（微生物与生化药学专业论文）产紫杉醇内生真菌fusarium+mairei的菌种改良和发酵优化研究.pdf

摘要 中文摘要 紫杉醇是种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一。1 9 9 2 年被美国食品与药物管理局( f d a ) 批准作为抗晚期癌症的新药上市。由于紫杉醇来源主 要依靠日益贫乏的红豆杉树皮，致使目前国际市场价格居高不下，因此寻找其它的生产 方法已成为国内外研究热点之一。近年来国内外很多研究人员也都相继报道其分离得到 的产紫杉醇真菌。 本论文以微生物发酵法生产紫杉醇的产量提高为目标，通过对已分离菌株美丽镰刀 菌( 胁船，j 唧册打e j ) y 1 1 1 7 进行原生质体诱变并筛选得到一株产量较高的正突变株 k 1 7 8 ，然后对其发酵条件进行优化以进一步提高产量。其主要研究方法和结果如下： 1 通过正交设计等实验方法，详细的研究了培养基成分、酶系组成、菌龄、渗透压缓 冲剂、p h 、酶解温度、时间和再生培养方式等多种因素对美丽镰刀菌原生质体制备 和再生的影响。实验结果表明，将美丽镰刀菌通过先静止2 d 再以1 8 0 r m i n 震摇2 d 后，在以o 6 m o l l 的k c l 配制的口h 为5 的复合酶( 3 溶壁酶、2 5 蜗牛酶、1 溶菌酶和o 5 纤维素酶) 中，3 2 恒温酶解4 h ，原生质体制备产量达3 2 1 0 7 个m l ； 纯化后的原生质体在2 5 ，以0 6 m o l l 的蔗糖配制的y c m 再生培养基上单层培养， 其再生率达8 9 。 2 原生质体诱变方法和筛选方法的研究。在不同剂量条件下，分别采用紫外照射和d e s 作用，研究其对孢子和原生质体存活率的变化。确定较合适的诱变条件为：紫外照 射( 1 5 w ，3 0 c m 距离) 3 0 s ，d e s 终浓度0 2 处理3 0 m i n 。在常规筛选的基础上同 时进行了寻找合适药物筛子的研究。通过比较几种抗真菌药物的作用效果，选择以3 ug m 1 的制霉菌素作为药物筛，结果表明在其作用下正突变率较高为1 3 。同时， 选择产量最高的一株k 1 7 8 作进一步的发酵研究。 3 采用统计学方法对基本培养基组成进行一系列的优化研究，结果表明最优培养基组 成为：葡萄糖8 0 l ，n h 4 n 0 37 8 4 1 ，乙酸钠2 0 2 l ，m g s 0 4o 6 8 l ，k h 2 p 0 4o 5 l ， z n s 0 4l 1 旷3 l ，c u ( n 0 3 ) 21 1 0 q l ，f e c l 32 1 0 q l ，v b l5 0 1 0 叶l ，l 一酪氨 酸5 lo - 3 l 。在该条件下发酵时紫杉醇产量可达2 2 5 2 p l 。在此基础上研究了几种 前体的作用，结果表明适量的苯丙氨酸、苯甲酸钠和邻苯二酚添加均能提高紫杉醇 产量。同时，基于l og i s t i c 方程建立了描述分批摇瓶发酵过程菌丝体生长的动力学数 学模型。 关键词：紫杉醇；原生质体；诱变育种；发酵优化；响应面分析 江南大学项士学位论文 a b s t r a c t 陌x o l ，ac o m p l e xd i c e r p e n o i dp r o d u c e db ys o n l es p e c i e so f 风搬，w a sf b u n di n1 9 7 l 1 舣o l i sm a r k e t e da sa 1 1a i l t j c a j l c e rd m ga p p m v e db yf d ai nl9 9 2 t h e 蛳o u n to 九a ) ( o li n y e w si sr e l a t i v e l ys m a l la n dt h i sh a sb e e nam a j o rf a c t o rc o n t r i b u t i n gt oi t sh i 曲p r i c e r e c e n t l y ，m a n yr e s e a r c h e r sh a v er e p o r t e dt l l a tt h e yh a df o l u l dt a x o j p r o d u c i n gf l u l g u si s o l a t e d 厅o mp h l o e mo fy e w s w i t ht h eg o a lo fi n c r e a s i n gt h ey i e l dd fm n g a lt a x o l ，t h i ss t u d ys h o w st 1 1 a tam u t a n tk 17 8 s e l e c t e df b ma ne n d o p h y t i c 胁g u s ，凡螂r f “mm d 抛fy l l1 7 ，o b t a i n e df b mt h ei 肿e rb a r ko f c h j n am a i r e i 埘t 1 1p r o t o p l a s tm u t a t i o n ，w h i c hp r o d u c e dt a x o li nat i i g hy i e l da f t e ro p t i m i z i n g t h ef 色h n e n t a t i o nc o n d i t i o n 1 ，af a s ta n dr e i i a b l em e t h o do fo b t a j j l i n gp r o t o p 】a s t sf 而m ，加计，黼m 谢陀iw m c hc a f l p m d u c et a ) ( o l i ss t u d i e d a r e r2d a y so fs t i l lc u l m r ea 1 1 d2d a y so fs h a k i n g - c u l t u r ea t 2 5 ，t 1 1 em y c e l i a l sw a st r e a t e d 、v i t hac o m b i n a t i o no f l ) r w a l l z y m e ( 3 ) ，s n a i l a s e ( 2 5 ) ， l y s o z y m e ( 1 呦a n dc e l l u l a s e ( o ，5 ) i np h 5 ，a n d0 6 m o 虬k c la s 妞o s m o t i cs 油i l i z e r 1 1 1 eh i 曲p r o t o p l a s ty i e l do f3 2 1 07 m li so b t a i n e di n4ha t3 2 n l ec o n d i t i o i l so f p r o t o p l a s tr e g e n e m t i o nw e r ea l s o洒v e s t i g a t e d t h ep m t o p l a s t sw e r e 叫f i e da 1 1 d r e g e n e r a t e do nt l l es o l i dy c m a t2 5 ，u s i n go 6 m o 扎s u c m s ea st h eo s m o t i cs t a b i l i z c l n e r e g e n e r a i i o nr a t ef e a c h e da t8 ，9 2 t h ec o n d i t i o no fm u t a g e n e s i sw a ss t u d i e da i l dm u l t i p l em u t a t i o n st op r o t o p l a s tw e r e c h o s ea st l l et 0 0 1t oa c q u i r et h es t r a i no fh i g hp r o d u c t i o n m y c o s t a t i n ( n y g t a t i n ) a sa s c r e e nt og e tt a x o l p r o d u c i n gf h n g u so fl l i g hy i e l dw a sa d d e dt om es c r e e n i n gm e d i a t h ee 骶c to fm y c o s t a t i no ns c r e e n i n gw a ss t u d i e da i l d 也er e s u l ts u g g e s t e dt h 越也e d e g r e eo fp tw a sl3 am u t a n t ，删堋肼口打苫fk 17 8w a ss e l e c t e db yp m t o p l a s t m u t a t i o no fu vr a d i a t i o na 1 1 dd e s 3 t h eo p t i m i z a t i o no fm e d i mc o m p o n c n t sf o rt h ep m d u c t i o no ft a ) ( o lb y 出em u t a n t k 17 8w a sp e 响h n e du s i n gb o t hp i a c k e 钍一b u 玎n a i ld e s i g na n dr e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y t h er e s u l t ss h o w e dt h a t 山eo p t i m a jc o n c e n 廿a t i o n sw e r e ：g l u c o s e8 0 9 ，l ， n h n 0 37 8 4 l ，n a o a c2 0 2 l ，m g s 0 4o 6 8 l ，k h 2 p 0 40 5 i ，z n s 0 41 l o q l ， c u ( n o ) 21 1 0 1 l ，f e c l 32 1 0 qg ，l ，v b l5 0 l o 吖1 ，l t y r o s i n e5 1 0 1 1 a r e r m eo 讲i m i z a t i o no fl h em e d i at h ey i e l do ft a x o lw a si n c r e a s e dt o2 2 5 2 p 酣s e v e r a l p r e c u r s o r ss u c ha sp h e n y l a l a n i n e ，n ab e n z o a t ea 1 1 dc a t e c h 0 1w e r es t u d i e da n dp r 0 v e dt o h a v eap o s i t i v ei n n u e n c e ak i n e t i cm o d e lo fm y c e l i a lg r o w t hw a sc o n s t r u c t e db a s e do n l 0 2 i s t i cf j n n u l a ， k e y w o r d s ：t a x o i ；p r o t o p i a s t ；m u t a g e n e s i s ；f e 硼e n t a t i o n ；r s m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名 日期：渺6 年牛月万日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 魏磐颖熬坐盟 日期：正名年产月奎日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 紫杉醇的发现及其临床引用 紫杉醇( p a c l i t a x e l ，商品名t a x 0 1 ) 是一种二萜类衍生物，是具有独特抗癌机制 的天然产物，为当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一，也是继阿霉素和顺铂后的热点 抗癌新药。 早在1 8 5 6 年，l u c a sh 就从欧洲红豆杉( t a x u sb a c c a t a ) 叶片中提取到粉末状碱 性物质，即紫杉碱( t a ) 【i n e ) 。但在随后的1 0 0 年间没有多大进展。直到1 9 5 8 年，美国 国家癌症研究所( n c i ) 组织化学、生态、药理及临床方面的专家发起了一项历时2 0 余年，对3 5 0 0 0 多种植物提取物的抗癌活性进行筛选的计划【】。在该计划实施过程中， 1 9 6 3 年美国化学家m c w a n i 和m e w 砒l 【2 】首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太 平洋杉( p a c i f i cy e w ) 的树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，w 抽i 和w a u 发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性 成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到1 9 7 1 年，他们才同杜克( d u k e ) 大学 的化学教授姆克法尔( a n d r et m c p h a i l ) 合作，通过x 一射线分析确定了该活性成份的化 学结构一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇( t a x 0 1 ) 。 s c h i f f 3 等随后证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。它作用于细胞微管，通过与微管 蛋白n 端第3 1 位氨基酸和第2 1 7 2 3 1 位氨基酸结合，诱导和稳定微管蛋白聚合，抑制 其解聚，增加聚合程度，使维管束不能与微管组织中心相互连接，将细胞周期阻断于g 2 m 期，导致有丝分裂异常或停止，阻止癌细胞增殖。这一发现极大地增加了人们对这种药 物的研究兴趣，美国n c i 决定加大力度推进紫杉醇的临床试验。1 9 8 0 年完成了制剂研究， 并开始毒理学的研究，1 9 8 3 一1 9 8 7 年基本完成i 期临床试验，确定了人类的最大耐受剂 量和剂量限制毒性；紫杉醇的期临床试验开始于1 9 8 7 年，主要研究试验药物对各类 患者的有效性。结果表明：紫杉醇对晚期卵巢肿瘤、转移性乳腺肿瘤治愈率为1 0 以上。 此外，紫杉醇对非小细胞肺肿瘤、前列腺肿瘤、上胃肠道肿瘤和白血病也有一定的疗效； 1 9 9 0 年进入紫杉醇的i i i 期临床试验，主要是确定剂量和给药时间以及有效性试验，共 进行了5 次1 8 9 名患者的i i i 期临床和3 0 0 名患者的附加临床试验。1 9 9 2 年被美国食品 与药物管理局( f d a ) 批准作为抗晚期癌症的新药上市。 1 1 2 紫杉醇工业生产的现状 1 1 2 1 直接从红豆杉提取 目前对于紫杉醇的生产，主要是从红豆杉的树皮中提取。红豆杉又名紫杉，也称赤 柏松，属浅根植物，其主根不明显，侧根发达。目前是世界上公认的濒临灭绝的天然珍 稀抗癌植物。红豆杉是第四纪冰川遗留下来的古老树种，在地球上已有2 5 0 万年的历史， 因其资源稀少，被列为世界珍稀树种加以保护。在自然条件下红豆杉生长速度缓慢，再 生能力差，所以很长时间以来，世界范围内没有形成大规模的红豆杉原料林基地。红豆 江南大学硕士学位论文 杉属植物在全世界有1 1 种，主要分布于北半球的温带至热带地区，中国有4 种1 变种， 东北红豆杉q 奴u sc u s p i d a t es t e b e th 【c c ) 、云南红豆杉( 瞰u sy u n n a n e n s i sc h e n ge t l k f u ) 、西藏红豆杉( t 奴u sw a l l i c l l i n a l l ai u c c ) 、中国红豆杉( t 奴u sc l l i n e n s i sp i l g e rr o h d ) 、 南方红豆杉f i 奴u sc l l i n e n s i sv 缸m a i r e i ) 。 红豆杉资源极其缺乏( 全世界野生红豆杉仅有1 0 0 0 万株左右) ，在红豆杉的不同部 位紫杉醇的含量均很低，紫杉醇在植物树皮中的含量仅为0 0 l ，每提取l k g 的紫杉 醇就要砍剥1 0 0 0 2 0 0 0 棵树的树皮：紫杉醇正式运用于l 临床以后，每年约需2 0 0 k g 以上。 以1 9 9 2 年为例，b r i s t o l m y e r ss q l l i b b 为临床试验提供了1 6 螬的紫杉醇，消耗了1 2 0 万 k g 的红豆杉。据估计，治疗一个卵巢癌患者需要6 棵树龄6 0 1 0 0 年的红豆杉树【4 】。即 使将全部的天然资源采伐，也只能满足短期需要。因此，直接从红豆杉树皮中提取紫杉 醇，必然严重破坏生态平衡，造成对森林和人类环境以及生物多样性不可弥补的损失。 1 1 2 2 化学合成紫杉醇的研究 世界上进行紫杉醇全合成研究的小组有3 0 多个，h o l t o n 【5 】和n i c 0 1 a o u 【6 】分别完成 了紫杉醇的全合成，尽管这些方法是化学研究上的杰作，但是合成路线复杂，都包括2 5 3 0 步化学反应，反应条件难以控制，试剂繁多，制备成本昂贵，只能停留在实验室阶 段，不能进行工业化生产。 1 9 8 8 年，法国u n i v e r s i t ej o s e p hf o u “e r 的d e n i s 【7 】首次报道了从欧洲红豆杉的 针叶中获得的1 0 一去乙酰浆果赤霉素( b a c c a t i n - i i i ) ，以此为原料半合成了紫杉醇以 及同系物t a x o t e r e ；随后美国r h j n e p o u l e n er o r e r 化学公司也实现了紫杉醇的半合成， 并申请了以b a c c a t i n 一为原料半合成紫杉醇的专利。美国b m s 公司计划在获得美国f d a 批准后，停止从树皮中萃取紫杉醇的生产，利用半合成法进行工业化生产紫杉醇。为此， b m s 公司开辟了3 0 0 0 万株红豆杉。但是，半合成方法中的前体物质b a c c a t i n i i i 和1 0 - d a b i i i 仍然是从红豆杉中提取，与直接提取并无本质上的区别，在来源上限制了其发展。 1 1 2 3 红豆杉愈伤组织培养和细胞悬浮培养 利用植物细胞培养法生产紫杉醇，是各种研究方向中十分有吸引力的一个方向，也 是1 9 9 0 年美国n c i 主持召开的紫杉醇研讨会上，得到n c i 投资的方向之一。国内外进 行愈伤组织和细胞培养的红豆杉种和变种超过1 0 种，选作诱导愈伤组织的外植体包括 根、茎、叶、树皮、形成层、大配子体、种子胚、假种皮、幼苗胚轴等。但是离体培养 生产紫杉醇实现工业化生产还有一定的难度，培养物生物量小、紫杉醇产率较低、生产 周期长以及需要保持细胞生长与生产特性的稳定等关键问题难以突破。c h r i s t e n 降l 首次利 用植物细胞悬浮培养技术生产紫杉醇后，研究吸引了众多实验室的跟进。中国的甘烦远 【9 1 ，梅兴卧1 0 1 ，张长平【1 l 】等在该方面都做了相关研究并取得了一定的进展，但是总体情 况产量低，费用高，均未达到实用水平，要达到商品化生产还需要相当长的时间。 综上所述，目前国际市场上紫杉醇原料药的主要来源还是红豆杉的树皮提取和树枝 提取一半合成，尚未有第三种方法形成大规模的工业化生产。 第一章绪论 1 1 3 产紫杉醇内生真菌的发现及其意义 早在2 0 世纪3 0 年代，日本的植物病理学家已经从几种特殊的真菌( g i b b e r e l l a f i g i k u r o i ) 中发现赤霉素，赤霉素是一种功能强大的二萜类物质。1 9 9 3 年，美国m o n t a i l a 州大学植物病理系的s t i e r l e 博士等从短叶红豆杉的韧皮部中分离得到一种能产生紫 杉醇的内生真菌安德鲁紫杉菌( t a x o m y c e sa i l d r e a n a e ) 。s t i e r l e 等采用质谱( m s ) 、免疫 化学、色谱( t l c 、 玎，l c ) 和放射性同位素标记等方法，证明了安德鲁紫杉菌的3 周 培养物中存在紫杉醇及其类似物。 能合成紫杉醇的红豆杉内生真菌的发现，是紫杉醇资源研究的重要进展。内生真菌 是一大类未被充分认识的真菌，泛指那些生活在健康的植物体内不引起任何病害症状的 所有真菌。从目前已经研究过的植物来看，尚未发现没有分离到内生真菌的，因此可以 推断内生真菌在植物体内是普遍存在的。他们在其寄主植物组织内部的生长发育过程 中，其代谢产物不仅对植物体本身有着各种各样的影响，而且对其他各种生物也有各种 不同的作用。 自从s t i e r l e 等证明短叶红豆杉的内生真菌可以产生抗癌药物紫杉醇，对于植物内生 真菌的研究更加引人注目。随后，国内外很多学者纷纷报道其分离到不同的产紫杉醇的 真菌。1 9 9 6 年，s t r o b e l 等从西藏红豆杉( zw n f 缸曲i n n 口) 中分离到一株产生紫杉醇的 内生真菌小孢拟盘多毛孢( 尸酣m 如f f 叩s 括m f c r 0 印d r ) ，这种真菌的5 周培养液( 5 0 0 i i l l 于2 l 瓶中) 可以产生紫杉醇的量达到5 5 1 0 嵋。1 9 9 8 年，j y “等从zg m ，l d 咖妇 中分离到一种可以产生紫杉醇的内生真菌，产量约4 0 0 n g l 。2 0 0 0 年，w a i l g 等从t m a 曲i 中分离到产紫杉醇内生真菌瘤座菌属( 弛6 p r c “肠r f s p ) 【1 5 】。 我国学者也发现了多种产紫杉醇的内生真菌，邱德有等【l6 】于1 9 9 4 年首先从云南红 豆杉( zy “，z n 础册s 括) 树皮中分离出一种内生真菌，周东坡小组【1 7 j 从东北红豆杉( z c “印f 如钯) 的树皮中分离、筛选出一株产量较可观( 5 l 1 2 5 斗酣) 的菌种( d 如i 蹄o r f h m 夥f v 扣r m e ) 。2 0 0 2 年，本实验室研究人员也从中国南方红豆杉中分离到一株产紫杉醇内 生真菌( 凡s r f “mm n f m f ) ，产量约2 0 峙l 。 如此众多的产紫杉醇真菌的报道，向人们强烈预示，真菌界是紫杉醇资源的宝库， 具有重大的研究和开发价值，是解决目前原料来源限制的一条新路。红豆杉及其内生真 菌产生相同的次生代谢产物，这提出了一个显而易见的问题，即这两类属于不同界的物 种合成紫杉醇的代谢途径是否相同? 或者，两个途径中参与紫杉醇合成的酶及其编码基 因是否相同或具有同源性? 因此，对产紫杉醇的真菌进行深入研究，不仅有实际意义， 而且有助于解开红豆杉与内生真菌的物质和信息交流的机制，提供共生物种在长期的进 化过程中相互作用的重要信息。 1 1 4 真菌发酵生产紫杉醇的优势 发酵法生产紫杉醇有其独特的优势。无论是从生态还是经济条件的角度来看，利用 植物内生真菌作为药源是一项不会枯竭的资源，微生物发酵的方法具有以下优点： 江南大学硕士学位论文 ( 1 ) 微生物生长迅速，易于培养，应用的培养基相对比较便宜；其作为工业生产的源 泉，可以在发酵罐中进行，可以源源不尽的进行生产； ( 2 ) 微生物易于通过基因工程等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量； ( 3 ) 微生物的生长仅仅需要一般的培养技术，在收集紫杉醇之前，可以通过改善培养 ； 环境、改进技术来提高产量：同时，可望满足市场的需求，降低紫杉醇的价格。 1 1 4 1 原生质体诱变育种技术 去除细胞壁后的原生质体是单细胞，对各种诱变因子比较敏感，诱变剂易于透过细 胞膜和细胞质，直接作用于细胞核d n a ，诱变基因发生突变，从中可筛选到需要的突 变株。1 9 6 7 年s 仃1 m k 第一次分离到担子菌原生质体并观察到其自发融合，是真菌原生 质体研究的先驱之一。 近三十年来，真菌原生质体技术研究在理论和应用上取得了很大的进展。起步阶段 主要研究从不同生态型的菌丝体、抱子或子实体中制各原生质体的条件，利用从木霉等 真菌中分离和纯化出的脱壁酶，从酶种类及配比、酶浓度、渗透压稳定剂种类及浓度、 p h 条件、菌丝生理状态( 菌龄、预处理等) 等方面建立起真菌原生质体制备与再生的最佳 条件。对于不同的真菌，同一真菌的不同材料制备原生质体的条件不同。去除细胞壁的 原生质体对外界环境非常敏感，经诱变剂处理后很容易发生突变，因此，原生质体诱变 育种己成为原生质体育种的一种方法。 1 1 4 2 统计学方法在发酵条件优化中的应用 在优化发酵条件过程中，传统的单因素分析法通过一次只改变一个变量的设计方法 来逐个研究所有的影响因子。该方法简单易行可广泛用于某些关健因素的研究。但是， 对于大量未知因素的影响考查，该方法不可避免的出现试验点繁多工作量过大的缺陷。 而且，因素变量之间的相互影响在单因素法中得不到体现。 基于这些原因，本研究采用统计学方法结合单因素法来设计相关的实验方案。 p l a c k e n b 唧啪二水平正交设计被用来分析大量微量元素中的主要成分。该方法采用特 定的设计表可以在n 组实验中最多考查n 一1 个因素变量。虽然实验点不多，但是关于各 因素的影响大小等大量重要信息都可以获知。 通过二水平设计获得的重要影响因素可以通过进一步的响应面设计方法来研究其 最优值。b o x b e h n k e n 响应面设计可用于考察该多个因子的相互作用和优化水平。其通 过特定软件可以回归得到相应的方程和响应面曲线，不仅可以预测最优设计点还可以考 查变量之间的相互关系。本研究采用该方法对已获得的重要因素进行优化。 1 2 本论文研究的主要内容 1 2 1 发酵法生产紫杉醇需要解决的问匝 目前，红豆杉紫杉醇的研究进展较快，而真菌中紫杉醇合成代谢途径方面的研究几 第一章绪论 乎是空白，迄今为止还少有任何与紫杉醇合成相关基因克隆的报道。微生物发酵法生产 紫杉醇的关键问题是紫杉醇产生菌的分离和发酵液中紫杉醇产量的提高，要达到紫杉醇 发酵生产的要求，还存在一些问题需要通过以下几个方面来解决。 首先，获得能够适用于发酵生产的工业菌株是实现发酵生产紫杉醇的前提。目前报 道的菌株主要是红豆杉内生菌，其菌丝体不发达，从而影响其总产量。解决这一问题主 要从两个方面入手，一是从自然界中继续寻找更好的适合发酵的原始菌株，二是对现有 的菌株进行改造。通过基因工程手段改造菌株是该研究方向的主要趋势，但是至今关于 紫杉醇合成的分子生物学机制尚不清楚，因此目前尚用传统的诱变育种手段来筛选高产 菌株。 其次，研究产紫杉醇内生真菌的代谢机理和紫杉醇的合成机制，以及通过寻找代谢 合成的中间体来进一步提高产量。在内生真菌发酵液中加入红豆杉针叶提取物，可以提 高紫杉醇的产量。内生真菌脱离植物体后，往往次生代谢停止或延缓，加入红豆杉的提 取液，提供产紫杉醇的诱导物可以提高紫杉醇的产量，可以启动紫杉醇的合成。这些添 加物的成分很难确定，而且真菌自生和共生条件下，代谢途径会有所差异，这方面的研 究有待于深入进行。 第三，通过优化环境因子寻找高产的最适条件。作为次级代谢产物，寻找适合的前 体物质对提高紫杉醇的产量具有重要意义。同时研究产物形成和菌体生长的规律，为工 业放大生产做准备。 1 2 2 本论文主要研究内容 做为国家自然科学基金资助项目( n s f c 3 0 4 7 0 0 1 6 ) “红豆杉内共生真菌与宿主共生 机理研究”的子课题，本论文的研究目标是：对出发菌进行诱变育种及对诱变获得的菌 株进行主要培养条件的优化改良，以进一步提高产量。主要研究内容包括： 1 2 2 1 原生质体制备和再生研究 通过正交设计等实验方法，详细的研究培养基成分、酶系组成和菌龄等多种因素对 助s a ，j 肋j ，e j 原生质体制备和再生的影响。 1 2 2 2 原生质体诱变研究 通过对助s a 订删肋打e j 原生质体进行紫外照射和d e s 复合诱变进行育种研究，寻 找并获得有效的诱变方法以及筛选方法来获得正突变菌株。 1 2 2 3 发酵条件优化研究 采用统计学方法对经过上述诱变筛选获得的一正突变菌株进行培养条件的优化研 究，以进一步提高产量。 江南大学硕士学位论文 第二章产紫杉醇内生真菌n f s 口一“mm 口讹i 的原生质体 制备和再生研究 2 1 引言 原生质体( p r o t o p l a s t ) 是指动植物和微生物细胞去除细胞壁后的细胞结构，一般 具有没有细胞壁、失去细胞刚性、呈球形以及对渗透压敏感等特征。去除细胞壁后的原 生质体是单细胞，对各种诱变因子比较敏感，诱变剂易于透过细胞膜和细胞质，直接作 用于细胞核d n a ，使诱变基因发生突变，从而可从中筛选到需要的突变株。因此，自1 9 5 3 年研究人员用溶菌酶溶解细胞壁获得原生质体以后，原生质体育种技术被广泛应用于很 多领域，如原生质体融合育种、转化重组d n a 育种和诱变再生育种。 在真菌的菌种保藏或扩大增殖过程中菌丝体是比较容易取得的实验材料，由其制备 原生质体也较方便。当然子实体和有性繁殖中的担孢子，以及无性繁殖中的厚垣孢子、 节孢子、粉孢子也都可以作为游离原生质体的材料。但要取得一定数量则不如前者方便， 脱壁也比较困难。因此，本实验对供试菌只，朔r j 删脚打p jy l l l 7 以菌丝体作为制备原 生质体的材料。在制备方法上，虽然获得原生质体的方法有很多，如机械法，酶法以及 超声波法等等。但其中酶法以其条件温和、制备量大、对原生质体影响小等优点成为目 前常用的制备方法。 原生质体形成和再生过程是原生质体技术及其应用的基础和主要组成部分，而对不 同的真菌以及菌种都有其适宜的制备和再生条件，本实验通过研究影响内船，j 埘 肋打p jy 1 1 1 7 原生质体的制备与再生的诸多因素，为进一步诱变育种奠定了基础。 2 。2 材料与方法 2 2 1 出发菌株： 红豆衫内生真菌砌5 d r f h mm f 理f 编号y 1 11 7 ，由本实验室提供。 2 2 2 培养基： 斜面培养基( p d a 固体培养基) ：马铃薯2 0 0 9 ( 去皮煮汁，过滤取液) ，葡萄糖2 0 9 ， 琼脂2 0 9 ，水1l ，p h 自然 平板培养基：( a ) c m 培养基：m g s 瓯o 5g ，k h ：p 0 4 0 5 9 ，k 。h p o - lg ，葡萄糖2 0 9 ， 蛋白胨2 9 ，酵母膏2 9 ，琼脂2 0 9 ，加水至ll ，p h 自然。 ( b ) 再生固体培养基： 相应的平板培养基中加入相应的渗透压稳定剂。( c ) 再生半固体培养基：将再生固 体培养基中的琼脂浓度降至7 l 即可。( d ) s m y 再生固体培养基：蔗糖1 0 9 ，麦 芽糖1 0 9 ，酵母膏4 9 ，琼脂2 0 9 ，渗稳剂，加水至ll ，p h 自然。 液体培养基：( a ) p d a 培养基：马铃薯2 0 0 9 ( 去皮煮汁，过滤取液) ，葡萄糖2 0 9 ， 兰三兰主茎堑壁堕竺塞堕! 坐! 竺! 竺竺! 竺! 塑堕兰堕笪型鱼塑曼竺堕圣 水ll ，p h 自然。( b ) 酵母浸膏完全培养基( y c m ) ：在c m 培养基中把蛋白胨和 酵母膏的量均提高至5 9 l 。( c ) m c m 培养基；在c m 培养基中添加微量元素溶液 1 0 r n l l ，微量元素溶液每升中含4 m gm g s o t ，1 m gc u s 0 t 5 h z 0 ，7 m gm n c l 。4 h ：0 和1 0 m g f e s o 。7 h ：o 。( d ) 基础种子培养基( b s m ) ：葡萄糖2 0 9 ，硝酸铵3 9 ，m g s 0 t0 5g ，k h z p o t 0 5 9 ，加水至1l ，p h 自然。 2 2 3 试剂 酶试剂：溶壁酶( l a l l z y m e ) ，购于广东省微生物研究所；纤维素酶( c e l l u l a s e ) 、 蜗牛酶( s n a il a s e ) 、溶菌酶( l y s o z y m e ) 均购于上海华美生物有限公司。 配制方法：称取所需浓度的酶( w ) ，采用相应的渗透压稳定缓冲液配制，经0 4 5um 微孔滤膜过滤除菌后备用，现用现配。 渗透压稳定剂：0 6 m o l l n a c l ，0 6 m 叫l k c l ，0 6 m o l l 甘露醇，0 6 m 0 1 l 蔗 糖。 其它试剂均购于中国医药集团( 上海) 试剂公司。 2 2 4 主要仪器 电子天平 m e t t l e rt o l e d o 高速冷冻离心机t g l 1 6 g上海安亭科学仪器厂 立式压力蒸汽灭菌锅u ) z x - 4 0 上海申安医疗器械厂 生化培养箱m j 一2 5 0 i 上海一恒科技有限公司 显微镜o l y m p u sc x 4 1 2 2 5 菌丝体的培养： 先在斜面培养基上活化出发菌株一次，然后在2 5 ，装液量5 0i i l l 3 0 0 i i l l 三角瓶 以先静止2 d 再1 8 眦，m i n 震摇2 3 d 的方式培养。培养好的菌丝体以5 0 0 0 r m i n ，离心2 0 i i l i n ， 收集菌丝体，用渗透压稳定剂洗涤两次，再转入平底试管。 2 2 6 原生质体制备： 取o 2 5 9 湿菌体加入l l i l l 酶液在平底试管中震荡摇匀，在适宜的温度下酶解，反应 期间每隔一段时间吸取少量酶解液镜检观察菌丝变化和原生质体制各情况，用血球计数 板计算原生质体数。酶解结束后，加入o 5 倍酶液体积的渗透压稳定剂，涡旋混合后， 用三层镜头纸过滤除去残存的菌丝体及菌丝片段，滤液以4 0 0 0r 血n 离心l o m i n ，沉淀 的原生质体用渗透压稳定剂洗涤两次后重新悬浮于稳定剂中，得纯化的原生质体。 2 2 7 原生质体的再生： 在经过纯化后的原生质体溶液中加入5 i i l i n o l l c a c l 2 h 2 0 作为保护剂，按下面两 江南大学硕士学位论文 种方式涂平板： 单层平板培养法：将原生质体悬液用液体再生培养基进行系列稀释，直接涂布在再 生固体培养基平皿中，2 5 培养3 5d 。双层平板培养法：将原生质体悬液稀释涂布 后再倒入5 m l 半固体再生培养基，2 5 培养3 5d 。 同时，为了消除残余菌丝所形成的再生菌落所带来的误差，要用低渗溶液处理原生 质体3 0 r n i n ，稀释涂布在c m 培养基上作为对照。 原生质体再生率c ，= 盟壁气蓁凳裳善嘉笔差笔蓦蓁錾寒蔷耋铲。 2 3 结果与讨论 2 3 1 原生质体形成研究 2 3 1 1 原生质体的形成和释放过程： 酶反应l h 左右菌丝开始发生变化，部分断裂( 图2 1 a ) ：反应2 3 h 后，菌丝多呈 易断的念珠状( 图2 1 b ) ，部分缠绕菌丝呈葡萄串状( 图1 c ) ，此时原生质体开始大量 释放，释放形态以原位释放为主：反应4 5 h 后，原生质体浓度升至1 07 个i i l l 以上，经 过纯化后呈分散的小球状( 图2 1 d ) ，直径约2 5 1 0um 。 图2 1m 口r mm 口f 阼 原生质体的分离 f i g 2 1b o l a d o no f f 船口r f “mm i 即lp r o t o p l a s t 2 3 1 2 培养基组成的影响： 培养基成分不同，会引起细胞壁的成分发生某种程度的变化，从而使细胞壁对酶的 敏感性发生相应的变化，影响原生质体的制备。研究了f 淞口r i m mm 叻崩y 1 1 1 7 在p d a 培养基，基础种子培养基，酵母浸膏完全培养基和m c m 培养基培养后，制备原生质体 时产量的变化( 表2 1 ) 。发现经p d a 培养基和基础种子培养基培养的菌丝体均能获得较 好的原生质体产量。故本实验采用p d a 培养基培养茵丝体。 第二章产紫杉醇内生真菌m 口r f “小”w f 形f 的原生质体制各和再生研究 表2 1 培养基组成的影响 1 砧1 e2 1e 胜c to f m e d i ao np r o t o p l a s ty i e l d 培养基种类 m e d i a 原生质体产量 p m t 叩l ty i e l d ( 1 0 7 ，m 1 ) p d a 培养基 基础种子培养基( b s m ) 酵母浸膏完全培养基( y c m ) m c m 2 8 2 9 2 5 2 2 7 o 8 1 2 o 6 2 3 1 3 预处理的影响： 根据文献报道，巯基乙醇能够打断菌丝外分泌蛋白的二硫键，破坏细胞壁外这一蛋 白保护层，使菌体的细胞壁对酶的敏感性增强【l 8 】【19 1 。我们在酶解前用o 5 巯基乙醇对 菌丝进行了预处理3 0 1 1 1 i n ，发现原生质体产量并未有明显提高，这和孙剑秋等的研究 结果一致。原因可能是菌丝预处理后再酶解，在酶解细胞壁的同时，细胞质膜也被部分 酶解，以致原生质体的产量反而较直接酶解更低。另外，亦有可能是巯基乙醇浓度偏高 或时间过长，有待进一步研究。 2 3 1 4 酶系统组成和浓度的影响： 由真菌制备原生质体采用单一酶的效果没有复合酶好，不同真菌细胞壁的组成有差 异，我们初步实验发现溶壁酶在制备过程中起关键作用，溶壁酶浓度低于2 的复合酶 系统都较难成功制备原生质体。考虑到各种酶的协同作用【l9 1 ，我们使用正交表l 9 ( 3 4 ) 作 四因素三水平正交试验，比较了溶壁酶，纤维素酶，蜗牛酶和溶菌酶的效果并做了优化。 表2 2 表明，四种酶中影响最大的是溶壁酶，其次为蜗牛酶。根据主要因素取最好水平 的原则，所以采用3 溶壁酶、3 蜗牛酶、1 5 溶菌酶和0 5 纤维素酶组成的酶系统。 经过实验，在同等条件下该酶系统能够制备得最大的原生质体产量3 7 1 0 7 个m l 。同 时，考虑到过高的酶浓度对原生质体的再生不利，而正交实验的次要因素可以不取最好 水平，因此酶系统作了适当调整，选择3 溶壁酶、2 5 蜗牛酶、1 溶菌酶和o 5 纤 维素酶。实验亦证明，采用该酶系统后原生质体产量为3 2 1 0 7 个m 1 。 2 3 1 5 菌龄及培养方式的影响： 由于持续的震摇培养容易导致菌丝密集缠绕甚至结球【2 ”，而酶对球状或团状的菌体 在短时间内很难彻底酶解。本实验研究了先静止培养2 d 以后，震摇培养时间对原生质 体产量的影响( 表2 3 ) 。结果表明，在静止培养2 d 后再1 8 0 r 佃i n 震摇2 d ，原生质体产 量最大。 江南大学硕士学位论文 表2 2 酶系的组成对原生质体制备的影响 t a b l e 2 2 e 脏c t o f t h ec o r n b i n 撕o n o f v a 哟u se n z y m e s o n p r o t o p l a s ty i d d 表2 3 培养时间对原生质体制备的影响 t a b l e2 _ 3e 虢c to f i n c u b a 血g 缸l eo np r o t o p l 船ty i e l d 吃止鼍只震孥培养，间 原生质体产量 1 1 1 1 紫撕登6 哆? p 。t o p 忑j j 美o 佃 s t n lc i l l t u r e ( d ) 。、 l 2 3 2 5 o 6 3 2 5 1 1 8 3 5 2 3 1 6 渗透压稳定剂的影响： 合适的渗透压稳定剂对原生质体的释放非常重要。由于渗透压稳定剂的存在，可以 使原生质体内部的渗透压与环境渗透压保持平衡，防止原生质体的破裂。在上述条件下， 我们比较了不同的渗透压稳定剂( o 6 肿1 l ) 对原生质体制备的影响。图2 2 显示了在 不同渗透压稳定剂下原生质体产量随时间的变化曲线，可知o 6 m o 儿的k c l 是n 阳r f “m ，l _ 口f 陀fy 1 1 1 7 最好的原生质体释放渗透压稳定剂，同浓度的n a c l 效果其次。结果亦表明 实验中所选择的有机物的稳定效果均不如无机物，原因可能是所选有机物浓度不是最适 稳定浓度。虽然有报道在丝状真菌制备原生质体时0 6 m o l 1m g s 0 4 作为渗透压稳定剂有 良好效果【l 钔，但实验中发现同浓度的k c l 在制备时效果更好，原因可能是不同种类的渗 透压稳定齐j 对酶系统与底物的促进作用不同【l9 1 。同时，不同菌种原生质体制备时的渗透 压稳定剂最适浓度也有待进一步的研究。 第二章产紫杉醇内生真菌凡m r m 卅m d 胛i 的原生质体制各和再生研究 芎3 5 吉3 0 支2 5 2 0 翟1 5 犟1 0 蓦s 皤0 345 酶解时间( h ) 图2 2 渗透压稳定剂的影响( ：n a c l ，：k c l ，m g s 0 4 ，口蔗糖甘露醇) f i g 2 2 e f f e c t so f o s m o t i cs t a b i l i z e r s