（药学专业论文）淀粉基硫酸酯衍生物的制备及其抗凝血活性研究.pdf

独创性声明 俐枷舢舢删小 y 18 7 9 5 0 8 本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 武汉理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示了谢意。 签名：边丑日期：赵! ! ：堑尘三 学位论文使用授权书 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权武汉理工大学可以将本学位论文的 全部内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存或汇编本学位论文。同时授权经武汉理工大学认可的国家有 关机构或论文数据库使用或收录本学位论文，并向社会公众提供信息 服务。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究生( 签名) ：粗导师( 签名；趔! 一e l 期耋丝堕：兰岁 要 淀粉是自然界仅次于纤维素的多糖类天然高聚物，其来源广泛。淀粉及其衍 生物硫酸酯化后，能获得与肝素类似的结构，可显著提高其生物活性，如抗病毒 性、抗肿瘤活性、抗凝血活性以及免疫调节等。本课题首次利用近似中性的三磺 酸钠胺作为酯化试剂制备淀粉硫酸酯、羟丙基淀粉硫酸酯和季铵型阳离子淀粉硫 酸酯。本文主要研究内容如下： 1 用淀粉分别制备了羟丙基淀粉及季铵型阳离子淀粉。在均相条件下，采 用水溶性酯化剂三磺酸钠胺n ( s 0 3 n a ) 3 对淀粉及其衍生物进行硫酸酯化，制得 了淀粉硫酸酯，羟丙基淀粉硫酸酯和季铵型阳离子淀粉硫酸酯( q a c s s ) 。通过红 外光谱及核磁共振谱图证实了硫酸酯基团的引入。 2 采用单因素实验法对制备淀粉及其衍生物硫酸酯的操作条件进行了优 化，考察了酯化剂溶液p h 值、酯化剂用量、温度、时间对淀粉、羟丙基淀粉、 季铵型阳离子淀粉磺化反应的影响，得到了制备各种硫酸酯的最佳反应条件。用 硫酸钡明胶分光光度法测定淀粉及其衍生物硫酸酯的取代度。结果表明，磺化 淀粉的最佳反应条件为：酯化剂溶液p h = 9 ，酯化剂摩尔量与淀粉质量比为 1 7 5 1 6 2 m o l g ，反应温度为4 0 ，反应时间为2 0 h 。磺化羟丙基淀粉的最佳反应 条件为：酯化剂溶液p h - - 1 0 ，酯化剂摩尔量与羟丙基淀粉质量比为2 5 2 2 1 m o l g ， 反应温度为4 0 ，反应时间为2 2 h 。磺化季铵型阳离子淀粉的最佳反应条件为： 酯化剂溶液p h = 1 0 ，酯化剂摩尔量与季铵型阳离子淀粉质量比为2 3 1 4 5 m o l g ， 反应温度为4 0 ，反应时间为2 2 h 。 3 研究了所制备的淀粉基硫酸酯衍生物的抗凝血活性。实验结果表明， a p p t ，p t 及t t 随着硫酸酯基团含量及浓度的增加而增加，其中对a p t t 的增 强最为明显。同时随着分子量的变化而变化，淀粉硫酸酯、羟丙基淀粉硫酸酯和 q a c s s 具有最优的抗凝血效果的分子量分别为2 2 6 1 0 4 、2 9 5 1 0 4 、2 5 1 1 0 4 。 关键词：淀粉；羟丙基淀粉；季铵型阳离子淀粉( q a c s ) 抗凝血活性；硫酸 酯 a b s t r a c t s t a r c hw h i c hi sac l a s so fn a t u r a lp o l y s a c c h a r i d ep o l y m e ri nt h en a t u r eh a sr i c h s o u r c 宅s t a r c ha n di t sd e r i v a t i v e sa r em o d i f i e db ys u l f a t e dc a ni m p r o v ei t sb i o l o g i c a l a c t i v i t y , s u c ha sa n t i - v i r u s ，a n t i t u m o r , a n t i c o a g u l a n ta c t i v i t ya n di m m u n ef u n c t i o n s i nt h i sp a p e r , s t a r c hs u l f a t e s ，h y d r o x y p r o p y l a t e ds t a r c hs u l f a t e sa n dq u a t e r n a r y a m m o n i u mc a t i o n i cs t a r c hs u l f a t e sw e r ep r e p a r e db ya nu n c o m m o ns i m i l a rn e u t r a l s u l f a t i n ga g e n t ( n ( s 0 3 n a ) 3 ) 1 1 1 em a i nc e n t e n t so ft h i st h e s i sw e r ea sf o l l o w s ： 1 s t a r c hw a sp r e p a r e dh y d r o x y p r o p y l a t e ds t a r c ha n dq u a t e r n a r ya m m o n i u m c a t i o n i cs t a r c h s t a r c hs u l f a t e s , h y d r o x y p r o p y l a t e ds t a r c hs u l f a t e sa n dq u a t e r n a r y a m m o n i u mc a t i o n i cs t a r c hs u l f a t e sp r e p a r e df r o ms t a r c ha n di t sd e r i v a t i v e st h r o u g h r e a c t i o nw i la nu n c o m m o ns u l f a t i n ga g e n t ( n ( s 0 3 n a ) 3 ) w h i c hw a ss y n t h e s i z e db y s o d i u mb i s u l f i t ea n d8 0 d i u n ln i t r i t ei na q u e o u ss o l u t i o n n 圮i n t r o d u c t i o no fs u l f a t e g r o u pw a sc h a r a c t e r i z e db yi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ( f r 埘a n d ”c - n m r 2 t h r o u g hs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t , o p t i m i z e dt h ep r e p a r a t i o nc o n d i t i o n so fs t a r c h a n di t sd e r i v a t i v es u l f a t e s ，t h ei n f l u e n c eo ft h ep ho fs u l f a t i n ga g e n ts o l u t i o n , s t u d i e d t h ed o s a g eo fs u l f a t i n g a g e n ta n ds t a r c h ，h y d r o x y p r o p y l a t e ds t a r c h , q u a t e r n a r y a m m o n i u mc a t i o n i cs t a r c h , t e m p e r a t u r ea n dt i m eo ns u l f o n a t i o nr e a c t i o n t h ed so f s t a r c ha n di t sd e r i v a t i v e ss u l f a t e sw e r em e a s u r e db yt h eb a r i u ms u l f a t en e p h e l o m e t r y m e t h o d t h ee x p e r i m e n tr e s u l t sw e r e ：t h eb e s tc o n d i t i o no ft h es u l f o n a t i o nr e a c t i o no f s t a r c hw a s - t h ep ho fs u l f a t i n ga g e n ts o l u t i o nw a s9 0 ，t h er e a g e n t s t a r c hr a t i o w a s l 7 5 16 2 m o l g , t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s4 0 ，t h er e a c t i o nt i m ew a sa b o u t 2 0 h ；t h eb e s tc o n d i t i o no ft h es u l f o n a t i o nr e a c t i o no fh y d r o x y p r o p y l a t e ds t a r c hw a s ： t h ep ho fs u l f a t i n ga g e n ts o l u t i o nw a s10 0 ，t h er e a g e n t h y d r o x y p r o p y l a t e ds t a r c h r a t i ow a s2 5 2 2lm o l g , t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s4 0 ，t h er e a c t i o nt i m ew a s a b o u t2 2 h ；t h eb e s tc o n d i t i o no ft h es u l f o n a t i o nr e a c t i o no fq u a t e r n a r ya m m o n i u m c a t i o n i c s t a r c hw a s t h e p h o f s u l f a t i n ga g e n t s o l u t i o nw a s10 0 ，t h e r e a g e n t q u a t e r n a r ya m m o n i u mc a t i o n i cs t a r c hr a t i ow a s2 0 314 5 m o l g , t h er e a c t i o n t e m p e r a t u r ew a s4 0 c ，t h er e a c t i o nt i m ew a sa b o u t2 2 h 3 t h ea n t i c o a g u l a n ta c t i v i t yo fs t a r c h - b a s e ds u l f a t e sd e r i v a t i v e sp r e p a r e dw e r e s t u d i e d 砸他e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a ts t a r c ha n di t s d e r i v a t i v es u l f a t e s o b v i o u s l yp r o l o n g e da p t t 、t ta n dp t n ea n t i c o a g u l a n ta c t i v i t ys t r o n g l yd e p e n d e d o ns u l f a t ep e r c e n t , m o l e c u l a rw e i g h t ( m w ) a n dc o n c e n t r a t i o no fs t a r c ha n di t s d e r i v a t i v es u l f a t e s a n dt h i sa c t i v i t yn o to n l yi m p r o v e dw i t ht h ei n c r e a s eo fs u l f a t e n p e r c e n ta n dc o n c e n t r a t i o n ，b u ta l s oc h a n g e dw i t hd i f f e r e n tm w ，t h eb e s t m o l e c u l a r w e i g h t o fs t a r c h s u l f a t e s ，h y d r o x y p r o p y l a t e d s t a r c hs u l f a t e sa n d q u a t e r n a r y a 加m o i l i 啪c a t i o n i cs t a r c hs u l f a t e sw e r ea r o u n d2 2 6 10 4 ，2 9 5 10 4 ，2 51 10 4 k e y w o r d s ：s t a r c h , h y d r o x y p r o p y l a t e ds t a r c h ，q u a t e r n a r ya m m o n i u mc a t i o n i cs t a r c h ， a n t i c o a g u l a n ta c t i v i t y , s u l f o n a t i o n m 目录 中文摘要：i a b s t r a c t i i 第一章绪论l 1 1 淀粉和变性淀粉的概述l 1 1 1 淀粉的结构1 1 1 2 淀粉的基本性质2 1 1 3 变性淀粉2 1 2 硫酸酯化多糖的研究进展3 1 2 1 多糖类物质的研究状况3 1 2 2 多糖的硫酸酯化4 1 2 3 硫酸酯化多糖的制备方法5 1 2 4 硫酸酯化多糖的生物活性6 1 2 5 硫酸酯化多糖的抗凝血机制7 1 3 本论文的立题依据及研究内容。8 第二章淀粉硫酸酯的制备及其抗凝血活性的研究1 0 2 1 引言l o 2 2 实验部分l o 2 2 1 材料及试剂1 0 2 2 2 实验仪器1 l 2 2 3 酯化剂的制备1 l 2 2 4 淀粉硫酸酯的制备l l 2 2 5 淀粉硫酸酯的结构表征1 1 2 2 6 淀粉硫酸酯取代度的测定。1 2 2 2 7 淀粉硫酸酯的降解。1 2 2 2 8 淀粉硫酸酯的抗凝血活性分析1 3 2 3 结果与讨论1 4 2 3 1 结构表征1 4 2 3 2 淀粉硫酸酯反应的条件的优化1 4 2 3 3 分子量的计算1 8 2 3 4 淀粉硫酸酯抗凝血性能的分析。1 8 2 4 结论：! ( ) 第三章羟丙基淀粉硫酸酯的制备及其抗凝血活性的研究2 2 3 1 引言2 2 3 2 实验部分2 2 3 2 1 材料及试剂2 2 3 2 2 实验仪器2 3 3 2 3 羟丙基淀粉的制备2 3 3 2 4 酯化剂的制备2 3 3 2 5 羟丙基淀粉硫酸酯的合成2 4 3 2 6 羟丙基淀粉硫酸酯的结构表征2 4 3 2 7 羟丙基淀粉硫酸酯取代度的测定2 4 3 2 8 羟丙基淀粉硫酸酯的降解2 4 3 2 9 羟丙基淀粉硫酸酯的抗凝血活性分析。2 5 3 3 结果与讨论2 6 3 3 1 结构表征2 6 3 3 2 羟丙基淀粉硫酸酯反应的条件的优化。2 7 3 3 3 分子量的计算31 3 3 4 羟丙基淀粉硫酸酯抗凝血性能的分析。3 1 3 4 结论3 4 第四章阳离子淀粉硫酸酯的制备及其抗凝血活性的研究3 6 4 1 引言3 6 4 2 实验部分3 6 4 2 1 材料及试剂3 6 4 2 2 实验仪器。3 7 4 2 3q a c s 的制备3 7 4 2 4 酯化剂的制备3 8 4 2 5q a c s s 的制各3 8 4 2 6q a c s s 的结构表征。3 8 4 2 7q a c s s 的取代度的测定3 8 4 2 8q a c s s 的降解3 9 4 2 9q a c s s 的抗凝血活性分析。3 9 4 3 结果与讨论4 0 4 3 1 结构表征4 0 4 3 2q a c s s 反应条件的优化4 2 4 3 3 分子量的计算。4 6 4 3 4q a c s s 抗凝血性能的分析。4 6 4 4 结论4 9 第五章结论5 0 参考文献5 2 作者已发表和待发表的研究成果5 6 致谢5 7 武汉理工大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 淀粉和变性淀粉的概述 淀粉是自然界仅次于纤维素的多糖类天然高聚物，广泛存在于植物的种子、 块茎、果实、根部甚至叶子中。它是植物经光合作用产生的高分子有机物，是可 再生的物质。虽然淀粉的来源广泛，几乎遍布整个植物世界，但能用于商品化生 产的只有玉米、马铃薯、小麦等几种农作物。总的来说，淀粉的种类可分为谷类 作物和薯类作物两类，而谷类作物有玉米、小麦等；薯类作物有木薯、马铃薯、 甘薯等【1 1 。 玉米是制取淀粉的主要来源。在美国，几乎9 5 以上的淀粉是由玉米生产的； 在欧洲马铃薯淀粉产量比较高；而木薯淀粉与西谷淀粉主要由巴西、印度热带国 家生产【2 1 。 1 1 1 淀粉的结构 淀粉是由许多脱水葡萄糖单元经糖苷键连接而成的天然大分子，化学结构式 为( c 6 i - i 1 0 0 5 ) n ，n 为聚合度。淀粉的微观结构至今仍没有完全阐明，但已确定淀 粉不是一种均质物质，而是由直链淀粉和支链淀粉这两种很不相同的聚合物组 成。 直链淀粉是一种是一种线型聚合物，是d 葡萄糖基以c t - ( 1 ，4 ) 糖苷键连接的 多糖链，分子中一般有2 0 0 - - - - 2 0 0 0 个葡萄糖基。分子大小随植物种类及提取淀粉 时的加工条件而变化，分子量般为5 x l o s - 1 0 6 ，其空间构想不是完全伸直的， 而是卷曲成螺旋形，每一回转为6 个葡萄糖基。 支链淀粉又称胶淀粉，是一种分支型聚合物。分子中，葡萄糖分子之间除以 n ( 1 ，4 ) 糖苷键相连外，还有以a ( 1 ，6 ) 糖苷键相连的。因此，带有分支，约2 0 个 葡萄糖单位就有一个分支。从结构上讲，支链淀粉是一个具有树枝形分支结构的 多糖。分子量在百万数量级【3 - 6 1 。 淀粉的来源不一样，则其中的直链淀粉与支链淀粉的含量比也不一样。大部 分的淀粉中直链淀粉与支链淀粉的含量比约为3 ：7 。天然淀粉大多是直链淀粉与 支链淀粉同时存在的，且含量比不尽相同，也有完全由支链淀粉组成的。但自然 界中尚未发现完全由直链淀粉构成的植物品种。大多数马铃薯及木薯等薯类淀粉 的直链淀粉含量约为1 8 左右；而普通玉米和小麦淀粉中直链淀粉约占2 8 ； 某些遗传变性的作物，如黏玉米、糯性玉米等，完全由支链淀粉组成。 武汉理工大学硕士学位论文 淀粉的基本结构如图： c h z 0 秘 图1 = 1 直链淀粉的分子结构 1 1 2 淀粉的基本性质 图l - 2 支链淀粉的分子结构 淀粉分子拥有许多羟基，是亲水性的天然高分子化合物。由于分子间与分子 内的羟基通过氢键相连，因此在冷水中，淀粉颗粒不溶，淀粉颗粒也不溶于一般 的有机溶剂，仅溶于d m f 、d m s o 等强极性有机溶剂。普通淀粉不溶于冷水， 但置于冷水中加热，分子内与分子间氢键作用减弱，淀粉颗粒会吸水膨胀，温度 升到一临界值时，吸收足够的水分后，高度膨胀的淀粉分子链间相互接触，变成 半透明的粘稠糊状，此时淀粉发生糊化现象 7 1 。淀粉的来源不同以及分子中直链 与支链比例不同，其糊化温度也不相同。 1 1 3 变性淀粉 随着工业生产技术的发展，对淀粉性质的要求越来越苛刻，很多领域原淀粉 已不适合。为了克服天然原淀粉的缺点，扩大在工业中的应用范围，有必要对淀 粉进行变性处理。变性淀粉是指以天然原淀粉为原料，通过化学、物理或酶的方 法来处理天然淀粉，从而改变天然淀粉的性质，所得产品即为变性淀粉。 按变性处理方法的不同，变性淀粉可分为以下几类： ( 1 ) 化学变性：利用各种化学试剂处理得到的变性淀粉。组成淀粉的脱水葡萄糖单 2 武汉理工大学硕士学位论文 位有三个活泼醇羟基，c 6 上是伯醇羟基，c 2 ，c 3 上是仲醇羟基。主要有两大类 8 q o ： 一类是使淀粉分子量增加，如酯化淀粉、接枝淀粉、醚化淀粉、交联淀粉等；另 一类是使淀粉分子量下降，如氧化淀粉、酸解淀粉等。 ( 2 ) 物理变性：是通过光、热、电等途径对淀粉进行处理，产品主要有：预糊化( q 一 化) 淀粉、分离淀粉、湿热处理淀粉、油脂复合处理淀粉、机械研磨处理淀粉等。 ( 3 ) 酶法变性：利用生物酶对淀粉进行处理。产品有：酶降解淀粉、直链淀粉、c t 、 d 、丫环状糊精、麦芽糊精、普鲁兰等。由于酶法处理的变性淀粉与酸化淀粉一 样，都是使淀粉分子量下降，所以其用途不太广泛，只占变性淀粉总量的6 左 右。然而近年来，随着普鲁兰、环糊精等产品的开发，这类变性淀粉的用途又不 断地拓广了。 ( 4 ) 复合变性：采用两种以上处理方法得到的变性淀粉。如交联酯化淀粉等。这类 变性淀粉具有两种变性淀粉的优点。 变性淀粉的生产与应用已有1 5 0 多年的历史，变性淀粉的历史最早起源于西 欧1 8 0 4 年合成出的英国胶，1 8 1 1 年k i r c h o f f 对酸变性淀粉进行了研究，通过实 验，使普通淀粉转化成果糖和糖浆，创立了淀粉的酸糖化法。1 9 世纪后半叶成 功开发出了糊精产品，2 0 世纪初荷兰工业化生产出了a 淀粉。5 0 年代研制成功 羟乙基、阳离子淀粉等衍生物，6 0 到7 0 年代研制成多种高分子的接枝共聚物。 真正高速发展是近三十年间，各种新型的淀粉衍生物大量涌现。我国变性淀粉的 研制开始较晚，从上世纪8 0 年代以来，变性淀粉的研究和开发得到了很大的进 展。现在我国的变性淀粉从无到有，从小到大，从少到多已进入高速发展时期， 在纺织、造纸、食品、饲料、铸造、医药、建筑、石油钻井等诸多领域都得到了 广泛的应用【l 。 1 2 硫酸酯化多糖的研究进展 1 2 1 多糖类物质的研究状况 多糖是一类由l o 个以上的单糖分子通过糖苷键聚合而成的天然高分子多聚 物，是构成生命的四大基本物质之一。主要来自高等植物、动物细胞膜和微生物 细胞壁【1 2 - 1 4 。 早在1 0 0 多年前，德国科学家f i s c h e r 就开始了对糖的研究。糖类的生命科 学几乎与蛋白质同时诞生【阍。但是由于其结构的复杂性和研究手段的局限性， 使糖的研究远滞后于蛋白质和核酸【i t , - 1 7 1 。2 0 世纪5 0 年代，随着生物学的发展以 及分离技术的提高，人们开始认识到多糖结构的复杂性，其生物学功能的复杂性、 多样性。6 0 年代多糖的许多生物活性逐渐被发现，如免疫调节、抗病毒、抗炎 武汉理工大学硕士学位论文 症、抗肿瘤、降血糖等。而且大多无毒，所以，引起了越来越广泛的重视。近二 十年来，随着分子生物学，细胞生物学的发展，人们对糖类物质的认识也有了质 的飞跃，其研究也取得了巨大的进展。然而，多糖的研究虽然取得了巨大的进展， 但与蛋白质和核酸的飞跃式发展相比，显然，非常落伍。因此，多糖的研究还有 待更深入的进行【1 8 。2 1 1 。 中国对多糖的研究较晚。开始于7 0 年代，但是发展得很迅速，尤其在生物 学功能研究方面取得了很大的进步。在研究糖类机理的时候，与中医药理论结合 起来，形成了发展快速的形势。由于我国是中药大国，中药的发源地，多糖广泛 地存在于许多中药材中。多糖是中药发挥独特疗效的重要物质之一，对各种中药 材的化学成分研究的过程中，人们都少不了对其中多糖的关注。进入新世纪的近 几年，我国在多糖方面的研究己经进入到更加广泛和深入的研究【2 2 彩】。 目前，国内外研究的主要目标是一方面进一步寻找活性更高的多糖；另一方 面，重点研究多糖的构效关系。 1 2 2 多糖的硫酸酯化 对多糖进行分子修饰，通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基，对其进 行硫酸化、降解、乙酰化等，可能大大提高多糖的生物活性 2 4 1 。 多糖的硫酸化，即硫酸酯化多糖是多糖大分子链中单糖分子链上的部分羟基 被硫酸根取代而形成的一类化学结构复杂、生物活性多样、构效关系鲜明的多糖 衍生物，为聚阴离子化合物。包括从植物中提取的各种硫酸多糖、肝素、天然中 性多糖的硫酸衍生物及人工合成的各种硫酸多糖，具有抗凝血、抗病毒、抗肿瘤 等生物学活性【2 5 - 2 7 1 。除了天然的外，许多原本不具有或仅有微弱抗病毒或抗肿瘤 活性的多糖，经过磺化后其抗病毒或抗肿瘤活性得到了明显的增强，而且由于其 还能提高机体的免疫功能，可以成为拥有美好开发前景的药物。 硫酸酯化多糖的获得，一般有天然和人工合成两类。1 9 1 6 年，m c l e a n 等人 从猪肠粘膜中发现了肝素，2 0 多年后，b r i n k h o u s 等证实了其抗凝血活性【2 8 1 。1 9 6 4 年，n a h m i a s 等报道，肝素对疱疹病毒( h s v ) ) 具有抑制作用【2 6 1 ，后来，日本 学者研究发现，海藻中的硫酸多糖具有体内抗肿瘤作用f 2 9 1 。其它天然硫酸酯化 多糖有从鲨鱼软骨及海藻中提取的粘多糖、岩藻糖硫酸酯，从紫菜中提取的半乳 糖硫酸酯等。人工合成的主要有硫酸化香菇多糖、硫酸化戊聚糖、硫酸化木聚糖 垒塞【3 0 1 ， 可 硫酸酯化多糖因具有广泛的生物学活性，而受到了广泛地关注。作为一种新 型药物，它具有多方面的优势，且有望成为一系列新型促进人类健康的理想药物。 4 武汉理工大学硕士学位论文 1 2 3 硫酸酯化多糖的制备方法 硫酸酯化多糖的制备，即磺酸基团与多糖的羟基发生酯化反应的过程。整个 反应体系主要包括酯化剂和溶剂两部分。酯化剂的选择主要依据反应过程控制的 难易程度和反应装置的情况，常用的酯化剂主要有：浓硫酸、氯磺酸、三氧化硫、 二氧化硫和氧气等，但是这些酯化剂都存在着缺点，比如，浓硫酸、氯磺酸、三 氧化硫等，虽然酯化能力强，但其酸性太强，在反应过程中会使多糖分子链发生 强烈的降解；溶剂的作用在酯化反应中不可忽视，其作用体现在络合酯化剂的能 力和对多糖的溶解上，传统常用的溶剂有：d m s o 、d m f 、吡啶、甲苯、三乙胺、 甲酰胺等【3 l 】，这些溶剂大多价格昂贵，并且均有很高的毒性。下面介绍一些常 用的硫酸酯化的方法。 1 2 3 1 浓硫酸法 3 2 4 3 】 分别量取一定比例的浓硫酸和正丁醇，置于带有干燥管和搅拌装置的三颈瓶 中，再加入一定量的浓硫酸，在冰浴中搅拌。慢慢加入一定量多糖，反应3 0 m i n 。 反应液经中和、离心后，用蒸馏水透析，再冷冻干燥后即得。 1 2 3 2 氯磺酸一甲酰胺法 3 4 - 3 5 多糖悬浮于无水甲酰胺中，搅拌，在室温下逐渐加入酯化试剂氯磺酸，反应 结束后，用n a o h 中和除氨，透析，浓缩，乙醇沉淀，沉淀经干燥即得。 1 2 3 3 氯磺酸一吡啶法【3 2 , 3 6 - r q 将附有冷凝管和搅拌装置的三颈瓶置盐水一冰浴中，加入吡啶，搅拌，使之 充分冷却，用滴液漏斗慢慢加入一定量的氯磺酸，烧瓶中出现大量淡黄色固体， 然后加入多糖粉末，迅速将三颈瓶移人沸水浴中，恒温搅拌1 h ，冷至室温，将 反应液倾入冰水中，中和后加入乙醇，析出沉淀，将沉淀溶于水透析7 2 小时， 过滤，滤液经冷冻干燥后得多糖硫酸化产物。 1 2 3 4 其他方法 传统的常用的多糖硫酸酯化的方法很多，比如三氧化硫吡啶法【3 3 】、三氧化 硫三甲胺盐d m f 等。由于传统的方法都或多或少的有一些缺点，因此，本论文 采用的是由亚硫酸氢钠和亚硝酸钠合成的近似中性的醋化剂n ( s 0 3 n 。) 3 在水 溶液中与多糖反应【3 9 1 。既能够得到具有较高取代度、低毒的多糖硫酸酯，同时 可以大幅度降低生产成本，制得较为适于工业生产的产品。 5 武汉理工大学硕士学位论文 1 2 4 硫酸酯化多糖的生物活性 1 2 4 1 抗病毒活性 近年的研究证明，硫酸多糖无论在体内还是在体外，都显示了不同程度的抗 病毒活性，其抗病毒作用机理是通过抑制病毒的吸附而阻止了合胞体的形成， 从而发挥作用【柏】。海藻硫酸多糖的主要活性就是抗病毒，尤其是抗h i v 。b c r c s s a 等棕色墨角藻及其同种藻中提取分离到一种硫酸化多糖，该多糖具有抑制h i v 诱导的合胞体形成和抑制h i v 逆转录酶活性【4 1 1 。辛现良等从南海多种海藻硫酸 化多糖中筛选以及分子修饰得到的聚甘古酯海洋硫酸多糖9 1 1 ，是一种高效的 新型抗h i v - 1 海洋药物【4 2 1 。王琪琳等从海带中提取的海带硫酸多糖是一种含有 多种单糖残基和硫酸基的水溶性杂多糖，也具有抗病毒活性【4 3 1 。 有些多糖本身抗病毒活性较弱，经硫酸化后抗病毒活性明显增强。陈春英等 从箬叶中分离纯化得到的两种箬叶多糖，对其硫酸酯化后具有更高的抑制h i v 引起的细胞病变作用【俐习。 l 242 降血糖活性 研究发现多糖经过化学修饰具有降血糖活性。如h c p a r i n ，d e x t r a n 进行硫酸 化得到的硫酸化衍生物具有降血糖活性【钓】。 1 2 4 3 防止肾功能衰竭的活性 李绪亮、焦庆才等通过观察硫酸化茯苓多糖( s p ) 对腺嘌呤致大鼠慢性肾 功能哀竭( c r f ) 的影响发现：相比与模型组，用药3 0 d 后s p 组尿肌酐、尿量排 出增加，尿蛋白排出减少。尿素氮和血清肌酐水平有明显的下降，白蛋白和血清 总蛋白有明显的增加现象。肾脏系数明显下降。肾小球、近曲小管数日增加、远 曲小管扩张程度明显减轻。因此，s p 对大鼠c r f 有明显防止作用【4 7 】。 1 2 4 4 抗肿瘤活性 乐晓桐等在体外抗肿瘤实验中对硫酸酯海藻多糖对人肝癌细胞s m m c 7 7 2 1 的活性进行测试，结果表明，与未修饰的海藻多糖相比，硫酸酯海藻多糖具有良 好的体外抗肿瘤活性【4 引。先宏等发现，海藻硫酸多糖可以通过对巨噬细胞的调 节而使肿瘤细胞凋亡【4 9 j 。 1 2 4 5 抗凝血活性 抗凝血活性是硫酸酯化多糖的一个非常典型的生物活性，而肝素正是最早用 于临床的抗凝剂 3 0 1 。但是后来的研究显示：肝素不仅具有抗凝血活性，还有抗 血小板活性，从而能引发不正常的流血现象【3 8 ，5 0 1 。还有，由于肝素是由动物中 6 武汉理工大学硕士学位论文 取得的，从而可能引发动物蛋白或是病原菌的感染。因此，当今新药研究的重点 之一就是寻找一种既具有抗凝血活性又无副作用的药物。研究发现，硫酸酯化多 糖就是这样，具有抗凝血活性，且无肝素的抗血小板副作用。 杨铁虹等证明，当归多糖硫酸酯在凝血方面显示出了双向性调节作用，既有 显著的抗凝血活性，又有显著的止血作用【5 1 1 。王春玲等进行小鼠实验，结果表 明褐藻多糖硫酸酯具有抗凝血活性并对静脉血栓形成有效的抑制作用f 5 2 1 。 1 2 4 6 其他活性 硫酸酯化多糖除了上述的那些生物活性外还有其他许多生物活性，如：增强 机体免疫功能、抗内皮细胞损伤、抗衰老、治疗尿毒症、调节细胞增殖、抗辐 射等。因此，硫酸酯化多糖是一类很有前途的新药，随着医学研究的不断深入， 硫酸酯化多糖的不断开发，有望成为一系列新型的促进人类健康的理想药物。 1 2 5 硫酸酯化多糖的抗凝血机制 在生理条件下，人体的抗凝血和纤维蛋白溶解系统与凝血止血系统，为了维 持血液的循环流动，处于动态平衡状态。但是，任一系统发生病变，均会导致出 血或形成血栓。 硫酸酯化多糖在治疗和预防这些状况方面，有一定的价值。目前常用的多糖 类抗凝剂当然是肝素。肝素作为一种天然的酸性糖胺聚糖，是由d p 葡糖醛酸( 或 l - a 艾杜糖醛酸) 和n 一乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。肝素可以与 抗凝血酶( a t - i i i ) 结合，催化灭活因子i i a 、x a 、i x a 和x i i a ，这就是肝素抗凝 的主要机制。肝素能够负电荷的硫酸基团与a t - i l l 的赖氨酸结合部位结合，进而， 改变精氨酸反应中心的构想，激活a t - i l l ，使a t - i l l 由慢凝血酶抑制剂转变为快 凝血酶抑制剂，使凝血酶的丝氨酸活化中心与a t - i l l 共价结合，灭活凝血酶【5 2 弓3 1 。 但是后来研究表明：肝素在具有抗凝血活性的同时还有抗血小板活性，进而引起 不正常的流血现象。况且，肝素是从动物中得到，在治疗中有可能引起动物蛋白 或是病原菌对患者的感染。所以，寻找一种既具有抗凝血又无其他副作用的新药 己成为当今研究的热点之一。 a l a n 等研究发现昆布多糖硫酸酯在分子中没有特定的戊糖单位，无法和 a t - h i 特异性结合，在1 1 实验中活性较低。但是，其负电荷可以和a t - 1 1 1 分子 中精氨酸和赖氨酸残基的正电荷非特异性结合，进而激活a t - i l l ，故在a p t t 中 有较高的活性【州。 7 武汉理工大学硕士学位论文 1 3 本论文的立题依据及研究内容 肝素是一种典型的抗凝血药物，其结构中的硫酸基团具有很强的负电荷，这 种高度带负电荷的物理化学性质，干扰了凝血过程的许多环节，因而能阻止血液 的凝固过程，可用于防止血栓的形成。而肝素在体外凝血过程中容易引起大出血。 同时肝素诱导的血小板减少症是肝素治疗中的一种严重并发症，因此这在一定程 度上影响了其在临床上的应用。因此，寻求一种分子结构与肝素类似的物质，以 改进医用材料的生物亲和性，提高药物疗效就显得十分迫切和必要。 天然淀粉仅仅是各类淀粉植物的初级产品，为了进一步提高其经济效益，需 要对淀粉进行深加工处理。这不但提高了淀粉产品的附加值，也使资源得到更合 理的利用。比如，作为变性淀粉的羟丙基淀粉、阳离子淀粉，具有许多淀粉所没 有的重要性质。 作为变性淀粉的成员之一，淀粉硫酸酯、羟丙基淀粉硫酸酯、阳离子淀粉硫 酸酯等是重要的淀粉衍生物，具有高粘度和其他变性淀粉少见的生理活性，在医 药工业中用作胃蛋白酶抑制剂、肝素代用品；利用其降低血液中胆甾醇、防动脉 硬化、抗凝血、抗酯血清、抗炎症等功能，可作为血浆代用品、肠溃疡的治疗剂 以及药物和抗生素的载体。因此，研究新的硫酸酯淀粉生产工艺具有重要的意义。 传统的酯化剂一般是发烟硫酸、氯磺酸以及三氧化硫等，反应时的溶剂一般 为d m f 、d m s 、吡啶、三乙胺、甲苯等有机溶剂。磺化试剂一般都有很强的酸 性、脱水性，会造成多糖链的严重降解，不但不易对其进行收集、纯化，而且其 生物活性也会减弱甚至消失。同时也存在价格昂贵，保存条件苛刻，有较大毒性， 对环境造成污染等问题。本文拟在水相条件下，用廉价的三磺酸钠胺作为磺化试 剂制备淀粉硫酸酯、羟丙基淀粉硫酸酯以及季铵型阳离子淀粉硫酸酯。由于三磺 酸钠胺的p h 值近似中性，可有效的避免反应过程中的降解、水解等问题。本论 文的主要研究内容是： ( 1 ) 以乙醇为分散剂，在水溶液中合成高取代度的羟丙基淀粉、季铵型阳离子 淀粉。 ( 2 ) 用n a n 0 2 一n a h s 0 3 水相法，以三磺酸钠胺( n ( s 0 3 n a ) 3 ) 为酯化剂，将淀粉 及其衍生物羟丙基淀粉、季铵型阳离子淀粉合成为硫酸酯。并采用红外对其进行 表征。 ( 3 ) 采用单因素实验法系统地研究考察了反应体系的p h 值，投料比例、反应温 度、反应时间对淀粉及其衍生物硫酸化程度的影响。确定了制备高含硫量的淀粉 及其衍生物硫酸酯的最佳的操作及硫酸酯化条件。 ( 4 ) 采用h 2 0 2 氧化法降解得到不同分子量的淀粉及其衍生物硫酸酯，并用光散 8 武汉理工大学硕士学位论文 射法测定其分子量。并研究考察取代度、浓度以及分子量对淀粉及其衍生物硫酸 酯的抗凝血活性的影响。 9 武汉理工大学硕士学位论文 第二章淀粉硫酸酯的制备及其抗凝血活性的研究 2 1 引言 淀粉是高分子碳水化合物，是葡萄糖的高聚体，通式是( c 6 h l o o s h 。以颗粒 形式沉积在植物的种子、块茎或根部中，经光合作用转化而成，与蛋白质、纤维、 油脂、糖及矿物质等共同存在。淀粉是一种广泛存在于植物中的的高分子化合物， 其产量在自然界中仅次于纤维素。随着工业的发展，淀粉的深加工产业得以兴起 并迅速壮大。变性淀粉除了食用外，在化工、造纸、医药、合成材料、金属冶炼 等许多领域都有广泛地应用。作为工业发展的产物，在目前更极大的推动着世 界工业的发展。由于在近代，我国一直深为粮食危机所困扰，淀粉的深加工业起 步较晚，直到上世纪8 0 年代开始，才开始较快地发展，但是与发达国家相比， 仍然比较落后。如何开发变性淀粉的新品种，增加我国淀粉加工业的国际竞争力， 对我国工业的发展及农产品经济都有重大的意义。 多糖作为一类非特异性免疫增强化合物，能提高机体的免疫功能，增强抗病 能力，受到了人们的普遍重视，得到了相应的研究和开发。而含硫的多糖如肝素 等，还具有抗凝血、抗病毒等其它生物功能。天然肝素虽然具有抗凝血、抗h i v 活性等，但活性很低。这是由于其硫酸根含量不足的缘故。研究表明，葡聚糖经 硫酸酯化也能得到与肝素相同的抗凝血活性、抗h w 活性等【5 5 1 。 淀粉作为一种生物多糖，己被证明其硫酸酯同样具有生物活性。随着近年来， 对淀粉硫酸酯研究的深入，发现淀粉硫酸酯无论在体内还是在体外实验中，均有 良好的抗凝血活性，抗病毒作用。本章对淀粉进行磺化制备类肝素物质淀粉硫酸 酯，并测定其抗凝血活性。 2 2 实验部分 2 2 1 材料及试剂 淀粉：乙醇( c h 3 c h 2 0 h ) ，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠 ( n a n c h ) ，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；亚硫酸氢钠( n a h s 0 3 ) ，分析 纯，国药集团化学试剂有限公司：氢氧