（环境科学与工程专业论文）消油剂处理燃料油对两种海洋生物的毒性效应影响研究.pdf

英文摘要 a b s t l a c t i ： u et oo i le x p l o r a t i o n ，t e n n i n a lo p e r a t i o n ，s h i p p i n gn ? a n s p o n a t i o na n da l ik i n d so f u n e x p e c t e d0 i ls p i l l s ，l a r g eo i lp o l l u t i o n sg e ti n t 0m e a ，w h i c ht l l r e a t st h em a f i n e e c o l o g i c a le n v i r o n m 饥t t h es t u d yo nt o x i ce f r e c to fp e t r o l e u mh y 山o c a r b o n sp o l l u t i o n t 0m a r i n eo r g 锄i s m sc 锄p r o v i d ed a t i l mf o rq u 卸t i t a t i v e 私s e s s m e n to ft h ep 0 1 l u t i o n s d a h l a g et ot 1 1 es e a ，锄dh a v et 1 1 ei m p o n a l l tv a l u et 0t l l ec o n t r d lo ft l l eo i lp o l i u t i o n c h o o s i n gc h l o r e l l a 柚dl u m i n e s c e n tb a c t e r i a 舔t e s ts p e c i e s ，t 1 1 ep a p c rs t u d i e st l l et o x i c e f f e c to fl2 0 群如e lo i ld i s p e 瑙i o n 锄de m u l s i o no nt h e m t l h er c s e a r c hf i r s ts t i l d i e sm ee f j f e c to fl2 删允e lo i l 锄dw a t c rm i x i n gr a t i o 锄do i l d i s p c r s a n td e l i v e r yr a t i oo no i ic o n t e n t ，觚d 也e nm a k et h ep r 印a r a t i 叩p r o g r a mo fl2 嘴 允e l0 i ld i s p e 飓i o n 锄de m u l s i o n f n 们u g l lt h ea c u t et i 畎i ce 艉c t so f12 皑f h e lo i l 蚴c h l o r e l l a t l l ei r l l l i b i t i o nm t 部 粕dt h ei i l h i b i t i o nc u r v e so f 蓼o 、t h 哦0 b t a i n c d n e 陀l a t i o n s h i pb e t 、 ，e 廿l e c o n c 仃a t i 锄dt 1 1 et o x i ce 舵c tc 柚b es 印a r a t e l yf i t t e dw i n lg e m l i z e dl o g i t 锄d g 饥e m l i z e dl o g i tif i m c t i o nm o d e lw h i c hh a v et h eb e s t 他s u i t s t h er c l a t i o n s h i po f e c 5 0 柚dt i m ec 锄b ed e s c 抽e db e n c rw i t l lp a r a b o l a 劬c t i o nm o d e l t h e 托s e a r c h s h o w c dt h a t 也e9 6 he c 轴v a l u eo fd i s p e 硌i o n 觚d 锄u l s i o n0 fl2 皑觚lo i lo nc h l o r e i l a i s5 0 6 6 m g l 柚d2 6 2 6 m g l ，r e s p e c t i v e l y ，锄dt l l ev a l u eo fe c 5 0i n c r e 弱e s 、们t 1 1t i m c t h e 姒i c i 锣o f1 2 0 捍凡e lo i lt ol u m i n e s c tb a c t e r i ai ss t l l d i e s t b er e s e 砌 c o m p a r c st 1 1 ef i t t i n gr c 辄l to fs e v e m l 如n c t i o n s ，锄dc o n c l u d e st i l a tt l l er c l a t i o n s h i p b e 铆咖d i s p e r s i o n 锄d 锄u l s i o nc 仰c e n 仃a t i o n 觚de 虢c tc 柚b e6 t t e db e n e rw i m g e n e r a l i z e dl o g i ti ia n db o x c o xl o g i t 如n c t i o nm o d e l t 1 l e9 6he c 5 0v a l u eo f12 0 捍 如e lo i ld i s p e r s i o n 彻d 锄u l s i o n0 nl 啪i n e s c e n tb a c t 鲥ai s2 5 0 2 m g l 柚d2 2 0 3 m g l ， r c s p e c t i v e l y ns i m i l 矾yp 耵d v e sd i s p e r s i o ni sl e s st o x i cm 锄哪u l s i 咖 b yc o m p a r i n ge c 5 0v a l u e so fl2 0 拌f h e lo i ld i s p e r s i o n 锄d 锄u l s i o no nc h l o r e l l a 锄dl m n i n e s c e n tb a c t e r i a ，t l l e 豫s u l t ss h o wt h a tt l l e t o x i c i 秒o fl2 0 群如e l o i lo n l u m i n e s c e n tb a c t e r i ai sm o r es e n s i t i v et h a nc h l o r e l l a k e y w o r d 墨：如do n ；伽d l s p e n _ n t ；c u o r d h ；l u m 组髑c e 毗b a c t 盯h ；t i l d ce m e n 消油剂处理燃料油对两种海洋生物的毒性效应影响研究 1 1 研究背景 第l 章绪论 海洋作为万物生命的起源地，不仅给人类提供了珍贵的水资源，而且其中蕴 藏着极其丰富的化学资源。海水中现己发现的化学物质有8 0 多种，其中有1 1 种 元素( 氯、氟、钠、镁、钾、钙、溴、硫、碳、硼和锶) 占海水溶解物质总量的 9 9 8 以上，其中有5 0 多种为可提取的化学物质。世界上8 5 水产品都来自于海洋， 其中大部分以鱼类为主，还有多种多样的藻类资源。又因海水运动而产生的如潮 汐能、海洋能、波浪能、以及由于海水温差和盐差而引起的温差能与盐差能等， 为不可或缺的动力资源。 在全球的经济迅猛发展的现今社会，海洋在人类可持续发展中起到了至关重 要的作用。但随着人口不断增长以及工业迅速发展，人类的生活生产给海洋的带 来了巨大的负面影响，人类以各种途径向海洋中排放了大量的废水废物，致使海 水的含盐量、温度、透明度、p h 、生物种类和性状等发生改变，对海洋生态环境 构成了危害。海洋危害的几个突出表现为有毒物质的累积、赤潮、油污染等方面， 与此同时其中油污染更是环境问题一大难点。 随着人们对石油需求的不断增长，海上石油污染风险也在不断增大，航运油 轮溢油、海上石油开采、码头作业以及船舶运输所引起的突发石油污染事件频发， 导致大量的石油污染物进入海洋，严重威胁海洋及陆域生态环境。另外，在海上 溢油清除过程中化学消油剂的广泛使用也对海洋生态尤其生物也有不同程度的毒 害作用。 1 1 1 海洋石油污染来源 根据联合国海事组织( i m o ) 的统计【1 】，全世界以各种途径进入海洋的石油及其 产品每年达到约为1 0 0 肛1 5 0 0 万吨。其主要来源可分为【2 】：自然因素( 约占9 2 ) ， 包括由于海洋中含油地层的提升致使海底油藏的泄露，以及河流侵蚀陆地含油沉 积岩冲积到海水中；人类活动来源( 约占8 ) ，主要为海上石油开采作业、事故性 溢油以及其他方式。具体海洋石油来源【3 】见表1 1 。 第1 章绪论 表1 1 海洋石油的来源 t a b l e1 1t h es o u r c eo f o f r h o r eo i l 海上石油 钻井正常、违章排放 突 人运输开采船舶正常、违章排放 发 类海洋源 事故性钻井泄露 性 输 活输入船舶受损泄露 入 动 沿海地区排放 慢 大陆源 来 大陆径流输入性 源 含油 木材类燃烧 长 大气矿物燃料燃烧产生 期 天然海底、大陆架泄露 输 来源含油沉积岩缺损 入 1 1 2 海洋石油污染现状 每年通过各种渠道进入海洋的石油以及石油产品，约占全世界石油总产量的0 5 ，由于航运而排入海洋的石油烃污染物就达1 6 0 2 0 0 万t ，而其中三分之一左右 是油轮在海上发生事故导致石油泄漏造成的。根据我国国家海洋局 煤油 柴油 原油 润滑油。胜利原油对真鳃、牙坪及黑嵋仔 鱼的4 8 h l c 5 0 值分别为6 4 、1 3 7 和l o 7 m g l ，对暇虎鱼和牙醉仔鱼9 6 h l c 5 0 值分 别为6 6 、1 6m g l 。林钦和贾晓平测定了原油、删柴油以及2 钟柴油对刀额新对虾、 日本对虾和斑节对虾3 种仔虾以及前鳞鲻、黑鲷、黄鳍鲷和七星鲈4 种仔鱼的急 性毒性，发现石油烃对仔虾、仔鱼的毒性顺序均为：鲥柴油 2 0 柴油 南海原油， 且油类分散液的毒性大于油类水溶性组分【3 2 】。贾晓平等【3 3 】在其他研究中发现嘣柴 油对几种贝类的9 6 h l c 5 0 值在1 4 l 巧4 6 m g ，l 之间，而文蛤的l c 5 0 为3 2 m g ，i 。l s m a 玎 g u l e c 实验报道【蚓石油组分对三种水生生物的急性毒性的9 6 h e c 5 0 都已超过 2 5 8 ，0 0 0 p p m 。c 锄e la 等总结之前研究结果表明，原油对早期生命阶段的r a i n b o w 丘s h 的9 6 h l c 5 0 值从1 2 3 5 3 3 m g l 。吕福荣等在对海胆进行油污实验得出结论： 侧柴油分散液对马粪海胆的9 6 h l c 5 0 值分别为9 6 m g l 。田力杰等【3 5 1 总结的结论是 原油对海洋生物的毒性研究结果见表1 3 。 消油剂处理燃料油对两种海洋生物的毒性效应影响研究 表1 3 石油对各类海洋生物的危害浓度 t a b l e1 31 1 1 eh 舵a r dc o n c e n t r a t i o no f o i l t oa i lk i n d sm 撕n eb i o l o g y 1 2 2 消油剂对水生生物的毒性研究 国内外关于消油剂对生物的毒性研究己有不少，但究其对海洋生态是有益处 的还是有害处的，目前尚未有一致的结论。一是如若不使用消油剂，溢油所产生 的油膜给水体和生物带来危害；二是又因使用消油剂虽然减弱了溢油的影响，但 相对的消油剂又会对许多生物个体和生物链带来一些消极影响，因此消油剂的毒 性研究一直受到各国研究学者的关注。很多研究都会针对加分散剂后分散液 ( d i s p e r s e dw a t c ra c c o m m o d a t e df m c t i ，乳化液) 和单纯油分散液m t 盯 a c c o m m o d a t e df m c t i 咖，分散液) 的毒性加以比较，但结果的半致死浓度有很大的 不同，其原因可能是实验条件、受试生物和实验方法等的差异。由于这些研究提 供的数据可比性和可利用率非常小，所以有必要建立一套合理又实用的石油和消 油剂毒性检验方法。 邓岳文等【3 6 l 研究了g m s - 2 牌、青岛牌和海环牌三种消油剂对合浦珠母贝稚贝 的急性毒性试验，结果三种消油剂的l c 5 0 分别为1 2 5 8 m g l 、2 5 4 5 m g l 和4 4 6 9 m g l ： 杨波、关敏等【3 7 】用双象l 号、奥妙能、碧浪宁8 6 8 、g a m l e n 、 n a l d l e e t9 0 l o 和 c o 玎e x i t9 5 2 7 六种消油剂对阿匍鳜虎鱼、菲律宾蛤仔、中肋骨条藻和中华哲水蚤的 毒性进行了研究，且并对毒性大小进行了比较。这些研究都是关于单独的消油剂 的毒性研究，说明消油剂对生物是有影响的。 杨庆霄在研究表明，双象l 撑消油剂以及原油消油剂的混合物浓度在3 m g l 以 上时，孔石莼藻体叶绿素a 含量都有下降，在同一条件，且混合物溶液对这种浮 游植物生长的影响要比单一溶液要大。s 姗m 等【3 8 】得出原油的分散液和乳化液对 第l 章绪论 ，o p a l j j d u s 卵的4 8 h l c 5 0 分别为0 3 9 和1 8m 鲫，其讨论结果为总石油烃的增加对 生物的毒性影响很小。m i t c h e l l 等1 3 9 】报道，原油的分散液和乳化液对i n v e n e b r a t e h y d r av i r i d i s s i m a 的9 6 h l c 5 0 值分别为0 7 和9 0m l 总石油烃。s i n g e r 对l a r v a l t o p s m e l t 的研究表明分散液和乳化液的9 6 hl c 5 0 值分别为( 1 6 3 似0 2 0 ) 和 ( 2 8 6 0 7 4 7 3 ) 。相似的，f u c i l ( 等发现即使因加入分散剂后总石油烃的浓度增加了 石油的乳化液对各种海洋生物的毒性水平仍小于石油分散液的毒性。 然而g n l e c 等【删试验研究得出结论原油水溶性组分对一种海洋生物a m p h i p o d a l l o r c h e s t e s c o m p r c s s a 的9 6 h l c 5 0 为3 l1 0 0 0 m 鲫，而原油添加c o 陀x i t9 5 2 7 后的水 溶性成份的9 6 h l c 5 0 降至1 6 2 m g ，l 。s h a f i rs 用燃料油的乳化液对砌矗场阳懈妇懈， 删和岛比彬溯泐忉急性毒性试验时，得出加消油剂的毒性明显增加。 c o l l i l l a r dcm 的研究表明，石油加入消油剂后，石油分散液中多环芳烃的浓度增 加，仔鱼的e r o d 活性加强，对仔鱼的毒性加剧。s c 觚l e n a 用两种消油剂的分散 液进行了对比试验，也得到了同样的结论。同样的吕福荣等【4 l 】对海胆的研究结果 表明：脚柴油分散液、加入消油剂的乳化液对马粪海胆的9 6 h l c 5 0 值分别为9 6 m g ，l 和5 1m g l ，这个结果表明乳化液的急性毒性大于分散液。 在决定是否使用消油剂作为应急措施时，应优先考虑消油剂本身对水生生态 的毒性以及分散油的毒性，并且要结合优先保护物种或生态环境等其他因素。并 且无论是对油品的分散液还是乳化液的研究表明，其半致死浓度差异很大，分析 其中原因可能是试验条件的各种差异所致。综上所述，有必要建立一套比较完整 合理的石油毒性检验方法。 1 2 3 生物毒性研究 1 2 3 1 藻类的毒性研究 藻类作为水生生态系统的初级生产者，处于环境中的毒物会明显影响到藻类 的分布，经大量的研究的测试及总结，发现藻类对于许多环境污染物的敏感程度 高于鱼类、甲壳类，且易于培养、培养周期短，藻类可以直接通过显微镜观察其 在细胞水平上的毒性症状等特点【4 2 l ，是比较理想的污染物毒性测试材料。因为藻 类是对虾和贝类等生物天然的优质饵料，在育苗的生产阶段，藻类一旦被污染， 都可能会影响水中其他生物的生长。 消油剂处理燃料油对两种海洋生物的毒性效应影响研究 ， 依据标准方法进行污染物对生物的急性毒性试验，得出2 4 、4 8 、7 2 9 6 h 等 时刻的e c 5 0 值，从而建立时间效应方程、浓度效应方程，以此得到污染物的毒 性效应。陈海柳等1 4 3 l 实验得出结论，选取几种藻类对六价c r 毒性耐受性顺序：四 尾栅藻 羊角月牙藻 钝顶螺旋藻 极大螺旋藻 聚球藻 蛋白核小球藻。王翠红， 徐建红等【删使用了小球藻为受试物对三种重金属离子及六种有机磷农药进行毒性 比较研究。刘娜在研究对小球藻的毒性效应中得出油品的毒性顺序为：汽洳2 矿 柴油 0 一柴油 0 “船用柴油 船用燃料油，即轻质油的毒性大于重质油的毒性。金伟【4 5 】 研究了盐度、铬等对单细胞藻的毒性效应，从它的生长、呼吸作用、光合作用、 叶绿素合成及s o d 酶谱方面研究对其影响，结果证实在一定的浓度范围内，对藻 类是有很大的毒害作用。 唐学玺，于娟等【删使用有机磷农药对海洋微藻的毒性机理进行了研究，结果 表明，三种海洋微藻：叉鞭金藻、扁藻和三角褐指藻细胞的膜脂过氧化产物丙二 醛含量不断提高，并且细胞中的电解质外渗率也有所增加。张洪勋i 卅选用了七种 苯的取代物对小球藻的生长影响进行研究，得出在水质富营养化时，发现了某些 物质可以抑制藻类生长，而另一些却能够促进藻类生长。以上这些情况的可能解 释为：较低浓度的污染物作为营养物质而被藻吸收而富集，或者是刺激并加速了 细胞分裂。物质的促进顺序上的差别影响是一个复杂问题，必须要连同细胞的生 命过程共同加以考虑，这些尚待进一步研究。 我国环保局推荐了几种藻类进行污染物毒性方面的实验，如普通小球藻、蛋 白核小球藻、斜生栅藻、四尾栅藻和羊角月牙藻。并有研究表明：在这几种藻类 中，羊角月牙藻对毒物较敏感，普通小球藻及蛋白核小球藻对毒物抗性较强。 1 2 3 2 发光细菌的毒性研究 自从二十世纪3 0 年代，发光细菌就已开始应用到快速评价污染物的毒性作用， 5 0 年代，随着工业污染的情况越来越严重，其在环境污染中的应用也逐渐备受重 视，到了7 0 年代，由于m i c r o t o x 系【4 8 】的出现，很多国家的环境研究和监测机构开 始使用这种法快速测试环境污染物的生物毒性。我国也一直推广利用发光细菌进 行测试物质毒性的方法，并设计并制造了专用的发光测定仪。 发光细菌法1 4 9 】是通过光电测量系统，测定毒物对其发光强度的影响，以此来 直观反映毒物的毒性效应的方法。发光细菌由于体内含有荧光酶、荧光素、a t p 第l 章绪论 等发光要素，当其处于有氧条件下会发出徼弱的荧光。在其体内的细胞活性继续 升高而积极分裂，增加了a t p 含量，于是其发光强度便会增强：然而当毒物作用 于发光细菌时，细胞活性会下降，a t p 含量就随之降低，于是其发光强度降低。 所以毒物浓度与菌体发光强度会呈现线性负相关，进而便可用发光细菌的发光度 表征毒物的急性毒性效应。 k a l l n l 等人【划于1 9 9 9 年采用一系列毒性测试方法，来对油页岩工业区的含酚 废水的毒性进行评价，得出其中发光细菌方法是最为合适的方法。c l 啪等【5 - 】系统 地研究了明亮发光杆菌对有毒污染物的连续监测，比较了h 9 2 + 、p b 2 + 、c d 2 + 、n i 2 + 、 a s ( ) 、十二烷基硫酸钠( s d s ) 和五氯苯酚( p c p ) 的毒性大小以及检测的灵敏度。张 亚旦等【5 2 】使用发光细菌毒性测试技术，对9 3 撑汽油、m 5 0 甲醇汽油和e 1 0 乙醇汽 油的毒性进行了研究，结果得出毒性大小：9 3 撑气油 e 1 0 乙醇汽油 m 5 0 甲醇汽油 于此同时，还检测了单纯的添加剂的毒性，得出结论为汽油的主要毒性是来源于 其中的石油烃。刘清等【5 3 】研究了c d 、c u 、z i l 、h g 对发光细菌的联合毒性，并通 过毒性加强指数t e i ( t o x i c 时e n l l 锄c c - m c n ti n d e x ) 对其联合作用进行了评价，得出 两两金属相加是拮抗还是协同作用。b o l i c h 【5 4 1 采用发光细菌方法对鱼类、蚤类测定 了工业废水的急性毒性，根据试验结果，提出了3 个毒性比较分级标准以供科研 人员使用，如表1 4 所示。 表1 4 发光细菌试验百分数法等级划分 1 a b l e1 4c l 豁s i f i c a t i o f t h ep e r c 曲t a g em e t l l o do f l u m i l l 岱c tb a c t 甜a 1 3 研究目的、内容和意义 1 3 1 研究目的 由于海洋石油污染的日趋严重，特别是各种突发性溢油事故，严重的破坏了 消油剂处理燃料油对两种海洋生物的毒性效应影响研究 海洋的生态平衡，降低了海洋的利用价值。在溢油事故后化学消油剂的使用，对 海洋生物的毒性效应也有待深入的研究。目前我国对海上溢油损害程度的评估模 式存在着手段不统一和主观性较大的缺陷，尚且缺少有效的评估模式。所以定量 评估石油对海洋环境的危害及破坏程度，开展有关石油烃对海洋生物的毒性效应 研究是非常必要的。 在传统的检测方法中，可以直接对水体中有害物质的种类及其浓度等相关参 数进行分析及测定。但是由于水体污染现象的严重，水体环境也随之越来越复杂， 进而无法更好的推断污染物对生物的毒害作用效果或是污染物究竟是以何种方式 对生物造成毒害作用的。换言之，传统化学分析并不能在整体水平反映水环境的 优劣，更无法预测污染物对生态系统的影响。所以利用生物毒性测试来了解污染 物对水体环境的影响效应是必要的。 关于石油烃污染对海洋生物的急性毒性研究，大多数都集中在经济品种如鱼 类及虾、贝类，然而对浮游植物和低级生物的研究很少，且大部分也只限于生长 发育情况的观察，而定量化毒性研究相对更少。因此本研究的目的就是针对一种 石油烃，探讨和建立其及添加消油剂后的油品对单细胞小球藻和发光细菌的毒性 研究方法，在设计一些试验基础上，获得相应的急性毒性数值，为定量化评估溢 油对海洋生态的损失量提供基础实验数据。 1 3 2 研究内容 本实验选择了较少研究的1 2 嘴船用燃料油作为试验油品，分别以小球藻和发 光细菌为受试生物，研究了1 2 0 i 燃料油及加消油剂后的油品对水生生物的毒性效 应影响。 1 通过1 2 0 撑燃料油在不同油水比例及消油剂的投放比例的实验，得出燃料油、 海水和消油剂不同混合比例对最终水中油含量的影响，并得出实验所用油品的最 佳投放比例及制备方案； 2 测定了1 2 0 j 毕燃料油的分散液和乳化液对小球藻的毒性影响，并通过非线性 拟合得出其对小球藻的e c 5 0 值； 3 测定了1 2 0 撑燃料油的分散液和乳化液对发光细菌的毒性影响，并通过非线 性拟合得出其对小球藻的e c 5 0 值； 第l 章绪论 4 通过以上的毒性研究，评价1 2 0 撑燃料油加消油剂前后毒性大小的变化，并 比较小球藻和发光细菌两受试生物对毒性的敏感程度。 分别测定1 2 0 f 燃料油分散 液及乳化液的相关属性 上 确定1 2 雠燃料油分散液 及乳化液制备方案 i 图1 1 研究中采用的技术路线 f i g 1 1 1t l l e 自h n i c a l 删t eo f t l l cp 他s ts t i l d ) ， 消油剂处理燃料油对两种海洋生物的毒性效应影响研究 1 3 3 研究意义， 1 在生物毒性监测中，通常是从生态学上来考虑物种的选择，如浮游生物、 处于早期发育阶段的生物或受污染的直接物种等。然而海洋石油烃污染的生物监 测目前还没有标准意义的物种，因此本研究中选用了小球藻，发光细菌作为受试 生物进行试验研究，可以为石油污染敏感生物的选择和海洋环境监测提供基础的 方法及数据。 2 本文研究了1 2 侧燃料油分散液及乳化液对普通小球藻和发光细菌的急性毒 性，通过相关的毒性试验获得了1 2 侧燃料油对小球藻2 4 1 6 8 h 半数抑制浓度数据， 发光细菌的1 5 m i n 的半数致死浓度，这些实验测得的急性毒性数据可以为石油污染 损害的评估提供了参考依据。 3 本研究中对消油剂进行了相关研究，测得了其与1 2 雠燃料油结合的毒性数 据，为石油添加消油剂后对生物的联合毒性效应提供了相关的试验依据。 4 结合溢油对生物的损害效应和时间关系，展开了进一步的探讨，为定量的 评价海洋石油烃污染提供了一个可供参考的数据。 第2 章试验材料和方法 2 1 试验材料 ， 第2 章实验材料和方法 2 1 1 试验油品及消油剂 2 1 1 1 试验油品 本研究选择了船用燃料油。据b p 能源统计，2 0 0 9 年世界残渣型燃料油的需 求约为4 5 亿吨，船舶燃料油需求约为】4 亿吨。而我国燃料油的年消耗量为3 3 9 5 万吨，其中自产1 7 9 5 万吨，进口1 6 0 0 万吨【5 5 】。 燃料油又称重油、渣油，是一种呈暗黑色、粘稠的液体【5 6 】。定义燃料油有两 种说法，欧洲的定义一般是指原油在蒸馏之后留下的粘稠残余物，或是与轻组分 的混合物，而美国则指任何闪点不低于3 7 8 的原油产品、且可液化或可燃烧， 它既可以是残渣燃料油也可是馏分燃料油，主要是用于燃料，如应用于蒸汽炉、 加热炉或大型慢速柴油及各种工业。 燃料油是成品油的一种，在原油加工过程中，经过汽、煤、柴油之后的，从 原油中分离出来的较重的剩余产物。燃料油的分类：根据性质和使用用途，以及 当前国际标准( i s o ) ，a s 刑标准和国家标准，燃料油可以分两大类，即馏分燃 料油和残渣燃料油。 馏分燃料油一般是由直溜重油混合一定比例的柴油而成，其具有一定的透光 度、清澈透明，较易和原油区分开，用于中速或高速船用柴油机和小型锅炉油和 重柴油等；而残渣燃料油是减压残渣或裂化残油、或是二者的混合物，包括重油 和渣油等，残渣燃料油特点是黑色粘稠，不具有透光度，并且粘度大，组成上含 非烃化合物、胶质、沥青质多，没有轻组分，主要用于低速柴油机、各种工业炉 或锅炉作为燃料【s 7 】。 对于船舶燃料油市场上规定了两个主要特点：一质量要统一，都要遵循国际 海事组织制定的标准，这与汽柴油质量情况不同；二是流动性强，其需求随着海 上贸易量和方向而变化，这与航空煤油的情况相似。 1 2 伽燃料油是由减粘渣油与一定比例的柴油调和而成，是一种运动粘度不大 于1 2 0 i 】眦n 2 s 的残渣型燃料油。目前供需双方一般相约1 2 皑燃料油按i s o8 2 1 7 2 0 0 5 消油剂处理燃料油对两种海洋生物的毒性效应影响研究 ( 或1 9 9 6 ) 标准巾的r m d 8 0 指标执行( 粘度除外) 。 农2 1 1 2 0 f 燃料油性能执行标准 t a b l e2 1l2 0 拌凡e io i lp e o n n a n c es t a n d a r d s 2 1 1 2 试验所用消油剂 消油剂选用白灵牌9 1 9 型溢油分散剂( 浓缩型) 。 本消油剂在使用时的用量比例为：根据油的品种、厚度及风化程度而定。通 常对于新兴出的稀薄渍层，用量约为溢油的1 5 3 0 左右，油层较厚时应采取吸、 刮和其它方法尽量回收，余下1 m m 左右时再施以本消油剂。遇有特殊情况，可继 续增加用量，但最多不能超过溢油的一倍以上。 2 1 2 受试生物的选择 采用生物监测的方法能较好的反映污染物对海洋环境的污染情况。传统的生 物毒性评价常以哺乳类作为受试对象，因操作较为复杂、周期相对较长，不能满 足快速监测的需要【5 s 】。近年来，浮游生物和微生物因其快速、简便、灵敏和低廉 的特点备受研究人员的重视。本文选择了小球藻和发光细菌作为受试生物。 】小球藻 小球藻【5 9 】是北方海域具有一定代表性的藻种，是海洋食物 链的低层基石，有一定的科研价值( 图2 1 ) 。小球藻通过显微镜 的观察表现出明显细胞形态，颜色形态较易辨别。在本实验中 通过几次对小球藻的接种，绘制的生长曲线上可以看出，小球 藻生长繁殖很快，并在较短时间达到对数生期，基于这些特征 图2 1 普通小球藻 表明小球藻符合急性毒性试验的要求。 f j g 2 1 翻励砒v u l g a 本研究选择了普通小球藻( c h i o r e l l av u l g a ) ，其藻类呈圆球形或略椭圆形，较 第2 章试验材料和方法 蛋白核小球藻大，胞体直径5 1 0 岬，细胞壁薄，胞内的原生质体中具有1 枚透明 的细胞核。色素体绿色，呈深杯状，位于胞壁内的细胞底部，往往不见造粉核。 其繁殖能力强，繁殖时，其所形成的不动孢子，每藻体为8 枚，不动孢子的直径 0 8 2 岬，当母细胞壁破裂时，孢子放出成为新的植物体。 2 发光细菌 发光细菌【6 - 】为革兰氏阴性、兼性厌氧型细菌，它们广泛分布于海洋或非海 洋环境中，以游离或同鱼类、浮游生物共栖状态，分离培养较容易，其中发现的 发光杆菌属、希瓦氏菌属和弧菌属为海洋细菌。 发光细菌的生长过程同样包括生长初期、对数生长期、稳定期和衰减期。细 菌发光反应的主要参与物质包括包括荧光酶、n a d ( p ) h 、f m n 、八碳以上长链脂 肪醛( r c h o ) 、分子氧等。在荧光酶的作用下，f m n h 2 和r c h o 被0 2 氧化，产生 的能量并未被储存，而是通过光的形式释放出来，其反应式如下： n a d ( p ) h + f m n + h + 型塑! 翌笙一n a d ( p ) + + f m n h 2( 2 1 ) f m h n 2 + r c h 0 牛0 2 型；曼jf m n + r c o o h + h 2 叶l l v ( 4 9 0 啪) ( 2 2 ) 在一定的条件下发光强度是恒定的，当与外来干扰物，如各种形式的污染物 质接触后，便会影响了发光细菌新陈代谢或是使其体内的a t p 含量水平下降，导 致发光强度降低。在一定条件下，有毒物浓度的大小与发光细菌强度变化具有一 定的关系，使用精密仪器便可测出待测物作用前后的光强度变化，从而推算出综 合毒性大小。因为发光细菌灵敏程度高，且快速、简便、费用低，所以其适用于 研究急性毒性。 2 1 3 实验仪器和药品 2 1 3 1 实验仪器 1 j d s 1 0 6 u 红外分光测油仪 2 恒温磁力搅拌器 3 u v l1 0 2 紫外可见分光光度计 4 生物毒性测试仪 5 原子摩尔冷光检测仪 6 紫外何见近红外分光光度仪 消油剂处理燃料油对两种海洋生物的毒性效应影响研究 7 培养箱( 温度范围2 1 2 5 2 且具连续均匀光照，光谱范围为4 0 0 ， 7 0 0 r i m ，光通量0 7 2 l0 2 0 光子( m 2 s ) ) 8 无菌操作台和摇床 9 k q 5 2 0 0 d e 型数控超声清洗器。 1 0 其他：显微镜、9 6 孔板试样、1 0 n l l 比色管、锥形瓶、量筒、移液枪、烧 杯和分液漏斗等。 2 1 3 2 试验药品 分析纯四氯化碳、无水硫酸钠、盐酸、无水乙醇。 2 2 小球藻试验 2 2 1 小球藻的培养 1 小球藻的选取 小球藻藻种质量对培养效果影响很大，一般要求选取生命力强，生长旺盛 的藻种。可从以下几个方面考虑藻种好坏的标准： 外观：其颜色正常情况下，呈鲜绿色；水中分布情况，有运动能力的藻类上 浮运动，无运动能力的藻类均匀悬浮于水中；好的藻种无明显附壁，无大量沉淀。 镜检：好的藻种细胞颜色鲜艳，运动种类运动活泼，无杂藻和敌害生物存在。 培养单细胞藻类可分为几个阶段：生长延缓期、指数生长期、静止期等【6 2 j 。 因小球藻的急性毒性实验要选取其指数生长期的藻类接种并实验。实验前十五天 将藻种转移到锥形瓶进行接种和扩培养，在此过程要注意高压灭菌工作，并记录 生长速度和绘制生长曲线。 2 小球藻的培养 在光照培养箱中培养，旧光灯照明，光强2 0 0 0 3 0 0 0 1 u x ，光暗比1 0 ：1 4 ，培 养温度在2 4 2 。培养藻液取自大连星海湾水域的天然海水，经沉淀、过滤、煮 沸消毒并过夜贮存后使用，所有仪器都要经过高压灭菌后使用。小球藻的培养采 用f 2 ( g u i l i a r d ，1 9 6 2 ) 的改良配方。配制好的营养液要经过高压灭菌后，用棕色 瓶保存于4 环境中。培养基配方见2 1 ( 其中若有难溶固体需加热，如n a 2 s i 0 3 9 h 2 0 ) 。 第2 章试验材料和方法 ，表2 1f 2 培养基改良配方 t 如l e2 1r e f 0 咖e df y 2c u l t u r cm e d i 岫 试剂 n a n 0 3 n a h 2 p o n a 2 s i 0 3 9 h 2 0 舵微量元素溶液 舵维生素溶液 海水 含量 7 5 r n g 4 4 m g 2 0 m g l m l l 如i l 1 0 0 0 m i ， 舵维生素溶液( 置于阴暗处) 试剂 含量 维生素b 1 2 维生素h 维生素b 1 0 5 m g o 5 m g 1 0 0 恤g 纯水 l o o o m l z n s o 7 h 2 0 c u s o 5 h 2 0 m n c l 2 4 h 2 0 n a 2 m o i d 4 2 h 2 0 n a 2 e d t a c o c l 2 6 h 2 0 纯水 2 3 m g l o m g 1 7 8 m g 3 9 9 7 3 m g 4 3 5 9 1 2 m g 1 0 c d m i ， 培养方法：每天摇动2 3 次，将藻液培养到较高浓度后，要进行扩大培养和 2 0 消油剂处理燃料油对两种海洋生物的毒性效应影响研究 接种。选择无污染、生长旺盛、颜色正常、藻液中无沉淀、无附壁的藻种进行接 种。一般来说藻种液和新培养液的比例为1 ：4 左右比例，7 1 0 d 转接一次，使藻 细胞始终生长良好，以备随时有足够的数量的藻液进行试验。藻培养过程中，藻 液的接种和取样均在超净工作台上进行无菌操作。 2 2 2 生长曲线的测定 取预培养中生长良好的小球藻藻液，适当稀释后，在显微镜下观察有无原生 动物或者其它微生物污染，如被污染，则整个培养液会呈灰白色，高倍显微镜下 可观察到大量的细菌，如没有，且生长良好，即可用于实验。试验前，适应性生 长一周，这时便可测定小球藻的吸光度来观察其生长情况。 由图2 2 可见，用紫外可见近红外分光光度仪对小球藻藻液做全波长扫描， 可以得到小球藻的最大吸收峰为6 8 6 啪。 图2 2 小球藻藻液的最大吸收峰分析图 f i g 2 2a n a l y s j sf i g u r co fc h l o 他l i ap y o i d e s sm 戤i m 啪a b s o r p t i 伽p e a l c s 每天定时测定藻液在6 8 6 m n 处的吸光度，以测定时间为横坐标，以吸光度为 纵坐标绘图，这样便可确定小球藻的生长曲线( 图2 3 ) 。进行毒性试验时要选用 处于对数期的小球藻。 第2 章试验材料和方法 0 5 0 4 兰0 3 o 2 0 1 0 01234 5 6789 t d 图2 3 小球藻正常生长曲线( 以吸光度表示) f i g 2 31 1 1 eg r 0 州h 涨o f c h l o r e n ap y e n o i d e s ( a b s ) 2 2 3 小球藻急性毒性实验方法 藻类试验有细胞计数法和光密度法，通过小球藻的全波长扫描得知其在6 8 6 砌 处有最大吸收峰，所以本实验选择了简便且重现性很高的光密度法进行试验。光 密度( a i p t i c a ld 髓s 时，o d ) 的定义是材料遮光能力的表征量。它通过透光镜来进 行测量，表示被检测物质吸收掉的光密度。光密度没有量纲单位，是一对数值， 光密度是入射光与透射光比值的对数，其计算公式为o d l o g l 0 ( 入射光透射光) 试验中取适量的受试藻液放入比色皿中，利用分光光度计，测定其在6 8 6 姗处的 吸光度用来反映光密度的变化。 本实验参考了有关藻类的生长急性毒性抑制试验方法，并依据化学品对藻类 毒性的标准测试方法，采用封闭式静水培养法，并每天固定时间摇匀藻液。试验 藻液初始的藻液的吸光度控制在o 0 7 0 1 ，将初始藻液和不同浓度的油分散液按总 体积为1 0 0 m l 作为实验液，转移至2 5 0 n l l 具塞锥形瓶中培养，培养条件同小球藻 生长期间相同。培养期间人工摇匀藻液，每天定期各2 次。 每天在小球藻生长良好的上午为测试时间，测定其吸光度为试验数据。并每 个处理组设定3 个平行样，在平行样之间的相对偏差小于1 0 时，取3 个平行样 消油剂处理燃料油对两种海洋生物的毒性效应影响研究 的均值作为试验数据。 1 预实验：根据相关文献选定几个浓度范围，每天测定小球藻藻液吸光度变 化，测定一周左右，找出正式实验的浓度范围。 2 正式试验：根据预实验结果，将待测油污按等对数间距配成1 0 个浓度梯度， 并每个浓度点设三个平行，同样测定其吸光度变化情况。 2 2 4 数据处理 藻类生长抑制率，以藻类的吸光度来计算【6 3 侧： 抑制率= ( 1 _ 筹) l o o ( 2 3 ) 一一a c o 式中：a 。为处理组第n 次测定时藻液吸光度；a 。为处理组初次测定时藻液吸 光度；a 。为对照组第n 次测定时藻液吸光度；如为对照组初次测定时藻液吸光度。 2 3 发光细菌实验 本实验选用的菌种为明亮发光杆菌( p h o t o b a c t 嘶u mp h o s p h o r c 啪) t 3 小种冻干 粉，其在含3 n a c l 和0 3 甘油的生长介质中最有利于其发光，适宜其存活的温度 在2 0 3 0 ，适宜的p h 为6 o 9 0 。 2 3 1 发光细菌的培养 1 培养液的制备 表2 2 为发光细菌的营养液配方。 表2 2 发光细菌培养液配方 t i l b l c2 2f o m u l ao fc u l m r ef l u i do fl u m i n e s c e n tb a c t e u m 成分含量 酵母浸出青 胰蛋白胨 n a c l n a 2 h p o k h 2 p 0 甘油 蒸馏水 g g 增g g g m吩眶咖魄魄吣嘶 孓 i 如支l 王鲫 第2 章试验材料和方法 按照表中所示配制溶液，并将其p h 控制在7 o 5 ，适当加热促进其溶解并直 至溶液澄清透明：趁热将上述溶液分装于2 5 0 i l l l 锥形瓶中，每瓶约5 0 1 1 ：l l ，为防 止外界环境的干扰，在瓶口塞上棉塞，用牛皮纸包扎好，这是为了防止外界微生 物的干扰。在1 2 l 高压灭菌2 0 3 0 m i n ；灭菌完毕后取出冷却，置于4 左右的 冰箱中备用。 2 斜面固体培养基的制备 取l 中制备的培养液1 0 0 m l ，加入1 5 9 2 9 琼脂粉，加热使溶液溶解至透明， 并保持p h 值在7 0 5 。趁热将培养液分装于1 5 m l 试管中，每支试管各约1 0 m l 左右，塞上棉塞和包上牛皮纸，经1 2 l 高压灭菌2 0 3 0 m i n ，取出后斜置试管， 使其中溶液有适当的斜度，凝固后即成一斜面，同时斜面的长度保证不超过试管 长度的l 2 。 3 斜面菌种的接种与培养 先将装有冻干粉的安瓿瓶置于4 的冰箱中活化1 0 1 5 m i n ，取出后在无菌操作 环境下，将安瓿瓶置于含有冰块的小烧杯中，取0 5 1 1 l l 己灭菌的3 n a c l 滴入安 瓿瓶溶解。将复苏后的发光细菌用接种环接种到3 中的试管斜面上，底面向上置 于2 2 紫外灭菌后的培养箱培养2 4 小时。根据发光菌的生长和发光情况可适当缩 短或延长培养时间，然后在无菌台上转接第二代，同上条件培养2 4 小时。将培养 好的第一、二代菌种置4 的冰箱中保存备用。 将第三代新鲜斜面菌种用接种环接入装有5 0 m l 培养液的锥形瓶中，其中接种 量不得超过一个接种环，之后放置在2 0 、转数为1 8 蛐的摇床中培养1 2 h ， 此时的发光细菌为对数生长期。 4 工作菌液的制备 将3 中所述处于对数期的且培养好的菌种，用3 n a c l 适当稀释，稍微摇动 将菌体冲下，用磁力搅拌将菌液适当摇匀。用原子摩尔冷光检测仪测量其发光量， 当为2 0 万到2 0 0 万相对发光单位，且发光度保持稳定，菌液便可用于毒性实验。 制备的工作菌液必须在l 小时内使用。 2 3 2 生长曲线的测定 将接种并按条件培养的菌液，从培养6 h 开始，每l h 测定一次它的发光量， 消油剂处理燃料油对两种海洋生物的毒性效应影响研究 并做记录，可以看出1 7 h 之后其发光量开始下降停止记录。将数据绘制成曲线即 为发光细菌在正常情况下的发光曲线( 图2 4 ) 。 891 0l l1 21 31 41 51 61 71 81 92 02 l t h 图2 4 发光细菌