1 ) 研究长期水分胁迫对小麦生育的中后期的搬和叶内渗透调节物质 含量的影响发现，随着水分胁迫程度的加重，绝大部分墨静叶片中脯氨酸含量均 有增加的趋势，根系中脯氨酸含量同样是随着水分胁迫的加重逐渐增加。王玮等 ( 2 0 0 0 ) 研究了不同程度的水分胁迫对玉米生育中后期根系及叶片的渗透调节能 力和渗透调节物质含量的影响，结果表明，根系中光论渗透调节物质的含量，还 是渗透调节物质的增加量均小于叶片，灌浆期严重水分胁迫下游离氨基酸与脯氨 酸对渗透调节的贡献增大。杨洪强等( 王9 9 4 ) 以苹果的薪根为研究对象，探讨土壤 干旱条件下，吸收根和延长根中脯氨酸含量的变化，结果发现，土壤干旱条件下， 延长根中的脯氨酸含量迅速提高，吸收根中脯氨酸含量的变化不犬。s a n 薹薹e z 等 ( 2 0 0 5 ) 研究不同耐翠玉米( 压露掰妒l ) 品种在水分胁迫下根蠹脯氨酸的含量， 发现处在细胞分裂期的根系区域脯氨酸的含量比其它的根系区域较多。彭志红等 人( 2 0 0 2 ) 认为，缺水时，脯氨酸积累的蹶初部位主要是叶，其次是茎，其它器 官内的脯氨酸来自叶片。在离体叶片、茎和根经受同样程度的缺水时，离体叶和 茎可积累脯氮酸，而离体根没有脯氨酸的积累。z a i 主翥e i 主主等( 1 9 9 7 ) 对p e g ( 聚 乙二酵) 引起的水分胁遥下高粱( 勋培磊越瓒矗i c d ；o ，l 。) 中脯氨酸的积累情况进行 研究也发现，茎干中的脯氨酸的含量比根系中高。 但也有学者认为，尽管水分胁迫会使脯氨酸增加几倍甚至几十倍，但臃氨酸 的绝对量只有几个l l m o l g 。d w ，而且在细胞质和液泡中的分布不均，细胞质中的 含量与液泡中的含量比值为1 5 9 8 。因此，脯氨酸的渗透调节作用是有限的。 1 2 甜菜碱的积累与水分胁迫 + 甜菜碱是高等植物中最主要的 一热点。通常，积累甜菜碱的植物比积累脯氨酸的植物对干旱和盐渍等逆境的耐 4 碱的浓度为l o m m o l 时，植物的抗冻能力也会增强，抵抗的低温从3 1 下降到 4 5 。 1 3 可溶性糖的积累与水分胁迫 。 近年来，不少学者对水分胁迫下可溶性糖的积累情况进行研究( s a s a k i ，1 9 9 8 和2 0 0 0 ) 。k a m e l i 等( 1 9 9 6 ) 研究硬质小麦( 乃订f c 甜肌幽，”朋l ) 在水分胁迫下 的生长状况和可溶性糖的积累情况，结果表明，水分胁迫下硬质小麦的生长与水 分胁迫前期、中期及后期植物体内可溶性糖的积累和水势的变化密切相关。该研 究同时认为，光合作用不是贮藏淀粉而是水分胁迫下可溶性糖积累的主要来源。 刘瑞香等( 2 0 0 5 ) 通过对中国沙棘( 胁p p d 础口p 砌口m 拧d f 如ss 跏p 玎s 括) 和俄罗斯沙 棘( 胁p p d p 办口口砌口所甩d j 如s ) 在野外不同生境和田间不同干旱胁迫条件下叶片可 溶性糖含量的变化进行研究后发现：两种沙棘叶片内可溶性糖含量随着干旱胁迫 程度和干旱胁迫时间的延长而持续增加，但沙棘叶片可溶性糖的积累能力因雌雄 株和品种不同而出现一定差异，表现为俄罗斯沙棘 中国沙棘，雌株 雄株。米海 莉等( 2 0 0 4 ) 在宁夏灵洲区牛心朴子、甘草自然生境条件下，采用土壤控水措施， 研究了土壤水分胁迫对两种优势旱生植物牛心朴子( c ! y 疗册c 厅“掰勋肌口，d 订f ) 和 甘草( g 陟c y ， 扬口“，- 口始忍s 括) 根、茎、叶中的可溶性糖的影响，结果发现土壤水 分长期胁迫引起了两种植物根、茎、叶可溶性糖含量的升高，并且可溶性糖含量 增加或减少的程度不同。李予霞等( 2 0 0 4 ) 测定一年生葡萄的不同叶龄叶片中可 溶性总糖的含量，结果表明，水分胁迫使幼龄叶片的可溶性总糖含量增加，而减 少了在成熟叶片中的含量，说明水分胁迫导致渗透调节物质由老组织向幼嫩组织 运输并积累，从而提高了幼嫩组织的干旱适应能力。 可溶性糖组分( 如蔗糖、葡萄糖和果糖等) 在水分胁追下的变化因植物种类 而异。k a m e l i 等( 1 9 9 5 ) 研究硬质小麦( 乃f 廊以m 办厂甜ml ) 叶片中有机和无机 溶质在水分胁迫下渗透调节作用，认为可溶性糖类物质，尤其是葡萄糖对渗透调 节的贡献率最大，并且葡萄糖即使是在最小的嫩叶比第一次完全绽开的叶片中含 量也要高的多。g i l l 等( 2 0 0 3 ) 研究水分胁迫下的高粱( 肋r g | l 甜m6 f c d ，d r ( l ) 胁e 刀c ) 种子，发现可溶性糖的含量在胚和胚乳中都有显著增加，果糖在各种 胁迫下的含量都比葡萄糖和蔗糖的含量高。喻方圆等( 2 0 0 4 ) 以杉木、马尾松、 花旗松和北美乔柏为对象，研究在水分胁迫下，苗木生长期间针叶内可溶性糖含 量的变化，结果表明：水分胁迫对杉木针叶果糖含量的影响不明显，但对杉木针 叶葡萄糖和蔗糖的含量却有显著影响。随着水分胁迫程度的加深，葡萄糖含量提 高了l1 8 0 ，蔗糖含量提高幅度达31 8 8 6 ：水分胁迫对马尾松苗木针叶葡萄糖 和蔗糖含量的影响显著，水分胁迫条件下葡萄糖含量提高了4 5 9 2 ，果糖含量提 高了3 4 0 1 ，蔗糖含量提高了1 3 8 3 2 ；水分胁迫尽管对花旗松苗木针叶的3 种 可溶性糖含量均有较显著影响，但随着水分胁迫程度的加深，3 种可溶性糖含量 均未表现出明显的上升趋势；水分胁迫对北美乔柏苗木针叶可溶性糖含量均有显 著影响。随着水分胁迫程度的加深，葡萄糖含量提高了8 9 4 6 ，果糖含量提高了 6 9 0 3 2 ，蔗糖含量提高了7 1 6 8 。 1 4 游离氨基酸的积累与水分胁迫 氨基酸是一类带有氨基( n h 2 ) 或亚氨基( 一n h ) 的有机酸的总称，是细 胞的重要组成部分，在植物生命活动中担负着重要作用。近年来，在研究氨基酸 的积累与水分胁迫的关系方面取得了一些进展。a s h r a f 等( 2 0 0 5 ) 研究菜豆 ( p 办口j e d ，“s1 ，“忉，妇) 和剌田菁( s 6 口刀妇口c ”昆口纪) 后发现，干旱胁迫下两种植物所 有部位的游离氨基酸含量都有增加，菜豆的叶和节结部位游离氨基酸的含量比刺 田菁高。h o a i 等( 2 0 0 3 ) 研究水稻( d 彬口s 口f f _ l ，口l ) 幼苗中氮的化合物在盐胁迫 下的积累，发现脯氨酸和其它氨基酸会大量积累。 近年来不少学者对游离氨基酸总量及氨基酸组分在水分胁迫下的变化进行 研究。吴晓红等( 2 0 0 6 ) 采用a c c q t a g 法测定水分胁迫下迷迭香( r o s e m 口，f ”“s 鲫c 砌口z 捃) 中氨基酸的组成和含量，结果表明，水分胁迫导致迷迭香中游离氨 基酸的含量显著增加，其中丝氨酸、脯氨酸起主导作用，天门冬氨酸、谷氨酸、 蛋氨酸含量变化显著。在p e g - 8 0 0 0 模拟干旱胁迫条件下，检测到迷迭香中含有 17 种氨基酸。总的来看，迷迭香中总游离氨基酸的含量显著增加。干旱过程对迷 迭香的总游离氨基酸含量的影响表现在丝氨酸、脯氨酸两种氨基酸上，谷氨酸、 蛋氨酸、天门冬氨酸也有不同程度的变化，而其它种类氨基酸则没有明显的变化。 薛崧等( 2 0 0 1 ) 研究水分胁迫下山黧豆( 工口肪 甜ss 谢f ，”s ) 种子萌发过程中游离 氨基酸的变化发现，山黧豆在萌发过程中，胚根中的总游离氨基酸含量高于子叶， 随着种子萌发，胚根和子叶中总游离氨基酸含量逐渐增加，7 d 达到高峰，尔后下 降，子叶中总游离氨基酸含量下降速度快于胚根，且二者的变化趋势相似。胚根 中的脯氨酸、谷氨酸和丝氨酸含量最高，约占总游离氨基酸的6 8 8 5 ，是胚 根生长的主要氨基酸。其次是丙氨酸、精氨酸、缬氨酸和天冬氨酸，其它氨基酸 的含量较小。子叶与胚根相类似，脯氨酸、谷氨酸和丝氨酸约占总游离氨基酸的 6 5 7 l ，其次是组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸含量较高，这些必需 氨基酸可能是通过蛋白水解酶水解后在子叶中以游离态存在，然后进一步分解为 可供胚根生长的含氮化合物。沈黎明和王舰( 1 9 9 6 ) 研究水分胁迫对林生山黧豆 ( 三口岫，甜5 妙，1 ，e s ，r 括l ) 幼苗体内游离氨基酸含量的影响发现，水分胁迫下幼苗 体内游离氨基酸的总量明显增加，对游离氨基酸含量影响的特点，主要在于林生 山黧豆体内的非蛋白质氨基酸，包括特征游离氨基酸( d a b a ) 和幼苗中的主要 游离氨基酸( 高丝氨酸) 的含量增幅较大，两种非蛋白氨基酸代谢密切相连的天 门冬族氨基酸的含量上升幅度也较大，如色氨酸、甘氨酸、亮氨酸和苏氨酸分别 比对照增加了3 9 8 、7 2 、2 7 2 和5 5 。游离的丙氨酸族氨基酸( 如色氨酸、 谷氨酸、亮氨酸和缬氨酸) 和谷氨酸等5 种氨基酸在林生山黧豆体内含量较低， 在水分胁迫下也明显增加。 大多学者认为，游离氨基酸积累的多少与水分胁迫的程度存在一定关系。如 薛崧等( 2 0 0 1 ) 发现，不同浓度的p e g 对山黧豆种子萌发过程中胚根和子叶的游 7 离氨基酸含量的影响不同。子叶游离氨基酸随着胁迫强度的增加而降低，胚根中 游离氨基酸含量随胁迫强度增加而增高，萌发时间越长，不同胁迫程度之间的差 异越大，胚根生长明显受到水分含量的抑制，生长减慢。s i r c e l j 等( 2 0 0 5 ) 研究 干旱胁迫下两种一年生苹果( 彪如m p 盯站口) 的嫁接品种乃刀卿掰臃，聊“幻和 佻f 口，结果显示，在苹果这两个品种中总游离氨基酸含量有相同的变化，轻 微胁迫和中等胁迫都不会影响总游离氨基酸的含量，而严重的胁迫导致总游离氨 基酸的增加量相当于正常水平下的4 0 。但是s i r c e l j 等( 2 0 0 5 ) 的研究结果与他 们以前的研究结果( 1 9 9 9 ) 不一致，以前他们研究发现轻微的水分胁迫下就会有 脯氨酸、谷氨酸和总游离氨基酸的增加。现在的研究结果表明，游离氨基酸的急 剧增加只有在严重的干旱胁迫下才会发生。因此，游离氨基酸的含量能否代表植 物对水分胁迫的适应还有待进一步的研究证实。 1 5 多元醇类物质的积累与水分胁迫 在水分胁迫下，植物体多元醇的含量也有所增加。b o h n e r t 等人( 1 9 9 6 ) 认 为水分胁迫下产生的多元醇类物质分为两大类，即开链式多元醇( 如甘露醇， m a n n i t 0 1 ) 和环链式多元醇( 如右旋肌醇甲醚或松醇，p i n i t 0 1 ) 。 对于多元醇与水分胁迫关系的研究在国内的资料中还未见报道，而在国外近 年来已有较多学者对水分胁迫下的多元醇积累进行研究。w i l l i a m s o n 等( 2 0 0 2 ) 认为多元醇类物质是一种多功能的植物保护剂，它在植物的糖代谢、盐胁迫和抵 抗病菌方面起非常重要的作用，m e r c h a n t 等( 2 0 0 5 ) 也发现桉树( e ”c 口切f “s 印口砌“肠砌) 中环多醇在细胞质中积累可以适应盐胁迫和水分胁迫。c l a r k 等( 2 0 0 3 ) 研究西红柿在高渗的环境下生长过程中多元醇所起的作用，结果发现由西红柿的 真菌病原体产生并在植物体内大量积累开链式的多元醇类物质，但是起渗透调节 作用的不是甘露醇，而是阿拉伯醇和丙三醇。 目前国外较为关注的多元醇类物质是松醇类物质，对逆境中松醇积累的研究 也较多。松醇是环状多元醇类物质之一，最早是f o r d ( 1 9 8 4 ) 在干旱胁迫下豆 类植物中发现，随后研究的对象也从豆类植物扩大到非豆类植物( w a n e kp f 口，1 9 9 7 ，s u np f 以1 9 9 9 ，m c m a n u sp r 口t 2 0 0 0 ，s t r e e t e rp f 口，2 0 0 1 ) 。与脯氨酸、 甜菜碱和可溶性糖类物质相比，松醇突出的特点是含量差异大和代谢缓慢。f o r d ( 1 9 8 4 ) 分析干旱胁迫条件下豆类植物细胞质中溶质分子的积累情况，结果发现， 在所分析的多种溶质分子中，松醇的累积显得特别突出，因为其浓度在胁迫2 0 5 0 d 的时间内上升了好几倍。尽管胁迫条件下豆类植物细胞质中脯氨酸也会积 累，但对大多数豆类植物来说，松醇是细胞质中的主导溶质。自f o r d ( 1 9 8 4 ) 的研究发表后，一系列相关研究表明，不仅在干旱胁迫条件下，而且在高温、盐 渍和生长调节物质的胁迫条件下，松醇和其它环多醇类物质都会积累。植物体中 的环多醇类物质的另一个显著特点是代谢缓慢，这种代谢缓慢与其作为渗透调节 物质的功能是相适应的。对干旱胁迫的研究表明，胁迫情况下植物细胞质中糖类 化合物的含量会上升，但如果解除水分胁迫，则糖类化合物浓度的下降速度会大 8 大高于环多醇囊瘌引翼蓠。圈藩靼藜噬缮琵璀塑霎鋈蹿撼霎篓攀坦然罂；缬群薹 够强姆矧嚣鲤熏蓁峪蕴塑蚕雾熨嚣雨i 割刎廷纛秘拖；硅搀霪趸亭她黪翼啊窃 器薹型i 薹谚隶萌帮福鬲喇囊懿酉囊嘲璞m 啥懒匪蠢。纛l 蠹薹耋l i 鼙垂蓁重蓁蓁n 溺鐾 蓁瑙强撵稿鞘譬雾耐捌搿耋囊囊鎏薹再萎耋零毒剑篇羹褓篓雾室墓翼羹| 篓鳓 羹量至垦4 ；嚣烂g 誓；警占暴羹蓁褥善基醛雾羹泛疆淫沌毽柱勘则萋喙灌衙；滗 瞳霎鋈付薹亘蓁錾塞稀墨鬻望占麦徭勰瞿坦丝雾雾；等黧潮薹篓汽祭繇韩静甄翮 越鍪露塑雾雾霰峪妻龚戳雾量再耋妻譬。翼牮雩i 毫；两! 誊羹羹蓁耋印笛蕈珲叶苴誓 疆耄旨翟谚嗍睽表主l 茎蓁萋鍪告一溜，羹霎划纠酗鬟黝羹誉器鲁蝙耧磐墓雨看豁蘸 酮顽纂：衽固哲勘铲雕翻雾篓酉尊再型；冀兰占赢掣翳互绚稻，辩瑟霾霪藩院缮 篓菰籍器努篓薹雾嚣矧季羹确诺绍罐礞；群蚕；葡鬟蓑券蠢莼蒌帜邑荔篆蓊藏 薹巍琵器铸譬翼蓁蓁冀鏊露羹盏* 惑懿赫瓮； 冀i 霪薹鬟冀燮蓁薹蓁羹雾薹薹蓁薹羹 器髫要蓦羹叶i 蕈t 薹孽惶蠢堡皇薯翌撵咝銮季；雾蠹霪霪匿匡i 胁迫 善篓囊；唧 灞蝤如土壤低囊氆尊晦冀埝蹦复薹隔聚爵擎婆；霎“器墨骓塑至雾晦图篓； 毒箩主莹l i 耄i | 衙竺蔼蘧墨鱼需耋蝌氩癸置- 雨薹皆登摹善j 茎i 莹；二毫l 塞j 萼妻毂型明整个生参李茸漳矍研- 片坝蓁薹童像塞霎矛强崮琢限i 季墼鬟蔓嚣 翊薪酗霁靖鍪继蜀薹摊塑羹雾鐾夔黎翔卵复毋认粗托分；椭i i i i 霎i 妻善瞄萋萎曩熏麦爹 浠蓊 ! 讶髭冀堑箔一蓁墼鋈舅髦漉强型耄；塑蒿滚强拦遣溜捌，篓雨潺探蒴 薹蟊酹霁裁巯蓟蟊孰商篇甘藉；喜蓁薯萋霪毒喜! 荛昏霞譬耋零害鱼霞攫嚏氆 篓墼章圣篓囊妻 羹兰碍董p 确羔霎卧弘娩朔孵薹圣翼鸯虿存蓉鲥剐喇黍衙旨跨降篓露。囊l 雪季鱼丽茎耋耋 x 种子萌发前做好沙床管理，如果发现表层沙变白则需给沙床洒水，白天天气晴好 则揭开薄膜，一方面使沙床有足够的光照，另一方面可以使床面通风，夜间温度 降低又将薄膜盖上。种子约l 周后开始出苗，出苗后天气晴好时揭开薄膜，使幼 苗进行正常的光合作用。平均每隔1 0 d 喷洒多菌灵( 1 ：5 0 0 ) 一次，一直到幼苗 移栽至容器定植后一个月才结束。3 月中旬观察苗高约l c m 左右，部分幼苗子叶 开始脱壳，待幼苗子叶完全脱壳后的几天进行移栽。4 月3 日至4 月5 日选取健 壮的幼苗移栽到容器中继续培育。容器茁培育期间做好拔草、灌溉、遮荫、排水、 松土、防病害等管理。 2 3 2 试验内容及试验设计 2 3 2 1 小分子渗透调节物质时间和空间分布研究 以田间正常生长的马尾松( 浙江江山种源) 一年生苗和二年生苗为研究对象， 在2 0 0 7 年5 月3 0 日( 生长初期或幼苗期) 、7 月1 5 日和8 月1 5 日( 速生期) 、 1 0 月1 日( 生长后期或硬化期) 分别采集一年生苗针叶、二年生苗的一年生针 叶和二年生针叶，其中8 月1 5 日还分别采集一、二年生苗木的根和茎。将采集 的所有样品冷冻干燥磨成粉末，测定松醇、肌醇及可溶性糖含量。 2 3 2 2 水分胁迫下小分子渗透调节物质积累、苗木生长及生理变化研究 本研究采用三因素随机区组设计，三个因素分别为种源、水分胁迫和胁迫时 间。种源因素有5 个水平，即广东信宜、浙江江山、湖南汝城、重庆黔江和湖北 大悟种源。水分胁迫因素有3 个水平，即对照、中度干旱和重度干旱。胁迫时间 因素有3 个水平，即水分胁迫1 8 d 、3 6 d 和5 4 d 。 2 0 0 7 年7 月下旬将广东信宜、浙江江山、湖南汝城、重庆黔江和湖北大悟5 个种源马尾松一年生苗移入玻璃温室继续培育，每个种源3 0 0 株左右，这些苗木 被平均分成3 组，培育一周后，于8 月8 日开始分别施以周期性的不同水分胁迫 处理，即对照( 每三天浇水一次，浇水时将苗木浇透) ，中度干旱( 每六天浇水 一次，浇水时将苗木浇透) 和重度干旱( 每九天浇水一次，浇水时将苗木浇透) 。 l8 天为一周期，循环三次。处理时间从8 月8 日到1 0 月1 日，共计5 4 天。3 个胁迫周期结束后土壤含水量及土壤水势如表2 所示。 由表2 可知，在同一水分胁迫周期内随浇水间隔时间的延长，土壤水势逐渐 下降。根据h s i a o ( 1 9 7 3 ) 对中生植物水分胁迫程度的分级标准和本试验测定土 壤水势的结果，将每三天浇水一次视为对照、每六天浇水一次视为中度干旱胁迫、 每九天浇水一次视为重度干旱胁迫比较科学。3 个胁迫周期内的相同处理之间土 壤水势基本一致，这为探讨不同种源之间及同一种源马尾松苗木在一定的干旱胁 迫下发生的生理生化变化提供了可靠保证。 表2 水分胁迫下的土壤含水量及土壤水势 t a b 2t h es o i lw a t e rc o n t e n ta n dw a t e rp o t e n t i a la f t e rw a t e rs t r e s s 此外，在3 个胁迫周期内分别对各种源马尾松苗木的形态指标、叶绿素荧光、 针叶相对水分亏缺及丙二醛含量进行测定，同时采集各种源马尾松苗木针叶，冷 冻干燥磨成粉末，测定针叶内松醇、肌醇、可溶性糖、脯氨酸、游离氨基酸等渗 透调节物质含量和叶绿素含量。最后一次水分胁迫结束后，全部收获苗木，测定 根系活力和苗木生物量。 2 3 3 试验中各指标的测定方法 2 3 3 1 土壤水势的确定 ( 1 ) 建立土壤水势与土壤含水量的相关关系 取培育苗木的土样，事先进行处理，得到不同干湿程度的土样，用美国w e s c o r 公司p s y p r o 型露点水势仪测定各个土样的水势，再用1 0 5 恒温烘干法测定相应 的土壤含水量，建立土壤水势( y ) 与土壤含水量( x ) 之间的关系如下： y = 一o 0 0 0 0 0 5 x 3 + 0 0 0 2 2 x 2 + 0 0 9 35 x 4 2 3 5 ， r 2 = 0 9l2 7 。 ( 2 ) 确定土壤水势 在马尾松苗木的每个水分胁迫周期结束后，用1 0 5 恒温烘干法分别测出对 照、中度干旱和重度干旱下土壤含水量，代入土壤水势与含水量之间关系方程， 算出对照、中度干旱和重度干旱下对应的土壤水势。 2 3 3 2 苗木形态指标测定 在水分胁迫前和每个水分胁迫周期结束后，分别测定苗高，计算胁迫处理期 间的苗木高增长量和高增长百分率。 2 3 3 3 苗木生物量测定 在第三个水分胁迫周期结束后，收获苗木，用美国w i n b o u m ei n d u s t r i a l a 公 司生产的自动洗根系统( a t p 6 6 0 ) 清洗干净，吸水纸擦干，放入1 0 5 烘箱中烘 至恒重。烘干后，用电子天平测定苗木地上部分干重、地下部分干重和苗木总干 1 2 2 3 3 7 针叶相对水分亏缺的测定 参照植物生理学实验指导书第三版( 张志良和瞿伟菁，2 0 0 3 ) 。每个水分胁 迫周期结束后，采集针叶，擦净表面污渍，迅速称取新鲜针叶o ：2 9 左右，黑暗 中用水浸泡2 4 小时后取出，吸水纸吸干表面水分，再称针叶的饱和重，最后在 1 0 5 烘箱烘至恒重。按下式计算针叶相对含水量和相对水分亏缺。 针叶相对含水量( r w c ，) = 器l o o 针叶相对水分亏缺( i 州d ，) = 1 0 0 r w c 式中：w f ：针叶鲜重( g ) ，w t ：针叶饱和重( g ) ，w d ：针叶烘于重( g ) 。 2 3 3 8 脯氨酸含量测定 采用磺基水杨酸提取，酸性茚三酮显色法，参照李合生( 2 0 0 0 ) 、张殿忠 ( 1 9 9 0 ) 、刘山莉( 1 9 9 7 ) 和徐晓峰( 1 9 9 7 ) 等人的方法，略加修改。称取冷冻 干燥的针叶粉末0 3 9 于1 0 m l 离心管中，加入3 的磺基水杨酸溶液5 m l ，在沸 水浴中振荡提取3 0 m i n ，冷却后，3 0 0 0 r m i n 。离心1 5 m i n ，取上清液2 m l 于干净 的带玻璃塞试管中，分别加入2 m l 冰醋酸及4 m l 2 5 的酸性茚三酮试剂，在沸 水浴中加热显色3 0 m i n ，溶液即呈红色。冷却后加入4 m l 甲苯盖好玻璃塞摇荡 3 0 秒，静置片刻，吸管轻轻吸取上层红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白 对照，用分光光度计在波长5 2 0 n m 下比色，得吸光度值。从标准曲线上查出测 定液中脯氨酸的含量，然后按下列公式计算针叶中脯氨酸含量。 ，y 矿 脯氨酸含量( l g g 1d w ) = 三二 y ， 式中：c ：从标准曲线上查得的测定液中脯氨酸的含量( i l g ) ，v 。：提取液的总 体积( m l ) ，v 。：测定时样品体积( m l ) ，w ：样品干重( g ) 。 2 3 3 9 游离氨基酸含量测定 采用乙酸提取，水合茚三酮显色法，参照李合生( 2 0 0 0 ) 和汤章城( 2 0 0 4 ) 的方法，略加修改。称取冷冻干燥的针叶粉末0 5 9 ，于研钵中加入5 m l l 0 乙酸， 研磨匀浆后，移至离心管内，3 0 0 0 r m i n 1 离心1 5 m i n ，吸取上清液0 2 m l ，放入 2 0 m l 干燥试管中，加无氨蒸馏水1 8 m l ，随后加入3 m l 水合茚三酮、0 1 m l 0 1 抗坏血酸，试管封膜，置沸水中加热l5 m i n ，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动， 使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去，当呈现蓝紫色时，用6 0 乙醇定容 至2 0 m l 。混匀后在5 7 0 n m 波长下比色测定吸光度，根据样品测定液的吸光度， 在标准曲线上查得氨基态氮含量。按下式计算样品中游离氨基酸的含量。 ，1 v 矿 游离氨基酸含量( p g g 以d w ) = y ， 式中：c ：从标准曲线上查得的氨基态氮含量( p g ) ，v 。：样品稀释后的总体积( m l ) ， 1 4 v 。：测定时样品体积( m l ) ，w ：样品干重( g ) 。 2 3 3 1 0 可溶性总糖含量测定 采用李合生( 2 0 0 0 ) 的方法j 蒸馏水提取，蒽酮乙酸乙酯显色法。称取冷冻 干燥的样品粉末( 针叶、根或茎) o 1 9 于试管中，加l o m l 蒸馏水，塑料膜封口， 于沸水中振荡提取1 h ，冷却后，将提取液过滤到2 5 m l 容量瓶，反复漂洗试管及 残渣，定容至刻度。吸取提取液0 2m l 于2 0m l 刻度试管，加蒸馏水1 5 m l ， 恩酮乙酸乙酯0 5 m l ，浓硫酸5 m l ，充分振荡，立即将试管放入沸水中准确保温 1 m i n 。取出自然冷却至室温，用7 2 3 型分光光度计在波长6 3 0 n m 下比色测定吸 光度，按下式计算可溶性总糖的含量。 f 、，1 7 可溶性总糖含量( m g g 。1d w ) = 二二1 屹 式中：c ：从标准曲线上查得的糖含量( m g ) ，v t ：样品稀释后的总体积( m l ) ， v 。：测定时样品体积( m l ) ，w ：样品干重( g ) 。 2 3 3 1 l 可溶性糖组分含量测定 样品主要检测到葡萄糖、半乳糖和麦芽糖3 种糖组分。样品提取采用汤章城 ( 2 0 0 4 ) 和李合生( 2 0 0 0 ) 的方法，测定参考胡晓健( 2 0 0 7 ) 、陈淑芬( 2 0 0 6 ) 和甘宾宾( 2 0 0 0 ) 的方法，略有改进。 称取0 5 9 冷冻干燥的样品粉末( 针叶、根或茎) 于试管，加超纯水1 0 m l ， 塑料膜封口，于沸水中振荡提取3 h ，冷却后过滤，滤液离心收集上清液，即为 可溶性糖类物质的提取液。取1 m l 提取液，用0 4 5 p m 滤膜过滤，用于可溶性糖 组分含量测定。 糖组分测定用高效液相色谱法( h p l c ) 测定。测定条件：美国a g i l e n t l l 0 0 液相色谱仪，检测器为r i d ( 示差折光检测器) ；色谱柱为z o r b o x n h 2 ( 4 6 m m i d 2 5 0 m m ，内径柱长；柱面厚度5 u m ) ，柱温3 5 ；流动相：乙腈：水 = 8 0 ：2 0 ( v ：v ) ( 洗脱样品成分) ，流速1 2 m l m i n 一；每次进样量为l o p l 。 标准样品：葡萄糖、半乳糖和麦芽糖( 购于南京赛吉科技有限公司) 。 相同条件下，先测出各种糖的标准样品的出峰时间，然后将提取液样品中经 高效液相色谱仪测出的各个峰与标准样品进行比较，找出与标准样品具有相同出 峰时间的峰，确定样品中所含的可溶性糖组分。 计算某种可溶性糖组分含量，应先绘制标准曲线，配制不同浓度的某种糖的 标准样品，经高效液相色谱仪测定，得到不同面积的峰，根据标准样品的浓度以 及相应峰的面积，可绘制标准曲线，通过提取液样品中测定的某种糖组分的峰面 积，从标准曲线上可查出其浓度，按下式计算糖组分的含量： f ，1 7 可溶性糖组分含量( m g g 。1d w ) = 冬。 l o o o 式中：c ：通过标准曲线求得的糖的浓度( m g l 以) ，v 。：样品提取液的体积( m l ) ， 1 5 w ：样品干重( g ) 。 2 3 3 1 2 环多醇含量测定 主要测定样品中松醇( d p i n i t 0 1 ) 、肌醇( m y o i n o s i t 0 1 ) 两种环多醇。根据 松醇具有极易溶于水的物理特性( m i s r aa n ds i d d i q i ，2 0 0 4 ；吴东儒，1 9 8 7 ) ，对 w e n d e l l 等( 1 9 9 9 ) 的方法进行改进，采用超纯水提取，高效液相色谱仪测定， 提取和测定的方法与可溶性糖组分相同。 肌醇的化学结构不稳定( 吴东儒，1 9 8 7 ) ，采用w e n d e l l 等( 1 9 9 9 ) 的方法， 三甲基硅烷咪唑衍生提取，气相色谱法测定，具体方法如下： 称取冷冻干燥的样品粉末5 0 m g ，加入lm l 5 0 的乙醇7 0 下提取2 h 后， 1 3 0 0 0 r m i n d 离心1 5 分钟，收集上清液，按以上步骤重复三次。将收集的上清液 真空干燥，用1 5 m l 水溶解，用o 2 p m 滤膜过滤，滤液冷冻干燥后，加入l m l 衍生试剂( 三甲基硅烷咪唑和吡啶l ：4 ( v ：v ) 混合) 在9 0 衍生l h 。冷却至室 温，样品待测。 肌醇的测定采用气相色谱法( g c ) 测定。测定条件：美国v a r i a nc p 3 8 0 0 气相色谱仪，检测器为f i d ( 氢火焰离子化检测器) ，检测器温度为2 4 0 ；色谱 柱为c p s i l 8 c b ( 毛细管柱，非极性) ，柱长3 0 m ，内径o 2 5 m m ，柱面厚度l i l m ； 每次进样量为0 5 u l ，分流比lo ：l ；进样口温度( 气化室) ：2 6 0 ；柱温：1 0 0 保持2 m i n ，以1 5 m i n 1 上升到2 6 0 ，最后在温度2 6 0 时保持8 m i n 载气( 流 动相) ：氮气，流速2 o m l m i n d 固定相：5 苯基和9 5 聚二甲基硅氧烷；标样： d p i n i t o l ( 购于美国s i g m a a l d r i c h 公司) 、m y o i n o s i t o l ( 购于美国s i g m a f l u k a 公司) 。 相同条件下( 肌醇采用气相色谱法，松醇采用高效液相色谱法) ，通过两种 环多醇的标准样品先确定它们的出峰时间，然后从提取液样品经气相和高效液相 色谱仪测得的峰中找出与标准样品具有相同出峰时间的峰，则可确定样品中含有 待测的环多醇- 。最后，配制不同浓度的标准样品经测定可得到不同面积的峰，根 据标准样品的浓度及相应的峰面积制作各自的标准曲线，由样品中所测的两种环 多醇的峰面积从标准曲线上求得它们的浓度，按下式计算它们的含量： f 、v v 环多醇含量( m g g 1d w ) = 二生 。 1 0 0 0 式中：c ：通过标准曲线求得的醇含量( m g l 0 ) ，v 。：样品提取液的总体积( m l ) ， v 。：测定时样品体积( m l ) ，w ：样品干重( g ) 。 2 3 3 1 3 膜质过氧化物( 丙二醛，m d a ) 含量测定 采用陈建勋和王晓峰( 2 0 0 5 ) 的方法，研磨提取，硫代巴比妥酸反应法。称 取0 5 9 新鲜针叶，加入0 0 5 m o l l 1 p h = 7 8 的磷酸缓冲液在冰浴上研磨， 4 1 5 0 0 0 r m i n 1 离心1 5 m i n ，上清液定容至5m l 。取上清液1 5 m l 于试管中， 加入o 5 硫代巴比妥酸2 5m l 。混合后于水浴上反应2 0 m i n ，冷却后离心，上 1 6 清液分别在5 3 2 n m 、6 0 0 n m 、及4 5 0 n m 波长下测定吸光度a 5 3 2 、a 6 0 0 、舢5 0 。按 下式计算舞二醛含量。 m d a ( | t m o l l 1 ) = 6 4 5 ( a 5 3 2 a 6 0 0 o 5 6 a 4 5 0 2 4 数据处理与统计分析 试验数据采用m i c f o s o 叠o 嫌c ee x c e l 2 0 0 3 软件编辑和图表处理，采用 s p s s l 3 of o rw i n d o w s 软件中a n o v a 程序作三因素方差分析，d u c a n 程序作 多重比较。 1 7 3 结果与分析 3 1 马尾松苗木针叶内松醇等渗透调节物质含量的动态变化 ， 3 1 1 马尾松苗木针叶内松醇含量的动态变化 言 薯竺 如2 0 羹l o o 5 3 0 7 1 58 1 51 0 1 取样时间 + 一年生苗针叶一二年生苗一年生叶+ 二年生苗二年生叶 图l 马尾松苗木针叶内松醇含量的动态变化 f i g 1d y n a