（发育生物学专业论文）甘蔗内生固氮菌的分离鉴定及16srrna基因克隆和序列分析.pdf

摘要 摘要 本文首先用无氮培养基从福州甘蔗栽培品种的根部进行内生固氮菌的分离、纯 化和筛选，并采用乙炔还原法对这些菌株进行固氮酶活性测定；其次对分离出的菌 株进行生理生化指标测定和1 6 sr r n a 基因克隆和序列分析；同时研究了在不同环境 因子作用下少动鞘氨醇单胞菌的生长特性；最后，采用三亲交配法将n o h - g f p 融合荧 光蛋白标记基因导入固氮菌少动鞘氨醇单胞菌，将其回接到甘蔗中，利用激光共聚 焦扫描显微镜对其进行了观察。 研究结果表明：实验分离到了1 2 株形态大小、质地各异的菌株；固氮酶活性测 定结果显示6 株固氮酶活性较高，其中少动鞘氨醇单胞菌固氮酶活性为最高；在对1 2 株菌1 6 sr r n a 基因的序列分析的基础上，建立了系统发育树，确定了菌株分类学地 位及进化亲缘关系；在不同环境因子作用下，少动鞘氨醇单胞菌在生长时对这些处 理有较广的适应性，对温度和p h 的适应范围较大，在1 5 4 0 ，p h 4 5 9 0 范围内均能 生长，并且具有很强的耐铵能力，而且对高渗透压环境也有很强的适应性；显微观 察表明固氮菌主要定殖在甘蔗根的内皮层细胞，回接结果显示接种少动鞘氨醇单胞 菌的甘蔗苗与未接菌的对照相比，株高提高了8 7 1 9 ，鲜重增加了1 1 9 8 8 。 关键词：甘蔗内生固氮菌，分离，鉴定，基因克隆，序列分析 中文文摘 中文文摘 甘蔗是热带、亚热带禾本科c 4 植物，是主要的制糖原料，也可以用它生产工 业酒精。世界上甘蔗种植面积最大的国家是巴西，其次是印度，中国位居第三，在 中国主要分布在广西、广东、福建、台湾、四川、云南、江西、贵州、浙江、湖南、 湖北等省份。 氮元素是空气中的主要成分之一，游离型的氮气不能被大多数生物直接利用， 必须还原成氨类化合物才能被生物所利用，在这个生化反应过程中生物固氮发挥了 重要作用。生物固氮占地球上固氮总量的9 0 ，对维持地球生态平衡有着重要意义。 除了豆科植物，目前在甘蔗、玉米等作物上也发现了有固氮微生物存在。利用固氮 生物的白生固氮能力进行固氮，不仅提高固氮效率，而且可以节省大量能源。甘蔗 是南方地区的经济作物，种植面积非常大。对生物固氮进行研究，对于缓解能源短 缺和解决农业生产中造成的环境污染等问题，具有重要意义。如果能在甘蔗体内分 离出固氮能力强的固氮菌，并对其进行研究，构建出工程菌株，对于解决当前农业 生产的实际问题开辟了一个新的途径。 国内外学者在内生固氮菌的研究中，已经取得了很多有意义的进展。1 9 8 6 年 b a r b a r a 从卡拉草内分离到了固氮弧菌( a z o a r c u ss p ) ，可用于牧草生产中；1 9 8 7 年巴 西d o b e r e i n e r 实验室从甘蔗体内分离到醋酸固氮菌( a c e t o b a c t e ri a z o t r o p h i c u s ) ，该菌 株具有非常高的固氮能力，可以提供甘蔗生产中五分之三的氮元素；我国学者在水 稻和玉米内生固氮菌的研究中，做了大量工作，1 9 8 1 年丘元盛等从广东水稻根中分 离出粪产碱菌和阴沟杆菌，尤崇杓对它们的生理特性及其与水稻的相互作用开展了 深入研究，采用分子生物学方法构建了水稻固氮工程菌株。 前人的研究工作给我们很多重要启示，我们从福州本地现有主要甘蔗栽培品种 的根部进行固氮菌的分离，纯化得至i j l 2 株形态大小质地各异的菌种，用乙炔还原法 测定菌种固氮酶活性，获得6 株酶活较高的菌株。对分离出的菌株进行生理生化指标 初步鉴定；用分子生物学技术对这些细菌的1 6 sr r n a 基因进行克隆，并对基因序 列进行了分析，建立了系统发育树，在进化上确立了菌株间的亲缘关系。1 6 sr r n a 基因序列分析结果与生物梅里埃公司w i p e k 3 2 鉴定仪生理生化测定结果以及形态 学观察的结果一致，且经判定这些菌株均是属于固氮菌属。将1 2 株菌的1 6 sr r n a 基 因序列提交至l j g e n b a n k 数据库，获得了序列号：e u 9 3 1 5 4 8 、e u 9 3 1 5 4 9 、e u 9 3 1 5 5 1 、 v 福建师范大学硕士学位论文 e u 9 3 1 5 5 2 、e u 9 3 1 5 5 3 、e u 9 3 1 5 5 5 、e u 9 3 1 5 5 7 、e u 9 3 1 5 5 9 、e u 9 3 1 5 6 0 、e u 9 3 1 5 6 1 、 e u 9 3 1 5 6 3 、e u 9 3 1 5 6 4 。从甘蔗根部分离鉴定到了1 0 个种属的固氮菌：铜绿假单胞 菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 、短芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b h l i s ) 、嗜麦芽糖寡养单胞菌 ( s t e n o t r o p h o m o n a sm a l t o p h i l i a ) 、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a ss p p n e u m o n i a e ) 、巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) 、成团泛菌( p a n t o e aa g g l o m e r a n s ) 、 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、恶臭假单胞菌( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) 、藤黄微球 菌( m i c r o c o c c u sl u t e u s ) 、少动鞘鹌鹑单胞菌( s p h i n g o m o n a s p a u c i m o b i l i s ) 。 我们还对温度、酸碱度、铵盐浓度、蔗糖浓度、渗透压等不同环境因子处理下 固氮菌的生长特性进行了研究。研究结果表明在无氮源的条件下，少动鞘氨醇单胞 菌对环境因子都有较广的适应性，对温度和p h 的适应范围较大，在1 5 4 0 ，p h 4 5 9 0 范围内均能生长，且具有很强的耐铵能力，对高渗透压环境都有很强的适应性。 基于少动鞘氨醇单胞菌对不同环境条件表现出的广泛适应性，采用三亲交配法 将n i f l - i - g f p 标记基因导入少动鞘氨醇单胞菌中，用该固氮菌回接甘蔗植株，对感染 细菌的甘蔗根进行激光共聚焦扫描显微镜观察，发现少动鞘氨醇单胞菌主要分布在 蔗根内皮层细胞。回接结果显示接种少动鞘氨醇单胞菌的甘蔗组织培养苗与未接菌 的对照相比，从植株的鲜重来看，接种菌后其甘蔗组培苗的鲜重要较对照组要高 1 1 9 8 8 ，实验组植株鲜重与对照组呈极显著性差异，其p = o 0 0 7 0 0 1 ，由此说明， 接种菌液对植株的鲜重具有极显著性的影响。而从植株的株高来看，接种菌后其甘 蔗组培苗的株高要较对照组要高8 7 1 9 ，实验组植株株高与对照组相比呈显著性差 异，其p = o 0 2 3 0 0 5 ，由此说明，接种菌液对植株的株高具有显著性的影响。此外， 接菌盆栽苗4 2 天后，对照组株高平均增加量为1 1 2 7 c m ，而实验组平均增加高度为 2 7 5 c m ，其p = 0 0 2 5 0 0 5 ，对照组与实验组之间差异显著，说明固氮菌对甘蔗苗生 长具有促进作用，这与接菌对甘蔗组培苗的影响结果相一致。由于时间的限制，对 接种固氮菌后盆栽苗长势的研究只是阶段性和初步的，还需要进一步的实验加以证 实。这些结果将为固氮微生物在农业生产上的应用研究提供理论依据。 a b s t r a c t a b s t r a c t t h es c i e n t i f i cr e s e a r c hw o r kw a sc a r r i e do u ti nt h i sp a p e r f i r s to fa l l ，t h ee n d o p h y t i c d i a z o t r o p h i cb a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o mt h er o o t so fs u g a r c a n e ，t h en a t i v es p e c i e si n f u z h o u ，f u j i a np r o v i n c eo nt h en i t r o g e n f r e em e d i a ，t h e nt h e yw e r ep u r i f i e d ，s c r e e n e d a n di d e n t i f i e d ，t h ed e t e r m i n a t i o no ft h e i rn i t r o g e n a s ea c t i v i t yw a sc a r r i e do u tb yt h e d e t e c t i o no fa c e t y l e n er e d u c t i o na c t i v i t y ；t h es e c o n d ，t h ed e t e r m i n a t i o no ft h e i r p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lp r o p e r t i e sw a sp e r f o r m e d ，t h e i r16 sr r n ag e n e sw e r e c l o n e da n dp h y l o g e n e t i ca n a l y z e d ；t h et h i r d ，t h e i rg r o w i n gp r o p e r t i e st r e a t e dw i t ht h e d i f f e r e n te n v i r o n m e n t a lf a c t o r sw e r es t u d i e d；f i n a l l y , t h ep l a s m i d s c o n t a i n i n gt h e r e p o r t e rg e n e 咖f u s e dt ot h ep r o m o t e rn f l - 1w e r ei n t r o d u c e di n t o t h ed i a z o t r o p h ， s p h i n g o m o n a sp a u c i m o b i l i sb yt r i p a r e n t a lc r o s s i n g ，t h ec o n j u g a t e dd i a z o t r o p h i cb a c t e r i a w e r ei n o c u l a t e di n t ot h er o o t so fs u g a r c a n e ，a n dt h eo b s e r v a t i o nu n d e rt h ec o n f o c a ll a s e r s c a n n i n gm i c r o s c o p e w a sa l s om a d e t h er e s u l t sw e r es h o w na sf o l l o w s ：t h e1 2s t r a i n sw i t ht h ed i f f e r e n ts h a p e sa n d s t r u c t u r ew e r eo b t a i n e d ；t h er e s u l t so ft h e i rn i t r o g e n a s ea c t i v i t yi n d i c a t e dt h a tt h e a c e t y l e n er e d u c t i o na c t i v i t yo ft h es i xs t r a i n sw a sh i g h e rt h a nt h eo t h e r s ，a m o n gt h e mt h e h i g h e s ta c e t y l e n er e d u c t i o na c t i v i t yw a ss p h i n g o m o n a sp a u c i m o b i l i s ；o nt h eb a s i so ft h e a n a l y s i so f16 sr r n ag e n e si nt h e s ed i a z o t r o p h i cb a c t e r i a , t h ep h y l o g e n e t i ct r e ew a s e s t a b l i s h e da n dt h e nt h es p e c i e sa n dt h ee v o l u t i o n a r yr e l a t i o n s h i pa m o n gt h e mw a sc l e a r ； t h es t r a i ns p h i n g o m o n a sp a u c i m o b i l i sh a daw i d e ra d a p t a b i l i t yt r e a t e dw i t hd i f f e r e n t e n v i r o n m e n tf a c t o r s ，f o re x a m p l e ，a tt h er a n g eo f1 5 - 4 0 ( 3a n dp h 4 5 9 0 ，t h eb a c t e r i a c o u l dg r o w ，m o r ei m p o r t a n t l y , t h e yh a das t r o n ga d a p t a b i l i t yo no s m o t i cp r e s s u r ea n d s h o w e dg r e a tt o l e r a n c eo nt h em e d i aw i t ht h eh i g hc o n t e n t so fs o d i u mc h l o r i d e ；t h e r e s u l t so ft h eo b s e r v a t i o nu n d e rm i c r o s c o p ei n d i c a t e dt h a td i a z o t r o p h i cb a c t e r i am a i n l y e x i s t e di nt h ec o r t e xc e l l s ，t h ed a t aa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eh e i g h ta n dw e i g h to f s u g a r c a n ep l a n t si n o c u l a t e dw i t hs p h i n g o m o n a sp a u c i m o b i l i sw e r ei m p r o v e db y8 7 19 p e r c e n ta n d119 8 8p e r c e n tr e s p e c t i v e l yc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lw i t h o u ti n o c u l a t i o n k e yw o r d s ：e n d o p h y t i cd i a z o t r o p h i cb a c t e r i ai ns u g a rc a n e ，i s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o n ，g e n e c l o n i n g ，t h ea n a l y s i so ft h es e q u e n c e i i i 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 本人( 姓名) 题筮俊学号2 q q 鱼q 窆窆5 专业发直生物堂所呈交的 论文( 论文题目：甘蔗内生固氮菌的分离鉴定及1 6 s r r n a 基因克隆和 序列分析) 是本人在导师指导下，独立进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除论文中已特别标明引用和致谢的内容外，本论文不包 含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果。对本论文的研究 工作做出贡献的个人或集体，均已在论文中作了明确说明并表示谢意， 由此产生的一切法律结果均由本人承担。 本人完全了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 福建师范大学有权保留学位论文( 含纸质版和电子版) ，并允许论文被 查阅和借阅；本人授权福建师范大学可以将本学位论文的全部或部分内 容采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文，并按国家 有关规定，向有关部门或机构( 如国家图书馆、中国科学技术信息研究 所等) 送交学位论文( 含纸质版和电子版) 。 ( 保密的学位论文在解密后亦遵守本声明) 学位论文作者签名：j 司段位 指导教师签名： 签字日期：3 口。( 7 年6 月g 日 签字吼西。1 “月i 口日 绪论 绪论 一、生物固氮的意义 农业的发展既要增加农作物产量，又不能破坏土地的持续生产力和生态环境， 这是可持续农业发展战略。但长期大量、单一地施用化肥造成农产品质量下降、肥 料利用率降低和环境污染等问题日益突出，对农业可持续发展产生了严重的影响。 氮是一切生命结构的原料，被视为衡量土壤养分状况乃至土壤肥力的一个重要指标。 空气中氮气的含量非常丰富，约占8 0 ，但由于其性质很稳定，一般不能被绿色植 物和大多数微生物直接利用，必须通过固氮作用，一般有三种途径，一是工厂固氮， 二是高能固氮，三是生物固氮。生物固氮( b i o l o g i c a ln i t r o g e nf i x a t i o n ) 是指某些微生物 在固氮酶作用下将空气中的氮气( n 2 ) 还原成氨( n h 3 ) 并为植物或微生物的生长发育 提供氮源。生物固定的氮量在整个自然界的固氮量中占的份量很高，为非生物固氮 的两倍多【1 】，具有很大的优越性，在自然界氮循环中有重要意义，可维持环境生态 平衡和农业的可持续发展。因此，生物固氮在提高作物产量、降低农业化肥使用和 生产成本、减少环境污染、改善生态平衡和促进农业可持续发展等各个方面都有重 要的意义l 引。 二、内生固氮菌 生物固氮作用主要存在于一些原核生物中，己经鉴定有固氮作用的微生物己近 5 0 个属【3 1 。固氮微生物可分为三个类型：自生固氮微生物、共生固氮微生物和联合 固氮微生物。自生固氮菌是指能独立进行固氮的微生物，对植物并没有依存关系， 能独立进行固氮，如圆褐固氮菌、蓝藻。共生固氮是指与高等植物或其他生物共生 时才能固氮的微生物，如与豆科共生固氮的根瘤菌。生物固氮的研究已有百余年， 而联合固氮作为其重要分支则只有几十年的历程【4 】，d o b e r e i n e r 实验室于1 9 5 8 年首 次从热带甘蔗的根际分离到固氮细菌，1 9 7 5 年再次发现禾本科植物联合共生的固氮 螺菌，由此而提出了根际联合固氮的概念。继d o b e r e i n e r 等的发现之后，近年来在甘 蔗、玉米、水稻等作物和一些牧草发现了多种具固氮功能的内生细菌，引起了学术 界高度关注【5 1 。内生固氮菌( e n d o p h y t i cd i a z o t r o p h ) 是能定殖在健康植物内部而对植物 无实质性伤害的固氮菌，部分可促进植物生长及诱导植物抗病【6 】，且可与植物建立 和谐的联合关系【| 7 1 。1 9 7 4 年，d o b e r e i n e r 等在研究发现固氮螺菌大多数聚集在牧草植 物根表的粘液层或粘质鞘中，但有少部分却可以突破根表细胞壁，侵入宿主根的皮 福建师范大学硕士学位论文 层组织或维管中，因此d o b e r e i n e r 称之为内生固氮菌【8 9 】。1 9 9 7 年，b a l d a n i 等又将内 生固氮菌划分为专性内生固氮菌( o b l i g a t e e n d o p h y t e s ) 和兼性内生固氮( f a c u l t a t i v e e n d o p h y t e s ) 1 0 j 。前者是指那些在土壤中难以生存，仅能在植物根、茎、叶内等部位 定殖的内生固氮菌：如从玉米、甘蔗、高梁等植物中分离得到的红苍白假单胞菌 ( p s e u d o y n o n a sr u b r i c s u b a l b i c a n s ) 、织片草螺菌( h e r b a s p i r l l u ms e r o p e d i c a e ) 1 0 , 1 1 】。从 甘蔗、甜马铃薯、喀麦隆草等分离得到的醋酸杆菌( a c e r o b a c t e rd i a z o t r o p h i c u s ) 1 2 , 1 a 】。 后者指那些既能在根内及根表进行定殖，又能在土壤中生存的内生固氮菌。目前发 现大多数内生固氮菌属于兼性内生固氮菌，主要为固氮螺菌属( a z o s p i r i l l u m ) ，目前 已分离鉴定出有5 个种：产脂固氮螺菌t i p o f e r u m ) ，巴西固氮螺菌似b r a s i l e n s e ) ，亚 马逊固氮螺菌口a m a z o m e n s e ) ，伊拉克固氮螺菌似i r a n k e n s e ) ，高盐固氮螺 似h a l o p r a e f e r e n s ) t 4 1 。 三、甘蔗内生固氮菌研究进展 目前，国内外专家已在甘蔗体内分离和鉴定了大量的内生固氮菌【1 4 】，其种类、 数量随甘蔗的品种、株龄、区域及研究手段不同而有所差异，主要属于肠杆菌、芽 抱杆菌等兼性厌氧菌【1 5 , 1 6 1 。从1 9 8 8 年起，陆续在甘蔗体内发现几种大量存在的内生 固氮菌：重氮营养醋杆菌( a c e t o b a c t e r d i a z o t r o p h i c u s ) ，红苍白草螺菌( h e r b a s p i r i l l u m r u b r i s u l b i c a n s ) 和织片草螺菌( h s e r o p e d i c a e ) ，这些内生固氮菌被认为可能是甘蔗 生物固氮系统中的最重要固氮者 1 7 - 2 4 】。近年来，随着研究的进一步深入，固氮微生 物家族又添了新成员b u r k h o l d e r i a ，2 0 0 4 年从甘蔗的茎和根中分离得至u b u r k h o l d e r i a t r o p i c a 2 5 1 。目前，有很多被发现的固氮菌还未命名，随着研究的深入，将会有越来 越多的固氮菌被发现。 在巴西、印度和泰国，从事甘蔗固氮研究，主要利用1 5 n 平衡法、1 5 n 同位素技 术、1 5 n 自然丰度和生理生化实验技术等进行研究【2 9 1 。在泰国，利用1 5 n 同位素示 踪法，发现3 0 的甘蔗品种具有明显的固氮能力，且其3 4 氮素来自生物固氮，氮 肥的利用效率为4 1 4 5 ，通过吸收氮肥获得的氮营养物质占甘蔗生长所需氮营养物 质总量的1 8 3 1 【2 7 】，巴西采用1 5 n 原子示踪法实验证明甘蔗具有高效的固氮能力， 可以从生物固氮中获得3 0 7 0 以上的氮素【2 8 ，2 9 1 。葡萄糖杆菌回接甘蔗组培苗，在 甘蔗的茎基部的木质部可以检测到大量该细菌，在甘蔗叶子中也可检测到该菌的存 在【3 2 1 。在南非的甘蔗品种体内分离到的有固氮活性的菌株，发现其对南非甘蔗生 物固氮作用贡献不大，可能是由于不同地区的甘蔗品种其体内的固氮菌发挥作用的 绪论 能力不刚”j 。 甘蔗内生固氮菌被认为是通过茎切口或是植物的自然开口和伤口进入植物体内 的【3 4 3 5 1 ，所以甘蔗的固氮能力可以通过砍种，将固氮菌遗传到下一代。其中自然开 口包括水孔、气孔、皮孔和蜜腺等，伤口则是通过土壤对根的磨损、动物摄食及收 割多年生植物所造成的。同时固氮菌从根际进入宿主的过程也就是其从植物侧根发 生的裂刚3 6 1 或根尖的根冠脱落处“乘虚而入”或利用果胶酣3 7 1 、纤维素酶水解根 表皮细胞间层进入根皮层，继续溶解胞间多糖，接着通过皮层细胞间隙向内深入， 而皮层细胞间隙也为细胞纵向迁移提供了一定的空间【3 9 1 。导管和相邻胞间的迁移可 穿过纹孔，细菌进人导管后可能通过蒸腾流上升以完成系统侵染【3 6 1 。研究表明固氮 醋酸杆菌是从根尖和侧根发生的周围侵染植物的，它还能侵入甘蔗根毛从而形成侵 染线样结构，但其频率很低m 4 l 】。内生细菌进入植物组织后，可以定殖在一个特定 的组织内，也可以通过传导或非原生质体在植物内移动。关于甘蔗固氮菌进入植物 后促进生长的机理，根据前人的研究结果可以看出其主要是通过诱导植物产生植物 激素、改善植物对矿物质的利用率来间接促进植物生长。h u s s a i n 等1 9 8 7 年发现接种 固氮菌、固氮螺菌的玉米苗比对照含有较高的游离态生长素l 蛆、a b a 等植物内源 激素【4 2 1 。1 9 9 2 年，d o b e r e i n e r 等从墨西哥分离的1 8 株重氮营养醋杆菌( a c e t o b a c t e r i a ) 也有产生生长素的能力【9 】。 目前国内甘蔗固氮方面的研究相对较少，只在甘蔗固氮菌分离、生物菌肥等方 面有少量报道。李星洪等从甘蔗根部中分离得到成团泛菌，并利用乙炔还原法证明 其具有固氮酶活性【4 3 1 。莫立鲜在甘蔗生物固氮肥试验中，施用甘蔗根际联合高效固 氮菌剂，可以提高甘蔗出苗率和分孽率、有效茎数、产量和甘蔗糖分，提高甘蔗叶 片的全氮含量】。关中秀等对甘蔗施用耐氨固氮菌，研究结果表明蔗茎产量和糖分 均有显著提高，植株叶绿素、根系活力、光合速率和某些酶活性也有所增加，在提 高氮吸收、提高氮素利用率的同时也提高了对磷、钾的吸收【4 5 1 。樊妙姬等将甘蔗内 生固氮菌接种到甘蔗组培苗中，结果发现接种组培苗的固氮酶活性并没有改变【4 6 1 。 近年广西从巴西引进了一些固氮甘蔗品种，其中一个甘蔗品种( b r 7 2 4 5 4 ) 只施少量 的氮肥并不影响甘蔗的出苗率、分蘖率、蔗茎产量和糖分，间接证明巴西固氮甘蔗 品种在广西本地也有固氮活性【4 7 】。邢永秀等从巴西引进的甘蔗品种与广西甘蔗栽培 品种中分离到一些具有固氮酶活性的固氮细菌，发现过量的n 元素对固氮作用有抑 制【4 引。从以上的资料来看，国内对甘蔗内生固氮的研究还处在相对落后的位置，我 福建师范大学硕士学位论文 国南方甘蔗资源丰富，因此有必要开展更广泛深入的研究。 四、甘蔗内生固氮菌研究存在问题与展望 从第一次发现内生固氮菌至今，对内生固氮菌的研究已有十几年，但还有很多 问题没有弄清楚：甘蔗内生联合固氮菌种类目前还没有系统的归类；巴西甘蔗联合 固氮作用主要源自哪种固氮菌；固氮菌与宿主甘蔗的相互作用机制；内生固氮菌固 定的氮素是如何向宿主转移的等等问题。另外，内生固氮菌的导入会不会破坏植物 的微生态平衡，也是需要注意和探讨的问题。因此，将固氮细菌分离出来，进行离 体观察研究，有助于理解甘蔗内生固氮菌与宿主之间的相互关系，明确固氮细菌的 固氮酶活性表达规律。在了解甘蔗固氮菌各种特性的情况下，将活力高的固氮菌回 接到甘蔗体内，或把固氮菌制作成固氮肥，增强甘蔗的固氮能力，减少氮肥的使用 量，节约生产成本，将是很有意义的研究课题。如果能在更广泛的地区及更多的甘 蔗栽培品种上导入内生固氮菌，那将是不可估量的贡献。另外通过遗传操作、基因 工程改造等各种手段在如甘蔗、玉米、水稻等禾本科作物体内建立联合固氮系统， 将可能是未来建立可持续的农业耕作系统的主流。 五、本课题的研究意义与研究内容 随着人口的不断增长，人们对于粮食的需求变得越来越紧迫，而粮食的增产目 前仍很大程度上取决于化学肥料的施用，但大量施用化肥，即提高了农业生产成本， 也引起水体污染严重，生态平衡破坏，阻碍了农业的可持续发展。生物固氮可以为 农作物提供氮素，不降低土壤生产力，不污染环境，而且是取之不尽、用之不竭的 廉价氮源。甘蔗是我国南方的重要经济作物之一，施用高效甘蔗联合固氮菌将成为 促进甘蔗增产的措施之一。因此筛选固氮酶活性高的甘蔗联合固氮菌，无论对生物 固氮的基础理论研究和联合共生固氮菌的应用都具有十分重要的意义。 本研究充分利用我国南方丰富的甘蔗资源，尽可能广泛地收集不同地域来源的 甘蔗品种，了解本地来源的甘蔗品种体内固氮菌的种类和数量，以及所含固氮菌的 生长特点和生理生化特性并将它们系统地分类、鉴定。期望筛选出具有高效固氮的 内生固氮菌株，将其回接到甘蔗体内，探讨其对甘蔗的促生效应。从而更深入地了 解这些甘蔗品种的固氮潜力，以发掘其在农业上潜在的应用价值，对生物菌肥的开 发以及农业生产应用提供可靠的理论依据。这无疑具有重要的学术价值和实际应用 价值。本课题一方面丰富甘蔗固氮菌株资源；另一方面对其促进甘蔗生长效应进行 研究，为甘蔗科研、生产实践提供一定的理论依据。 绪论 主要研究内容如下： 1 ) 甘蔗内生固氮菌的分离、纯化 2 ) 固氮酶活性的测定和生理生化指标鉴定 3 ) 1 6 s r r n a 基因克隆及菌株的系统发育地位分析 4 ) 环境因子对甘蔗内生固氮菌的生长影响效应 5 ) 回接内生固氮菌对甘蔗生长影响的测定 第1 章甘蔗内生固氮菌分离纯化和初步鉴定 第1 章甘蔗内生固氮菌分离纯化和初步鉴定 目前，国外对甘蔗根系固氮细菌的研究较多，而国内关于甘蔗内生固氮菌的报 道还相对较少。福建是广泛栽培甘蔗的大省，不同地方的甘蔗品种中含有的内生固 氮菌种类不同，即使在同一地区的甘蔗品种中含有的内生固氮菌种类也不尽相同， 显然，系统地探讨各地各品种中内生固氮菌的数量与种类，有利于了解甘蔗的固氮 能力，以对该品种作出更全面的评价。鉴于此，本文首次对福州地区甘蔗栽培品种 的根系进行内生固氮菌的分离、筛选和纯化，固氮酶活性测定、生理生化特性鉴定 等初步研究，希望筛选出固氮酶活较高的固氮菌株接种甘蔗，以期提高甘蔗产量， 降低生产成本，为甘蔗科研及生产应用等方面提供一定的科研依据。 1 1 实验材料 1 1 1 材料 从福建师范大学甘蔗地和福建农林大学甘蔗所采集健康的甘蔗根样品( 根部带 少许土壤) ，并分别用新的聚乙烯塑料袋包好，带回实验室后立即放入冰箱中4 。c 保 存，2 d 内进行固氮菌分离实验。 甘蔗品种：元蔗9 9 - - 5 9 6 ，r o c l 6 ，福农9 8 1 1 0 3 ，r o c l 0 ，闽糖9 6 1 4 0 9 ，闽 糖9 3 7 3 0 ，福农2 8 ，福农0 2 2 9 ，福农0 2 3 0 等。 1 1 2 培养基 4 9 】 1 ) l b 培养基：蛋白胨1 0 9 ，酵母粉5 9 ，n a c l1 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，琼j 旨2 0 9 。p h7 0 ， 1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 2 ) a s h b y 培养基：甘露醇10 9 ，k h 2 p 0 40 2 9 ，n a c l0 2 9 ，m g s 0 4 。7 1 - 1 2 00 2 9 ，c a c 0 3 5 9 ，c a s 0 4 2 h 2 0o 2 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，琼j j n 2 0 9 。p h7 0 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 3 ) 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 9 ，蛋白陈1 0 9 ，n a c l5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，琼脂 2 0 9 。p h7 2 7 4 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 4 ) 淀粉培养基：可溶性淀粉2 9 ，蛋白胨1 0 9 ，牛肉膏5 9 ，n a c l5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ， 琼j 旨2 0 9 。p h7 0 ，1 2 1 灭菌2 0m i n 。 5 ) 明胶培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基1 0 0 m l ，明胶1 2 1 8 9 。在水浴锅中将上述 成分溶化，不断搅拌。溶化后调p h 至7 2 7 4 ，1 2 1 灭菌3 0m i n 6 ) 醋酸铅培养基：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基1 0 0 m l 加热溶解，待冷至6 0 。c 时加 入硫代硫酸钠0 2 5 9 ，调至p h 7 2 ，1 2 0 。c 灭菌1 5 m i n ，取出后待冷至6 0 c ，加入 福建师范大学硕士学位论文 1 0 醋酸铅水溶液( 过滤除菌) l m l ，混匀后倒入灭菌试管中。 7 ) 尿素培养基：尿素2 0 9 ， k h 2 p 0 42 9 ，n a c l5 9 ，蛋白胨1 9 ，酚红0 0 1 2 9 ，琼脂 1 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 。p h 7 0 。在去离子水1 0 0 m l 中，加入上述所有成分( 除琼 脂外) 。混合均匀，过滤除菌。将琼脂加入9 0 0 m l 蒸馏水中，1 2 1 灭菌1 5 m i n ， 冷却至5 0 加入灭菌好的基本培养基，分装于灭菌好的试管中。 1 1 3 实验试剂 甘露醇、蛋白胨、酵母粉、琼脂粉、牛肉膏、n a c l 、k h 2 p 0 4 、k 2 h p 0 4 、c a c 0 3 、 m g s 0 4 7 h 2 0 、c a s 0 4 2 h 2 0 、尿素、可溶性淀粉、硫代硫酸钠、明胶等常规药品皆为 国产分析纯。 1 1 4 主要仪器 哈尔滨东联恒温摇床，t o m ye s 3 1 5 高压灭菌锅，上海天能紫外分析仪， o l y m p u s d 7 0 光学显微镜，m e t t l e rt o e l d op l 6 0 2 s 分析天平，苏州净化设备厂s w - c j 超净工作台，a g i l e n tt e c h n o l o g i e s6 8 9 0 n 气相色谱仪，上海跃进恒温培养箱等。 1 2 方法与步骤 1 2 1 固氮细菌的分离纯化 取采集回来的不同甘蔗品种的根，剪取健康的须根，对其进行表面消毒：先在 自来水下冲洗2 0 分钟，洗去表面泥土，再在超净工作台上先用7 0 酒精消毒3 0 s ，无 菌水洗涤3 次，再用2 n a c i o 消毒5 8m i n ，无菌水洗涤5 7 次，将消毒的甘蔗根放到 装有l b 培养基的固体平板上，在2 8 c 培养2 d ，平板中无菌落出现表明消毒完全。若 消毒不完全，将重新取根分离。将表面消毒完全的甘蔗根加少许无菌水用灭过菌的 研钵研碎，静置5 m i n ，取5 m l 汁液加入5 0 m l a s h b y 液体培养基中，置2 8 。c ，1 8 0 r p m 摇 床培养2 d ，共转接三次，然后在a s h b y 无氮固体培养基上反复划线分离，挑取形态不 同的菌落进行纯化培养，保存菌种备用。 1 2 2 固氮酶活性的测定 采用乙炔还原法( a c e t y l e n er e d u c ti o na s s a y ，a r a ) n 定固氮酶活性。其是根据 固氮酶可以使乙炔还原为乙烯，最终以生成的乙烯量的多少来表示固氮能力大小， 方法简单而且灵敏度高。挑取分离纯化好的单菌落接种于己灭菌的装有1 0 m l 的 a s h b y 液体培养基 1 0 0 m l l 丢用注射瓶中，在2 8 。c ，1 8 0 r p m 摇床上振荡培养2 d 。然后 第1 章甘蔗内生同氮菌分离纯化和初步鉴定 在超净台中将封口膜换成反口橡胶塞，用一次性注射器抽出1 0 m l 空气，再注入1 5 m l 高纯乙炔，保证瓶内负压的状态，继续培养1 2 h 后静置待测。对照用加入高纯乙炔但立 未接种菌的注射瓶。采用p e r k 蚺e l m e r 公司生产的a g i e e n t6 8 9 0 n 型气相色谱仪测 定。用无菌注射器从瓶中抽取混合气体0 2 m l 注入气相色谱仪进样柱中进行测定。 1 2 3 固氮菌的生理生化特性 1 2 3 1 菌落特征的观察 采用钱存柔，董碧江【4 9 】的方法，将固氮菌接种于l b 固体平板培养基，2 8 c 恒温 培养1 2 2 4 h 后，出现单菌落特征，观察其大小、形态、表面、边缘、颜色、隆起形 状、透明度、菌落及培养基的颜色等。 1 2 3 2 革兰氏染色观察【5 0 】 ( ) 染色 1 ) 用牙签挑取少量菌，涂布在洁净玻片上的一滴无菌水中，于酒精灯火焰上固定。 2 ) 用结晶紫混合液染色l m i n 后，水洗。 3 ) 加碘液染l m i n ，水洗，吸干。 4 ) 用9 5 酒精洗脱液轻轻快速冲洗玻片至洗脱液无紫色产生( 约3 0 s ) 。 5 ) 用番红染液复染2 3 m i n ，水洗，晾干。 ( 二) 镜检观察 在显微镜下，先用低倍镜锁定位置，再在油镜下观察，并照相。深紫色为革兰 氏染色阳性细菌，淡红色为革兰氏染色阴性细菌。 1 2 3 3 生理生化指标【5 1 5 2 】 1 ) 运动性 配制l b 半固体培养基，穿刺接种菌室温培养3 5 d 。用透射光目测细菌的运动性。 如细菌只生长在穿刺线上，边缘清晰，则表明细菌无运动性( 一) ，如细菌由穿 刺线向四周云雾状扩散，呈辐射状，则表明菌株有运动性( + ) 。 2 ) 淀粉水解试验 将固体淀粉培养基溶化后冷却至5 0 c 左右，无菌操作制成平板，用无菌操作分别 接种固氮菌，一皿不接种作为对照，置2 8 。c 恒温倒置培养2 3 d 后，在平板上滴加 碘液观察其菌落处，若菌落处呈透亮的菌落色泽则为淀粉试验阳性( + ) ，若菌落 处呈蓝黑色为淀粉试验阴性( 一) 。 3 ) 明胶液化试验 福建师范大学硕士学位论文 配制明胶高层培养基，通过穿刺接种法分别接种固氮菌，一管不穿刺作为对照， 2 8 c 恒温培养3 7 d 后，将试管置于4 。c 冰箱中3 0 m i n ，若明胶培养基呈液化状态 为阳性( + ) ，若无液化现象的为阴性( ) 。 4 ) 触酶试验 用灭菌牙签挑取培养1 6 2 4 h 的固氮菌少许涂于载玻片上，并以空白载玻片为对 照，用枪头滴一滴过氧化氢溶液于菌体上，肉眼观察反应。若有气泡产生为触 酶试验阳性( + ) ，若无为阴性( 一) 。 5 ) 硫化氢产生试验 配制醋酸铅固体培养基，无菌操作分别接种固氮菌，2 8 c 恒温培养3 5 d ，若接菌 处有黑褐色硫化铅产生者为阳性( + ) ，若无此现象者为阴性( 一) 。 6 ) 脲酶测定试验 在培养基中加入尿素和酚红，通过穿刺接种法分别接种固氮菌，一管不穿刺作 为对照，置2 8 恒温培养3 5 d 后观察，若接种处有紫红色产生为阳性( + ) ，若不 变色为阴性( 一) 。 1 2 4 固氮菌的初步鉴定与保存 将纯化好的固氮菌株采用三线法划线接种于l b 固体平板培养基上，于2 8 c 下培 养1 6 2 4 h 后，一部分送福建省疾病防疫控制中心鉴定，采用生物梅里埃公司w i p e k 3 2 鉴定仪，另一部分放入冰箱中4 c 保存，隔两个月转代一次。挑取单菌落于l b 液体 培养基摇菌1 2 1 6 h ，以l ：l 比例与甘油混合保存于8 0 。 1 3 结果与讨论 1 3 1 固氮细菌的分离纯化筛选 首先挑取在a s h b y 培养基上不同形态的菌落在l b 平板上用稀释划线法，分离 单菌落至菌落形态单一，并结合简单染色在油镜下观察菌体形态是否一致，至菌种 纯化完全。从甘蔗各个品种中分离得到的菌落形态观察发现有不少都相同，因分离 得到的菌株数量太多，无法全部留存，主要挑选颜色大小等形态不同的菌株进行转 管保存，通过单菌落继代纯化5 - 6 次过后对于目测表型一致的菌株，保存以备鉴定。 因实验中最后有用消毒过后的甘蔗根在l b 平板上培养2 d ，并没有任何菌落发现， 故这些菌株都是来自于甘蔗内部组织的，可以被称为内生细菌。本研究挑选形态大 小质地各异，且在a s h b y 培养基上生长较快的1 2 株菌进行鉴定，对菌种分别进行编 第1 章甘蔗内生同氮菌分离纯化和初步鉴定 号为s 2 ，s 3 ，s 4 ，s 5 ，s 6 ，s 7 ，s 8 ，s 1 2 ，s 1 3 ，s f ，s i ，s k 。 1 3 2 固氮菌酶活检测结果 本实验中采用p e r k i n e l m e r 公司生产的a g i c e n t6 8 9 0 n 型气相色谱仪测定菌 株的固氮酶活性，其工作条件设置为：氢火焰离子化检测器，汽化室温度1 2 0 c ，检 测器温度2 5 0 。c ，色谱柱为g d x 5 0 2 ，长2 m ，内径3 m m ，柱温7 0 c ，载气n 2 ，流量 1 8 m l m i n - 1 ，尾吹无，h 2 流量5 0 m l m i n 1 ，空气流量3 0 0 m l m i n 1 。以n m o l c 2 h 4 l l 。1 m l 1 表示固氮酶活性【5 3 巧5 1 。 表1 1 甘蔗内生固氮菌的乙炔还原酶活性 t a b l e1 1d e t e c t i o n o fa c e t 3 t l e n er e d u c t i o na c t i v i t y ( a r a ) o f e n c l o o h y t i cd l a z o t r o p l l l cb a c t e r i ai ns u g a r c a n e 一m i i _ 一 菌株乙炔还原酶活性a r a