肿瘤抑制因子arf对去乙酰化酶sirt1的调控及生物学功能的分析.pdf

华东师范大学 硕士学位论文 肿瘤抑制因子arf对去乙酰化酶sirt1的调控及其生物学功能研 究 姓名：王婷 申请学位级别：硕士 专业：生物医学 指导教师：王传贵 201104 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 肿瘤抑制因子a r f 对去乙酰化酶s i r t l 的调控 及其生物学功能研究 摘要 s i f t l 是哺乳动物细胞中与酵母沉默信息调节因子s i r 2 同源性最高的同系物， 广泛表达在成熟组织中，可以与染色质、许多转录因子以及转录共调节因子相互 作用，通过去乙酰化作用，调节基因的转录、染色体的稳定性以及靶蛋白的活性， 进而参与代谢、衰老、肿瘤发生发展等一系列过程。 a r f 作为一个肿瘤抑制基因，在肿瘤的发生发展过程中起着至关重要的作 用。大多数肿瘤细胞都是通过干扰r b ( r e t i n o b l a s t o m ar b ) 蛋白或者p 5 3 的功能， 导致细胞周期调节紊乱以及阻抑凋亡反应的。i n k 4 a a r f 基因可同时调控这2 条通路，参与控制细胞增殖和凋亡。a r f 一般通过p 5 3 依赖的途径实施其抑癌 功效，但不管p 5 3 基因缺失与否，a r f 依然可以与许多种蛋白结合，并引发其翻 译后修饰，这是a r f 行使其不依赖于p 5 3 的基因表达调控和抑制肿瘤作用的一 种普遍机制。 本课题研究首次发现了s i f t l 是a r f 一个新的靶蛋白，过表达a r f 时，s i r t l 的表达水平显著减少，a r f 在细胞内可以与s i r t l 结合，且两者共同过表达时有 共定位现象。此外，a r f 可以使s i r t l 的泛素化以及s u m o 化修饰明显上调。a r f 的1 6 4 区段，是其与s i r t l 的结合区，也是行使其翻译后修饰不可缺少的。希 望这一研究可以进一步发现a r f 调控s i r t l 的具体机制，阐明二者功能上的关 系，从而对s i r t l 参与的众多基因的转录调控、能量代谢、细胞衰老的过程以及 增强对药物的敏感性提供理论依据。 关键词：触遇s i r t l ，泛素化修饰，s u m o 化修饰 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 r e g u l a t i o no fs i r t 1a c t i v i t yb yt u m o rs u p p r e s s o ra r f a b s t r a c t a st h em o s th o m o l o g i ch o m o l o g u eo fs i l e n ti n f o r m a t i o nr e g u l a t o r2o fy e a s t ， s i f t lg e n ei se x t e n s i v e l ye x p r e s s e di nm a t u r et i s s u e s ，a n di sr i c hi ne a r l ye m b r y oa n d r e p r o d u c t i v ec e l l s i t i si n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no fg e n et r a n s c r i p t i o n ，e n e r g y m e t a b o l i s ma n dc e l la g i n g t h ea r fp r o t e i ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tt u m o rs u p p r e s s o ra n di tp l a y s w i d e s p r e a da n di n d e p e n d e n tr o l e i nt u m o rs u p p r e s s i o n t h i st u m o rs u p p r e s s o r f u n c t i o n si nt h ep 5 3a n dp r bc e l lc y c l er e g u l a t o r yp a t h w a y sa n dc a ne f f e c t i v e l y a c t i v a t eb o t hp a t h w a y st oi n d u c ec e l lc y c l ea r r e s to rc e l ld e a t h a l t h o u g hm u c ho f a r f st u m o rs u p p r e s s o ra c t i v i t yi sm e d i a t e dt h r o u g hp 5 3 ，i ta l s oh a sp 5 3 - i n d e p e n d e n t f u n c t i o n a r fc a ni n t e r a c tw i t l lm a n yp r o t e i n sa n di n c r e a s et h e i rp o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n sw i t h o u tp 5 3 t h i sm i g h tb eag e n e r a lm e c h a n i s mb yw h i c ha r fc o u l d p e r f o r mi t sp 5 3 - i n d e p e n d e n te f f e c t so ng e n ee x p r e s s i o na n dt u m o rs u p p r e s s i o n i nt h i ss t u d y , w ep r o v e ds i r t li san o v e lb i n d i n gp r o t e i no fa r f ，a n dt h e e x p r e s s i o nl e v e lo fs i r t lc a nb ed o w n - r e g u l a t e db ya r e w ew e r ea b l et of i n dt h e t w op r o t e i n sf o r mac o m p l e xa n dd e t e c tt l l e i rc o l o c a l i z a t i o nw h e ns i r t la n da r fa r e e x p r e s s e d i nv i v o a n dt h e u b i q u i t i n a t i o na n ds u m o l a t i o no fs i r t l c o u l db e d r a m a t i c a l l yi n c r e a s e da sa r fa c c u m u l a t e d t w oa r fm u t a n t s ，1 6 4b i n d st os i r t l w h i l et h eo t h e ro n e6 5 - 13 2d o e sn o t t h i sr e s e a r c hi so n l yi ni t si n f a n c y w eh o p e0 1 1 1 s t u d ym a yr e v e a lm o r ep o t e n t i a lf u n c t i o no fa r f - s i r t li n t e r a c t i o na n dp r o v i d e t h e o r yb a s i sf o rs i r t li nt h er e g u l a t i o no fg e n et r a n s c r i p t i o n ，e n e r g ym e t a b o l i s m ，c e l l a g i n ga n dd r u gs u s c e p t i b i l i t y k e yw o r d s ：a r f , s i r t l ，u b i q u i t i n a t i o n ，s u m o l a t i o n 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 王蝗硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 翁杰敏教授华东师范大学主席 王平教授华东师范大学委员 王嫒教授华东师范大学委员 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 第一章综述 第一节组蛋白去乙酰化酶s i r t l 1 s i r t l 基因及其结构特征 s i r t l 是哺乳动物细胞中，与酵母沉默信息调节因子s i r 2 同源性最高的同系 物。s i f t l 广泛表达于成熟组织中，可以与染色质、许多重要的转录因子以及转 录共调控因子相互作用，通过去乙酰化作用，调节基因转录、靶蛋白活性以及染 色体稳定性，进而参与代谢、衰老、肿瘤发生发展等一系列病理生理过程。 s i r t l 基因位于1 0 q 2 1 3 ，长约3 3 k b ，其蛋白质分子量大小约为6 2 k d ，无剪 接变异，保守性很科。如图1 所示，晶体结构分析表明s i r t l 具有两个基本结 构域：一个大的结构域，主要由6 个a 螺旋和6 个d 折叠组成，这一结构域保守 性较强：另有一个小的结构域，由3 个反平行b 折叠，2 个a 螺旋和1 个锌原子 组成，这一结构域保守性较弱；另外还有一系列环状结构与这两个结构域相连， 并在这两个结构域之间形成一个裂隙，它的底物就结合于此，并发生催化反应 2 ，3 】。 图1s i r t l 结构图【2 】 飞。缀攀 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 s i r t l 属于s i r t u i n 家族，在n a d + ( 烟酰腺嘌呤二核苷酸) 存在的情况下， 使组蛋白非组蛋白去乙酰基，生成去乙酰化组蛋白月 组蛋白，氧代乙酰基a d p 和尼克酰胺( n i e o t i n a r n i d e ，n a m ) ，反应过程如下所示。 n a d + 7 , 酰化赖氨酸n a m + 乙酰a d p 核糖+ 去乙酰化的赖氨酸 略r 峨 图2s i r m i n 催化的蛋白质去乙酰化反j 立【4 】 细胞质中 n a d + n a d h 比率变化会影响s i r t l 的去乙酰化活性，比率升高 可以增强s i r t l 的活性，反之则可以降低其活性，由此影响到细胞内相关基因的 表达【5 】。此外，我们看到n a m 是s i r t l 去乙酰基反应的产物之一，同时n a m 也是s i r t l 很强的非竞争性抑制剂，因此s i r t l 的活性可以受到n a m 的调节。 晶体结构分析表明1 1 6 位的h i s 和1 5 9 位的p h e 在催化反应中引导底物移向 正确的催化活性位置；另两个保守的氨基酸2 4 位s e t 和1 0 1 位a s p 不直接与 n a d + 相互作用，而是埋在蛋白质底部，稳定n a d + 的腺嘌呤核糖，使其稳定的 结合【3 1 。 2 s i r t l 基因的生物学功能 s i r t l 是目前哺乳动物s i r t u i n 家族中被了解最多的蛋白，它位于核内，可以 与许多蛋白因子相互作用，进而参与一系列新陈代谢活动。例如，它能够调节转 录因子p m l 8 1 、b c l 引、t a f l 6 8 引、c t i p 2 9 1 、h e y 2 1 0 l 、m y o d 【1 1 1 的活性，从而 参与f o x 0 1 、f o x 0 3 a t l 2 - 1 3 1 、p p a r - t 1 4 1 、n f k b 1 5 】的信号通路。除此之外，s i r t l 还抑制细胞凋亡因子k u 7 0 的活动并参与d n a 的修复【1 6 】。过表达的s i r t l 还可 以引起端粒酶逆转录酶( h t e r t ) 的过量表达，进而影响细胞分裂【1 7 】。s i r t l 与 2 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 p 5 3 鲫、f o x o 1 2 - 1 3 等作用，起到一个内源性的凋亡抑制因子的作用。此外，近期 报道显示，s i r t l 还可以将自噬相关基因a t 莎，a t 矿和a t 9 8 去乙酰化，从而促 进细胞自噬的发生【1 引。 表1 与s i f t l 相互作用的部分蛋白因子 蛋白因予细胞，组织牛理意义 p 5 3 n f kb k u 7 0 p p a r y e 2 f l p g c 1n s m a d 7 t a t f o x 0 3 a p 3 0 0 a r p 5 3 f o x 0 3 a u c p 2 f o x o h l h 2 h 3 乳癌，肺癌等细胞系 肺癌等细胞系 入胚肾细胞系等 ，脂肪细胞脂肪3 1 3 ll 肺癌等细胞系 i | 阡细眦肝脏 肾小球膜细胞 人胚肾细胞系等 成纤维细胞等 前列腺细胞系等 肝膨骨骼肌 胰岛细j j 6 i 胰岛组织 肝癌细胞系等 减少凋亡，促进生存 增加t n f a 诱导的凋亡 减少凋亡促进生存 促进脂肪动员 应答d n a 损伤 增加糖合成 降低t g f 1 3 诱导的凋亡 增加t a t 活性 抗应激 抑制增殖 调节营养利用率 增加胰岛索分泌 参与异染色质形成 3 s i r t l 基因的疾病相关性 3 1 s i r t l 与2 型糖尿病 大量研究表明，2 型糖尿病的发病原因与遗传、工作、饮食以及年龄等因素 有关，其中的一个主要原因是胰岛素分泌不足。研究报道显示，s i r t l 对胰腺p 细胞的胰岛素分泌以及葡萄糖代谢具有调控作用，故而与糖尿病等代谢性疾病的 发生相关。m o y n i h a n 等的研究显示，s i r t l 能够正向调节哺乳动物p 细胞的胰岛 素分泌，在他建立的转基因小鼠模型中，s i r t l 能够特异性高表达于胰岛1 3 细胞， 与对照组相比，转基因小鼠耐糖量以及糖刺激引起的胰岛素分泌得到明显改善 f 1 9 】 o 解偶联蛋白2 ( u c p 2 ) 可以解离呼吸链氧化磷酸化偶联，减弱p 细胞将葡 萄糖转化为a t p 的能力，并将a t p 的能量转化为热量，使胰岛素释放减少；研 3 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 究表明，s i r t l 可以直接结合到解偶联蛋白2 ( u c p 2 ) 的启动子上，抑制其转录， 从而增加胰岛素的释放【2 0 】。 3 2 s i r t l 与神经退行性疾病 近些年的研究发现，敲除s i r t l 的小鼠会出现脑畸形、视网膜病变等神经系 统发育异常。研究表明p 淀粉样多肽( a p ) 诱导下的n f - k b 乙酰化水平增高是 导致阿尔茨海默病的主要原因【2 1 1 。s i f t l 的过表达可以明显减少这一现象的发生， 采用短期能量限制( c r ) 的方式，可用于辅助治疗神经退行性疾病【2 2 1 。s i f t l 不 仅在正常生理情况下具有神经保护作用，而且对退化的神经元细胞亦具有保护作 用，在大脑的发育过程中起着非常重要的作用。 3 3 s i r t l 与心脏疾病 研究发现s i f t l 对心脏形态的形成极为重要，敲除s i f t l 会出现心脏发育异 常，出生后存活率极低，无论是其活性或者表达量发生改变，在心脏疾病的发生 发展中都起着重要作用。研究表明s i r t l 通过对p 5 3 2 3 1 、b c l 2 家族【2 4 】、脂肪细 胞p p a r 7 2 5 】等的调节，可以延缓冠心病、心力衰竭等疾病的发生，此外，s i f t l 还可以通过对免疫细胞的调节，减轻心脏炎症【2 6 1 。 3 4 s i r t l 有关的新药开发 白藜芦醇是一种红葡萄酒中的植物抗毒素，可以增强细胞内s i r t l 的活性【2 7 】。 t c n o v i n s 可以抑制s i r t l ，通过抑制s i r t l 去乙酰化活性可以增强p 5 3 基因乙酰化 水平【2 引。此外，烟酰胺( n a m ) 、s p l i t o m y c i n 、s i r t i n o l 也是s i f t l 活性抑制剂， 但其抑制s i f t l 的具体机制还不是很清楚。研究发现，在多种产生耐受现象的肿 瘤细胞系中，s i r t l 的表达水平有所上升，通过r n a 干扰s i f t l 的表达后，肿瘤 细胞对化疗药物的敏感性明显增强，提示s i r t l 参与了肿瘤化疗的药物耐受，将 来针对s i r t l 的新药开发，有望提高肿瘤的化疗效率【2 9 1 。 3 5 s i r t l 在细胞凋亡中的作用 p 5 3 在体内可以与不同的转录共激活子以及共抑制子相互作用，同时还可以 作为转录因子直接影响细胞胁迫，以诱导生长停滞或者细胞凋亡；正常情况下 4 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 p 5 3 处于无功能的休眠状态，但当细胞处于胁迫状态下或者d n a 受到损伤时， p 5 3n 末端的多个位点发生磷酸化，c 末端的多个赖氨酸发生乙酰化，这时p 5 3 被激活并行使其诱导细胞凋亡的功能；其中通过对p 5 3 点突变体的研究发现，n 末端的磷酸化并不起主要作用，而c 末端的乙酰化却十分重要【捌。 l u o j 等发现，s i r t l 可以通过去乙酰化p 5 3 ，降低其转录活性从而延长细胞 的寿命。他们通过免疫共沉淀实验发现，不管在体内还是体外，s i r t l 与p 5 3 均 相互作用，s i r t l 能使p 5 3c 末端l y s 3 8 2 的乙酰基脱去，使其成为无活性形式， 从而降低其对下游靶基因的激活作用，并由此减少由p 5 3 诱导的细胞凋亡，使细 胞寿命延长【3 1 】。同时研究发现，敲除s i r t l 的激活调节子后，可以看到p 2 1 的表 达加强，g 0 g 1 细胞群显著增加，促进了细胞的凋亡【3 2 1 。在突变细胞中，过量表 达s i r t l 可以增强细胞对环境的应激能力，以上研究表明，s i r t l 在调控p 5 3 信 号通路以及调节细胞产生应激反应中发挥着重要作用【”拼】。 第二节细胞内重要的肿瘤抑制因子i n k 4 a a r f 1 i n k 4 a a r f 基因的结构 i n k 4 a a r f ( i n h i b i t o ro fc d k 47a l t e r n a t i v er e a d i n gf r a m e ，i n k 4 a ? a r e ) 是位 于人第9 号染色体短臂2 区1 带( 9 p 2 1 ) 的基因，这一基因位点包含有2 个启动子， 可以通过基因重叠编码两种抑癌蛋白。两个启动子共享部分外显子，通过2 个独 立的转录调控区，可以生成两种不同的转录产物，分别是：a 转录产物p 1 6 i n k 4 a 和b 转录产物a r f ( 人类是p 1 4 a r f ，小鼠是p 1 9 a r f ) 3 6 】。 其中，p 1 6 i n k 4 a 基因全长8 5 k b ，由2 个内含子分割成3 个外显子，包含 1 5 6 个氨基酸。5 端第l 外显子为1 2 6 b p ( e x o n l a ) ，第2 外显子为3 0 7 b p ( e x o n 2 ) ， 3 端第3 外显子为1 1 b p ( e x o n 3 ) ，3 个外显子共同编码分子量为1 6k d 的蛋白产物， 含有1 4 8 个氨基酸的开放阅读框架( o r e ) 鲫。 5 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 霸妇1 1 2b 轻试两誊，n o l sm o u 豫n o l s 秒鳜黝缓罐黔瓣罐p 辩v 嬲弦鼽zp 羹厶t g 肼a l p s i i p 褰礴地婚喀k 黔罐塌扎黔嚏釉 辫兹豳疆壤增潍r 曩避e 缀罐| 缸疑裒p r t 薹s o 乳i i f 静撇静攀黔墩篓糙麟羹一礓6 3 鼍哺2h u m a n n o l s h u m s n6 5 囊辩霸i 骠鬻s gg a a 荔魏 囔r g a c 黝象r h s m 豢t ? 自鬻秀( p 1 l ( ；荔自端鳕自j o 目锈p 备壤l ；5 嬲i 自自i 甥镕鬓一荔8 1 2 7 u 秘蓐觏缴溯缴瀚8 s s 数罐e r f 嚣貔“；雾抖y o 罐p 灞鳜：游錾嬲编磅觞劾v 鬓鼯；黝：兹酝绨彩歉1 2 7 觳蛳2 。一一曼嬲熬豫壁魈堕塑受建 。 h u m n1 2 8 缀绣黔 m o u s e1 2 8 缫i 硼缓鼢船8 巍擀l 酣翰挪搿v l f v f i r w v v fv y r w r r f i d rf 魄 1 9 9 5 年有研究报道，在外显子l a 上游约2 0 k b 处，有一个与外显子c x o n l a 长度相同的外显子e x o n l l b ，虽然1 d 的外显子2 ( e x o n 2 ) 是1 a 的剪接子，但由于1 p 改变了e x o n 2 的阅读框架，因而产生了2 个不相同的氨基酸序列，外显子1 a 编 码p 1 6 i n k 4 a ，1 1 3 编码p 1 9 a r f ( 鼠) p 1 4 a r f ( 人) 。小鼠p 1 9 a r f 蛋白的阅读框 终止于e x o n 2 ，由1 6 9 个氨基酸组成，相对分子量为1 9 k d 。人p 1 4 a r f 编码蛋 白终止于e x o n 3 的上游，产生1 个由1 3 2 个氨基酸组成，相对分子量为1 4 k d1 3 8 - 3 9 。 2 i n k 4 a a r f 基因的调控机制 i n k 4 以r f 是一种重要的肿瘤抑制因子，a r f 位点的失活常常会导致其丧 失肿瘤抑制的功能，诱发肿瘤形成。近年来的研究表明，i n k 4 a a r f 基因缺失 时，最常发生的肿瘤为肉瘤，其次为淋巴瘤和一些中枢神经系统肿瘤；另外在许 多人类肿瘤细胞中，如白血病细胞、肺癌细胞、皮肤癌细胞、黑色素瘤细胞中也 发现该基因失活，而且发现纯合缺失i n k 4 a a r f 基因的细胞更易发生肿瘤恶性 转化【删。 细胞增殖失控以及细胞凋亡障碍是机体发生癌变的根本原因，大多数肿瘤细 胞都是通过干扰r b ( r e t i n o b l a s t o m ar b ) 蛋白或者p 5 3 的功能，导致细胞周期调节 紊乱以及阻抑凋亡反应的。i n k 4 a a r f 基因可同时调控这2 条通路，参与控制 细胞增殖和凋亡。 2 1 p 1 6 a r f - c d k 4 一r b - e 2 f 通路 细胞周期素d ( c y c l i nd ) 与细胞周期素依赖蛋白激酶4 ( c d k 4 ) 结合后可激活 c d k 4 的蛋白激酶活性，使r b 蛋白发生磷酸化，释放转录因子e 2 f 。与d n a 合成密切相关的重要酶类，如d n a 聚合酶( p o l ) 、胸腺激酶( t k ) 、二氢叶酸还 6 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 原酶( d h f r ) 等基因的转录，可以被e 2 f 激活，促使细胞从g l 期进入s 期。然而 p 1 6 a r f 能够与c y c l i n d 竞争性得结合c d k 4 ，导致r b 蛋白不能被磷酸化，转录 因子e 2 f 不能被释放，通过调控c y c l i n d c d k 4 - r b e 2 f 通路，使细胞分裂不能 通过g 1 期进入到s 期的转变，而被阻滞于g 1 期【州1 1 。 医函歪圈 毒 匦匿蛩匦窭圜叫匪警囵叫圜岭隧圈 2 2 p 1 4 a r f - m d m 2 一p 5 3 通路 在大多数正常组织中，细胞中a r f 、m d m 2 以及p 5 3 水平都很低。m d m 2 能够结合在p 5 3 四聚体的转录活性区域，干扰p 5 3 的转录激活作用，泛素化p 5 3 并将其从细胞核转运到细胞质，使其在蛋白酶体中降解，从而抑制p 5 3 相关基因 的表达【4 2 】。 但是在异常的促有丝分裂信号，如原癌基因r a s 过表达时，a r f 基因的表 达可以被激活。r a s 调节r a f m e k e r k 激酶通路激活c d k c y c l i n 激酶，从而磷 酸化视网膜细胞瘤蛋白( p r a ) ，释放e 2 f 1 ，e 2 f 1 可以结合于a r f 的启动子上， 从而刺激a r f 的表达【4 3 1 。 当a r f 被诱导或者过表达时，它能够捕获m d m 2 ，拮抗m d m 2 上述的所 有功能，稳定p 5 3 的表达，一方面，促进p 2 1 的激活，从而抑制c y c l i n - c d k 复 合物，引起细胞周期阻断；另一方面，这一过程同时可以上调b a x b i m 比值， 下调b c l 2 的表达，增加线粒体细胞色素c 的释放，最终引起细胞凋亡脚郴】。 a r f 蛋白最保守的区域在n 端，由e x o n l d 编码，n 端的2 1 4 个氨基酸残 基是a r f 与m d m 2 的结合区域；m d m 2 以其中央的第2 3 5 2 6 4 以及2 7 0 2 8 9 个 7 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 氨基酸残基与a r f 结合，而p 5 3 结合区为m d m 2 的n 端1 7 1 2 5 个氨基酸残基； a r f 和p 5 3 以非竞争的方式分别结合在m d m 2 的两个不同区域；而a r f 的c 端6 2 个氨基酸与核仁定位有关，如果缺失这些序列，同样不能诱导p 5 3 在核质 中积剽蛔。此外，a r f 也可以通过形成a r f m d m 2 p 5 3 的三元复合物，阻断p 5 3 的核输出以及降解h 7 】。 2 3 p 1 4 a r f 的非p 5 3 调节通路 研究表明，在m y c 转基因小鼠中，同时缺乏a r f 和p 5 3 的比那些只缺乏 a r f 或p 5 3 的细胞分裂快，表明a r f 还有另外不依赖p 5 3 的功能。后续研究报 道指出，a r f 、m d m 2 、p 5 3 三种蛋白同时敲除的老鼠比敲除p 5 3 和m d m 2 或 只敲除p 5 3 的动物致癌率更高，若使敲除三种蛋白的小鼠重新表达a r f ，就会 使细胞周期停于g 1 期。以上实验现象表明除了a r f m d m 2 p 5 3 途径外，a r f 还通过非p 5 3 途径发挥抑癌作用【4 8 】。 最近研究发现，不管p 5 3 缺失与否，a r f 仍能与细胞中多种蛋白质发生相 互作用。例如，a r f 可以和e 2 f i 3 以及d p i t 4 9 】分别形成复合物，使其进入核仁， 被蛋白酶体降解；a r f 可以与m y c 相互结合，进而负反馈调控m y c 的功能 5 0 - 5 1 1 ： 通过和p 1 2 0 e 4 f 相互作用，可以进一步增强阻断细胞周期的功效【5 2 1 ；可以与位 于核内的核磷酸蛋白( n p m ) 、核仁蛋白以及p t r f 相互作用，影响调控核糖体 r n a 的转录以及核糖体的生物合成，阻止细胞分裂【5 3 1 ；可以直接作用于p 3 4 c d e 2 激酶，降低其活性和含量，阻止有丝分裂进行【5 4 】；另外，a r f 还可以调控a n c 0 1 f 5 5 】，b c l 6 5 6 1 ，c a r f 5 7 1 ，l z a p s s 】，c t b p 【5 9 】，p 6 3 删，p x f 【6 l 】，s p i n o p h i l i n 【6 2 】，t b p1 6 3 】，t i p 6 0 6 4 】，w l 【6 5 1 和h p v l 6 e 7 6 6 1 等。发现与鉴定新的a r f 结合蛋白是进 一步探索a r f 非p 5 3 依赖性途径的相关功能的重要方法。 此外，研究发现随着a r f 在核仁中积累，s u m o 1 进入核仁，a r f 可以对靶 蛋白进行翻译后修饰，如可以引起核酸解旋酶w r n 的s u m o 修饰，导致其再核 内的重新分配，促进s u m o 与靶蛋白的结合是a r f 行驶其不依赖于p 5 3 的调控 作用的一种普遍机制。 8 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 第二章材料与方法 第一节实验材料和仪器 1 细胞株，质粒和引物 1 1 细胞株 本论文所使用细胞株有： 人胚肾细胞2 9 3 t 细胞株； 人子宫颈癌细胞h e l a 细胞株； 人骨肉瘤细胞u 2 0 s 细胞株； 人肺癌细胞h 1 2 9 9 细胞株。 以上细胞株由含l o d 、牛血清或胎牛血清的d m e m 培养。 所有细胞株均培养在3 7 摄氏度，5 c 0 2 饱和湿度恒温培养箱中。 1 2 质粒 m y c a r f 质粒是由美国h l e em o 伍t tc o m p r e h e n s i v ec a n c e rc e n t e r 惠赠； p c d n a 3 0 一f l a g - v e c t o r ，p c d n a 3 0 一g f p - v e c t o r ，l e n t i - v i r u s - f l a g v e c t o r ， h i s u b i q u i t i n ，h i s s u m o l a t i o n 来自于本实验室原始质粒； 利用本实验室的克隆系统，通过亚克隆的方式构建了一系列实验所需质粒： p c d n a 3 0 - f l a g - s i r t l ，p c d n a 3 0 - g f p s i r t l ，p c d n a 3 0 - f l a g - p 14 a r f , p c d n a 3 0 - g f p p l4 a r f , l e n t i - v i r u s - f l a g - pl4 a r f , p c d n a 3 1 - g f p - pi4 a r f ( a a 1 - 6 4 ) ，p c d n a 3 1 一g f p p 1 4 a r f ( a a6 5 - 1 3 2 ) 1 3 引物 p c d n a 3 1 一g f p p 1 4 a r f ( a a1 - 6 4 ) 弓 物： f 1 ：5 a t a g g a t c c a t g g g t c a t g a t g a t g g g c a g c g 3 r 1 ：5 a t a c t c g a g t c a g c c a g g t c c a c g g g c a g a c 3 p c d n a 3 1 一g f p - p 1 4 a r f ( a a6 5 - 1 3 2 ) 弓1 物： f 2 ：5 a t c g g a t c c a t g g t g c g c a g g t t c t t g g t g a c 3 9 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 i 匕：5 a t a c t c g a g t c a t g g t c t t c t a g g a a g c g g c t g c 3 以上引物由上海博尚生物技术有限公司合成。 2 实验试剂和药品 琼脂粉、蛋白胨、酵母提取物、甲醇、乙醇、异丙醇、d m e m 培养基( g i b c o ) 、 胰酶( h y c l o n e ) 、胎牛血清( p a a ) 、青霉素( 上海生工) 、链霉素( 上海生 工) 、d m s o ( s i g m a ) 、脱脂牛奶( b b i ) 、t h s ( b b i ) 、盐酸( 上海凌峰) 、 t w e e n - 2 0 ( 上海生工) 、甘油( 上海生工) 、c a c l 2 ( 上海生工) 、n a h c 0 3 ( s i g m a ) 、 n a c i ( s i g m a ) 、k c i ( s i g m a ) 、m g c l 2 ( s i g m a ) 、n a 2 h p 0 4 ( s i g m a ) 、k h 2 p 0 4 ( s i g m a ) 、t r i t o n x - 1 0 0 ( 上海生工) 、n p 4 0 ( 上海生工) 、脂质体l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 转染试剂( i n v i t r o g e n ) 、多聚甲醛( 上海生工) 、e d t a ( 上海生工) 、 d a p i ( s i g m a - a l d r i c h ) 、b s a ( n e b ) 、载玻片( 上海三精) 限制性内切酶：b a m h i 、x h o l 、t 4 连接酶、连接b u f f e r 、t a n g ob u f f e r 、p f u 聚合酶、购自f e r m e n t a s 公司。 d n t pm i x t u r e 、m g c l 2 、t a q 酶、购自t a k a r a 公司。 f l a g m 2 - b e a d s 购自s i g m a 公司。 3 抗体 1 3 - a c t i n 抗体是m o n o c l o n a la n t i - p a c t i nc l o n ea c 一15 购自s i g m a 。 f l a g 标签抗体是m o u s ep o l y c l o n a la n t i b o d yh - 9 5 ( s c 一2 0 9 6 6 ) 购自s i g m a 。 g f p 标签是r a b b i tp o l y c l o n a la n t i b o d y f l ( s c 8 3 3 4 ) 购自s a n t ac r u z 。 s i r t l ( h 3 0 0 ) 抗体r a b b i tp o l y c l o n a la n t i b o d y ( s c l5 4 0 4 ) 购自s a n t ac r u z 。 p 5 3 ( d o 1 ) m o u s em o n o c l o n a la n t i b o d y 购自s a n t ac r u z 。 带有h r p 的，能够用e c l - p l u s 反应发光试剂显色的鼠二抗，购自s a n t ac r u z 。 带有h r p 的，能够用e c l - p l u s 反应发光试剂显色的兔二抗，购自s a n t ac r u z 。 a l e x a f l o u r5 6 8 g o a t - a n t i m o u s e ( a 11 0 0 4 ) 购自i n v i t r o g e n 。 a l e x a f l o u r4 6 8g o a t a n t i r a b b i t ( a 110 3 4 ) 购自i n v i t r o g e n 。 4 实验仪器 e p p e n d o r fp c r 仪 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 e p p e n d o r f 4 cc e n t r i f u g e5 8 0 4 r t h e r m om i c r o m a x 高速离心机 t h e r m of o r m a 8 6 cu l tf r e e z e r f o r m as e r i e r l iw a t e rj a c k e t e dc 0 2i n c u b a t o r f o r m ac l a s s l i ，a 2b i o l o g i c a ls a f e t yc a b i n e t t a n o n 凝胶成像系统 t a n o n 电泳槽 t a n o n 转膜槽 t a n o n e p s3 0 0 电泳仪 d y y - 6 c 型电泳仪 a n k et d l s o 2 b 低速离心机 o l y m p u sc h x 4 1 荧光显微镜 u v l1 0 2 紫外可见分光光度计 民桥精密电子天平 m p 6 0 0 1 电子天平 马头牌j y t - 5 托盘天平 c d h z c a 恒温震荡器 9 0 1 型恒温磁力搅拌器 q t - 1 涡旋混合仪 t s - 8 st r a n s f e r e n c ed e , c o l o r i n gs h a k e r t s 2 0 0o r b i t a ls h a k e r s w - c j 1 d 型单人净化工作台 g s p 9 0 5 0 m b e 隔水式恒温培养箱 d k - 4 2 0 型电热恒温水槽 h a i e r 低温保存箱 美的电磁炉 y x q l s 7 5 2 立式压力蒸汽灭菌锅 1 l 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 1 细胞培养 1 1 细胞的复苏 第二节实验方法 1 从液氮罐或8 0 拿出含有冻存细胞的冻存管，迅速放于3 7 水浴锅中孵 育融化至冰渣全部融化。 2 在超净台中将细胞转移到1 5 m l 塑料离心管中，加入5 m l 培养基混匀。然 后5 0 0 r p m ，离心5 r a i n ，弃去上清和d m s o 。 3 在超净台中，取l m l 培养基加入离心管中，将细胞沉淀轻轻重悬打散， 而后将其转移到1 0 c m 细胞培养皿中，再补加入9 m l 培养基，轻轻晃匀后放于3 7 ， 5 c 0 2 培养箱中培养。 1 2 细胞的体外培养及传代 1 将细胞置于显微镜下观察，生长状态良好，密度达到8 0 即可传代。 2 倾去培养基，加入预热的p b s2 m l ，( 如果是在皿里，贴着培养皿的侧壁 缓慢加入，如果是在培养瓶中，沿着贴壁细胞的对面缓慢加入，以免吹起细胞， 如此清洗l 一2 次) 。 3 加入l m l 0 2 5 的胰酶消化细胞，置于显微镜下观察，待细胞开始变圆， 细胞与细胞之间分开时，立刻弃去胰酶，加入2 m l 培养基终止胰酶的消化反应。 4 轻轻拍打培养瓶( 1 0 c m 的皿中，可以用培养基吹打细胞) 使之悬浮，充 分打散。 5 用细胞计数板进行细胞计数( 4 个大方格细胞个数平均值x 1 0 4 为每m l 所 含细胞数) 。依据细胞计数结果，将适当数量的细胞悬液按照实验需要转接入含 有新鲜培养液的培养瓶、培养皿或细胞培养板中，补足培养基，放入3 7 ，5 c 0 2 培养箱中培养，以备实验所需。 注：以上所用的p b s ，培养基在使用前都应放置于3 7 水浴锅中预热，以 减少对细胞的损害及刺激作用。 1 3 细胞冻存 1 按照传代的方法将细胞消化下来，将细胞悬液转入1 5 m l 塑料离心管中， 1 2 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 5 0 0 r p m ，离心5 m i n ，去掉胰酶。 2 向细胞沉淀加入1 8 m l 已加血清的d m e m 培养基和0 2 m ld m s o 重悬细 胞( d m s o 终浓度为1 0 ) ，将细胞悬液转入冻存管中。 3 将冻存管放入冻存盒( 已平衡至室温) ，放入8 0 冰箱保存。 1 4 细胞培养溶液配制 1 0 d m e m ( 高糖) 总体积5 0 0 m l 1 l m i l l i qh 2 0 3 0 0 m l8 0 0 m l d m e m 粉末 6 7 91 3 4 9 n a h c 0 3 1 8 5 9 3 7 9 n b s5 0 m l1 0 0 m l 将g i b c o 公司的d m e m ( 高糖) 粉末溶解在超纯水中，加入3 7 9 碳酸氢钠， 调节p h 值至7 2 ，定容至1 l 。0 2 2 1 a m 的微孔滤膜抽滤除菌，吸取3 - 5 m l 过滤 后的培养液，做7 2 小时的无菌检查，其余培养基4 。c 密闭保存，使用前加入1 0 的小牛血清，并加入双抗使终浓度为1 0 0 u m l 。 0 2 5 胰蛋白酶 总体积 1 0 0 m l5 0 0 m l m i l l i qh 2 0 8 0 m l 4 5 0 m l 胰蛋白酶 0 2 5 91 2 5 9 用1 m h c i 或1 m n a o h 预先调节培养基的p h 值至7 2 ，由于过滤后p h 值 会上升0 1 0 3 ，定容至1 0 0 m l ( 或5 0 0 m l ) ，使其最终p h 值为7 4 。 l x p b s 缓冲液 总体积 5 0 0 m l 1 l n a c l 4 o g8 0 9 k c l 0 1 9 0 2 9 n a 2 h p 0 4 1 4 92 7 9 k h 2 p 0 4 0 1 2 90 2 4 9 m i l l i qh 2 0 4 0 0 m l8 0 0 m l 用。 调节p h 值至7 4 ，定容至5 0 0 m l ( 或1 l ) ，搅拌充分溶解后，高压灭菌后备 华东师范大学2 0 1 1 届硕士学位论文 双抗母液( 1 0 x ) 青霉素为8 0 万单位瓶，用注射器向瓶内加入4 m l 灭菌p b s 。链霉素是1 0 0 万单位瓶，向瓶内加入5 m l 灭菌p b s ，即得到每m l 各为2 0 万