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湿热灭菌工艺验证指南湿热灭菌工艺验证指南 中国医药设备工程协会中国医药设备工程协会 2008 年年 12 月月 1 目目 录录 一、范围.3 二、目的.3 三、术语.3 四、湿热灭菌基础.7 4.1 湿热灭菌的机理.7 4.2 影响芽孢耐热性的因素.7 4.3 湿热灭菌中的能量转移.8 4.4 湿热灭菌中微生物杀灭的数学模式.9 五、灭菌法选择的基本原则.11 六、灭菌方法的开发及选定.12 6.1 湿热灭菌方法选择决策树.12 6.2 过度杀灭法.14 6.3 残存概率法.14 6.4 装载类型的界定 .15 6.5 湿热灭菌对介质的要求.16 6.5.1 蒸汽.16 6.5.2 压缩空气.17 6.5.3 冷却水.17 七、湿热灭菌器的程序控制和记录仪表.17 7.1 who gmp的原则要求.17 7.2 技术性要求 .18 7.3 对验证用测试仪器的要求.18 八、几种常用的湿热灭菌法.19 8.1 液体注射剂产品的灭菌.19 8.2 多孔/固体物品的灭菌.22 九、灭菌工艺的验证及验证文件.24 9.1 灭菌工艺验证的步骤.24 9.2 验证文件.26 9.3 水喷淋式灭菌器验证方案示例.27 十、附表.32 十一、附件-蒸汽质量测试法.35 .35 不凝性气体的测试 .37 过热值测试 .39 干燥值测试 十二、参考文献.41 2 一、范围一、范围 由于蒸汽-湿热灭菌具备无残留，不污染环境，不破坏产品表面，易于控制和重现性好 等优点，被广泛应用于注射剂的除菌过程之中。 本文旨在向有关人员提供最终灭菌药品 （注射剂） 的蒸汽灭菌器的确认以及蒸汽灭菌工 艺验证一些带技术性的操作方法方面的指南。 本指南参照 who gmp 对无菌药品的要求及国外相关湿热灭菌的指南编写，重点放在 最终灭菌药品（注射剂）的湿热灭菌工艺的验证上，其基本原则也可供冻干机干燥箱的湿热 灭菌、在线蒸汽灭菌等参考。 二、目的二、目的 湿热灭菌验证的目的， 就是通过一系列验证试验提供足够的数据和文件依据， 获得有效 合理的灭菌参数， 并把经验证的湿热灭菌设备和灭菌工艺参数应用到药品生产的除菌过程中 去，以证明湿热灭菌设备对被灭菌品的适用性，不同灭菌程序的可靠性和重现性，简言之， 验证结果能够证明生产中所采用的灭菌工艺， 能确保灭菌后被灭菌品微生物污染的残存概率 低于百万分之一的要求。 湿热灭菌方式的选择，应能在保证产品理化指标、密封性能等前提下，达到我国药典通 则中无菌保证的要求。任何一种灭菌程序，都必须在生产实际应用前进行验证。 三、术语三、术语 湿热灭菌程序的设计和开发， 与蒸汽灭菌器的性能以及被灭菌产品的性能相关。 湿热灭 菌介质通常包含：饱和蒸汽，空气-蒸汽混合气体，过热水等。灭菌效果是通过蒸汽，蒸汽- 空气混合物，过热水等介质与被灭菌物品的热传递来实现的。在饱和蒸汽中，温度与压力之 间存在固定的关系。 饱和蒸汽的加热速度较快， 这是因为蒸汽在灭菌过程中相变放出了大量 潜热；对于大型的软包装产品或玻璃瓶产品而言，过热水喷淋灭菌的方法应用十分普遍，在 此灭菌方式中， 不存在蒸汽的相变， 热量的转移依赖于过热水的强制运动及与被灭菌品的直 接接触。蒸汽-空气混合物灭菌中，单位体积所包含的热容量较低，灭菌腔室压缩空气和蒸 汽的比例，需根据产品和所用的包装材料作必要的调整。 目前常用的脉动真空灭菌器，又称预真空灭菌器，是饱和蒸汽灭菌的一种特定方式，其 基本手段是在排除灭菌腔室中影响灭菌效果的不凝气体后，再通入饱和蒸汽进行灭菌。 本指南有关湿热灭菌过程及参数的术语如下， 在不同的文献中， 同一术语的含义可能有 所不同： 1. 初始菌（初始菌（bioburden） 又称生物负荷，即灭菌前原材料、部件、或包装等物品上所带有存活微生物的总数。 3 2. 生物指示剂（生物指示剂（biological indicator） 接种已知数量微生物用于测试湿热灭菌工艺实际效果的产品。 3. 腔室冷点（腔室冷点（chamber cold spot） 指在灭菌过程中，装载区中f0或温度最低的位置。 4. 化学指示剂（化学指示剂（chemical indicator） 化学指示剂是能展示一个或多个预定工艺变量的测试系统。 化学指示剂不能证明产品是 否无菌，它们只能说明产品是否灭过菌，所以在湿热灭菌的验证中，化学指示剂不能代替生 物指示剂和温度/压力等的仪器测试。 5. d（decimal reduction）值）值 微生物耐受参数，系指在一定温度下，使微生物的数量减少一个数量级或 90所需要 的时间。d值越大，说明该微生物的耐热性越强。不同的微生物在不同的环境条件下（如不 同的灭菌温度、不同的介质环境）可能具有各不相同的d值。在湿热灭菌中，dt系指微生物 在灭菌温度t下的d值。一些文献中，如不是特指的其它灭菌温度，d的测试温度通常可 理解为 121。 6. 蒸汽的干燥值（蒸汽的干燥值（dryness value） 系含水蒸汽中蒸汽的测量值。干燥值为 100%即是饱和蒸汽。蒸汽的干燥值与它具有的 潜热直接有关，如干燥值为 0.5 时，表示蒸汽和水的比例为 50:50，其潜热量只有饱和蒸汽 的 50。 7. f 值（值（f-value, lethality factor，或，或 process lethality ） 指灭菌效力的度量值。 f(t，z)是在规定的z值下， 一个灭菌程序赋予一被灭菌物品在参照 温度t下的等效灭菌时间，简称t灭菌时间。 实验数据表明，在湿热灭菌中，微生物死亡遵循一级动力学反应。灭菌程序的杀灭效果 是灭菌温度t下，微生物耐热参数d 和灭菌时间f tt的函数。微生物的存活曲线可以用下面的 半对数式表示： 式中 nf：被灭菌物品在灭菌f分钟后，微生物的残存数量； f（t,z）：在温度t和该温度z值条件下，灭菌程序经计算的杀灭力，以t下的时 间（分钟）表示； dt： 微生物在t和z值下的耐热参数； n ：灭菌程序开始前，物品的初始菌数量。 0 fphy系指以灭菌工艺的物理参数为基础的物理杀灭力，它与灭菌温度、z值相关。在同一 湿热灭菌程序中，灭菌率l是灭菌温度的函数。l（灭菌率）和fphy（物理杀灭力）的计算式 分别如下： 4 或 灭菌过程的温度-时间曲线 产品温度 腔室温度 保温升温冷却 tl（杀灭率） t1 t（分） t2 图 1 灭菌过程温度-时间曲线与f 关系图 0 上式中，t1表示灭菌过程中产品升温达到 100的起始时间，t2是产品冷却至 100（灭 菌保温阶段结束）的时间，t是记录灭菌温度的间隔时间。 （100以下对f0值影响极小，可 以忽略） 。 fbio系指灭菌过程的生物杀灭力。它可通过指示剂挑战试验或微生物实际杀灭试验中求 得。生物杀灭力的计算公式如下： 上式中，n0为初始菌数，nf是灭菌后的残存菌数，d为下降一对数单位所需的时间。 f0值（标准灭菌时间） ，是指z取 10时，一个湿热灭菌程序赋予被灭菌品 121下灭菌 的等效灭菌时间。例如，某产品在 117灭菌 20 分钟或 115灭菌 32 分钟的灭菌效果均相 当于 121下灭菌 8 分钟。 8. 阴性分数法（阴性分数法（fraction-negative methods） 指取生物指示剂的起始值（n0）及有序灭菌的数据来建立一条二点的直线，以此确定 dt值的方法。此方法必须采用一组试样，经有序加热后，获得相反结果-一些样品为阳性， 另一些样品为阴性，然后按阴性样品的比例数计算d值。 9. 热穿透（热穿透（heat penetration） 热穿透试验是一个用以评估热量已经转移到被灭菌品的测温试验。为了测试热量的穿 透，应将测温探头放置在需评估的装载上（或装载物品中间） 。 10. 杀灭率（杀灭率（lethal rate） 指某一温度下灭菌 1 分钟与 121 下灭菌 1 分钟的比值， 即某一温度下灭菌一分钟所相当 5 的标准灭菌时间，以 l 表示（参见术语 6） 。 11. 湿热（湿热（moist heat） 系指用于灭菌的蒸汽、蒸汽-空气混合物以及过热水。 12. 不冷凝气体（不冷凝气体（noncondesable gases） 指在灭菌条件下不会冷凝而释放潜热的空气及其它气体。 13. 运行参数（运行参数（operating parameters） 共同界定灭菌程序每一阶段（如抽真空、升温、保温、冷却）且需加以控制和/或测试 的数值（如压力、温度、时间） 。 关键参数（critical parameters） ：指与产品安全及有效性相关，需加以控制和/或测试的 数值，关键参数失控应直接导致装载报废的结果。 重要参数（key parameters） ：用以确保运行中灭菌过程处于“受控状态”而需进行控制 和测试的数值。任何重要灭菌工艺参数不符合标准，应进行调查，并有说明装载处置合理性 文件和记录。 14. 过度杀灭程序（过度杀灭程序（overkill approach） 一个对产品生物负荷信息要求很低的灭菌程序， 即用一个假设的最差的状况， 来确定被 灭菌品非无菌的概率小于 10-6的程序-要求fphy和fbio均大于 12 分钟的程序。 15. 预真空程序（预真空程序（prevacuum process） 以真空手段排除灭菌腔室中空气后再进入灭菌阶段的灭菌程序。 此程序特别适用于对包 藏或夹带空气的物品，如织物、胶管、过滤器和灌装机部件等的灭菌。 16. 灭菌工艺性能确认（灭菌工艺性能确认（process performance qualification） 也称为验证， 系指有文件和记录证明一个灭菌系统在规定的运行环境条件下， 能够始终 如一地按预期要求完成并控制灭菌工艺的一系列活动。 17. 饱和蒸汽（饱和蒸汽（saturated steam） 又称干蒸汽， 系指与水蒸发曲线的温度与压力相应的蒸汽， 即处在汽液平衡状态但不夹 带液体水的蒸汽。 18. 蒸汽空气混合气体（蒸汽空气混合气体（steam- air mixture）灭菌）灭菌 以饱和蒸汽-空气混合气体为加热介质的灭菌方式。空气的作用主要是平衡灭菌过程密 封容器中的空气膨胀及药液汽化产生的内应力，尽可能减少冲盖、炸瓶、软包装容器形变等 质量风险，提高最终产品密封的可靠性。 为了防止被灭菌装载中形成冷点， 减少蒸汽损耗， 灭菌过程必须保持蒸汽和空气混合物 气体的不断循环。 19. 灭菌（灭菌（sterilization） 用以去除产品中活的微生物并使其达到规定存活概率的处理过程。 20. 无菌保证水平（无菌保证水平（sterility assurance level, sal） 6 产品/物品经灭菌后微生物残存的概率。该值越小，表明产品中微生物存在的概率越低。 为了保证注射剂的无菌安全性，采用湿热灭菌法的产品，其sal不得大于 10-6，即灭菌后微 生物存活的概率不得大于百万分之一； 而采用无菌制造工艺生产的产品， 如冻干或无菌分装 的产品，其sal一般只能达到 10-3的水平。 21. 灭菌程序（灭菌程序（sterilization cycle） 一个使某一物品达到无菌所需条件及规定运行参数（如时间、温度和压力）的程序。 22. 过热水程序（过热水程序（superheated water process） 也称过热水喷淋灭菌程序，是在空气加压条件下，通过循环泵强制过热水循环，持续与 被灭菌产品进行热交换的灭菌方式。此程序中，加压的作用不但是保持循环水不发生汽化， 而且要维持被灭菌产品包装容器内外压力的平衡，以防止冲盖或包装变形等产品缺陷。 23. 验证（验证（validation） 一个能够科学地确保生产工艺生产出合格产品的有文件和记录证明的程序。验证的 证据应通过验证方案的合理设计及对验证结果的科学、 全面的分析和评估获得， 这一过程最 好始于工艺的开发阶段，持续地进行，直至商业化生产。 24. 灭菌温度系数（灭菌温度系数（temperature coefficient, z value） 使 d 值变化一个对数单位温度需调整的度数（） 。 四、湿热灭菌基础 四、湿热灭菌基础 4.1 湿热灭菌的机理湿热灭菌的机理 湿热灭菌是研究最深、使用最广的灭菌方式。当温度超过细胞最佳生理活动的温度范围 时，随着温度的升高，细胞代谢减缓，细胞的生长及繁殖最终停止。每种细胞对温度的耐受 性均有一上限，一旦温度超过它的上限，起生命作用的蛋白质、酶及核酸会被永久性破坏， 从而导致细胞发生不可逆转的死亡。简言之，从机理上说，在湿热灭菌中，芽孢的死亡属蛋 白质的变性，所需灭菌温度较低。与此不同的，干热灭菌从机理上说则属于氧化，因此，所 需灭菌温度要比湿热灭菌要高得多。 4.2 影响芽孢耐热性的因素影响芽孢耐热性的因素 细菌芽孢的耐热性与很多因素相关，这些因素尚未完全弄清。芽孢形成时，细菌停止生 化反应，并将遗传物质包藏在芽孢中。此期间发生了一系列生理变化：细胞质大量脱水，体 积变小，并在缩小的原生质体周围形成一层厚壳。此外，还会形成一种名为吡啶二羧酸或 dpa（吡啶-2,6-二羧酸）的特殊化学物质。芽孢形成阶段，吡啶二羧酸钙与 dna(脱氧核糖 核酸)以及细胞内的酶形成复合物，它们能保护处于休眠状态的芽孢。芽孢可以在休眠状态 下存活多年，有的可存活上百万年，一旦出现有利于芽孢适于繁殖的条件，它便可在几分钟 内恢复到生长状态。在湿热灭菌中，了解影响微生物耐热性的因素对设计灭菌程序、验证及 日常监控十分重要，现对主要的影响因素简要说明如下： 7 4.2.1 物理物理/化学条件化学条件 在细菌芽孢形成期，环境因素影响芽孢的耐热性。例如，温度较高并有二价阳离子（如 ca2+ 2+ 、fe 、mg2+、mn2+）存在时，芽孢的耐热性增强；在另一些条件下，如当ph值超出 6.0-8.0 的范围时，或在高浓度的盐水或磷酸盐中形成芽孢时，芽孢耐热性下降。 自然界中芽孢的耐热性还与环境条件相关，如溶液浓度、水份（相对平衡湿度a） 、ph 值、 对芽孢有损伤作用的物理因素以及对芽孢有抑制作用的化学品等， 它们均会影响芽孢的 耐热性。 包藏在晶体或有机物内的芽孢，其耐热性通常明显高于一般非包藏态芽孢。因此，在某 一温度条件下， 将泥土包藏性芽孢和从泥土培养得到的芽孢同时灭菌时， 要想获得相同的灭 菌效果，前者所需的灭菌时间是后者的十倍。理解这一点，有它的现实意义，因为待灭菌品 要是受到了泥土中芽孢的污染 （如在运输处理中被未经过滤空气的微粒所致的污染， 或者由 人员或其它物品接触所致的污染） ，则很难被完全杀灭。换言之，药品生产企业的 hvac 系 统设计和维护， 物料、 容器、 工器具等的清洗及处理， 对灭菌的安全性起有十分重要的作用， 湿热灭菌的安全性不能只局限于产品的最终灭菌。 4.2.2 湿度湿度 在热力灭菌中，水对杀灭细菌芽孢起着重要作用。与水相关的灭菌方式只有两种：湿热 和干热。湿度达到饱和条件下相对湿度(rh，relative humidity)为 100（或aw=1.0）的灭 菌方式称为湿热灭菌；相对湿度低于 100条件下的灭菌方式统称干热灭菌。有证据表明， 温度在 90125之间，相对湿度在 2050时，细菌芽孢的耐热性强,较难杀灭；当相对 湿度高于 50或低于 20时，芽孢的耐热性迅速下降，比较容易杀灭。 人们普遍认为湿热灭菌之所以有效， 是在于热使细胞内的起生命作用的蛋白质和酶发生 变性或凝固。水分对灭菌有促进作用，湿热灭菌所需的温度低于干热灭菌所需的温度，是这 一论点的依据。 4.3 湿热灭菌中的能量转移湿热灭菌中的能量转移 温度是热能的度量。热量是物体及其周围环境之间因温差而发生能量转移的结果。 对于适宜采用湿热灭菌方式的产品或物品而言，湿热灭菌不失为一种十分经济而又有 效的方法。饱和蒸汽灭菌是湿热灭菌中最常见的方式。饱和蒸汽灭菌、过热水灭菌（喷淋、 直接浸泡/过热水旋转灭菌等，发生着多种形式的能量转移，包括传导、对流和辐射。在湿 热灭菌中能量（热能）通过容器壁，传给被灭菌药液，或通过灭菌介质（蒸汽或过热水）直 接接触传给被灭菌品，这种形式属热传导。 饱和蒸汽和过热水特性参见第十章附表 3. 饱和蒸汽灭菌中，能量的转移主要依靠蒸汽的相变。当水由液态变成汽态时，需要吸 收大量的热能（汽化热：540 卡/克） 。在灭菌过程中，当蒸汽接触到温度较低的物体时，就 会释放 540 卡/克的潜热，生成冷凝水，直到物体的温度与蒸汽温度相等。这个高效的热传 递方式， 是其他任何方法无法相比的。 在预真空灭菌程序中， 无论是高真空或脉动真空灭菌， 虽然在灭菌的初期尽可能的排除了腔室及被灭菌物品 （如过滤器、 衣服、 口罩、 灌装机部件、 软管等） 的空气。 但这并不意味着已排除了妨碍灭菌的全部障碍， 冷凝水及时而通畅的排放， 8 和排除空气同样重要，冷凝水如不及时排放，将大大影响蒸汽灭菌的效果。 过热水灭菌过程中，能量的转移主要靠过热水的质量（mass） ，携带热量的大量过热水 与被灭菌产品直接接触，通过容器壁，将热能传递给容器中的内容物并杀灭其中的微生物。 因此，为了使灭菌的获得良好的均匀性，喷淋循环是十分必要的。有数据表明，在过热水喷 淋灭菌过程中，装载对灭菌程序的影响较小，如果不是旋转式菌器保持旋转平衡的需要，则 不需要采用替代品将灭菌器装满后按满载灭菌程序来处理。 在 sam 的灭菌应注意的要点，将在 8.1.1 中加以讨论。 要提高灭菌的效果，就必须特别关注灭菌设备的安装、灭菌程序设计，这也是湿热灭 菌验证成功的必经之路。 4.4 湿热灭菌中微生物杀灭的数学模式湿热灭菌中微生物杀灭的数学模式 本节拟对灭菌程序的设计、开发、确认和验证所采用的基本科学手段作一概述。 实验表明，在恒定的灭菌条件下，微生物（只指芽孢）的死亡遵循一级动力学规则。芽 孢的杀灭率（体现为残存曲线）是耐热性的函数，与芽孢的数量无关。采用内生芽孢（生物 指示剂 bi）的悬浮液或放在载体形式的芽孢进行灭菌试验的结果表明，在湿热灭菌中，半 对数规则适用于芽孢的灭活过程。因此，残存曲线可用如下的一级方程式来描述： log nf = log no -f(t,z)/dt 式中， n挑战微生物灭菌 f 分钟后的残存数 f no 灭菌前微生物的数量 微生物在t和z值下的耐热参数。注意，dt中的温度t需和ft中的温 度相一致。 dt 在温度 t和温度系数 z 值条件下，经计算获得的湿热灭菌程序的杀 灭力，以 t下的时间（分钟）表示 f(t,z) 微生物杀灭的数学模式的其它计算公式，参见术语第 6 条。 在恒定灭菌温度下，理想灭菌速率（微生物残存曲线）可用下图表述： 9 10 n 99.9999 99.999 99.99 99.9 90 99 % -6 -5 10 -3 -4 10 10 -1 -2 10 10 0 1 10 10 4 5 2 3 10 10 10 10 6 10 3d 4d 5d 6d 1d 2d 3d 4d 5d 6d 1d 2d 0 每一单元的残存数 残存概率区 杀灭的 % t度下的等效灭菌时间（f 值） t,z 123456789101112 d=1 图 2 理想微生物残存曲线 上图中，dtz为 1 分钟，如t为 121，z取 10时，本图体现了美国药典在无菌保证 中过度杀灭的要求。 n 为 106 0 ， 作为被灭菌品的最差状况来处理。 如在 121的灭菌时间12 分钟，则微生物残存的概率将小于 10-6。 dt是半对数残存曲线的斜率的量度值，因此，它阐述了残存微生物与灭菌时间的关系。 某一微生物的耐热性，实际上与对其测试时的生理状态及环境（如ph）相关。 在半对数湿热灭菌模式中，z 类似于温度系数，它描述灭菌温度变化对生物指示剂耐热 性的影响，这也是灭菌过程的升温和降温阶段中，计算标准灭菌时间必不可少的参数。z 较 大，说明通过提高温度的方式来提高灭菌的有效性收效较小，反之，如 z 较小，则提高灭 菌温度对杀灭率的影响就比较明显。 f是半对数模式中用以阐述灭菌时间的术语。根据定义，f值是按某个参照温度来定的， 因此， 它是以等效灭菌时间的形式来表述湿热灭菌的杀灭力。 由于常规灭菌通常不可能是方 形波，即被灭菌品不可能在瞬间达到所需的灭菌温度，冷却过程也不可能瞬间降到常温，此 时，需要用温度系数z值来计算不同温度下的等效杀灭率，然后再对时间积分求得f值。由于 z的引入，对f 的计算至关重要，因此，本文附录中收载了z的推导文献。 0 应当指出， 一级反应只不过是用以表述单细胞芽孢死亡动力学经验公式。 它未必适用于 所有的生物指示剂系统，可采用其它的模式来描述微生物死亡的动力学。不过，过于复杂的 公式，难以在生产中采用，这里不再赘述。 残存曲线的半对数模式必须满足二个先决条件： 1) 挑战菌应是均一的（没有其它杂类芽孢） 2) 挑战菌的灭菌条件相同，或能折算成相同的灭菌条件，例如，折算标准灭菌时间 半对数模式并不准确地适用于所有的试验微生物，然而，据我们所知，迄今还没有找到 一个数学模式， 能够适用于所有试验微生物。 在工业上能采用的数学模式必须具备以下条件： 1) 数学模式具有科学性； 2) 有良好的安全性，即按该模式处理，可保证被灭菌药品的安全性； 3) 容易理解，便于应用。 10 半对数模式及其图形，既可直接用于分析试验数据，也可用于设计微生物控制程序。这 也是此模式在学术界和工业界获得普遍认可和广泛采用的理由。 五、灭菌法选择的基本原则五、灭菌法选择的基本原则 众所周知，药典收载的灭菌方法有湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌、除菌过滤等，液体 产品以最终灭菌方式采用湿热灭菌则是首选的方法。 美国药品生产验证指南中中提到了一个十分重要的观点，这就是说，去验证一个不 合理的系统是没有意义的。本指南认为，验证的试验是有限的，不应当将有限试验数据拼凑 成所谓的“验证报告” ，为一个设计不合理的系统或方法辩护，从而给产品和患者带来风险。 这一风险管理的理念，在欧盟的灭菌方法决策树及注释中得到了充分的体现。 在灭菌方式的选择上，欧盟在药品研发指南注释附录（cpmp/qwp/155/96）阐述的基 本原则值得借鉴（参见图 3） 。 考虑到产品的热稳定性和受热降解等实际情况， 尽管本指南不期望会有很多产品能够采 用 121 15 分钟的灭菌程序，但它的基本原则对液体产品灭菌方式的选择有着重要的指导 意义。 液体产品灭菌选择决策树 产品是否可以121湿热灭菌15分钟 否是 使用高压灭菌器 12115分钟的程序 产品是否可以湿热灭菌 f08分钟,达到sal10-6 否是 使用湿热灭菌 f08分钟 该处方是否可以用 除菌过滤法过滤 否是 使用除菌和无菌制造 工艺相接合的办法 将各组分先分别灭菌 再无菌配制灌装 图 3 欧盟液体产品灭菌决策树 本指南认为，除特殊情况外，对液体产品而言，首选的灭菌程序是 121 12 分钟的程 序（过度杀灭程序） ，当产品的处方热稳定无法采用这一程序时，则可采用f08 分钟的程 序。应当指出，过度杀灭法以杀灭微生物作为实现产品无菌的手段，对整个工艺的控制要求 较低；而f08 的残存概率法的工艺，将防止产品被耐热菌污染放在首位，而不是依赖最终 灭菌去消除微生物污染，因此，整个生产流程的工艺控制要求比较严格。 在产品不能采用以上二种程序而不得不采用其它手段时， 可参照以上决策树的程序， 往 下采用最终灭菌方式的替代方法， 此时， 应采用一切手段最大限度地减少产品灭菌前的生物 负荷，按我国现行条件来说，即是采用无菌制造工艺，即便如此，应当理解，产品的无菌保 证水平将大为降低。欧盟无菌药品附录第 82 款提到：就最终可灭菌的产品而言，仅采用除 11 菌过滤是不充分的。 现行的灭菌法中， 蒸汽灭菌应是首选的灭菌法。 如果药品不能最终灭菌， 可用一孔径为 0.22m 或更小的除菌过滤器 将药液过滤，但不能将病毒或支原体全部 滤除。应考虑采用某种程度的热力灭菌来弥补除菌过滤的不足。因此，一些实行流通蒸汽灭 菌法的小容量注射剂， 应参考无菌制造工艺的控制条件， 并以流通蒸汽灭菌来弥补除菌过滤 的不足，提高无菌保证的水平。 本指南认为， 包装材料热稳定差不得成为采用无菌制造工艺的唯一理由。 生产企业应当 将选择适用于某个特定处方的最佳灭菌方法放在首位， 然后再考虑选择相应的包装材料。 举 例来说，某类产品，只要有适当的充氮保护措施，产品完全可在 121灭菌，达到f0大于 12 的结果，那么，就没有理由因软袋包装不耐热，而以除菌过滤和流通蒸汽灭菌法取而代之。 当然， 也有因容器类型、 给药途径和病人对产品的可接受性而选择某一特定类型的容器 （如某些眼科用药） ，而该容器无法经受最终热力灭菌工艺，这种情况通常是可以接受的。 在这些情况下，生产企业有责任继续寻找可接受的替代容器，以便在条件成熟时，采用首选 的最终灭菌法。 由于最终灭菌具有最高的无菌保证水平， 因此， 不得因商业原因而将本来可以采用最终 灭菌f 8 的工艺，以牺牲产品的无菌保证水平为代价，改成无菌制造工艺。 0 六、灭菌方法的开发及选定六、灭菌方法的开发及选定 6.1 湿热灭菌方法选择决策树湿热灭菌方法选择决策树 在明确了产品灭菌法选择的基本原则之后， 即转入另一个课题-灭菌方式的选择。 显然， 不同特性的产品、材料的灭菌，需要采用不同的灭菌设备和灭菌方法。美国注射剂协会采用 下图来协助药品研发、制造人员选择适当的灭菌方法。 12 是热稳定 产品吗 是热稳定 产品吗? 否是 采用特殊方法采用过度杀灭法 被灭菌品 的形式? 多孔/坚硬物品密封液体产品 需考虑抽 真空? 需加压吗? 现有抽真 空灭菌器? 重力置换程序脉动真空程序 无有要 可用过热 水程序? 过热水或sam任何湿热程序 可 不 可 不 要 要 sam程序 图 4 湿热灭菌方法选择决策树 在国际上， 湿热灭菌工艺开发和应用， 可采用两种方法： 过度杀灭法 （the overkill method） 和残存概率法（bioburden based process），也称生物负荷法。美国注射剂协会提到 product-specific，按其中文意思来理解，即是“因品种制宜”的方法。从实际内容看，与残 存概率法原则基本相同，即经最终灭菌后，微生物残存的概率小于 10-6标准没有变，但对f0 的要求有一定的灵活性，美国注射剂协会认为，严格实施cgmp、高的自动化程度以及低污 染的软包装材料的采用，使一些产品的生物负荷很低，例如，每个容器中生物负荷在 1 至 100 个菌之间，且多数是不耐热菌。一般说来，当生产环境中出现了芽孢或从产品中分离出 芽孢时，才需要测试d值。将产品在 80-100下，加热 10-15 分钟，先将耐热性差的微生物 筛选掉，再根据耐热性强的微生物的dt来确定安全限度，这样一来，f0可能不一定需要满足 8 的要求。热稳定性差的产品，达不到f08 时，须按无菌制造工艺要求严格控制环境及 工艺的各个环节。可以理解，只要产品的热稳定性允许， “因品种制宜”的方法理所当然地 会选用f 8 的灭菌程序。 0 简言之， f0只是个手段， 低于百万分之一的残存概率才是湿热灭菌产品的 “无菌” 标准。 中国业内人士一直注视着国际制药技术的进展，美国注射剂协会的上述观点，早在 2005 版 中国药典灭菌法中已有体现。然而，众所周知，人是主要的污染源，我国绝大多数企业 目前的自动化程度、生产全过程的监控和管理还不可能达到美国注射剂企业的水平，执行 f0低于 8 的标准，就必然需要强化整个过程的微生物污染控制，在采用无菌制造工艺的前提 下，再作适当的热力灭菌处理，即使这样，其无菌安全水平也会比f 8 残存概率法低。 0 13 6.2 过度杀灭法过度杀灭法 只要条件允许，产品的湿热灭菌就应采用过度杀灭法（the overkill method） ，这是因为 它对工艺全过程的控制要求相对较低， 而安全性却十分高。 采用过度杀灭法的目标是确保达 到规定的无菌保证值10-6，而不必担心装载的生物负荷和耐热性，本指南图 1 系最差状况 的示意，事实上，在企业实际生产中，只要遵循gmp的要求，不可能出现那种一个包装单 元中（如瓶、袋）芽孢数达到一百万个的糟糕情况。 假定生物负荷的数量和耐热值设为如下水平： n 106 0 d1211 分钟 z10 将数据代入公式，得 l=1，再按计算，达到微生物残存概率为 一百万分之一所需的物理及生物杀灭力如下： 物理杀灭力fphy为 12 分钟， 生物杀灭力 fd bio 121（logn log n0f）12 分钟 自然界中很少检到d121大于 0.5 的微生物，这已被国内一些合资企业 20 多年的实践所 证实。在过度杀灭法程序设计中，设定的芽孢数量应高于日常实际监测到的数据，其耐热性 也应比日常监控中分离菌的耐热性高， 这样设定的灭菌程序才具有挑战性， 以致在产品检出 耐热菌株时，便于对灭菌后微生物残存的概率科学地加以评估。 湿热灭菌工艺采用为过度杀灭法后， 对被灭菌产品的初始菌监测要求就比较低， 不需要 每批进行测试，除非是实施参数放行的产品。 需要说明的是， 与美国药典过度杀灭程序有所不同， 欧盟法规将湿热灭菌过度杀灭程序 定为 121 15 分钟，这既是最终灭菌药品努力的方向，也反映了欧盟制药业的现实。其实， 在美国及我国，均有这类能经受 121 15 分钟的产品。事实上，有一些处方相同的产品， 例如复方氨基酸和脂肪乳剂，只要在生产工艺条件方向上加以改进，121 15 分钟的程序 并不是无法实现的。如果处方、工艺条件或包装材料难以经受 121 15 分钟程序时，那么， 仍可按决策树的方向，选择其它适当的灭菌程序。 6.3 残存概率法残存概率法 耐热性较差的产品或物品灭菌就不能使用过度杀灭法。因此，需要建立一个灭菌程序， 它必须能杀灭产品中的污染菌， 同时又不会导致产品降解物/副产物在整个生命周期内超标， 这就是残存概率法。这与pda技术报告n01 中按产品特性进行设计的方法（product specific approach）相呼应。残存概率程序的灭菌温度通常低于 121，如 117或 118等。设计残 存概率程序，需要选定初始菌的控制限度n 、再设定灭菌温度下的d 0t，此外，灭菌还需要 留有安全的余量。后者需要经验、日常监测获得的生物负荷数据的波动范围等，这可以参照 14 同类产品的数据来定。 有些企业很可能以前从来没有测试过生物负荷， 那么现在可做一个阶 段的测试，以使设定的参数查有实据，虽说这是后补，但它总是一个完善的过程，应当加以 肯定。获得上述数据后，就可以正式设计出一个能达到sal小于 10-6的灭菌程序。 按 gmp 规范要求生产时，可以预期，玻瓶产品的生物负荷会比较高，而软包装产品实 际生物负荷数则比较低，后者约在 1100cfu/包装的水平，将灭菌前产品在 80100下 加热 1015 分钟，可以杀灭生长态的菌及耐热值低的微生物，获得每个包装单元中耐热的 菌的数量，计算灭菌后微生物残存的概率，例如， 假设产品的生物负荷测试中： n 102 0 d1211 分钟 z10 要求经灭菌后，微生物残存概率nf小于 10-6 利用上面的数值，可以计算出微生物残存概率小于 10-6所需的fphy和f如下： bio f f 0phyfbiod121（logn log n0f）8 分钟 对有效过滤面积较小的除菌过滤器而言，缺陷假单胞菌（brevundimonas diminuta）挑 战试验确立了除菌过滤器的起泡点与除菌过滤的性能的相关性， 与此相似， 生物指示剂的挑 战性试验确立了标准灭菌时间与杀灭微生物性能的相关性。因此，标准灭菌时间f0直观地反 映了湿热灭菌程序的杀灭能力。将lethality factor，或process lethality作为灭菌效力的度量 值。虽然它以分钟为单位，但它的内涵体现了湿热灭菌的杀灭微生物的能力。 可以理解，源于植物为原料药的注射剂，其生物负荷比一般化学药品高，存在耐热芽孢 的概率也会比较大。在设计灭菌程序时，更应当特别注意收集生物负荷的数据，从日常微生 物监控中建立生物负荷的数据库，不仅仅是微生物的染污水平，还应包括污染菌的耐热性。 以残存概率法（生物负荷法）为依据的灭菌工艺，通常要求对每批产品灭菌前头、中、 尾的产品进行生物负荷（带菌量/污染水平）及耐热性的测试，积累微生物污染的数据资料。 如果多年以来证明在实际的 gmp 控制条件下，污染水平很低，且检不到耐热菌，那么，监 控的方案可酌情作适当的调整。 6.4 装载类型的界定装载类型的界定 选择适当的灭菌程序，还需要充分考虑到装载特性对灭菌效果的影响。 在制药行业中，多孔/固体装载包括过滤器、织物，不锈钢容器、灌装机部件等。不管 这类装载的具体细节如何，一般不再细分，只采用通用的灭菌程序。这类物品通常用饱和蒸 汽灭菌，让蒸汽与被灭菌品直接接触，能量通过传导和/或对流传给被灭菌品，同时，蒸汽 冷凝，生成冷凝水。这类物品通常采用过度杀灭程序，如织物、不锈钢类物品的灭菌，f0通 常超过 30 分钟。 一个确定的湿热灭菌程序应当考虑到装载的特性及特定装载的方式。例如，多孔/固体 物品通常包括但不局限于以下物品： ? 过滤器（薄膜式过滤器、筒式过滤器、预过滤器等） 15 ? 胶塞和其它聚合物密封件 ? 管道和软管 ? 工作服、口罩 ? 清洁用具 ? 设备更换部件，如药液灌装头 液体装载通常包括但不局限于以下物品： ? 已灌装入最终容器（如小瓶、软包装、玻瓶或安瓿）的产品（溶液、混悬剂或乳剂） ? 已检验或加工后剩下的可能含有致病菌的废液。 出于保护密封完好性及提高产品收率的目的， 液体产品的灭菌通常需要采用空气加压的 灭菌程序。 6.5 湿热灭菌对介质的要求湿热灭菌对介质的要求 用于湿热灭菌介质包括蒸汽、压缩空气、冷却水，还有用于安瓿的“检漏色水”等。为 了避免产品灭菌后的二次污染，与产品接触的介质应是无菌的。 6.5.1 蒸汽蒸汽 在一定温度下，不同加热介质（灭菌介质）的热能有很大差别。过热水、饱和蒸汽和蒸 汽-空气混合物含有不同的热能。只有饱和蒸汽作为灭菌介质时，蒸汽的温度和压力之间存 在对应关系（见附表 1） 。 湿热灭菌采用的蒸汽包括工业蒸汽和纯蒸汽， 二者使用的场合不同。 工业蒸汽一般不应 与药液过滤器、灌装机部件类被灭菌品直接接触，只用于转移能量的目的。它可用于脉动真 空灭菌器的夹套（外层）加热。在过热水灭菌过程中，则可用作热交换器加热灭菌用水（通 常是纯化水） 的热源。 一种较常见的情况是工业蒸汽用于小容量注射剂 （安瓿） 的最终灭菌， 然而，应当认识到，少数安瓿可能存在密封性缺陷，微量的工业蒸汽有可能进入这类有缺陷 的安瓿，且在检漏和灯检中难以发现，这会给患者带来风险。据不完全统计，在湿热灭菌过 程中，国内约有 40%的企业采用工业蒸汽来灭菌与产品直接接触的过滤器、不锈钢容器及 灌装机部件，这种状况应引起重视，并尽快采取相应措施。 由于灌装部件、过滤器等直接与产品接触，灭菌腔室中的蒸汽应采用纯蒸汽。纯蒸汽， 也叫做洁净蒸汽和高质量蒸汽。 纯蒸汽的冷凝液应符合中国药典注射用水的要求。 纯蒸汽可 以由纯蒸汽发生器生产，也可由蒸馏水机提供。获得纯蒸汽的方式，可由企业根据产能平衡 的要求自行决定。 除化学项