（微生物学专业论文）一群自生固氮细菌的鉴定.pdf

摘要 本文综述了生物i 古i 氨作川、白生氮菌的主要类群、多相分类技术的研究进展，鉴定了1 3 株 自生崩氮菌，其中包括对曾经被定名的a s l 1 7 6 1 、d s m l 2 7 7 和d s m 2 4 5 7 进行重新鉴定。 论文研究r ：作包括；测定上述细菌的1 6 sr r n a 基因序列、研究其生理生化性状、进行d n a 同 源性分析和系统发育学分析。结果表明a s1 1 7 6 1 、d s m1 2 7 7 和d s m 2 4 5 7 属于a n c y l o b a c t e r ，但 它们之间，以及与该属唯一的种水生微环菌( a n c y l o b a c t e r a q u a t i c u s ) 2 l 间均d n a 同源性小于7 0 。 所以，我们认为这三株菌是该属的三个新种，分别定名为a n c y l o b a c t e r r u d o n g e n s e 、a n c y l o b a c t e r v a c u o l a t u s 和a n c y l o b a c t e r p o l y m o r p h u s 。 同时，我们还研究了从云南士壤中分离到9 株自生固氮菌a s1 3 0 2 5 、a s1 3 0 3 3 、a s1 3 0 3 4 、 a s1 3 0 3 5 、a s1 3 0 3 8 、a s13 0 3 9 、a s1 ，3 0 4 0 、a s1 3 0 4 1 、a s1 3 0 4 2 ，以及从宁夏污水中分离到 一株自生固氮菌a s1 3 8 2 0 。系统发育学分析表明，a s1 3 0 2 5 属于小球菌属( m i c r o c o c c u s ) ，a s1 3 0 3 3 和a s1 3 0 3 4 属于土壤球菌属( a g r o c o c c u s ) ，a s1 3 0 3 5 和a s1 3 0 3 8 属于节杆菌属埘n t h r o b a c t e r ) ， a s1 3 0 3 9 、a s1 3 0 4 0 、a s1 3 0 4 1 和a s i 3 0 4 2 属于红球菌属( r h o d o c o c c u s ) 。d n a d n a 杂交实验 表明a s1 3 0 2 5 为m i c r o c o c c u s 的一个新种，a s1 3 0 3 3 乖1 a s1 3 0 3 4 为a g r o c o c c u s 的一个新种， a s1 3 0 3 8 为a n t h r o b a c t e r 的一个新种，a si 3 0 3 5 与已知种模式菌株的d n a 同源性为6 4 8 ，它 的分类地位有待于进一步确定。a s1 3 0 3 9 、a s1 3 0 4 0 、a s1 3 0 4 1 和a s l 3 0 4 2 属于r h l o c o c e u s r h o d o r o u s 。另外，系统发育学分析表明，a s i 3 8 2 0 属于生丝微菌h y p h o m i c r o b i a c e a e ) ，与其亲 缘关系最近的种为游离臂微菌( a n c a l o m i c r o b i u ma d e t u m ) ，相似性仅为9 2 5 ，它的分类地位有待 进一步研究。 关键词：白生固氮菌1 6 sr r n a 基因序列系统发育学分析d n a d n a 杂交 a b s t r a c t t h em a j o rg r o u p so f f r e e - l i v i n gn i t r o g e nf i x i n gb a c t e r i aa n dr e c e n td e v e l o p m e n to f b a c t e r i a l t a x o n o m i ca p p r o a c hw e r er e v i e w e d i nt h i ss t u d y ，t h i r t e e ns t r a i n so f f r e e - l i v i n gn i t r o g e nf i x i n gb a c t e r i a w e r e i d e n t i f i e d ，i n c l u d i n g a s1 1 7 6 1 ，d s m1 2 7 7 a n d d s m 2 4 5 7 ，w h i c h w a s n a m e ds e v e r a l y e a r s a g o a c c o r d i n g t o p h y l o g e n e t i c a n a l y s i s ，a s1 1 7 6 1 ，d s m l 2 7 7a n d d s m 2 4 5 7 b e l o n g e d t o a n c y l o b a c t e r d n a - d n ah y b r i d i z a t i o ns h o w e dt h a tt h e yw e r et h r e en e w ss p e s i e si n a n c y l o b a c t e r t h e yw e r ep r o p o s e d a s ar u d o n g e m e ，a v a c u o l a t u s a n d a p o l y m o r p h u s ，r e s p e c t i v e l y n eo t h e rs t r a i n sw e r en i n ef r o ms o i la ty u r m a np r o v i n c e o n ef r o ms e w a g ea tn i n g x i ap r o v i n c e p h y l o g e n e t i ca n a l y s i ss h o w e dt h a ta s1 3 0 2 5b e l o n g e dt om i c r o c o c c u $ ；a s1 3 0 3 3a n da s1 3 0 3 4 b e l o n g e dt o a g r o c o c c u s ；a s1 3 0 3 5a n da s1 3 0 3 8b e l o n g e dt o a r t h r o b a c t e r ；a s1 3 0 3 9 ，a s1 3 0 4 0 ，a s 1 3 0 4 1a n d a s1 3 0 4 2 b e l o n g e d t o r h o d o c o c c u s t h e t e s t s o f d n a - d n ah y b r i d i z a t i o n i n d i c a t e d t h a t a s 1 3 0 2 5 w a san e ws p e c i e s i n m i c r o c o c c u s ；a s1 3 0 3 3a n d a s1 3 0 3 4 w e r ean e ws p e c i e s i n a g r o c o c c u s ； a s1 3 0 3 8w a san e ws p e c i e si na r t h r o b a c t e r ；a s 】3 0 3 9 ，a s1 3 0 4 0 ，a s1 3 0 4 1a n da s1 3 0 4 2 b e l o n g e dt or h o d o c o c c u sr h o d o r o u s t h ed n a - d n as i m i l a r i t yv a l u e so f a s1 3 0 3 5w i t ht h et y p es t r a i n o f a r t h r o b a c t e rg l o b i f o r m i sw a s6 4 8 t h et a x o n a m i cp o s i t i o no ft h i ss t r a i nc o u l dn o tb ea c e r t a i ni n t h i ss t u d y i na d d a t i o n , a c c o r d i n gt op h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，a s i 3 0 4 2b e l o n g e dt oh y p h o m i c r o b i a c e a e w i t h9 2 5 s i m i l a r i t yt oa n c a l o m i c r o b i u ma d e t w n t h et a x o n a m i cp o s i t i o no ft h i ss t r a i nn e e dt ob e f u r t h e rs t u d i e d k e yw o r d sf r e e l i v i n gn i t r o g e nf i x i n gb a c t e r i a p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s d n a h y b r i d i z a t i o n a f l p a r d r a b p e r i c i t s l m w l p s m l e e m l s t p f g e p y m s r e p - p c r r a p d t p r a p d r f l p r n a s d s s s c r e p p h y l i f u p g m a u v 缩写词 a m p l i f i e df r a g m e n tl e a g t hp o l y m o r p h i s m a m p l i f i e dr i b o s o m a ld n ar e s t r i c t i o na n a l y s i s b a s e p a i r e n t e r o b a c t e r i a lr e p e t i t i v ei n t e r g e n i cc o n s e n s u ss e q u e n c e s i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r l o wm o l e c u l a rw e i 譬1 1 tr n a l i p o p o l y s a c c h a r i d e m u l t i l o c u se n z y m ee l e c t r o p h o r e s i s m u l t i l o c u ss e q u e n c et y p i n g p u i s e df i e l dg e le l e c t r o p h o r e s i s p y r o l y s i sm a s ss p e c t r o m e t r y r e p e t i t i v ee x t r a g e n i ep a l i n d r o m ep c r r a n d o r e l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a t w o - p r i m e rr a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m r i b o n u c l e i ca c i d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s o d i u mc h l o r i d es o d i u mc i t r a t e r e p e t i t i v ee x t r a g , e n i cp a l i n d r o m i c p h y l o g e n yi n f e t e n c ep a c k a g e u n w e i g h t e dp a i rg r o u pm e t h o dw i t ha v e r a g e s u l “a - v i o l e tl i e - , h t v 中国农业人学博i 等 位论文第一、章文献综述 一、生物固氮与自生固氮 ( 一) 生物固氮的作用 第一章文献综述 氨( n ) 是生命的基础物质一蛋白质和核酸的主要组成元素之一，其含量在生物有机体中居第三 位，约占细胞干重的1 2 1 5 ( 章红，2 0 0 4 ) 。在天然的生态环境中氮往往是重要的生物限制性 营养因素，在农业生产中，被视为衡量土壤肥力的一个重要指标( 周志华等，2 0 0 4 ) 。 地球含氮最多的部分是原生岩( 火成岩) ，占全球总氮量的9 8 ；其次是大气，含总氮量的1 辨6 ； 生物圈( b i o s p h e 哟中所含的氮仅占全球总氮量的约0 0 2 。生物圈是地球表层中的全部生物和适 于生物生存的范围，它包括岩石圈上层、水圈的全部和大气圈下层，其中大部分的氮又被固定在 了海底的有机物和岩石之中( 吴启祥，1 9 8 2 ) 。 在成熟的天然生态系统中，9 0 - 9 7 的氮是在生物圈内循环利用的，各种生物吸收铵( n h 。+ ) 、 硝酸根( n 0 3 - ) 等无机离子，或同化氨基酸等简单的有机小分子化合物构成其机体。而它们死后， 残体又被分解，释放出铵( n h 4 + ) 和氨基酸等营养物质，成为其它生物氮素养料。然而，有些微生 物可以在厌氧环境中以硝酸盐作为电子受体进行厌氧呼吸，将硝酸还原成氮气( n 2 ) 或气态的氨氧 化物，致使每年有3 l o 氨索进入大气，这种现象称为反硝化作用( d e n i t r i f i c a t i o n ) 。由于原生岩 中氮的释放需要漫长的地质过程，所以大气中的氮是补充反硝化损失的唯来源。 大气中含有大量氮气，约占总体积的7 9 ，每公顷土地的上空就有8 5 万吨的n ：。但n ：不能被 动、植物直接利用，需要被固定成铵( n h 4 + ) 、硝酸根( n 0 3 一) 等无机离子，才能被生物细胞同化。 在自然界中，氮气固定的主要途径大致有两条：一是非生物固氮作用：在发生闪电、高温放电等 作用时，n 2 与氧发生反应，形成氨的氧化物，如二氧化氮( n 0 2 ) ，n 0 2 被雨水带到地面或水中后即 成为硝酸( h n 0 3 ) ；二是生物固氮( b i o l o g i c a ln i t r o g e nf i x a t i o n ) 作用：在有些原核生物细胞内含有一 种特殊的酶，称为固氮酶( n i t r o g e n a s e ) ，可以将n 2 还原成铵。据统计，全球每年陆地生物固氮1 4 亿吨，海洋生物固氮0 ，3 6 亿吨，闪电固氨0 0 8 亿吨。这样，大气中的氨又回到了生物圈中，反硝 化造成的缺口得到了弥补( n a r d i ，j b e ta l ，2 0 0 2 ) 。于是，地球上的一部分氮素就在生物圈内部 以及生物圈和大气圈之间形成一个循环，称之为氮素循环( n i t r o g e nc y c ! e ) 。 然而，人类的耕作活动极大地改变了这种循环，据估计，全世界每年收获的农产品从土壤中 带走约i 1 亿吨的氮。而且，随着人口的快速增长和生活水平的提高，氮素的损失也在迅速增加， 仅仅是在我国，3 0 年后我国人口将达到1 6 亿，年需粮食6 4 亿吨f 按人均4 0 0 公斤计算) ，需要向 十壤中补充约0 3 亿吨的氮( 沈世华等，2 0 0 3 ) 。 为了补充十壤中的氮素，提高粮食产量，i 业上以铁为催化荆在2 0 0 5 0 0 标准人气压f 2 1 07 5 i o7 p a ) + l l5 0 0 的赢温r ，t l j 氮气和氢气合成氨气，然后埘氨进一步合成各种氮肥。但是目前 全球每年合成氮肥的总产量折合成氮素只有0 7 7 亿吨( n a r d i ，j b e t a l ，2 0 0 2 ) ，远远不能弥补人 类造成的损火，而如果继续火幅度增加j 业合成氮肥的量将会带来诸多环境和财政方面的压力： 其一，建设化肥j ：厂需要昂贵的设备，投入巨额资金，例如为满足2 0 3 0 年时我国对氮肥的需 要，至少还要新建年产3 0 万吨尿素厂3 0 0 座，耗资上千亿元( 沈世华等，2 0 0 3 ) 。 中国农业人学博i ：学位论文第一章立献综述 其一 l ：业合成氮肥的过群会对自然环将造成污染，尤其是我国的小型氮肥企业一艺没各陈 旧，不仅对环境污染严重，而且耗能很高。以天然气、成品油和煤炭为原料的尿素装置能耗比国 外分别高2 0 、2 5 、7 5 。 其二，使川时，合成氮肥的损失率较高：这些氮肥中的有效成分多是无机氮( i nn h 4 + 、n o ，一 等) 或尿素，它们被施用后，迅速溶解在土壤的水溶液中，容易随地表径流转移，或随雨水淋火进 入地f 水。同时，氨态氮除可流失外，还容易挥发；硝态氮经土壤微生物的反硝化作用，可以将 n 0 3 转化成n 2 或氨的氧化物等气体，重新进入空气。据报道，尿素的损失率一般在2 6 5 , - 一4 3 9 ， 晟高可达8 5 0 。因为这个原因，2 0 世纪8 0 年代中期以来，我国的化肥产景和施用量持续增加， 但粮食总产量没有明显提高( 朱兆良，1 9 9 9 ；朱奇等，2 0 0 3 ) 。 其四，氮肥施用后，有一部分损失的氨素会进入河流、湖泊或地下水中，造成富营养化，从 而引起环境污染。在微生物的作用下，还有一部分氮肥中的氮素会转化成亚硝酸盐( n 0 2 _ ) ，这种 物质除了对植物产生毒害作用、污染地下水外，还会在一些农产品中富集，人和动物食j 【f = | 后，可 导致血液输氧能力降低，并引起癌变。此外，土壤中的微生物还会将部分氮肥中的氮转化成气态 的氮氧化物，造成对空气的污染，例如氧化二氮( n 2 0 ) 是一种温室气体，还有破坏臭氧层的作用( 朱 兆良，1 9 9 9 ；朱景双等，2 0 0 4 ) 。 于是，人们越来越多地关注生物固氮的重要地位，全球每年的固氮量为2 6 亿吨，其中生物闹 氮量为1 7 6 亿吨。可见，生物固氮是供应土壤、水体及农业氨素需求的一条重要途径。同时，与 工业固氮相比生物固氨有着明显的优点f 谢明杰等，2 0 0 0 ) ： 第一，生物固氮是在常温常压下进行的，成本低，且固氮过程中不会产生污染环境的有害物 质。 第二，与化学氮肥相比，生物固定的氮释放进入土壤是一个持续的过程，因而流失速度慢， 利用率高，损失率低，后效较长。如生物固定的氮在水稻上的损失率仅有4 1 7 4 。 第三，正是由于上述特点，生物固氮对环境的污染很小，这是化学氮肥所无法比拟的。 因此，增加生物固氮的总量，适当控制化学氮肥的用量，对生态环境的保护和农业的可持续 发展有着非常重要的意义。 然而，虽然我国传统耕作过程中就采用过豆科植物与其它作物轮作、套种等手段增加土壤中 氮素营养的含量，但至今进一步增加生物固氨总量的措施尚处于研究或试用阶段( 沈世华等， 2 0 0 3 ) 。究其原因，主要在于人们尚不能彻底了解各种生态环境中生物固氮各个环节详细机制，所 以，继续探明同氮微生物的资源，加强对各种固氮生物的基础研究，才有可能从根本上解决这一 难题。 ( 二) 生物固氮的体系和固氮微生物 迄今为r ，白然界中发现的l 州氮生物( d i a z o t r o p h ) 都是原核生物，它们营养和生活方式多种多 样，既有臼养的，也有异养的，既有营光能营养的，也有营化能营养的分散在细菌平占菌的许 多科、属之中。 按生活方式来分，嘲氮生物可分为自生崮氮菌( f r e e l i v i n gn i t r o g e n f i x i n gb a c t e r i u m ) 和l 共生问氮 i 省( s y m b i o t i cn i t r o g e n - f i x i n gb a c t e r i u m ) 。共生同氮微生物一般是在和其它生物紧密地生活在一起， 2 中国农业人学博i 。学位论文第一章文献综述 并形成特殊共生结构时，才进行闻氯。这种l 古| 氮作州( 或体系) 就称之为共生同氮作用( 或系统) 。而 臼生 i i i l 氮微生物通常在自然环境或培养基中独立生活时，就能崩定分子态氮，将其还原为氨。它 们的洲氮作州( 或体系) 就称之为自生嘲氮作川( 或系统) 。有些自生洲氮曲可以定植丁植物的根际 ( r h i z o s p h e r e ) 或体内，与宿主之间存在着互剥关系，并有定的特异性，这些微生物删定氨气的体 系( 或作用) ，称之为联合同氮系统( 或作用) ( a s s o c i a t i v en i t r o g e nf i x a t i o n ) 或内生固氮系统( 或作用) ( e n d o p h y t i cn i t r o g e nf i x a t i o n ) 。 1 共生固氮体系 研究最为成熟的共生固氮体系有：根瘤菌一豆科植物共生固氮体系、满江红蓝细菌 ( c y a n o b a c t e r i a ) 共生固氮体系、弗兰克氏菌( 凡嘛幻卜一非豆科植物共生固氮体系。 根瘤菌( r h i z o b i a 卜一豆科植物共生周氮体系 根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性腐生细菌，主要和对应的豆科植物共生，进行 固氮。当与豆科植物根部接近时，植物分泌的黄酮类化台物可以激活根瘤菌调节基因n o d d 的产物， 经过复杂的分子对话，在宿主植物凝集素和根瘤菌粘附素( r h i e a d h e s i n ) 、胞外多糖的共同作用下， 根瘤菌附着于豆科植物根部( f r a y s s e ，n e la l ，2 0 0 3 ) 。然后，从宿主植物根毛的尖端钻入豆科植 物的皮层中，并在皮层中大量繁殖。皮层细胞受到根瘤菌分泌物的刺激，也迅速分裂，把根瘤菌 包围在中央，形成一个个小根瘤。根瘤中根瘤菌的形态多与其在宿主体外的形态不同，称为类菌 体( b a e l e r i o d ) 。这时，豆科植物供给根瘤菌矿质元素、水、有机物等营养物质；而根瘤菌则可利 用细胞内的固氮酶将空气中游离态的氮还原成n h 4 + 态氮供豆科植物利用( p r e s c o t t ，l m 甜a ， 2 0 0 5 ) 。 这是自然界固氮效率很高的一个体系，该体系广泛分布于地面各处。据估计，其年固氮量约 占各种生物固氮体系总量的5 0 ，大大超过世界化工合成氨产量的总和，成为农业生产的主要氮 源。豆科植物共有1 9 7 0 0 多种，分属三个亚科。目前，对其共生固氮体系进行过研究的只占豆科 植物种数的0 5 。我国在共生固氮方面也进行了大量的研究，新发现结瘤豆科植物3 0 0 种，并经 多相分类研究，确定了根瘤菌新属2 个、新种1 6 个。不少国家，特别是美洲国家，积极发展种植 苜蓿、大豆( 播种面积在美国约占总播种面积5 0 v o 以上) ，以发挥生物固氮作用，减少化学氮肥施 用量，取得了明显经济效益( 慈恩等，2 0 1 ) 4 ) 。 弗兰克氏菌与非豆科植物共生体系 弗兰克氏菌是放线菌中的一个属，在固体培养基上生长缓慢，给研究带来困难。目前弗兰 克氏菌的分类鉴定仍处探索研究阶段，世界上只公认了一个属的存在，还没有确定的种名( 周志宏 等，1 9 9 7 ：i ! i i j 传炯等，1 9 9 7 ) 。 弗兰克氏菌可以与小本植物的乔小或滞术共生结瘤崩氮，尚术发现单子叶草本植物能够作为 该菌的宿主，其原冈不明。与弗兰克氏菌共生同氮的宿主较多，宿主植物间的亲缘关系较远，跨 越了多个不同科、属。而且这些宿主植物分布丁较为广泛的生态地域和十壤类型，其中包括耐干 早的沙棘，耐水湿的赤杨，耐盐碱的术麻黄，耐酸性的杨梅等。到1 9 9 0 年，全球已发现弗兰克氏 卤的宿主有7 个目8 个科2 4 个属2 2 3 个种。8 个科是栉术科、杨梅科、鼠李科、胡颓子科、马桑科、 木麻黄科、蔷薇科、打提加科。我国己调查到的与弗兰克氏菌共生的树种有8 个科8 个属的8 8 个种 中周农业人学博i 学位论文笫一章文献综述 ( 陈启锋等，1 9 9 8 ) 。 弗二：克氏菌与宿主间的共生关系的专一性，没有根瘤苗与豆科植物间那么严格。许多试验表 明，同一种弗兰克氏菌可以侵染不同科、属、种的宿主植物。该菌的侵入机制冈宿主的科属种类 而异，可由根毛域表皮细胞间隙侵染。有些弗兰克氏菌，如以胡颓子为宿主的一些种可以两种方 式进行侵染。弗兰克氏菌的同氮能力与根瘤菌不相上下，但由下具有孢囊、顶囊等结构，该菌的 抗逆性较强，崮氮体系固氮持续时间长( 陈启锋等，1 9 9 8 ) 。 满江红鱼腥藻共生固氮体系 满江红( a z o l l a ) ，又名红萍，是类水生蕨类植物，属满江红科，满江红属，可分为两个亚属， 共7 个大种。通常，其叶腔内会存在一种与之共生的蓝细菌满江红鱼腥藻“n a b a e n aa z o l l a e ) 。 在满江红形成孢子果期间，鱼腥藻进入满江红孢子果内并萌发出新藻丝，开始新的共生世代。鱼 腥藻能固定空气中的游离氮，供满江红作氮源，而满江红则为鱼腥藻提供糖类，作为碳源( 陈坚等， 2 0 0 1 ) 。 满江红共生体固氮能力较强，其固氮量通常可达1 5 0 0 0 0 k g ，l l m 2 ，i n 楸j 4 5 0 k g h m 2 。我国是世 界上养殖、利_ f ； j 红萍最早的国家之一。在水稻田里放养红萍，既能增加土壤中生物氮数量，又能 提高水稻的产量。因此，红萍这种蕨类植物与蓝藻的共生固氮体引起世界各国的普遍重视( 慈恩等， 2 0 0 4 ) 。 2 联合同氮和内生固氨 1 9 7 4 年，d 6 b e r e i n e r 等在研究禾本科热带牧草和固氮螺蔚( a z o s p i r i l h t m ) 形成的固氮系统时，认 为固氮螺菌大多定植于植物根表的粘质层或粘质鞘中，少部分侵入根的皮层或中柱内，靠根系分 泌物生存繁殖，与植物根系有密切的关系，但并不形成共生组织，形成一种“原始”的共生，是 介于根际自生固氮与结瘤固氮之间的过渡类型，称为“联合共生固氮作用( a s s o c i a t i v es y m b i o t i c n i t r o g e nf i x a t i o n ) ”( b a l d a n i ，j i “a ，1 9 9 7 ) 。现多叫作“联合固氮”。 随着，植物内生菌研究的兴起，人们分离到了许多内生的固氮菌，其中有些只能从植物体内 分离得到。于是，1 9 9 7 年，b a l d a n i 等进一步根据菌体是否能在植物体内定植，将固氮菌划分为根 际固氨菌( r h i z o s p h e r ed i a z o t r o p h s ) 和内生固氮菌( e n d o p h y t i ed i a z o t r o p h s ) ，再根据是否能在植物体表 面或士壤中生存，将后者分为兼性内生固氮菌( f a c u l t a t i v ee n d o p h y t i cd i a z o t r o p h s ) 和专性内生固氮 菌( o b l i g a t ee n d o p h y t i cd i a z o t r o p h s ) ( b a l d a n i ，j i p f a ，1 9 9 7 ) 。 根际周氮菌 根际或译为根圈( r h i z o s p h e r e ) 是指受植物根系生陡影响，在物理、化学和生物特性上不同丁原 十体的十壤微域，一般包括从根表到离根1 - 4 毫米的十层。这是植物十壤微生物三者相互作用的 场所，也是箐种养分、水分和有益或有害物质进入根系参与食物链物质循环的门户，是一个特殊 的生态系统。在这个微域内，微生物的数鲑远远高丁十体。 根际i 叫氮菌指定植丁宿主植物根际的所有问氮细菌，它们通常很少进入根内。这类同氮菌主 要包括雀稗删氮菌( a z o t o b a c t e r p a s p a l i ) 、贝捷林克氏同氮菌( b e i j i e r i n c k i as p p ) 等。许多研究表明， 它们不仅为植物提供氮素营养，而且还能产生激素，促进植物的生长，网此也将这类菌归为根圈 4 中周农业人学博l 等 位论文 第一章文献综述 促生细菌( p l a n tg r o w t hp r o m o t i n gr h i z o b a c t e r i a ) ( 张丽梅等，2 0 0 4 ；田颖等，2 0 0 5 ) 。 b o d d e y 等发现，在雀稗嗣氮菌与一种百喜草( p a s p a l u mn o t a t u m “b a t a t a i ) 的联合共生系统中， 植物每年可通过生物崩氯积累氮素2 0 k g ，1 1 m 2 ，且这种联合共生关系具有严格的专一性。但参与这 种专一性联合共生关系的化合物还不清楚，推测可能类似于根瘤菌一豆科植物共生关系中的分子 信号( 张丽梅等，2 0 0 4 ) 。 内生固氦菌 内生固氨菌是指那些能够定植在植物体内，包括地上部分和根内，而与宿主植物联合固氮的 固氢菌。它们的来源之一是种子和无性繁殖材料( 块根、块茎等) 。另一个来源是根围和叶围，其 中主要是根围。根据内生固氮菌的特点不同，又可分为兼性内生固氮菌和专性内生固氮菌两类( 张 丽梅等，2 0 0 4 ；田颖等，2 0 0 5 ；安千里等，1 9 9 9 ) 。 a 兼性内生固氨菌 这类固氮菌既能定植于宿主植物体内，也能在根表和土壤中生活，主要为固氮螺菌属 ( a z o s p i r i l l u m ) 的细菌。该属细菌分布广泛，能与许多寄主联合固氮，目前已分离鉴定出的有5 个种： 产脂固氦螺菌即l i p o f e r u m ) 、巴西固氮螺菌“b r a s i l e n s e ) 、亚马逊固氮螺菌0 a m a z o m e n s e ) 、伊 拉克固氮螺菌叫i r a n k e n s e ) 、高盐固氮螺菌“h a l o p r e f e r e n s ) 。 b 专性内生固氮菌 这是一类具有独特生理生化特征的固氮菌，在土壤中不能生存或生存能力很差，而以相当高 的数量存在于植物组织内。它们主要从寄主植物的自然开口( 排水口、气孔、皮孔) 、根表皮细胞 或次生根形成点细胞间隙感染植物，经木质部扩散至植株上部，可为宿主提供相当数量的氮素。 该类群包括重氮醋酸固氮菌卅c e t o b a c t e rd i a z o t r o p h i c u s ) 、固氮弧菌( a z o a r u ss p p ) 、织片草螺菌 ( h e r b a s p i r i l l u ms e r o p e d i c a e ) 、红苍白草螺菌( h e r b a s p i r i l l u mr u b r i s u b a l b i c a n s ) 、伯克霍尔德氏菌 ( b u r k h o l d e r i as p p ) 等。 不过，参与联合固氮的细菌在无氨培养基上大多有同氮活性，在自然界中，其固氮作用大小 极易受外界环境因素( 氧、铵、温度等) 的影响，因此大部分文献认为联合固氮的细菌是自生固氮 菌的特倒。 联合固氮体系中的植物主要是光合效率较高的c 4 植物，有很多是重要的粮食作物，如玉米、 高粱、甘蔗、黍等。近年来有研究表明甘蔗体内的内生固氮菌，它们生活在植物体内，可为植物 提供高达6 0 的氮素；另外，g h o n s i k a r 等用同氮螺菌接种高粱，结果发现，两者可形成联合固氮 体系，使高梁根的重量增女n 2 9 ，根的体积增加3 9 ，籽粒增产1 8 。虽然总的来讲，联合固氮 的效率比起共生固氮来要低得多，但多数学者认为它们固氮潜力很大，因此发掘和利用联合固氮 菌是目前的研究热点之一，研究方向主要有：从自然界分离筛选获得广谱高效固氮菌株，应1 l f ；j 基 冈：程构建耐铵、泌铵型联台闶氮菌，诱导禾本科植物形成l 司氮撤瘤，充分发挥植物内生甫| 氮菌 的优势等。 3 自生固氮 白生圊氮微生物是能够在自由生活状态下固氮的微生物总称。在自然界，自生i 州氨微生物种 类很多，分散地分布在原核生物不同的科、属和不同的生理群中，大致可以分为光合细菌利非光 5 中周农业大学博i ：学位论义 箝一章文献综述 合细菌两类。前者如红螺菌( r h o d o s p i r i l l u m ) 、紫色硫细菌( p u r p l es u l f u rb a c t e r i a ) , 和l 绿色硫细菌( g r e e n s u l f u r b a c t e r i a ) 等，其中的某些种类可与其它微生物联合而相互有利。后者的种类很多，根据非光 合自生嘲氮菌对氧的需求，可以分为厌氧的细菌如梭状芽胞杆菌( c l o s t r i d i u m ) ；需氧的细菌如a 生f i l i i 氨菌( a z o t o b a c t e r ) 、贝捷林克氏i 矧氮菌( b e i j e r i n c k i a ) 、矧氮螺菌叫z o s p i r i l l u m ) 等：以及兼性细 菌如多粘类芽胞杆菌( p a e n i b a c i l l u s p o l y m y x a ) 、克雷伯氏杆菌( k l e b s i e l l a ) 、肠杆菌( e n t e r o b a c t e r ) 等。 如上所述，自生固氮微生物中的某些种类，在有些情况下可以与植物进行联合同氮，但我们这里 主要讨论独立的固氦作用( 新楠等，2 0 0 5 ) 。 在土壤中，对于光合细菌来说，光能是其固氮能量的主要来源，因此它们的围氮活性受环境 光照强度的影响很大。对于异养细菌，其固氮的能量来源是有机质，它们的数量和固氮活性依赖 于土壤有机质的含量。而温暖、潮湿的热带地区，固氮生物的数黄和活性比较高，则是有机质含 量、温度、湿度共同影响的结果。此外，氧气的含量对固氦微生物的种类有选择作用，浸水的士 壤和草地中氧含量低，梭菌常是优势菌。 不过，一般地，当自生固氮微生物固定的氮素满足本身生长繁殖需要以后，就不再固氮了， 多余的氮反过来会抑制它们自身的固氮系统。同时，它们固氮效率也比较低，据测定，每消耗l 克碳水化合物，自生固氦微生物固定l o 毫克氮，而共生固氮的根瘤菌则可以围定2 7 0 毫克氮。所 以，这个类群的微生物每年的l 司氮积累量仅为5 也5 k 舯m 2 ，从这个角度衡量，对作物氮素供应的 贡献不大。 但自生固氮菌不需与其它生物联合即能固氮，在营养贫瘠的地区，或没有植物生存的环境中， 它们就是唯一的固氮生物，对天然生态系统的氮素循环、增加土壤的肥力有非常重要的作用。此 外，自生固氦具有条件宽、适应性广的特点，而且还能产生一些促进植物生长的激素，现在的一 些氮肥菌剂中即含有自生固氮菌( 毕永红等，2 0 0 3 ) 。 在海洋中，尤其是远海，每升水中n 元素的含量高达8 0 0 p g ，而硝态氮和氨态氮的含量不足 o 2 5 p g ，非常有利于固氨作用的进行，如前所述。每年海洋生物固定的氮为0 3 6 亿吨。目前在那 里已发现了多种自生的蓝细菌，如浮游型的束毛蓝细菌( t r i c h o d e s m i u m ) 、假膜蓝细菌 ( k a t a g n y m e n e ) 、聚球蓝细菌( s y n e c h o c o c c u s ) ，深水型的念珠蓝细菌( n o s t o c ) ，附着在基质上的：1 ，球 蓝细菌( n o d u l a r i a ) ，还有夜间固氮的蓝丝菌( c y a n o t h e c e ) 和e r y t h r o s p h a e r am a n n a 等，但绝大多数 尚未进行深入研究( z e h r ，j p ，2 0 0 0 ；侯建军等，2 0 0 5 ) 。 总之，在许多a 然的生态系统中，自生固氮均有着不可替代的重要作用。虽然过去人们对此 知之甚少，但近年来，自生固氮已越来越多地受到各方面的重视，成为固氮领域的研究热点之一。 对自生固氮的研究不仅有助于我们更深入地了解我们所处的环境，以及面临的环境问题，而且还 将成为我们改善环境的t 具。 二、自生固氮菌的主要类群 近年米建立的测定l 捌氢酶活性的乙炔还原法币l 通过d n a ，d n a 杂交检测胡氨酶结构基冈的方 法，使得人鼙的嗣氮菌种类得以确定。已知有2 0 0 个原核生物属具有闹氢的特性。在某些属、种 中，如白生l 嗣氮菌( a z o t o b a e t e r ) ，【i l i | 氮能力是一个普遍特性；而在另外一些属、种中，只有一部 分种和菌株具有嘲氮能力，如肺炎克雷伯氏杆菌( 魄h 如如p ”p d h 缸p ) 的菌株只有3 0 具有同氮 6 中旧农业人学博l ：学位论文第一章 文献综述 能力，多粘类芽胞杆菌( p a e n i b a c i l l u sp o l y m y x a ) 的卤株只有8 0 具有同氮能力。m c e w a n 等测试 了8 个属中嘲氮与不崩氮种的g + cm o l ，发现在同一个属内州氮的种比不同氮的种的g + cm o l 高。 影响嗣氮菌数量和分布的环境田索主要是碳源、能源、已被嘲定的氮、p h 值、湿度及微鼙元 素。只有在环境中可利朋氮贫乏且p 0 2 适宜的条件f ，自生同氨菌才能够固氮。由于需要大量 的有机碳源和能源，好氧的自生固氮菌对农作物的氮源的输入是有限的，但在自然环境中，自生 固氮菌对维持肥力起到了重要的作用，并对植物生长起到了刺激作用。值得一提的是能够进行光 合作用的蓝细菌，它不需要大量的有机碳源和能源，即可进行自生固氮，因而对农作物具有重要 作用。 表1 j 主要自生固氮菌一览表 类型属 种( 例举) c l o s t r i d i u m c p a s t e u r i a n u m ，cb u t y r i c u m ，ci d u y v e r i 严 m r m o a n a e r o b a c t e r i u mr t h e r m o s a c c h r o l y t i c u m 格 d e s u l f o v i b r i o d v u l g a r b ，d ，d e s u 妇r i c a n s 厌d e s u l f o t o m a c u l u mdr u m i n i s , dn i g r i f i c a n s 养 d e s u l f o b a c t e r n p o s t g a t e i , nl a t u s 1 2c u l v a l u $ 细 菌 d e s u l f o s p o r o s i n u s d o r i e n l t s d e s u l f o m i c r o b i u m z lb a c u l a f l f m t h e r m o d e s u 怕妇c t e r i u mzt h e r m o p h i l u m k l e b s i e i l a 置o x y t o c a 兼 e n t e r o b a c t e rea g g l o m e r a n s 性 厌氧c i t r o b a c t e rc 触u n d i i 厌 氧 时e s c h e r i c h i aei n t e r m e d i a 细 固氮 b a c i l l u s 丑p o l y m y x a ，b r t l 口c e t a n $ 菌 p a e n i b a c i l l u spb r a s i l e n s i s p r o p i o n i b a c t e r i u m ps h e r m a n i i , pp e t e r s o n i i x a n t h o b a c t e r x f l a v u s t h i o b a c i l l u s t f e r r o o x i d a n s a z o a r c u $ 彳a n a e r o b i u s a z o h y d r o m o n a s a a u s t r a l i c a ak l a a z o n e x u $4 f u n g i p h i l u s a z o s p i r a a o r y z a e a z o s p i r i l l u m a a m a z o n e n s e a z o v i b r i oar e s t r i c t i t s 一4 q u a s p i r i l l u mp e r e g r i n u m 微好氧时g l u c o n a c e t o b a c t e rg d i a z o t r o p h i c u s 好 固氮 m e t h y l o c a p s a m a c i d i p h i l a 氧m e t h y l o s i n u s腥t r i c h o s p o r i u m 细 m e t h y