（动物学专业论文）草鱼线粒体型超氧化物歧化酶的生化遗传特性的研究.pdf

摘要 超氧化物歧化酶( s o d ) 是一种对生物细胞保护至关重要，在进 化上比较保守的酶。因此，超氧化物歧化酶作为分子钟或分子标记 已被广泛应用于生物进化研究、群体遗传结构分析以及品系鉴定。 但目前人们对鱼类超氧化物歧化酶的生物化学和遗传学特性都尚未 进行过系统和深入的研究。为使这一重要的分子标记能更好地应用 于鱼类遗传育种、种质资源保护以及进化研究，本实验采用聚丙烯 酰胺梯度凝胶垂直电泳法，研究了草鱼线粒体型超氧化物歧化酶 ( f m s o d ) 的同功酶形式、生化遗传表型、在不同组织中的分布、 亚基组成以及金属类型。所得实验结果如下： ( 】) 草鱼线粒体型超氧化物歧化酶有三种不同的同功酶形式； 按其在酶谱上迁移率的不同，从正极到负极分别命名为f m - s o dl ， f m - s o d2 ，f m s o d3 ，其中f m s o d1 迁移率最快，而f m - s o d3 迁 移率最慢。每种不同的f m s o d 均由两条相关的酶带组成，分别命名 为主带和亚带。主带相对于亚带而言，迁移率较小而酶活力较高。 ( 2 ) 在草鱼群体中三种f m - s o d 的不同组合可构成三种不同的 草鱼线粒体型超氧化物歧化酶生化遗传学表型，即表型1 、表型2 与表型3 。表型1 个体只含有迁移率最快的f m s o d1 同功酶；表型 3 个体只含有迁移率最慢的f m s o d3 同功酶；而表型2 个体中含有 所有三种不同形式的同功酶。在表型2 中，当这三种不同形式的同 功酶均存在的时候，f m s o d2 活力比f m - s o d1 和f m s o d3 高，而 f m s o dl 与f m s o d3 活力相当。 ( 3 ) 在草鱼心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、尾鳍六种不同的 组织中，草鱼线粒体型超氧化物歧化酶存在三种不同的同功酶形式 和三种不同的生化遗传学表型。同一草鱼个体的线粒体型超氧化物 歧化酶在六种不同组织中表现出相同的酶谱类型，但在不同组织中， 酶活性有所不同。其中肝脏中活性最高，而其他组织活性相当。 ( 4 ) 在野生草鱼群体中，存在所有三种表现型：而在基因纯合 型的雌核发育草鱼群体中只检测到表型1 和表型3 个体。野生草鱼 群体中三种表现型的个体数之比为1 5 ：5 l ：2 8 。经过r 测试，发现 其比值符合常染色体上一个基因座位一对等位基因l ：2 ：1 的孟 德尔遗传分离比例。 ( 5 ) 草鱼f m s o d 对1 5 乙醇2 5 9 6 氯仿混合物敏感而对过氧化氢 具有一定的抗性，表明其金属类型为锰型。 由这些实验结果得出以下结论：( 1 ) 草鱼f m s o d 是由细胞核d n a 上的基因所编码而不是由线粒体d n a 上的基因所编码的；( 2 ) 草鱼 f m s o d 由单个基因座位控制；( 3 ) 至少存在两个有较明显差异等位 基因；( 4 ) 草鱼f m s o d 由两个亚基组成。 关键词：线粒体；超氧化物歧化酶；生化表型；基因座位；草鱼 a b s t r a c t s u p e r o x i d ed i s m u t a s ei sa n e v o l u t i o n a r i l yc o n s e r v e d e n z y m ew i t h3 r li m p o r t a n tr o l ei np r o t e c t i n go r g a n i s m sa n dc e l l s f r o mt h ed a m a g e sc a u s e db yo x y g e nf r e er a d i c a l s a sam o l e c u l a r c l o c ka n dg e n e t i cm a r k e r ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s eh a sb e e n w i d e l y u s e di n e v o l u t i o n a r ys t u d i e s ，p o p u l a t i o ng e n e t i c s ，a n d id e n t if i c a t i o no fd i f f e r e n ts t r a i n si n t h es a m e s p e c i e s h o w e v e r ，t h eb i o c h e m i c a la n dg e n e t i cf e a t u r e so ft h e m i t o c h o n d r i a l s u p e r o x i d e d i s m u t a s eh a v en o tb e e nw e l l c h a r a c t e r i z e di nf i s h e s i no r d e rt om a k et h i sm o l e c u l a rm a r k e r a p p l i e di nf i s hb r e e d i n g ，s p e c i e sp r o t e c t i n ga n de v o l u t i o n a r y r e s e a r c h f u r t h e r ， w e i n v e s t i g a t e d t h e i s o z y m ef o r m s ， b i o c h e m i c a l g e n e t i cp h e n o t y p e s a n dw ea l s o s t u d y t h e d i s t r i b u t i o no fd i f f e r e n tt i s s u e sa n ds u b u n i tc o n s t r u c t i o no f c t e n o p h a r y n g o d o n i d o l l u s ( g r a s sc a r p )m i t o c h o n d r i a l s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( f m s o d ) w i t hp o l y a c r y l a m i d eg r a d i e n t g e le l e c t r o p h o r e s i s i nt h i s s t u d y o u rd a t ar e v e a l e da s f 0 1 1 0 w s ： ( 1 ) t h e r ea r et h r e ei s o f o r m so ff m s o dw h i c hw e r en a m e d a sf m s o di ，f m s o d2a n df m s o d3a c c o r d i n gt ot h e i r p o s i t i o n s f r o mt h ep o s i t i v ep o l et ot h en e g a t i v ep o l e f m s o d1i st h e f a s t e s t ，w h il ef m - s o d3i st h es l o w e s t i n e v e r yd i f f e r e n t f m s o dt h e r ea r et w ob a n d s ，w h i c hi sn a m e da sm a j o rb a n da n d s u b b a n d t h em a j o rb a n dm i g r a t e sa1 i t t l em o r es l o w l y ，w h i l e a tt h es a m et i m es h o w st h eh i g h e ra c t i v i t y ( 2 ) t h ec o m b i n a t i o no ft h r e ei s o f o r m so ff m s o d c o n s t i t u t e st h r e ed i s t i n c tb i o c h e m i c a lp h e n o t y p e s ：p h e n o t y p e 1 ，p h e n o t y p e2a n dp h e n o t y p e3 p h e n o t y p e1w a so n l ya s s o c i a t e d w i t ht h ef a s t e s tm i g r a t o r yi s o f o r mf m s o d1a n dp h e n o t y p e3 w i t ht h es l o w e s tm i g r a t o r yi s o f o r mf m s o d3 w h i l ep h e n o t y p e 2w a sa s s o c i a t e dw i t ha 1 1t h r e ei s o f o r m s i np h e n o t y p e2 ，w h i l e n i a 1 1o ft h et h r e ei s o f o r m sa l1 a c t i v i t yt h a nt h a to ff m s o d l f m s o d3s e e mt ob et h e s a m e e x i s t ，f m s o d 2s h o w s h i g h e r a n df m s o d3 ，b u tf m s o d1a n d ( 3 ) i nt h es i xt i s s u e s ，s u c ha sh e a r t ，l i v e r ，s p l e e n ， k i d n e y ，m u s c l ea n dt a i i f i n ，t h e t h r e ei s o f o r m sa n dt h et h r e e p h e n o t y p e sa l le x i s t s i xt i s s u e so f t h es a m ei n d i v i d u a ls h o w t h es a m ez y m o g r a mw h i l et h e y h a v ed i f f e r e n ta c t i v i t y ：t h e a c t i v i t vo f1 i v e ri sh i g h e s ta n dt h a to fo t h e r t i s s u e ss e e m s t 0b et h es a m e ( 4 ) i nw i i dg r o u po fg r a s sc a r p ，a 1 1t h et h r e e p h e n o t y p e s w e r eo b s e r v e d ， w h e r e a si nm i t o g y n o g e n e t i cg r o u p ，o n l y d h e n o t y p e s1 a n d3w e r eo b s e r v e d t h er a t i oo ft h ei n d i v i d u a l n u m b e r so ft h et f i r e ep h e n o t y p e si s 1 5 ：5 1 ：2 8 a f t e rx 2t e s tf o r d r o b a b i l i t y ，w ef i n d t h a tt h er a t i oo ft h et h r e ep h e n o t y p e s i nt h ew i i dg r o u pw a s c o n s i s t e n tw i t h t h el ：2 ：lr a t i oo f m e n d e l i a ni n h e r i t a n c ef o r2 a l l e l e so fas i n g l el o c u s i nt h e a u t o s o m a lc h r o m o s o m e s ( 5 ) i na d d i t i o n ，a l lo ft h et h r e ef m - s o d s w e r es e n s i t i v e t ot h em i x t u r eo fl5 e t h a n o la n d2 5 c h l o r o f o r m b u tr e s i s t a n t t oh 2 0 2 ，i n d i c a t i n gt h a t t h ef m s o di ng r a s sc a r p i sm n s o d t h e s er e s u l t ss u g g e s t e d t h a t ：( i ) t h e m i t o c h o n d r i a l s u p e r o x i d ed i s m u t a s eg e n ei ng r a s sc a r p r e s i d e d1 nc h r o m o s o m e s i n s t e a do fm i t o c h o n d r i a ld n a ；( i i ) m i t o c h o n d r i a l s u p e r o x i d e d is m u t a s ew a se n c o d e db y as i n g l el o c u s ：( i ii ) t h e r ew e r et w o v a r ja n ta 1 1 e l e sa tl e a s ti ng r a s sc a r pa n d ( i v ) t h ef m s o d is c o m p o s e d o ft w os u b u n i t s k e y w o r d s ：m i t o c h o n d r i a l s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ；b i o c h e m i c a l p h e n o t y p e s ：l o c i ：g r a s sc a r p 绪论 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 是1 9 6 9 年 f r i d o v i c h 和m c c o r d 从牛红细胞中发现并正式命名。它广泛存在于 生物体内，能够催化超氧阴离子发生歧化反应，专一地清除生物体 内的超氧阴离子，平衡机体的氧自由基。1 。目前人们已经在植物、 动物、微生物中都发现了超氧化物歧化酶，如翟颐华、邹国林肺1 1 曾 研究过韭菜和小白菜超氧化物歧化酶；秦德安“o 。、赵厚安1 、杨 岑“”分别对人、猪、鸭的超氧化物歧化酶做过性质研究；白玉明“”与 吴国荣“1 分别研究了根霉、猴头子实体和佛洲侧耳子实体超氧化 物歧化酶。 学术界公认体内自由基过多可引起机体组织细胞损伤，导致多 种疾病发生和发展甚至死亡，其中超氧化物阴离子自由基起着重要 作用“州。超氧化物歧化酶被许多医学工作者用于疾病的治疗，其突 变和多态性与许多疾病直接相关。如它被用于治疗超氧阴离子自由 基引起的疾病及抗衰老领域“7 1 ”1 ，抗肿瘤和抗心肌梗塞“”，糖尿病 “；它的多态性被发现与乳腺癌直接相关“2 “。超氧化物歧化酶是清 除超氧阴离子自由基对细胞损害的一种重要的抗氧化酶，其作用原 理如下： 2 0 2 7 + 2 h ：竺- h ：o 。；2 h 。0 2 兰兰兰苎答2 h 2 0 + 0 。 1 超氧化物歧化酶的种类 1 1 按所含金属的类型不同划分 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，以共价键与金属辅基结合， 依据其活性中心金属离子不同，s o d 可分为三类：c u z n - s o d 。m n s o d ，f e s o d 口+ ”1 。它们具有相似的生物学活性，催化 超氧化物阴离子自由基歧化为h 2 0 。和0 2 口1 。三种s o d 的鉴别是采用 聚丙烯酰胺凝胶电泳后经不同抑制剂处理、染色后电泳带消失或存 活情况作为判断s o d 的类型。c u z n s o d 电泳带在h z 0 2 或k c n 作用 下消失，m n s o d 带在氯仿7 , 醇作用下消失，f e s o d 在h 2 0 z 或氯仿 乙醇作用下消失纽”1 。 它们的理化性质如表1 所示： 表l 三种超氧化物歧化酶的理化性质 t a b 1 p h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r so ft h et h r e e k i n d so fs o d 因而检测在氯仿无水乙醇和h 。0 ：作用下，不同的超氧化物歧 化酶对其所受的影响，可以判断其所含金属原子的不同船8 ”。 1 2 按在真核、原核生物中的分布不同划分 行有氧呼吸的各种生物，其机体在逐渐的进化演变过程中， 已形成了一套特有的抵御0 ，毒害的机制，然而它们无一例外地都选 择超氧化物歧化酶作为主要的防御工具伸“州。只是真核生物与原核 生物有所不同。c u z n s o d 主要存在于真核生物细胞中m “3 。m n s o d 主要存在于原核生物和真核生物的线粒体中阳1 “，在高等植物中的过 氧化物酶体中也含有位”。f e s o d 主要存在于原核生物。0 1 和某些植物 的叶绿体中“。 1 3 按在不同的细胞器中的分布划分 三种不同金属类型的超氧化物歧化酶在不同的细胞器中有不 同的分布。c u z n s o d 主要存在于真核生物细胞的细胞质以及细胞外 基质中旧1 3 。m n s o d 在真核生物体内主要存在于线粒体中呱，在高 等植物中的过氧化物酶体中也含有乜“。f e s o d 主要存在于原核生物 n 们和某些植物的叶绿体中”。 2 超氧化物歧化酶的检测方法 s o d 活性测定以其在一定时间内产物( h 。0 ：和o 。) 生成量或底物消 耗量( o 。) 作为酶活力单位。但由于底物不稳定，s o d 活力测定一般 为间接法。主要有化学法，包括细胞色素c 还原法，邻苯三酚法、 羚胺法、肾上腺素法等；免疫学法，包括放射免疫法和酶联免疫吸 附技术，电泳法，物理法光化学法，电化学法等。各种检测方法互 有优缺点，物理法和电化学法所需仪器复杂，一般化学法受干扰的 因素较多，免疫法不能测定s o d 的活性只能测定其量，电泳法相对 来说简单一些唯“。 电泳法的原理是在适当温度与适当p h 值下，氯化硝基四氮唑蓝 ( n b t ) 与酚嗪二甲酯硫酸盐( p m s ) 可以生成蓝色的化合物，使浸泡 于其中的凝胶染成蓝色，而超氧化物歧化酶则可以终止这一反应， 使凝胶呈现出无色。当采用聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳 将待检测的蛋白质在凝胶上分离开来以后，将凝胶置于一定浓度混 合液中染色，则所需检测的超氧化物歧化酶在凝胶上形成一条无色 透明的亮带。在相同进样量下，观察染色后酶带的亮度情况，可以 得出各个样品间酶活力的高低瞳”3 矧。 3 超氧化物歧化酶在种群分析和进化研究中的应用 3 1 作为遗传标记的应用 3 1 1 遗传标记概述 对生物遗传变异的分析，一是直接测序，一是借助遗传标记。 大于普通草鱼群体。 3 1 3 超氧化物歧化酶作为遗传标记在遗传育种中的应用 但遗传标记并非目的基因本身，而是与之连锁的位于同一染色 体上的d n a 片段或同工酶位点。同工酶位点也有人称之为生化位点， 广义上与d n a 位点一起称为分子标记。”“。它作为一种直接的基因产 物，明作遗传标记具有许多优点”“。首先它不受环境因素的影响， 表现出相对的稳定性；其次是它分析所需材料较少，可以不断获得 实验材料，进行反复验证；此外，同工酶位点是双显性的，父母本 的基因型可以同时在后代中检测出来，从而能够清楚地推断出子代 中各个体的基因型。同工酶的不足之处是位点数量偏少，覆盖整个 基因组的范围有限，在动物群体中，仅有1 0 2 0 种同工酶表现出位 点的多态性”“3 ，如王可玲等印在鉴别中国近海带鱼种群生化遗传结 构时，研究了乳酸脱氢酶、苹果酸酶、酯酶等共1 1 种酶。 超氧化物歧化酶就是这样一种有着多态性的同工酶，在一个基 因座位上存在多个等位基因，且不同物种的超氧化物歧化酶基因存 在不同。因而它被广泛用于遗传育种与品系鉴定。如w a r n k e 陋”发 现超氧化物歧化酶在多年生与一年生斜眼草中存在多态性； h a y w a r 扩”在选育一种草饲料时运用超氧化物歧化酶作为遗传标记。 g h i a n i 随3 1 等在进行人类群体遗传结构分析时将有多态性的超氧化物 歧化酶列入考虑的指标之一。l e e s a n g as n 沸们等发现鲶鱼中的超氧 化物歧化酶存在多态性；杨书亭、桂建芳等哺甜在对雌核发育白鲢群 体进行研究中将超氧化物歧化酶作为区别不同群体的个遗传标 记；王小虎哺印等人研究了鲤鲫人工多倍体谱系同工酶基因表达将超 氧化物歧化酶作为鉴别四倍体与三倍体、二倍体的遗传标记；朱蓝 菲等阳7 1 叫研究复合四倍体异育银鲫的红细胞同工酶在种内遗传差异、 银鲫不同雌核发育系的生物学特性以及鲢的远缘杂交予代和人工三 倍体的同工酶表达时，将超氧化物歧化酶列入研究的对象之一。 当远缘杂交时，其子代有可能遗传了其中某亲本的一种同工 酶，或者兼而有之。通过对子代超氧化物歧化酶表达酶谱的检测， 我们可以确定其所含的基因的来缘，从而确定它与某一亲本的相似 性。同时，不同物种中等位基因的频率有所不同，通过检测其等位 基因的频率，我们可以将其作为鉴定不同群体的一种分子标记，与 其它群体区别开来。对予在遗传育种中产生的新的群体，我们同样 可以用其来加以鉴定。 3 2 超氧化物歧化酶作为分子钟在分子进化研究中的应用 1 9 6 2 年，祖卡坎德尔( z u c k e r k a n d l ) 和鲍林( p a u li n g ) ”在对比 了来源于不同生物系统的同一血红蛋自分子的氨基酸排列顺序之 后，发现其中的氨基酸随着时间的推移而以几乎一定的比例相互置 换着，即氨基酸在单位时间以同样的速度进行置换。后来，许多学 者对若干代表性蛋白质的分析，以及近年来又通过真接对比基因的 碱基排列顺序，证实了分子进化速度的恒定性大致成立，并由中立 说在理论上奠定了基础。这便是“分子钟”名称的由来n ”7 。 分子钟的发现迈出了分子进化学发展中最早的步，特别是提 供了在分子水平分析生物系统进化的手段，从这个意义上讲具有更 重大的意义。马戈利来希( m a r g o r i a s h ) ” 通过现存各种动植物和菌 类这一广泛范围的生物种采集和提取来的细胞色素c 的氨基酸排列 顺序，首次再现了这些生物所表达的进化历程。利用这种分子对比 而绘制的生物系统树，与以往依据化石绘制的系统树拓扑性质非常 一致。沙里奇( s a r i h ) 和威尔逊( w i l s o n ) 。”3 用分子钟研究灵长类进化 问题，得出结论，否定了拉玛古猿是人类直接祖先，表明了人类的 出现比原先人们一直相信的年代晚得多。 超氧化物歧化酶作为生物有机体的一种重要的蛋白质，毫无疑 问也面临着进化与选择的压力，在进化过程中的氨基酸变化累积到 一定程度，则可以用于区别不同物种，并且成为衡量不同物种间遗 传距离的一种尺度，即前面所说的“分子钟”删。 已有的研究表明，任何生物来源的m n s o d 的一级结构的同一性 都很高，如人m n s o d 和鼠、大肠杆菌的m n s o d 的同一性分别为9 4 和4 3 ，不仅如此，参与形成活性中心及与金属连接的氨基酸在所有 m n s o d 中也都是保守的，而且与金属锰相连的氨基酸也完全一致， 它们是组氨酸2 6 、8 7 、1 8 1 和天冬氨酸1 8 5 哺。“3 。它已经被广泛运用 6 于分子进化的研究。如m i c h a e l ”1 对c u z n s o d 与m n s o d 两种超 氧化物歧化酶的进化速度进行了比较，发现m n s o d 的进化速度要慢 得多。r y o j if u k u h a r a 等喃1 1 对灵长目超氧化物歧化酶的进化做了研 究。 4 超氧化物歧化酶在鱼类种群分析与育种方面的研究现状与 应用 桂建芳等”“3 曾对四个不同的雌核发育银鲫群体进行研究，在四 个群体中共发现五个s o d 的控制位点，其中有两个位点具有多态性， 并用此来区别这些群体。杨书婷等m ”对两个雌核发育白鲢群体的同 ： 酶进行了分析，将其s o d 分为快带型与慢带型，并发现了十多条 s o d 同工酶带，检测到四种存在明显多态性的类型。朱蓝菲等”邮对复 合四倍体异育银鲫的红细胞s 0 d 进行了研究，发现其具有一定的多 态性。 但是，所有这些研究均没有将超氧化物歧化酶细分开来，对于 所研究的超氧化物歧化酶属于何种金属类型，来缘于何种细胞器， 以及其亚基构成与等位基因个数等均缺乏更深一步的研究。这必将 限制超氧化物歧化酶这一多态性的酶作为分子标记的应用。 而且，在群体分子进化的研究中，人们尚未将鱼类超氧化物歧 化酶作为一种重要的研究对象来加以研究，而在哺乳类如灵长目中 则早已研究得比较透彻啡“。因而，对鱼类超氧化物歧化酶进行更深 入的研究，对其基因的核苷酸序列以及蛋白质的氨基酸序列加以比 较研究，将有助于更好地理解鱼类在进化上的地位，并且寻找有关 鱼类进化的一些信息。 5 草鱼线粒体型超氧化物歧化酶研究的意义 5 1 草鱼种质保护和与育种研究现状 草鱼是我国的一种重要的淡水经济养殖鱼类。近几十年来，人 工养殖的草鱼品系由于种质的严重退化，其病害问题日益严重，如 抗病力较差、发病率高，导致商品鱼成活率低，使养殖的经济效益 受到很大的影响。自然水体中的草鱼也因环境的污染、生存条件的 恶化，种质资源也遭到了破坏。章怀云拍”、赵凯阳酗分别用r a p d 分析 长沙集贸市场草鱼、青海湖草鱼，发现草鱼种质资源较匮乏，明显 低于鲤鱼和鲢鱼。林凯东。卅对湘江野生草鱼群体与两个雌核发育草 鱼群体进行基因组微卫星分析比较，也表明湘江野生草鱼群体具有 高的遗传同质性。 为了解决草鱼的严重病害问题，以及保护和开发我国这一独特 的淡水鱼类资源，用各种现代生物学技术培育抗病的、或其他基因 组合优良的草鱼养殖品系和对自然种质资源的遗传多样性进行深入 的研究，不仅具有重要的理论与应用价值，也已成为我国水产养殖 业提高经济效益和产品竞争力的重要而迫切的任务。 通过人工诱导草鱼雌核发育以产生基因纯合型鱼，进而快速建 立草鱼品系，可望为实现草鱼种质改良、优良性状的组合以及种质 中一些基因的改造创造条件，同时对我为这种重要的经济鱼类的遗 传学研究和育种研究也很必要。国内外对草鱼人工雌核发育的研究 很多。主要是通过抑制第二极体的排出汹1 或抑制第一次卵裂阳。通 过抑制第二极体的排出而获得的雌核发育草鱼予代个体的基因型是 高度纯合的，但不是完全纯合的。而抑制第一次卵裂所获得的个体， 从理论上说，其子代个体染色体上的基因是完全纯合的，且由此两 代之后便可获得完全意义上的纯系。 5 2 线粒体超氧化物歧化酶与草鱼种质分析和遗传育种的关系 目前，已有学者对草鱼做过同工酶分析。“”、线粒体分析”4 。“i 、 微卫星分析o ”和r a p d 分析。“”。“5 3 。但对草鱼线粒体型超氧化物歧化酶 的研究与应用尚无报道。 草鱼为有氧呼吸的动物，线粒体作为细胞内行使有氧呼吸和电 子传递的重要细胞器，是o 。产生较多的地方。草鱼线粒体型超氧化 物歧化酶作为基因产物，是基因型的生化表现型，是生物体生命活 动中各水平上生理功能的重要参与者，因此，它是分析生物的发育、 遗传、系统进化和生理过程的有效探针，也是研究鱼类生化遗传的 b 抗病力较差、发病率高，导致商品鱼成活率低，使养殖的经济效益 受到很大的影响。自然水体中的草鱼也因环境的污染、生存条件的 恶化，种质资源也遭到了破坏。章怀云拍”、赵凯阳酗分别用r a p d 分析 长沙集贸市场草鱼、青海湖草鱼，发现草鱼种质资源较匮乏，明显 低于鲤鱼和鲢鱼。林凯东。卅对湘江野生草鱼群体与两个雌核发育草 鱼群体进行基因组微卫星分析比较，也表明湘江野生草鱼群体具有 高的遗传同质性。 为了解决草鱼的严重病害问题，以及保护和开发我国这一独特 的淡水鱼类资源，用各种现代生物学技术培育抗病的、或其他基因 组合优良的草鱼养殖品系和对自然种质资源的遗传多样性进行深入 的研究，不仅具有重要的理论与应用价值，也已成为我国水产养殖 业提高经济效益和产品竞争力的重要而迫切的任务。 通过人工诱导草鱼雌核发育以产生基因纯合型鱼，进而快速建 立草鱼品系，可望为实现草鱼种质改良、优良性状的组合以及种质 中一些基因的改造创造条件，同时对我为这种重要的经济鱼类的遗 传学研究和育种研究也很必要。国内外对草鱼人工雌核发育的研究 很多。主要是通过抑制第二极体的排出汹1 或抑制第一次卵裂阳。通 过抑制第二极体的排出而获得的雌核发育草鱼予代个体的基因型是 高度纯合的，但不是完全纯合的。而抑制第一次卵裂所获得的个体， 从理论上说，其子代个体染色体上的基因是完全纯合的，且由此两 代之后便可获得完全意义上的纯系。 5 2 线粒体超氧化物歧化酶与草鱼种质分析和遗传育种的关系 目前，已有学者对草鱼做过同工酶分析。“”、线粒体分析”4 。“i 、 微卫星分析o ”和r a p d 分析。“”。“5 3 。但对草鱼线粒体型超氧化物歧化酶 的研究与应 x 重要手段。 我国淡水流域面积辽阔，存在多个不同的草鱼群体阳。”。矧。为 更好的进行种质鉴定，加速水产事业的科学化，寻找不同群体之间 特异的分子标记，有必要将草鱼线粒体型超氧化物歧化酶的有关特 性加以研究。同时，本实验室研究培育了多个雌核发育草鱼品系。 这些品系中的个体为基因纯合型鱼，有着清晰的遗传背景，这也必 将有助与对角类线粒体型超氧化物歧化酶的研究。 为此，本实验以湘江野生草鱼以及雌核发育草鱼两个不同群体 为出发点，研究了草鱼线粒体型超氧化物歧化酶的基因座位、等位 基因、亚基构成以及金属类型。为鉴定不同草鱼品系提供了可靠的 分子标记，为草鱼的品种改良和定向育种提供生化指标和积累资料。 1 。实验材料 1 1 两个不同草鱼群体 材料与方法 本实验研究了两个不同的草鱼群体，即湘江野生草鱼群体和 雌核发育草鱼群体。其中湘江野生草鱼群体由长沙国家鱼类原种场 提供，由9 4 尾从湘江捕捞的野生草鱼构成；而雌核发育草鱼由湖南 师范大学鱼类发育生物学实验室提供，由6 2 尾雌核发育草鱼构成。 湘江野生草鱼群体中存在数目较多的普通野生草鱼个体，可能包含 了草鱼超氧化物歧化酶基因座位上的所有的基因型；而雌核发育草 鱼是通过热休克法抑制第一次卵裂而实现的，这些雌核发育草鱼几 乎都是纯合子“3 。个体数目较大的野生草鱼群体与遗传背景清楚的 雌核发育草鱼群体将有助于准确无误地研究草鱼超氧化物歧化酶基 因座位与等位基因个数。 1 2 试剂与仪器 本实验中用以破碎组织块的仪器为普通的玻璃匀浆器、剪刀、 镊子、培养皿，从普通的医学仪器用品公司购买；用以分离蛋自质 的梯度混合仪、三恒多用电泳仪和d y y i l l 2 8 d 型垂直平板电泳槽购自 北京六一仪器厂：凝胶成像分析系统为英国u v p 公司的g d s 7 5 0 0 ；其 它药，铺与试剂均为化学分析纯产品。 所需试剂及配方按照朱蓝菲的方法。”。如下： ( 1 ) 磷酸缓冲液 0 1 m p h7 2 磷酸缓冲液 ( 2 ) 线粒体分离液o 1 m 蔗糖；o 0 1 mt r i s h c l ；0 0 0 l m ( 3 ) 甘油溶液 ( 4 ) c 。液 ( 5 ) d 液 e d t a ；o 1 5 m 甘露醇 6 0 甘油 丙烯酰胺5 7 6 9 ，双丙烯酰胺2 4 9 ，用 蒸馏永配成1 0 0 m 1 丙烯酰胺7 6 8 9 ，双丙烯酰胺o 3 2 9 ， ( 6 ) p 液 ( 7 ) t v b 液 ( 9 ) 染色液a ( 1 0 ) 染色液b ( 1 1 ) 染色缓冲液 ( 1 d 抑制液a 抑制液b 2 实验方法 用蒸馏水配成1 0 0 m 1 o 3 过硫酸铵 t r i s 2 1 5 5 9 ， e d t a1 8 5 9 ，硼酸 1 1 。0 9 ，用蒸馏水配成1 0 0 0 m l 1 0 0 m l t v b 缓冲液中加o 3 m lt e m e d ( n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺) l m g m 1 氯化硝基四氨唑蓝( n b t ) l m g m l 酚嗪二甲酯硫酸盐( p m s ) 0 2 mt r i s h c l p h9 o 1 5 乙醇2 5 氯仿( v v ) 的混合溶液 5 埘的过氧化氢 2 1 线粒体的分离及总蛋白的抽提 按照b a u m a n n 提供的提取线粒体的方法“o ”，对湘江野生草鱼群 体中的个体，取约5 克湿重的肝脏组织，用4 蒸馏水洗两遍，用剪 刀将其剪碎，转入1 0 毫升规格的玻璃匀浆器中，加入1 0 毫升线粒 体分离液，分数次将其轻柔地彻底破碎。匀浆应在冰上进行动作 要轻缓，速度要快。匀浆结束后，将匀浆液转入数个1 5 t i l l e p 管中， 在4 ，3 0 0 0 r p m 下离心半小时。沉淀为细胞残渣，上清液中存在未 破裂的线粒体，则弃去沉淀，保留上清液。换上新的e p 管将上清液 重新在4 ，1 5 0 0 0 r p m 下离心半小时。此时收获线粒体沉淀。由于 鱼类上清液型超氧化物歧化酶与线粒体型超氧化物歧化酶在电泳图 谱上有明显差异，即清液型超氧化物歧化酶酶谱图中，会出现一条 非超氧化物歧化酶的蓝色带，可将其作为区别，无须额外检测线粒 体的纯度。 将数个e p 管中同一个体的线粒体聚集起来，用少量磷酸缓冲液 洗涤两遍，并加入l o o u l 磷酸缓冲液。转入o 5r 【| 1 一次性注射器中 反复抽提，将线粒体膜破碎，使线粒体中的蛋白质抽提出来，重新 在4 ，1 5 0 0 0 r p m 下离心半小时。此时沉淀为线粒体膜残渣，保留 的上清液即为线粒体总蛋白。 将上清液转入新的e p 管中加入3 0 u l 甘油溶液，混合均匀至于 一2 0 保存备用。 2 2 不同组织样品总蛋白的抽提 本实验对野生草鱼的六种不同组织的线粒体型超氧化物歧化酶 进行了研究。取同一个体草鱼相同质量的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、 肌肉、尾鳍组织，经过一定的处理之后，研究了其线粒体型超氧化 物歧化酶表达谱式及酶活性。 按照肖亚梅的方法聃“，取湘江野生草鱼群体中同一个体的心脏、 肝脏、脾脏、肾脏、肌肉及尾鳍六种组织各4 克湿重，用4 蒸馏水 沈两遍，用剪刀将其剪碎，转入1 0 毫升规格的玻璃匀浆器中，加入 4 毫升磷酸缓冲液，将其彻底破碎。转入3 个1 5 m l e p 管中，在4 ， 1 5 0 0 0 r p m 下离心半小时。沉淀为细胞残渣，上清液中保留有溶解在 磷酸缓冲液中的总蛋白，则弃去沉淀，保留上清液。将上清液转入 新的e p 管中加入等体积甘油溶液，混合均匀至于一2 0 保存备用。 2 3 氯仿乙醇和过氧化氢的抑制实验 1 5 乙醇2 5 氯仿( v v ) 的混合溶液可以在十五分钟完全抑制 m n s o d 的活性，而5 f l m 的过氧化氢可以在五十分钟内完全抑制 c u z n s o d 幂口f e s o d 的活性”。2 。 按照乙醇氯仿( v v ) 的梯度终浓度从1 5 2 5 到1 5 2 5 ， 处理相同进样量的草鱼线粒体型超氧化物歧化酶，处理时间为十五 分钟。按照过氧化氨的梯度终浓度从1 m m 到l o m m ，处理相同进样蹙 的草鱼线粒体型超氧化物歧化酶，处理时间为九十分钟。 2 4 聚丙烯酰胺梯度胶的制备 聚丙烯酰胺梯度胶的制备按照朱蓝菲的方法口“。电泳槽是夹芯 式垂直电泳槽，将制胶板的模具装配好后，用溶化的2 琼脂糖封底， 稍等片刻待其凝固。取5 m lc 。液与3 m 1 蒸馏水混合，加入4 m l t ， 液以及4 m 1 p 液混合均匀，配成浓胶；取8 m 1 d 液加入4 1 i j l t 。液以及 4 m l p 液混合均匀，配成稀胶；将浓胶与稀胶同时倒入梯度混合器中， 浓胶倒入梯度混合器的前槽而稀胶倒入梯度混合器的后槽。在约两 分钟的时间内将混合器中的胶液流到垂直电泳槽的玻璃夹层中。然 后，用注射器轻轻地注射一层约两厘米厚的蒸馏水至胶面上，将胶 面压平。待到三十分钟后胶完全凝固，则将上层的蒸馏水吸干。此 时分离胶就已经做好。 等到分离胶制好以后，取6 m 1 d 液加入3 m 1 ，液以及3 n 1 1 p 液混 合均匀，配成稀胶，用一次性滴管将稀胶注入玻璃夹层中，插上梳 子。约一个小时后，上层的浓缩胶便制好。此时，拔去梳子，加入 t v b 缓冲液至缓冲液盖过模具的短玻璃板，并用一次性滴管吸取少量 t v b 缓冲液冲洗进样孔，此时可以开始点样和电泳了。 2 5 加样与电泳及凝胶特异性染色 加痕量溴酚兰于样品中作指示剂，混合后用微量注射器或1 0 0 u l 进样枪吸取3 5 u 1 样品溶液，并小心地加入样品槽中。应尽量避免 不同点样孔间的污染。上槽为负极，下槽为正极。 点样结束后，先在6 0 v 的电压下预电泳1 0 分钟。然后在1 8 0 v 的电压下电泳2 0 小时。为避免电泳时间长电泳槽发热而造成酶失活 的情况，可将电泳槽放入4 冰箱中。 电泳结束后，小心将胶片取下，放入清水中洗涤两次。取6 0 m l 染色液a 与6 4 m 1 染色液b 加入5 0 m 1 染色缓冲液，用蒸馏水将其配 成终体积为2 0 0 m 1 的染色液。将胶片致于染色液中，在3 7 下染色 两个到三个小时，直到酶带清晰为止。 染色结束后，将胶片置于英国u v p 公司的g d s 7 5 0 0 凝胶成像分 析系统中扫描，得到清晰可靠的图谱。然后将胶片置于1 冰醋酸中 固定保存。 2 6 结果分析 稍等片刻待其凝固。取5 m lc 。液与3 m 1 蒸馏水混合，加入4 m l t ， 液以及4 m 1 p 液混合均匀，配成浓胶；取8 m 1 d 液加入4 1 i j l t 。液以及 4 m l p 液混合均匀，配成稀胶；将浓胶与稀胶同时倒入梯度混合器中， 浓胶倒入梯度混合器的前槽而稀胶倒入梯度混合器的后槽。在约两 分钟的时间内将混合器中的胶液流到垂直电泳槽的玻璃夹层中。然 后，用注射器轻轻地注射一层约两厘米厚的蒸馏水至胶面上，将胶 面压平。待到三十分钟后胶完全凝固，则将上层的蒸馏水吸干 x 鱼类同工酶非常复杂，与多种因素有关。如编码的等位基因数， 控制酶的位点数，组成酶的亚基数，染色体倍性及基因调控等。因 而研究与分析较困难。 本实验的结果的判读按照熊全沫等“”1 ”1 的方法，对于二倍体 个体，单位点两个等位基因而言，应有2 5 种酶带的2 3 种表现型。 其判读方式如图1 所示。 对于二倍体个体，两个位点两个 x 同聚体 单体 异二聚体 。_ _ 一 一- 异三聚体 - 一 一 一 - 一- 异四聚体 幽l 单个协点两个替佩罄冈的同i ：酶示意蚓 l ? i g 1 t h es k e t c hm a df o ri s o z y m e sw jt ho n e l o cl l sa n dt w oa l1 e l e s 在一倍体中，单个位点两个等位基闻编码的酶，在种群中戍有2 5 种酶带的2 3 种表 现艰，同聚体：2 种酶带，2 种表型：单体：2 种酶带。3 种表型；异二聚体：3 种酶带， 3 种表型：异二聚体：4 种酶带，3 种表型：异四聚体：5 种酶带，3 种表刑： _ 一i 一 一 4 3 、 _ _ - i - 一b b 7 座位1 酗2两个位点两个等位基围的同一酶示意图 f i g 2t h es k e t c hm a pf o r is o z y m e sw i t ht w o1 0 c ia n dt w oa l l e l e s 在二二倍体中，两个位点两个等位基因编码的酶，在种群中应有2 4 种酶带的9 种表现型。 座位l 与座位2 分别为两个位点，座位l 中的两个等位基因分别编码a a 与b b 两种酶带；座 位2 中的两个等位基因分别编码a a 与b b 两种酶带。座位1 与座位2 中的酶带互相缀合， 共形成9 种表现型。如表型1 由a a 与a a 组成：袭型2 由a a 、b b 、a a 、b b 组成。 m鏖 、。 _ 、 捌 w 一 一 9 _ 8 了 6 5 一 一 t 一 3 一 一 z l 型表 3 不同草鱼群体线粒体型超氧化物歧化酶酶谱的比较 湘江野生草鱼群体与雌核发育草鱼群体的所有个体的尾鳍均用 来研究线粒体型超氧化物歧化酶的表达谱式。在由9 4 尾野生草鱼组 成的湘江野生草鱼群体中，存在三种表达类型，即表型l 、表型2 、 表型3 。三种表型的个体数分别为；1 5 、5 1 、2 8 。为进步探讨三秘 表型的个体数是否按一对等位基因两个不同等位基因的分离，本实 验中对数据进行x 2 测试，算出其p 值为0 1 1 8 。其中三种不同表型 的个体数之比如表2 所示： 表2 草鱼线粒位型超氧化物歧化酶单位点两个等位基因的x 2 测 t a b 2t h ec h i s q u a