适于固体生物大样本的光学显微成像方法初步研究--优秀毕业论文 参考文献.pdf

华中科技大学 硕士学位论文 适于固体生物大样本的光学显微成像方法初步研究 姓名：董章 申请学位级别：硕士 专业：生物医学工程 指导教师：龚辉 2011-02-25 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 i 摘要摘要 * * 生物体的解剖结构是了解生物体生理功能和病理的基础。在许多生物医学的研 究和应用中，需要微米分辨率的生物体解剖图谱，以了解生物体的一些微细结构信 息；也需要组织水平固体大样本的解剖图谱，才可以获得较为完整、丰富的生物体 结构信息。因此提供一种微米分辨率的成像方法，去获得组织尺度固体生物大样本 的解剖图谱十分重要。 本文对一种适用于组织尺度固体生物大样本以微米分辨率成像的光学显微成像 方法进行了研究。按照工程光学设计中的一般步骤，首先，对光路的总体布局和原 理方案作了介绍，再分别对照明光路和成像光路进行了描述；其次，在光学部件选 型方面，主要分析了选择光源、物镜、分束镜的参考因素，对光阑对光能量和视场 的控制，刀具的辅助照明作用等设计进行了研究；最后，在光路拼接与调试方面， 介绍了 ccd 相机接入光路后的 tdi 过程及同步误差分析， 用矩形视场光阑限制 tdi 区域的方法，实现了同步误差的减少，提高了图像的对比度，还分析了光学部件拼 接过程中光程变化对光路带来的影响，并通过调准光程达到了改善照明效果的目的。 本文对所搭建成像装置的分辨率、畸变两个光学参数进行了测量。在介绍分辨 率测量的理论基础和一般方法基础上，分析了该装置的理论成像分辨率，描述了几 种不同实验条件下 psf 的测量过程，并给出了对应的分辨率测量结果。介绍了光路 畸变程度的测量过程，测量结果表明畸变程度为 0.384%。 以上对成像方法的研究和光路的调试，分辨率和畸变的测试实验证明，本文初 步研究的光学显微成像方法，能够实现对固体生物大样本以微米分辨率成像。 关键词关键词： 固体生物大样本 光学显微成像 组织尺度 光学设计 分辨率 畸变 *本研究由国家自然科学基金仪器专项（no.30727002）资助。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 ii abstract anatomical structure is very important for the understanding of function and pathology of organism, in many a research in biomedical science, the anatomical atlas of organism with micrometer resolution is needed for understanding the micro structure of the organism; and the anatomy atlas of large solid biologic specimen in tissue level is also needed for acquiring more integrated information of organism structure. hence, it is of great importance to provide a micrometer resolution imaging method which can get the anatomical atlas of large solid biologic specimen. the dissertation is about the research of an optical microscopy for the solid large biology specimen with micrometer resolution, the optical design is introduced by following the process of engineer optical design, which consists of three parts: firstly, introduces the principal and the location at large, then analyzes the principle of the illumination optical path and the imaging path; secondly, chooses the optical component, describes the concerned factor of light source, objective, beamsplitter, discuss about the aperture diaphragm which control the optical energy, and the field diaphragm which control the field of view, give the reason why diamond knife has the assistance in the illumination; finally, combines the optical path and the adjusting, introduce the tdi process and its synchronization error, enhance the contrast of image by limit the tdi area with the rectangle field aperture, analysis how the optical length affect the image acquisition, and improve the illumination quality by adjusting the optical length. in addition, two optical parameters: resolution and distortion are measured. introduce the theory and the methods of resolution measurement, analyze the theory resolution of the optical path, describes the process of different kinds of psf, give the test results. describe how the distortion is measured, and give the conclusion that the distortion of is 0.384%. the research and test proved that the introduced optical microscopy method is capable of getting the anatomical atlas of large solid biologic specimen. keywords: solid big biology specimen, optical microscopy, tissue scale, optical design, resolution, distortion 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集 体， 均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密， 在 年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 本论文属于 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 1 1 绪论 绪论 1.1 对固体生物大样本以微米分辨率成像的意义对固体生物大样本以微米分辨率成像的意义 生物体的解剖结构是公认的理解生物体生理功能和病理的基础。解剖学是一门 较古老的学科，由于生物体的结构非常复杂，所以解剖学的研究对象包含不同的层 次，从小到细胞大到器官、整体，以及器官之间的关系。 传统的大体解剖学是在整体观察和解剖过程中，用肉眼对组织水平的生物体器 官进行研究1，早在公元 6 世纪前后，我国的第一部医学经典著作内经中已有关 于解剖学方面的资料记载，其中已有心、肺、胃及脾等脏器的名称及其大小、位置 等内容。在公元 2 世纪，就有医学家通过解剖学知识来研究人体的生理功能。图谱 是我们对世界认知的记录，生物样本的结构图谱也称为解剖图谱，是表示生物样本 解剖结构的一种常用形式。文艺复兴时期（15 世纪） ，意大利画家 da vinci 对动物和 人体做了详细解剖，并绘制了最早的解剖图谱，被认为是时代巨著。大体解剖学中 组织器官的解剖图谱，不仅可以为医生提供组织器官的形态学信息，也可以在教学、 生理病理的研究中发挥作用。 而到微观层次的细胞解剖学，则是借助于特殊设备观察细胞及细胞内的结构。 微观层次解剖学的发展得益于 16 世纪后期发明的光学显微镜，通过对大量动植物解 剖结构的观察，人们逐渐意识到不同的生物都是由形形色色的细胞构成的，细胞是 生物体最小的功能单位。从 19 世纪细胞学说形成后，开辟了一个新的研究领域，在 显微水平研究生物体的结构与功能成为人们关注的焦点。因为有些病理的甄别需要 在成像中分辨出与临床相关的组织微结构，许多对昆虫、动物的胚胎、脑、局部器 官的研究中，也需要更为精细的、微米分辨率的数据，例如人体的毛细血管，是极 细微的血管， 管径平均为 69m2； 还有小鼠鼠脑的神经元胞体尺寸一般为 530m 等微细结构3，分辨这些微观结构是了解生物组织的结构和功能的基础。所以，得到 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 生物体的微观解剖图谱十分重要。 在生物医学的研究中，也需要对尺度在厘米或毫米的较大样本进行成像，以了 解大范围的、完整的生物解剖信息。例如小鼠鼠脑的平均长度为 2cm4，解剖图谱的 研究需要对小鼠全脑范围内的神经细胞成像，以此来了解神经网络的信息5。毛细血 管连于动、静脉之间，互相连接成网状，如果要了某些组织器官如脑、肺中的毛细 血管分布，也需要对这种组织的大样本成像，才能让人们对整个组织范围内的血管 网络有整体的认识和深入的研究6。 获取生物大样本的微观解剖图谱，成像分辨率需要达到微米水平，样本往往为 离体的组织或细胞，这对生物样本制作也提出了要求。如果生物样本呈液态或处在 液体环境中，例如在培养液中的组织或细胞，样本中的组织或细胞在成像时较易发 生位移和形态变化，无法准确地获得解剖图谱，也无法实现通过对微小样本的连续 成像而获得大样本的图谱的目的。因此在生物医学研究中，为了在较长时间内维持 生物组织结构的形态位置，便于观察，一般是将生物组织进行固定、包埋等步骤后， 制作成为了固体生物样本7。根据以上所述，对固体生物大样本以微米分辨率成像， 可以帮助我们了解精细、整体的生物体解剖结构信息。 1.2 现有获取生物样本解剖图谱的成像方法及特点现有获取生物样本解剖图谱的成像方法及特点 在过去的二十年里，生物医学成像方法取得了长足的进步，为科学家们提供了 丰富的生物组织结构信息，也为医生们提供了必不可少的宏观解剖信息。较为常用 的成像方法如下： x 射线计算机断层扫描成像（x-ray computed tomography, x-ct）, 是以测定 x 射线在生物体内的衰减系数为基础，采用数学方法，经计算机处理，求解出衰减系 数值在生物体某剖面上的二维分布矩阵，转变为图像画面上的灰度分布，从而实现 重新建立断面图像的现代医学成像技术。 例如用 x-ct 方法构建的人牙齿三维图谱8 等。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 磁共振成像（magnetic resonance imaging，mri）是一种生物磁自旋成像技术， 它是利用原子核自旋运动的特点，在外加磁场内，经射频脉冲激后产生信号，用探 测器检测并输入计算机，经过计算机处理转换后在屏幕上显示图像。mri 可以观察 颅脑，及其脊髓、关节骨骼、软组织等的解剖结构，也可作冠状、矢状及横断面像， 得到三维解剖图谱9。 超声成像可以利用超声波在不同组织中产生的反射和散射回波形成的图像或信 号，进行解剖学范畴的检测，以了解器官的组织形态学方面的状况和变化，来鉴别 组织结构和诊断疾病。使用超声成像方法也可以获得人体图谱10。 光学成像也是一种常用的方法，例如使用数码相机通过光学成像的方法得到的 “中国数字人男一号”图谱11，以及大鼠解剖图谱12。 但是，上述的几种成像方法分辨率较低，为亚毫米水平，还不能满足生物样本 的微细结构成像的需要。 光学显微镜也是一种较常使用的生物样本成像工具。光学显微镜的分辨率可以 达到微米水平。但是对于固体生物大样本，光学显微镜存在以下两个方面的问题。 首先，光学显微镜的视场有限。光学显微镜以微米分辨率成像时，其视场一般 仅为几百微米，所对应样本的尺度也在这几百微米以内，无法实现对大样本成像。 也无法通过光学设计来扩大显微镜的视场范围，因为根据傍轴近似条件13，除了特 殊的共轭点（齐明点）之外，球面是不能成像的，仅在傍轴光线范围内物点可以成 像，所以，一般显微镜的视场已经设计为最大值。 其次，光学显微镜的焦深一般在微米水平，而固体生物大样本的厚度比光学显 微镜的焦深大很多，所以光学显微镜也无法对固体生物大样本的较深区域成像，并 且在成像时也会有焦深之外的背景噪声干扰。所以光学显微镜也无法适用于固体生 物大样本的成像。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 1.3 对固体大生物样本以微米分辨率光学显微成像的关键问题对固体大生物样本以微米分辨率光学显微成像的关键问题 首先，成像分辨率要能达到微米水平，以获取生物样本中的微细结构信息。 其次，光路需要有较大的视场，视场为毫米水平或更大，这样才能够对大样本 进行成像。如果光路本身视场无法扩大，而要通过样本规则移动、以连续成像的方 式来实现视场的扩大，则要考虑以下二个问题：首先，在成像时样本位置要相对固 定，样本的运动速度与成像同步，使图像配准更为方便和准确，也是成像光路准确 的获取样本的结构信息的关键所在，相对于液态样本，选择固体样本更容易保持形 态位置；其次，固体生物样本的准备方面，将生物组织进行固定、包埋等步骤后， 得到的固体生物样本要存在光学对比度。 最后，要能对固体生物样本成像。存在以下两个问题：首先是对样本的较深区 域成像方面，和液态样本不同，固体样本无法通过物镜在样本中空间位置的移动来 实现对较深区域的成像；其次是关于光路的焦深与样本的厚度方面，如果样本的厚 度大于焦深，那么焦深范围外的信号会成为背景噪声，使成像质量下降。 1.4 本文的主要内容本文的主要内容 本文拟对一种光学显微成像方法进行研究，主要包括两方面的内容：首先，根 据该方法通过光学设计构建光路；然后分析、测量所构建光路的光学参数，由此对 光路的成像质量进行评价。 本文的研究要达到以下目的：首先，所构建光路的成像分辨率达到微米水平； 其次，光路的视场在毫米水平以上；最后，光路能够对固体样本清晰成像，包括固 体样本的较深区域。使光路能够对固体生物大样本以微米分辨率进行成像。 本文共分四章，各章主要内容如下： 第一章第一章 描述了获取生物样本的微细结构信息的重要性，以及对固体生物大样 本以微米分辨率成像的需求，分析了 mri，x-ct，超声、普通光学显微镜等成像方 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 法在分辨率、视场等方面的限制而无法满足上述需求，因此本文拟研究一种光学显 微成像方法， 并通过光学设计根据该方法搭建显微成像光路，通过对该光路的光学 参数的研究和测量，来检验该光路是否达到对固体生物大样本以微米分辨率成像的 目的。 第二章第二章 以工程光学设计的一般步骤，根据本文拟研究的光学显微成像要求， 介绍了光路的原理方案及总体布局，并研究并解决了光学部件选型，以及光路拼接 与调试中出现的问题。 第三章第三章 研究、测量所构建成像装置的光学参数。在对显微成像光路的分辨率 测量的理论基础和一般方法描述的基础上，分析了光路的理论成像分辨率，给出了 分辨率测量的过程及结果。介绍了使用畸变测试板对光路畸变进行测量的过程，也 测量了标准显微镜的畸变进行了测量，并给出了测量结果。 第四章第四章 本文的结论部分，对主要的工作内容及结果加以论述，对存在的问题 进行了总结，并对未来的工作进行了展望。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6 2 2 适于固体生物大样本的显微成像光路设计研究 适于固体生物大样本的显微成像光路设计研究 为实现对固体生物大样本以微米分辨率成像的目的，本文基于 olympus bx61 显微镜进行了光学设计，研究的重点包括： （1）光学原理方案、光路总体设计和布 局； （2）光学部件选型、确定初始结构参数； （3）光路的拼接与调试。 2.1 原理方案及总体布局原理方案及总体布局 本文所研究的光路如图 2.1 所示， 该光路可分为两个部分： 照明光路和成像光路。 待成像的物体为样本的切片（specimen section） ，成像时切片位于刀具表面上，与水 平面成一定倾角，以恒定速度运动，并与成像的速度同步，光路对样本的切片连续 成像，每次成像的切片厚度限制在焦深范围内，通过对样本块逐层切片，实现对样 本的较深区域成像。 图 2.1 整体光路图 fig.2.1 optical path of the system 光路工作过程如下： 光从光源(light source)发出后， 依次经过聚集透镜(collected lens)、孔径光阑(diaphragm aperture)、视场光阑(field aperture)、透镜(lens)、再经 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 7 分束镜(beamsplitter)、反射镜(mirror)反射后，通过物镜(objective)后照射在样本的切 片(specimen section)上，样本上的光线再被物镜收集，经反射镜反射，透过分束镜后 由镜筒透镜(tube lens)汇集到中间像平面(intermediate image plane)上， 此处放置的光 电耦合器件相机（charge-coupled device camera, ccd camera）将光信号转为图像 输出。光路采用笛卡尔空间直角坐标系，图 2.1 中左下角示意了水平方向上的 x 方 向和轴向的 z 方向。 2.2 照明光路的光学部件选型及拼接照明光路的光学部件选型及拼接 本文所研究的光路的独特之处在于其落射式照明和刀具辅助照明方式。照明光 路的光学部件的合理选型和拼接，是获得高质量数据的前提和关键。 照明光路包括的光学元器件有：光源、聚集透镜、孔径光阑、视场光阑、分束 镜、反射镜、物镜、金刚石刀具。对照明光路的研究，目的在于使得样本能够得到 均匀、亮度适中的照明。如图 2.2 所示 图 2.2 照明光路 fig.2.2 illumination optical path 本文所研究的光路属于落射式明场照明，并且采用了柯勒照明结构14：即光源 成像在物镜的后焦面上。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 8 在图 2.2 中，光从光源发出后，被聚集透镜汇聚在孔径光阑上，也即光源首先成 像在孔径光阑上，此后，光线通过视场光阑、透镜、分束镜后再次汇聚到物镜的后 焦面上，形成光源像，随后光线通过物镜后，会成为平行的光束照向样本，这样， 光源上每一点对样本照明的光能量、范围都是相同的。与此同时，视场光阑成像于 在样本平面上，而光源并没有在样本平面成像，也就意味着，在最终得到的成像结 果不会受到光源像的影响，例如，对于有灯丝结构的光源，成像图片中不会有灯丝 像的干扰，并且，由于光源没有聚焦在样本上，样本也不会承受过多的热量。 2.2.12.2.1 光源的光谱及稳定输出 光源的光谱及稳定输出 光路对光源的要求有以下三个方面： （1）有足够高的发光强度； （2）在一个较 宽的可见光波段上输出； （3）要能够在较长内保持稳定的输出，由于光路在采集数 据时需要连续的工作，往往时间长达几百小时。这就要求在这段时间内光源能保持 一个稳定的输出。 图 2.3 金属卤化物灯与汞灯的发射光谱比较24 fig.2.3 comparison of metal halogen lamp and the mercury lamp 对于宽波段照明的显微成像光路，常用如下光源：卤素灯、汞灯，金属卤化物 灯。 卤钨灯的输出光能量主要集中在红光及近红外波段，并且在输出会随使用时间 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 9 大幅减少。 图 2.3 以加拿大 exfo 公司的 x-cit120 金属卤化物灯和 olympus hbo 卤素灯为 例，将两者的输出曲线进行了对比。金属卤化物灯的输出光谱如图中蓝线所示，金 属卤化物灯从 280nm 到 750nm 范围内均有不同强度的输出，汞灯输出光谱在 325nm750nm，两者均在可见光范围（400nm-750nm）内强度相对较高。 金属卤化物灯在照明的均一性上（时间和空间）都要比汞灯好，而且寿命要比 汞灯大 10 倍左右，金属卤化物灯一般可以使用 2000 小时。并且金属卤化物灯没有 传统的调准问题，而在卤钨灯、汞灯中有多个旋扭用来调灯丝、集光镜等。 图 2.4 x-cite120 光源输出随使用时间衰减情况24 fig.2.4 the deduction of output of x-cite120 as using time increase 从图 2.4 中可以看出， 该光源寿命可以达到 2000 小时。 从开始使用到使用了 600 小时期间，光输出强度为以一个较恒定的速率减少的过程，到了 700 小时后，光强 减少为初始光强的 60%，并随后使用的 1200 小时内保持这个数值附近波动。只要光 路获取小鼠全脑数据要耗时在 50 天（1200 小时）以内，该类光源可以在这 1200 小 时内为光路获取数据实验提供稳定的光照明，而事实上连续采集数据的时间可以缩 短到 10 天以内。综上所述，金属卤化物灯为更合适的光源。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 10 2.2.22.2.2 分束镜的光谱及透反比 分束镜的光谱及透反比 分束镜在光路中所起的作用为：将照明光反射至样本，并让来自样本的光线通 过分束镜，由 ccd 相机成像。 对分束镜需要关注其在某一波段上的反射/透射率， 光路中 ccd 相机的响应光谱 主要分布在 400nm 至 750nm 波长范围，所以分束镜要能够对这一波段反射、透射。 为了光源的光能量得到充分的利用，需要选择合适反射/透射率的分束镜，如果 分束镜在 400nm 至 750nm 波段的光具有一定的反射/透射率 r/（1-r） ，其中反射光 所占比例为 r，透射光能量所占比例为 1-r。从光源发出、最终到达 ccd 相机的光， 经过分束镜一次反射，一次透射，ccd 探测到的光能量占光源光能量的比例为 r(1-r)，当 r0.5 时，该式取得最大值，也即选用反射/透射率比为 1：1 的分束镜， 会使探测器接收的光能量到达最大值。 2.2.32.2.3 光阑对光能量和视场的控制 光阑对光能量和视场的控制 根据共轴球面组在傍轴条件像的规律和理想光具组的理论15，除了平面镜的特 例外，理想光具组是不能实现的，只有把光束限制在傍轴区域内，一个实际的共轴 光具组才能近似成像。光具组中对光束起限制作用的可以是透镜的边缘、框架，或 者是特别设置的带孔屏障，即光阑。 在照明光路中，沿着光传播方向，依次放置着两个光阑：第一个光阑决定着通 过光具组光束孔径的大小，为孔径光阑，它同时又是入射光瞳；对于第二个光阑， 光源的主光线通过光具组时会与此光阑的边缘相遇，而离光轴更远的共轭点的主光 线将被此光阑遮断，此光阑即为视场光阑，它同时也是照明光路的入射窗。 如图 2.2 中所示，光源首先成像在孔径光阑位置，然后光源像会再次成像于物镜 的后焦面上，而孔径光阑也是在这个位置成像，而光源上的每一点都是对整个样本 范围内以相同的光能量均匀照明的，也就意味着，孔径光阑的孔径大小可以控制参 与照明的光源范围大小，从而控制着进入光路的光束孔径大小，也即亮暗程度。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 11 视场光阑被最终成像在了样本平面上，在样本平面上视场光阑像之外的区域， 由于光线都被视场光阑挡住，无法到达该区域，所以视场光阑的大小，也就决定了 样本平面被照亮的面积的大小，从而控制了成像的视场。这两个光阑的设计，方便 了照明光路光强和成像光路视场的调节。 2.2.42.2.4 聚集透镜和聚光镜 聚集透镜和聚光镜 在照明光路中，有两块聚集透镜，在 olympus 产品组件中已设置好，一块在 光源之后，另外一块在视场光阑之后。 由于光路为落射式照明，所以物镜也被当作聚光镜使用，此时主要需要考虑物 镜与样本块、切片三者之间的空间位置是否合适。 图 2.5 物镜与样本块、切片相对位置分析 fig.2.5 analysis of the location of the objective, specimen block and the section 图 2.5 均对刀具的形状及方位做了近似，物镜的工作距离、外型尺寸、前端透镜 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 12 半径大小必须满足一定的关系。因为刀具与样本的位置固定，若物镜相关参数不适 的话，会使物镜前端碰触到样本，使切片、成像无法进行。物镜前端是否会接触到 样本表面，是由样本切片上从物镜光轴到样本的距离 d1，物镜的工作距离 d2，物镜 前端侧边的长度 d3， 物镜前端透镜半径 r， 物镜前端侧边与物镜前端的角度 共同决 定的，可以证明，要使物镜与样本表面不接触，以上各参数必需满足： d1+d2r+d3sin( -135) （1） 这里使用上文中的公式（1）来判断该物镜与刀具的相对位置，测得该物镜各参 数如下：工作距离 d23.3mm，d3=(7.9-3.6)/42+(15.8-7.2)/421/2mm=4.8mm， r=3.6mm，=137，代入公式（1）可知，当 d10.47mm 时，物镜不会碰触到样本， 并与其处在合适的相对位置。 2.2.52.2.5 刀具的辅助照明作用 刀具的辅助照明作用 图 2.6 olympus bx61 显微镜光路24 fig.2.6 the optical path of olympus bx61 microscope 图 2.6 所示为 olympus bx61 的显微镜的透、反射照明成像光路。 图 2.7 是用 olympus bx61 显微镜、ccd 相机（像素尺寸 6.45m）对样本成 像的实验结果，样本是经过染色、树脂包埋后的鼠脑的切片，用玻片封装。图 a 中 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 13 样本为 nissl 染色，切片厚度为 5m，用 10 倍水浸物镜透射成像，图 b 是与图 a 相 同实验条件下的反射成像结果；图 c 中样本为 golgi 染色，切片厚度为 5m，用玻 片封装，用 40 倍水浸物镜透射成像，图 d 是与图 c 相同实验条件下的反射成像结 果。在图 2.7 中，黑色部分为神经细胞，周围透明区域为包埋剂。可以看出，透射成 像比反射成像的对比度高。 图 2.7 nissl 样本与 golgi 样本的透、反射成像。图 a 中的标尺长度为 80m，图 b 与图 a 的 尺度一样；图 c 中的标尺长度为 20m，图 c 与图 d 的尺度一样。 fig.2.7 nissl and golgi specimen image with transmitted and reflected light microscopy. the length of scale bar in figure a is 80m, figure b has the same scale with figure a, while the length of scale in figure c is 20m, figure d has the same scale with figure c. 而本文研究的光路与 olympus bx61 显微镜在照明、 成像方式上有区别， 是一 种透反射成像结合的成像方式。待成像的样本是经过染色后和树脂包埋的生物组织， 样本中生物组织部分不透明，颜色较深，而包埋剂部分较为透明，生物组织部分比 包埋剂部分会吸收更多的光能量。刀具一般为金刚石刀或玻璃刀，成像时切片厚度 一般在微米水平。若采用透射光照明，那么在刀具部分就需要进行复杂的设计，为 了减少光路的振动，光路采用了落射式照明方式，在成像时，样本的切片位于刀面 上，穿透切片的光，一部分会被刀面反射，再次照向切片，这部分光会再次穿透样 本后，也会参与成像，相对于没有刀具的情况，相当于生物组织部分与包埋剂部分 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 14 同时再加入一部分成像光能量，并且前者比后者的光能量要少得多，这样就使得两 者的成像光能量相差更大，从而加深了对比度，达到了辅助照明的效果，这也就意 味着，刀具除了对样本切片之外，也作为一种光学部件发挥作用。 2.2.62.2.6 光程分析 光程分析 在照明光路中，样本位置固定，物镜与样本之间的距离为物镜的工作距离，光 源、分束镜、聚集透镜均安装在照明器上的固定位置。因此，仅有反射镜的空间位 置可调，照明光路的光程仅会随反射镜空间位置改变而变化。光程偏大或偏小时， 由于成像光路中采用了无限远像距概念设计，也即物镜与镜筒透镜之间为平行光束， 所以光程的改变对样本对焦没有影响，样本平面与像平面仍然是共轭的，但照明光 路设计则会受到明显影响，会出现照明区域小、照明亮度暗、不均匀的现象，即使 用图像处理的方法，也无法恢复，造成数据的损失。 对于 olympus bx61 显微镜， 其照明光路在出厂时就已经调到合适位置， 对于不 同的物镜，照明器出光口与物镜最前端的距离也不同，例如，当使用 olympus 的 lumplanfl40 倍物镜时，上述距离为 11.6cm。 图 2.8 光程调整前后照明情况对比 fig.2.8 comparison of before and after the adjustment of the optical length 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 15 本文所研究光路的照明光路与 bx61 光路相比，不同之处在于多了一个反射镜， 所以当光路使用 lumplanfl40 倍物镜时，照明器出光口与物镜前端的光程也应为 11.6cm。这样的话，照明光路中的各个光学元器件处在正确的空间位置，这样照明 光路就可以与设计理论一致，光源成像在物镜的后焦面，从而使样本得到均匀、合 适强度的照明。 图 2.8 中，左上图为照明光路光程大于理论值（照明器出光口与物镜前端的光程 也应为 19.5cm）的情况，可以从该图中明显的看出，虽然样本对焦清晰，但是整个 视场中照明不均匀，中间亮两边暗，图像质量很差。左下图的横坐标对应左上图横 向像素位置，纵坐标对应某一横坐标上所有纵向像素值的累加值。 因此，对照明光路进行了调整，缩短照明器、反射镜、物镜之间的距离，使光 程与理论值相符，右上为调整后得到的图像，同理，右下图的横坐标对应右上图横 向像素位置，纵坐标对应某一横坐标上所有纵向像素值的累加值。从调整前后曲线 的对比结果可知，将光程调整正确后，照明变得均匀。 2.3 成像光路的光学部件选型及拼接成像光路的光学部件选型及拼接 成像光路光学部件的合理选型和拼接，主要在于物镜和 ccd 两个方面，在成像 光路中的镜筒透镜属于 olympus 显微镜组件，不需再进行光学设计过程分析。 成像光路如图 2.9 所示, 包括的光学元器件有：物镜、反射镜、分束镜、镜筒透 镜、 tdi(time delay integral, 时间延时积分)-ccd 相机。其中与照明光路共用的元器 件有：物镜、反射镜、分束镜。对成像光路的研究，目的在于对样本以特定的分辨 率、放大倍率成像。 从图 2.9 中可知，样本平面位于物镜的焦平面上，样本平面上的任一点发出的光 线经过物镜后，变为平行的光束，再依次经过反射镜、分束镜，最后由镜筒透镜汇 聚在像平面上，由 ccd 相机成像。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 16 图 2.9 成像光路 fig.2.9 imaging optical path 2.3.12.3.1 物镜 物镜 物镜同时也是成像光路一部分。由于成像时物镜位于水中，所以使用了水浸物 镜，一方面是因为水浸物镜的数值孔径一般比空气物镜要高，可以提高成像的分辨 率，另一方面便于设计水路吸走已经过成像的切片。此处因为在光路中采用 olympus 公司组件为无限远像距系统标准，也必须要匹配无限远像距系统的物镜。 物镜的数值孔径与光路水平方向的分辨率有关，由夫琅和费衍射所限定，通常 用 瑞 利 判 据 来 定 量 表 达 ， 显 微 成 像 光 路 能 够 分 辨 的 最 小 两 点 间 的 距 离 dmin=0.61/n.a.，若光路使用金属卤化物灯用为光源， 一般取 550nm, n.a.为物镜 的数值孔径。 例如要使光路水平方向的成像分辨率达到 0.5m， 那么物镜的数值孔径 应大于 0.671。如果要使水平方向的成像分辨率达到 1m，那么物镜的数值孔径则应 大于 0.336。 对于放大倍率为 40 倍的物镜，其视场数应大于 18mm。样本平面上的视场大小 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 17 (field of view in specimen plane, fov(specimen)物镜的视场数(field number, fn)/ 物镜的放大倍数(m)。光路使用 40 倍物镜成像时切片宽度一般取 0.45mm，并将成像 区域靠近视场直径位置， 如果物镜的视场数小于 18mm， 那就意味着对应样本平面上 的视场大小就会小于 0.45mm，就会导致超过物镜视场的部分不能成像而损失数据。 而刀具宽度为 3mm；光路使用的 olympus 显微镜组件，镜筒直径为 26.5mm，其中 装有相应的镜筒透镜。olympus 物镜的视场数一般也为 26.5mm，可以与其匹配，但 若要使用其它厂家的物镜，则要考虑该物镜的视场数是否与 olympus 组件符合。 2.3.22.3.2 tdi-ccd 相机及同步误差 tdi-ccd 相机及同步误差 对于本文所研究的光路，由于在成像过程中，样本是某一恒定速度运动的，运 动的速率由电控平移台控制，并且待成像区域较窄、亮度较低，线扫描 tdi-ccd 相 机适用于这种成像条件。 ccd 的成像分辨率与成像光路的分辨率有关， 而 ccd 的成像分辨率是由其像素 间距决定的16，由于在 ccd 芯片上，像素呈正方形且紧凑排列，像素间距也与像素 尺寸相等，根据奈奎斯特采样定律17，对光学显微成像中获取光学图像的情况，成 像光路最小分辨率，要用两个像素进行采样，以完整地重建样本的成像信息。例如 若光路水平方向的分辨率要达到0.3m， 那么ccd的分辨率必须小于或等于0.35m， 而 ccd 的分辨率是由其像素尺寸决定的，对于放大倍率为 40 的物镜，这样的话也 就意味线阵 ccd 的像元尺寸要小于 0.35m40/27m。 成像区域的大小，在 tdi-ccd 像素尺寸一定的情况下，主要由 tdi 级数和垂直 于 tdi 方向的像素数量决定。样本平面成像区域的大小等于 tdi 级数非 tdi 方向 的像素数量物镜放大倍率。 图 2.10 中， 将成像光路进行了简化， 当样本上的成像区域经过 ccd 上的第一行 像素曝光之后18，在下一次曝光之前，第一行像素曝光所产生的电荷会转移到下一 行像素上，当样本恰好移动到下一个位点，电控平移台给 ccd 相机一个触发信号， 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 18 与此同时第二行像素再对样本上的同一区域进行曝光，曝光的电荷与之前像素已有 的电荷相累加，再转移至第三行像素，如此继续进行直至最后一级 tdi 后，像素再 将累加的结果输出。 图 2.10 tdi 过程示意 fig.2.10 the process of tdi 由此可知，电控平移台的触发间距与像素间距的匹配十分重要，因为如果两者 不匹配，在 tdi 过程中，每行像素就不再都是对样本的同一区域曝光，这样累加的 结果就与样本的真实情况不符，得到的图像会变得模糊，触发间距与像素间距两者 差值越大，图像越模糊。 例如对于选用的 dalsa 公司的 piranha hs 4x-02k30 ccd 相机的像素间距为 13m，使用 40 倍物镜，也即成像光路将样本放大了 40 倍，所以电控平移台的触发 间距应该为 325nm。但实际上，电平移控台只能以 100nm 为单位设置触发间距，将 触发间距设置为 300nm， 这样与理论的像素间距还是有 25nm 同步误差。 这个误差可 容忍的范围可由下式确定19：mtf(tdi)=m(d/d)，其中 mtf（tdi）为反映同步 精度的调制传递函数， m 是 tdi 级数， d 是同步误差， d 为触发间距， 当 mtf(tdi) 小于 2 时，同步误差对成像没有影响，例如选用 16 级 tdi 时，m=16，d25nm， 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 19 d300nm，那么，mtf(tdi)等于 1.33 小于 2，所以，这种条件下，成像不会受到 同步误差的影响。tdi 级数越小，m 越小，这可以减少同步误差对成像的影响，而 在以上述成像条件下，理论上成像光路能选择的最大 tdi 级数为 24 级，但在实验中 发现，仅在 tdi 级数小于或等于 16 的情况下，才能得到足够清晰的图像，而对于 40 倍物镜，13m 像素尺寸，16 级 tdi 对应样本平面上的区域为 5.2m。选用高于 16 级的 tdi，图像变得模糊，原因可能在于金刚石刀面上的切片在运动出 5.2m 的 区域后，切片已经离开刀具表面，这样，切片的空间位置就会与 tdi 失去同步，并 且带来更大的同步误差，最终得到的图片就会变得模糊。 图 2.11 限制 tdi 区域前后成像效果。其中，左图为未限制 tdi 区域的成像结果，右图为限 制 tdi 区域之后的成像结果。 fig.2.11 the image in the left is the result without tdi region restriction, the image in the right is the result after tdi region restriction 当光路使用 10 倍物镜时，16tdi 区域扩大了 4 倍，切片偏离刀面更远，切片离 tdi 对应位置也更远， 这样， 由同步误差造成的图像模糊情况更为严重。 但是 piranha hs 4x-02k30 ccd 能设置的最小 tdi 级数为 16 级，通过减少 tdi 级数来减少同步 误差无法实现。然而，减少 tdi 级数本质上是通过减少 tdi 区域的方式来达到目的 的，所以，可以使用方形的视场光阑，将成像区域限制在 5.2m 左右，这样由于超 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 20 出成像区域的部分没有光能量，这部分在 tdi 过程中是以零电荷参与 tdi 的累加， 尽管 ccd 相机是设置为 16 级 tdi，但 tdi 的区域仍为 5.2m。 为了验证上述结论， 做了以下实验， 使用 10 倍 ol