基因工程的基本操作程序ppt.ppt

1.2基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建（核心）,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,四个步骤,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的基因,（二）、获取目的基因的常用方法,从基因文库中获取,利用PCR技术扩增,人工合成,1)基因文库？,1.从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,2)基因文库的种类:,种类,基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,受体菌的整个群体包含了这种生物的全部基因,基因组文库的构建模式图,cDNA文库的构建模式图,杂交双链(单链RNA/单链DNA),单链DNA,双链DNA(cDNA),与载体连接后导入受体菌贮存，组成cDNA文库,思考：怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？,基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因的表达产物蛋白质,根据基因的有关信息,概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术。,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,（2）利用PCR技术扩增目的基因,过程,变性,复性,延伸,1.变性（90-95）双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,氢键,单链DNA,2.复性(55-65)温度降低，与DNA模板结合，形成局部_。,双链,引物,3.延伸（70-75）在的作用下，从引物的连接，合成与模板互补的DNA链。,3端,脱氧核苷酸,Taq酶,2、具体过程,原理：.,DNA复制的原理,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,1对引物,DNA聚合酶(Taq酶),条件,模板,原料,酶,引物,能量,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制(PCR扩增仪内),主要在细胞核内,热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,解旋酶、普通的DNA聚合酶等,3.人工合成,1)反转录法：,杂交双链(单链RNA/单链DNA),单链DNA,双链DNA(cDNA),目的基因的mRNA,2)根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的脱氧核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,二、基因表达载体的构建（核心）,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代,使目的基因能够表达和发挥作用,1、基因表达载体构建的目的？（P11）,2、基因表达载体的组成？,启动子,目的基因,终止子,标记基因,思考,1、启动子？终止子？标记基因？它们的作用是？,2、作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？,3、基因表达载体的构建是千篇一律的吗？,三、将目的基因导入受体细胞,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,转化:,受体细胞,稳定,表达,2019/12/19,19,可编辑,1、将目的基因导入植物细胞的方法：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA)可以转移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。,农杆菌特点：,（1）农杆菌转化法(采用最多）,两次拼接？两次导入？,组织培养技术,（2）基因枪法（3）花粉管通道法,显微注射技术（最常用，最有效）,（3）将目的基因导入动物细胞,方法,受体细胞,常用受精卵,思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？,动物细胞受精卵的全能性大,目的基因的表达载体提纯,取卵（受精卵）,显微注射,受精卵发育,新性状动物,过程：,（2）将目的基因导入微生物细胞,过程：,Ca2+处理受体细胞,感受态细胞,重组表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA分子,思考：早期的基因工程用什么作受体细胞？为什么？,常用原核生物，因为原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。,方法,Ca2+处理法,用Ca2处理，增加细菌细胞壁的通透性,思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？,受精卵体细胞,受精卵,细胞/个体,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射技术,用Ca2+处理成感受态细胞,采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）A.将毒素蛋白注射到受精卵中B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中,BC,四、目的基因的检测与鉴定,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,1、导入检测,目的：,方法：,DNA分子杂交技术,从转基因生物中提取的基因组DNA,探针？,杂交的对象？,用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段,15N,15N,14N,探针,转基因生物的DNA,变性,变性,14N,过程,.首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针。使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中,2、转录检测,目的：,检测目的基因是否转录出了mRNA,方法：,分子杂交技术,用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段,探针？,杂交的对象？,从转基因生物中提取的mRNA.,3、翻译检测,目的：,检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法:,抗原抗体杂交技术,从转基因生物中提取的蛋白质,抗原？,抗体？,将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体,4、个体生物学水平的鉴定,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：个体生物学水平的鉴定,1.原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落),编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,2.真核