（细胞生物学专业论文）热激与四环素双重诱导调控的植物基因表达系统研究.pdf

摘要 热激与四环素双重诱导调控的植物基因 表达系统研究 细胞生物学专业硕士研究生胡华刚 指导教师张兴国研究员 摘要 在植物转基因研究中，建立或获得一种严紧、高效、灵敏、特异及可诱导调节的基因表 达调控系统，不仅在对目的基因进行精确和经济地调控方面具有重要利用价值，而且便于研 究目的基因在特定发育时期和发育部位的功能因此，一直倍受国内外学者的重视。目前， 可应用的植物调控系统很多，如温度诱导、植物激素诱导( 如a b a 、i a a 、a u x i n ) 、光诱导， 胁迫诱导、金属盐离子诱导等。但是，现有的这些诱导系统都存在诱导多元性这一致命的弱 点。现在应用最为广泛的是四环素调控系统，主要有t e t - o f f 系统( t t a , t e t r a c y c l i n et r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t o r ) 和t e t - o n 系统( r t t a , r e v e r e st e t r a c y c l i n ew a n s c r i p t i o n a la c t i v a t o r ) 两类。但是目前所建 立的这两种系统都存在一定的缺陷，如在系统关闭时仍有较高水平的泄漏表达、构建的杂合 启动予启动效率不高、较高浓度的四环素( t e t ) 对细胞或植株具有一定的毒害，同时与t t a 系 统相比，r t t 系统即使是在非诱导状态，r t t a 与t e t o 仍有一定的亲和力，仍可诱导基因表 达，导致目的基因的基础表达水平很高。鉴于此，本文采用t ? a 系统工作原理，构建了一新 型热激与四环素双重诱导的t t a 系统，以期能在较大程度上使对目的基因的表达调控更加严 紧，高效、灵敏且具有广普性。主要研究结果如下： 1 将含有4 个四环素操纵子元件t e t o 的序列与花椰菜花叶病毒c a m v 3 5 s 微启动子 ( - 4 6 b pm i n i3 5 sp r o m o t e r ) 片段连接，构建成含四环素操纵元件的人工启动子o m 3 5 s 片段，将 其克隆入载体p s a u 2 0 0 6 中获得与g u s 基因编码区以及t o n s 终止子融合的中间载体 p u - o m 3 5 s g u s ；通过限制性酶切下“o m 3 5 s - g u s ”片段并将其插入植物表达载体p v c t 2 0 2 0 中，获得含“o m 3 5 s - g u s - t n o s ”表达盒的植物表达载体p c - o m 3 5 s g u s ；采甩冻融法将该表达 载体导入根癌农杆菌e h a l 0 5 中，经农杆菌介导转化烟草叶片细胞，以组织化学法分析g u s 基因的瞬间表达活性。结果显示：转o m 3 5 s - g u s 基因的烟草叶片材料中，在不加四环素及正 常组培条件处理下没有检测到g u s 活性，表明o m 3 5 s 人工杂合启动子为具有表达严紧性。 2 将n 端缺失而自# t 5 7 、# 2 3 8 、# 2 7 3 和槲0 4 位氨基酸残基开始保留的拟南芥热激因子 a t h s f i a 的c 端的编码基因序列，分别与四环素阻遏蛋白基因t e t r 相拼接，获得融合基因 西南丈学硕七学位论文 r h s f c l 5 7 、r h s f c 2 3 8 、r h s f c 2 7 3 、r h s f c 4 0 4 并克隆入载体p s a u 2 0 0 6 中。分别构建了由 3 5 s 启动子控制融合基因的四种中间载体d 3 5 s r h s f c l 5 7 、p 3 5 s r h s f c 2 3 8 、p 3 5 s r h s f c 2 7 3 、 p 3 5 s - r h s f c 4 0 4 ；通过限制性酶分别酶切四种载体获得“3 5 s r h s f c l 5 7 - t n o s ”、 “3 5 s r h s f c 2 3 8 - 1 h ”、。3 5 s r h s f c 2 7 3 t n o s ”和“3 5 s r h s f i ：4 0 4 粕”四种表达盒基因 片段；另外通过限制性酶酶切p o - o m 3 5 s g u s 载体获得“o m 3 5 s - g u s ”片段，将该片段分别与 上述四种表达盒片段之一共同重组进表达载体p v c t 2 0 2 0 中，获得四种四环素调控系统 3 5 s c l 5 7 - o m 3 5 s g u s 、3 5 s c 2 3 8 - o m 3 5 s g u s 、3 5 s c 2 7 3 - o m 3 5 s g u s 和3 5 s c 4 0 4 - o m 3 5 s g u s 采用 冻融法将构建的四种表达载体分别导入根癌农杆菌e h a l 0 5 中，并经农杆菌介导转化烟草叶 片细胞，以组织化学法分析g u s 基因的瞬间表达活性。结果显示：在3 5 c 且不加四环素时， 均能检测到较强的g u s 基因表达活性，而在加入l m g l 四环素处理下g u s 基因表达活性均 受到抑制表明这四种调控系统均具有功能且严格受四环素负调控。 3 将调控系统3 5 s c l 5 7 - o m 3 5 s g u s 中控制调节组分的3 5 s 启动子替换成h s p 7 0 r a 人工热 激启动子，获得一新型的、由热激与四环素双重诱导调控的植物基因表达调控系统 7 0 m c l 5 7 4 3 m 3 5 s g u s 。同样进行瞬间表达分析该系统功能，结果显示：( 1 ) 在2 5 ( 2 以下及不加 四环素处理下均没有检测到g u s 活性：在2 8 ( 2 以上不加四环素处理下均检测到了g u s 活性。 其中，2 8 ( 2 表达最弱，3 5 c 时表达活性最强。而在加入1 0 m g l 四环素以及3 5 c 培养下没有 检测到g u s 表达活性。另外，对g u s 表达活性最强的烟草叶片采用! 0 m g l 四环素处理不同 时间，4 小时后没有检测到g u s 表达活性。表明植物基因表达调控系统7 0 m c l 5 7 - o m 3 5 s g u s 严格受温度和四环素的调控，并且诱导效应相当灵敏。 关键词：热激四环素诱导含四环素操纵子元件的人工启动子 n 四环素阻遏蛋白一热激因子融合转录因子植物基因表达调控系统 a b s t r a c t s t u d i e so nt h ep l a n tg e n ee x p r e s s i o ns y s t e m c o n t r o l l e db yh e a ts h o c ka n d t e t r a c y c l i n e m a j o r ：c e l l b i o l o g y c a n d i d a t e ：h uh u a g a n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s e rz h a n gx i n g g u o a b s t r a c t i ti si m p o r t a n tt oc o n s t r u c tas t r i c t ，h i 【g he f f i c i e n t , s e n s i t i v e ，s p e c i a la n di n d u c e dg e n ee x p r e s s i o n s y s t e mi nt h a tt h eg e n ec a l lb er e g u l a t e dp r e c i s e i ya n dc o n v e n i e n t l ya n dp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei n d e v e l o p m e n t a lr e s e a r c h a tp r e s e n t , t h e r ea f es o 腓g e u er e g u l a t i o ns y s t e m s s u c ha st e n l p o r a t o r e i n d u c e m e n t , p h y t o h o r m o n ei n d u c e m e n t ( a b a 、i a a 、a u x i n ) 1 i g h ti n d u c e m e n t , a d v e r s i t y i n d u c e m e n t , m e t a ls a l ti o ne n ds o h o w e v e r , a l lo ft h a ti n d u c e m e n th a sas h o r t c o m i n gw h i c hi s i n d u c e dp l u r a l i s m c u r r e n t l y , t e t - r e g u l a t i o n - s y s t mw h i c hm a i n l yi n c l u d e st w ot y p e so ft e t r a c y c l i n e t r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t o r ( t t a ) a n dr e v e r e st e t r a c y c l i n et r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t o r ( r t t a ) i sb r o a d l y a p p l i e d t h e r e e x i s t s i ns o n i c d l l v a n t a g e t h a t i t i s t h e h i g l l l e v e l o f l e a k i n g w l t e ns h u t , e n m 蛐g m i x e d p r o m o t e r i s l o we f f i c i e n c y , h i g l ic o n c e n t r a t i o no f t e t i s p r o v i d e d w i t h p o i s o n t oc e ho r p l a n t s m e a n w h i l e ，t h o u g ht h er e g u l a t i o no fr t t ai sn o ti n d u c e d , r t t aa n dt c t os t i l lh a v ea p p e t a n c yt o i n d u c et h eg e n ee x p r e s s i o n h it h el i g h to ft h i s ，t h i ss t u d yt a k eu s et h ep r i n c i p l eo ft t as y s t e m p l a y i n g ，e x p e c t e dt om a k ee x p r e s s i o nr e g u l a t i o nb e c o m em o r es t r i c t , h i g he f f i c i e n t ，s e n s i t i v ea n d u n i v e r s a l n ”r e s u l ta sf o l l o w ： 1 ，c o n n e c tt e t ow h i c he n n t a i n e d f o u rt e t r a c y c l i n e o p e r o ne l e m e n t st o t h ev i c i n i t yo f m i n i - c a m v 3 5 sp r o m o t e r ( - 4 6 b pm i n i3 5 sp r o m o t e r ) ，g a i n e dt h ea r t i f l c a lp r o m o t e ro m 3 5 sf r a g m e n t w h i c hc o n t a i n e df o u rt e t r a c y c l i n eo p e l o ne l e m e n t s t h e nc l o n e di ti n t op s a u 2 0 0 6v e c t o rt oo b t a i n t h es u b e l o n ev e c t o rp u - o m 3 5 s g u sw i t i it h ec o d e8 e c t i n no fg u sa n dt h ee n d e rt o n s t h e p c - o m 3 5 s g a st h a tc a l lc o n t r o lt h ee x p r e s s i o no fg u sg e n ei n c l u d i n gt h ea r t i f i c i a lp r o m o t e ro f o m 3 5 sw a sa c q u i r e db yt h er e s t r i c t i o ne n z y n l ee n t t i n gt h e “o m 3 5 s - g u s ”l i a g m e n ta n di n s e r t e di t i n t ot h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp v c t 2 0 2 0 w h e r ea w et r a n s f o r m e dt h ep l a n te x p r e s s i o nv e e r r p c - o m 3 5 s g u si n t oa g r o b a c t e r i n mm m e f a c i e n se h a l 0 5b yf r e e z i n ga n dm e l t i n g ，a n dt o o ki tt o i n f e c tt h et o b a c c ol e a f i nt h ee n d , t r a n s i e n te x p r e s s i o no ft h eg u sg o n ew a sm e a s u r e db y h i s t o c h e m i c a lm e t h o d ；t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a to m 3 5 s - g u so ft o b a c c ol e a fw a sn ot h ee x p r e s s i o n o fg u su n d e rt h ec o n d i t i o no fn o r m a lt i s s u ec u l t u r e t h a ti st os a y , t h ea r t i f l c a lp r o m o t e r0 m 3 5 s t o o ko nt h es t r i c te x p r e s s i o n 2 。f r o mt h es i t e # 1 5 7 ，# 2 3 8 ，# 2 7 3o r 槲0 4a m i n o - a c i dr e s i d u es t a r t sr e m a i n i n gd e l e t et h e g e n o m i cs e q u e n c e sn - t e r m i n a lo f a t h s f l a ，a n ds p l i c i n gt h i sc - t e r m i n a lg e n o m i cs e q u e n c e st ot h e g e n e t e t ro fh e a ts h u c k t e t r a c y c l i n er e p r e s s e rp r o t e i n , g a i n e d f u s e d g e n ef r a g m e n t r h s f c l 5 7 , r h s f c - 2 3 8 ，r h s f c 2 7 3a n dr h s f c 4 0 4 ，t h e nc l o n e dt h i sg e n ef r a g u a e n t si n t o p s a u 2 0 0 6v e c t o r , c o n s t r u c t i o nf o u rm i d d l ev e c t o rp 3 5 s - r h s f c l 5 7 ，p 3 5 s r h s f c 2 3 8 , p 3 5 s 1 1 1 两南大学硕t 学位论文 r h s f c 2 7 3a n dp 3 5 s - r h s f c 4 0 4w h o s ef u s e dg e n ef r a g m e n tw e r ec o n t r o l l e db y3 5 sp r o m o t e r , t h r o u g hr e s t r i c t e de n z y m ec u t t i n gf o u rv e c t o r sc o u l dg a i n e df o u re x p r e s s i o ng e n ef r a g m e n t s ： 3 5 s r h s f c l 5 7 t n ，3 5 s r h s f c 2 3 8 _ t n o s ，3 5 s - r h s f c 2 7 3 t sa n d3 5 s r h s f c 4 0 4 - t r l o s m e a n w h i l ew ea l s of r o mr e s t r i c t e de n z y m ec u t t i n gp u - o m 3 5 s g u sv e c t o rg a i n e d o m 3 5 s - g u s f r a g m e n t ，t h e nr e c o m b i n a t i o nt h i sf r a g m e n tw i t ha b o v e - m e n t i o n e do n ei nf o u rg e n ef r a g m e n t si n t o t h e p l a n t e x p r e s s i o n v e c t o r p v c t 2 0 2 0 。g a i n e d3 5 s c l 5 7 - o r n 3 5 s g u s ，3 5 s c 2 3 8 o m 3 5 s - g u s ，3 5 s c 2 7 3 - o m 3 5 s g u sa n d3 5 s c 4 0 4 - o m 3 5 s g u sf o u rr e g u l a t i o ns y s t e m so ft e t r a c y c l i n e i nt h e e n d , w et r a n s f o r m e dt h ef o u rp l a n te x p r e s s i o nv e c t o r si n t oa g r o b a c t e f i u mt u n 】e f a c i e n se h a l 0 5b y f r e e z i n ga n dm e l t i n g ，t h e r e a r e r , t o o ki tt oi n f e c tt h et o b a c c ol e a f w h e r e a 脑, w a n s i e n te x p r e s s i o no f t h eg u sg a n ew a sm e a s u r e db yh i s t u c h e m i c a l l ym e t h o d ；t 1 l er e s u l ti n d i c a t e dt h a ta tt h et e m p e r a t u r e o f 3 5 a n du n d e rt h ec o n d i t i o no f n ot e t r a c y c l i n e a l lt h ee x p r e s s i o nl i v eo f g u sw a sv e r ys t r o n g o nt h ec o n t r a r y , t h e r ew a sn os i g n a li nt i mc o l m l em e d i u mi n c l u d i n gl m g lt e t r a c y c l i n e i ts h o w e d t h a tt h ef o u rr e g u l a t i o ns y s t e m sa l la p p e a r e df u n c t i o na n ds u i c tr e g u l a t e db yt h en e g a t i v er e g u l a t i o n o f t e t r a c y c l i n er e g u l a t i o ns y s t e m 3 1 1 3 5 sp r o m o t e ro f3 5 s c l 5 7 - o m 3 5 s g u sw a sr e p l a c e df u rh o tp r o m o t e rh s p 7 0 m w e o b t a i n e dan e wp l a n te x p r e s s i o nr e g u l a t i o ns y s t e m7 0 m c l 5 7 o m 3 5 s g u sw h i c hr e g u l a t e db yd o u b l e i n d u c e m e n ta n dr e g u l a t i o n l i k e w i s e ，t r a n s i e n te x p r e s s i o no ft h eg u sg e n ew a sm e a s u r e dt o a n a l y s i st h ef u n c t i o no ft h i ss y s t e n l ，t h er e s u l t ss h o w s ：t h ee x p r e s s i o no ft h eg u sg e n e ，a sn o e x p r e s s i o nw h e n t h e r ew a su ot e t r a c y c l i n ea sw e l la sb e l o w2 5 t h ee x p r e s s i o nl i v eo f g u sw a s s t r o n g0 1 1t h ec o n d i t i o no fd e a l i n gw i t hn ot e t r a c y c l i n ea n da b o v e2 8 ( 2 ，a m o n gt h et o t a l ，t h e e x p r e s s i o nl i v eo f g u sw a sm o s tw e a ki n2 8 ca n dm o s ts t r o n gi n3 5 c i na d d i t i o nu s et h ec u l t r u e m e d i u mi n c l u d i n gl m 班t e t r a c y c l i n ei r e a t m e n tt h em o s te x p r e s s i o nl i v eo fg u st o b a c c ol e a f d i l t e r e l l c ct i m e s ，t h e r ew a sn o ts i g n a li nt h ec u l t m em e d i u mi n c l u d i n gl m g l t e t r a c y c l i n ea f t e rf o u r h o u r s t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ep l a n te x p r e s s i o nr e g u l a t i o ns y s t e m7 0 m c l 5 7 - o m 3 5 s g u ss t r i c t r e g u l a t e db yt e m p e m n j r ea n dt e t r a c y c l i n e ，b e s i d e sh a v eas e n s i t i v ei n d u c e m e n t k e y w o r d s ：h e a ts h o c k , t e t r a c y c l i n ei n d u c e ，a r t i f i c a lp r o m o t e rw i t ht e t r a c y c l i n eo p e r o n , t r a n s c r i p t i o n a lf a c t o rf u s e di nt e t r a c y c l i n er e s i s t a n c ep r o t e i na n dh e a ts h o c kf a c t , p l a n tg e n e e x p r e s s i o ns y s t e m 独创性声明 学位论文题目：热邀与四珏苤巫重透昱调控数植物基固盍达丕红硒 红 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者：胡华刚签字日期：2 。7 年6 肿日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：回不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：唁智哼刚 签字日期：州年f 月7 日 学位论文作者掣业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字日期：护q 年6 月7 日 电话： 邮编： 第1 章文献综述 第1 章文献综述 人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c t h g p ) q 是当代生命科学一项伟大的科学工程，它 奠定了2 l 世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础。目前，也有许多其他模式生 物的基因组测序已经完成或正在进行。大量序列的产生使人们不仅仅限于获得基因组序列， 而是必须要对这些基因组序列所包含的意义进行解释，于是从d n a 序列到生物学功能、从基 因到基因组、从基因组到后基因组和蛋白质组的研究相继被提出并得以启动 2 1 。与基因测序和 制图相比，基因功能的分析与鉴定面临的困难更多基因功能的研究方法多种多样，其中转 基因表达即为重要的方法之一。但由于某些基因的表达对细胞而言是具有毒性的，导致细胞 或者胚胎死亡，使得转基因表达研究无法继续。所以，近年来人们发展了一些可诱导性的植 物基因表达系统。 1 1 植物基因工程中诱导表达系统研究概况 植物基因工程现已成为研究和改善植物遗传资源的强而有力的工具，其中启动子是决定 基因表达部位、时间以及强度的主要因素。目前已被广泛用于转基因的启动子之一花椰菜花 叶病毒( c a m v ) 的3 5 s 启动子能在许多植物中的几乎所有发育阶段及发育组织中极强的表达， 它是一种组成型的启动子。但有时候我们需要一些目的基因在特定的发育阶段，特定的组织 部位表达，并且能受人为调控，也就是我们需要它表达时它才表达，否则就处于关闭状态。 例如有些基因的表达对植株早期的生长、发育有影响，甚至会致死，这时我们就希望将这些 基因置于可调控的启动子下游，在植株发育后期才表达它们；又比如我们希望某些疾病抵抗 基因仅在病原体侵入时表达，这同样也需要对基因的表达进行调控。目前研究的可调控体系 很多 3 4 1 ，例如温度诱导、植物激素诱导( 如a b a ，i a a 、a u x i n ) 、光诱导、胁迫诱导、金属 盐离子等。但是这些诱导系统都它们致命的弱点诱导多元性，它们在调控靶基因同时总 是引发植物体内许多其它基因的表达，难以区分特异或非特异性事件，并且影响植株的正常 生理代谢，也就是说几乎不可能使这些因素只对某一特定基因起作用并且。在没有诱导剂 时还经常出现“表达遗漏”现象。另外一种调控系统是利用那些来自植物远缘物种的调控元 件，由于这些元件来自植物的远缘物种，植物中含有同源元件的可能性非常小，而且诱发这 些元件起作用的物质( 诱导物) 通常是植物生长发育过程中很少遇到的，所以这些诱导物对 其作用元件具有高度的专一性，不会影响到植物体内源基因的表达和细胞功能。当前，在化 学诱导中也发展了许多诱导系统并都加以了一定改进如乙醇诱导系统、类固醇诱导系统、地 塞米松诱导系统等，但是目前应用最广泛效果最佳的就是四环素调控系统，四环素( t e t r a c y c l i n e , t e t ) 系统的出现阵6 1 ，为基因的诱导表达开辟了一个崭新的领域，不仅为研究系统发育中基因的 调控和功能提供了一个理想的研究工具，而且也为基因治疗提供了一条可控的安全途径。 西南大学硕士学位论文 1 2 四环素调控系统的研究进展 1 2 1 四环素阻遏系统原理及应用 人们在研究大肠杆菌耐药机制时发现，四环素f r c ) 耐药蛋白( t c t a ) 的表达是在四环素阻 遏物( t e t r ) 的调控下进行的【7 】：在无t c 存在时，四环素阻遏蛋白t c t r 可与t n l 0 区的四环素 耐药操纵子的操纵基因序列( t e _ 【0 ) 结合，抑制t e t a 的表达；加入t c 后，t c 与t c t r 结合，使 其构象发生改变，从t c t o 上解离下来，表达抑制解除，生成t e t a ，将药物泵出菌体外，细菌发 生耐药。t e t r 可调节其自身基因t e t r 以及四环素他) 抗性基因r a t a 的表达。这两基因分别位于 两侧，在它们之间有一含有重叠启动子控制两个四环素操纵子( t e to p e r a t o r s 。t e t o ) 的核心调节区 域( 图1 1 ) 。t e t r 是由两个2 4 k d 的蛋白亚基组成，通过螺旋一转角一螺旋的构象与两个t e t o 结 合，最终阻遏t e t r 和t e t a 两基因的表达。而基因的诱导是通过t c 结合到t e t r 上，形成t e t r - t c 复合物从而改变了t e t r 的构象使之不能与d n a 结合。这种有效的依赖t c 调节的遗传开关由 于其对能表达一种将t c 泵出细胞外的膜蛋白的阻遏基因组成型表达的选择压力。所以必将会 得到进一步的改进。 图1 1 t n l o 编码的依赖t c 的阻遏系统的遗传结构及调节机制 上图：t e t r 蛋白的大量表达并与两操纵子结合抑制l r t e t r 和t e t a 基因的表达： 下图：t c 同t e t r 蛋白相结合使其无法同操纵区结合，从而t c 抗性蛋白m 得以表达并将t c 泵出细胞外 f i g 1 一1 g e n e t i co r g a r n z a t i o na n dm e c h a m s m o f r e g u l a t i o no f t h e i n l o - - e n c o d e d t c - r e s i s m n c ed e t e r m i n a n t u p p e rp a n e l ：a n t o r e g u l a t o r ye x p r e s s i o no f t a t r ( g r e yc i r c l e s ) i e n d st ot e t rl e v e l st h a t 哪理s s w a n s c 们p t i o no f t e t ra n dt e t ab yb i n d i n gt ot h et w oo p e r a t o r so ia n d0 2 l o w e rp a n e l ：t eb i n d st ot e t 艮 e n f o r c m g1 t sd i s s o c i a t i o nf r o mt h ed n a w h i c hl e s d st ot r a n s c r i p n o no f b o t hg e n e s t c r e s i s t a n c ep r o t e i n t e t a w h , c hi sa ni n t e g r a lm e m b r a n ep r o t e i nt h a te x p o r t st co b to f t h ec e l l i sr e p r e s e n t e db yc y l i n d e 佩 目前，t c t r - t e t o 作用的分子机理已经十分清楚，大肠杆菌转座子t h l o 的两个操纵子t e t o 的 序列( 图1 2 ) 。每一个操纵子均有1 9 b p ，包括1 个核心碱基以及两个反向互补的9 b p 区域。每个 9 b p 的区域中均有5 个碱基能与t e t r 氨基酸n 端的螺旋- 转角螺旋基序直接作用，且特异性非常 2 第l 章文献综述 高，并且在真核生物中t e t r 也能具备这种高度的特异性，因此进一步的改进这t c 依赖的表达 调控系统在高等植物中也将是一种潜在的非常有用的工具。 t e t r 调控系统应答于t c ，当t c 与t c t r 相结合后能改变t e t r 的构象从而改变了其翻译的蛋白 质使其不能有效的与d n a 相结合。并且诱导物t c 与t e t r 之间的高度相关性使该调控系统对诱导 物t c 高度敏感，即使是极其微量的诱导物也能抑制基因的表达。t e t r - t c 复合物的形成使t e t r 的 构象发生改变从而调节四环素调控系统的开关，为发展新型的t c 诱导系统提供了线索。使用突 变体筛选分离得到一在有t c 存在时能阻遏原核基因表达的t e t r 的突变体，这一突变体需要有诱 导物t c 才能有效的结合到四环素操纵子t e t o 上，现已被成功的应用于哺乳动物调节基因的表达， 是一种与t e t r 阻遏系统相反的调控方式嘲。 拿c 三医t a t c 除t 褒会三拿g 除g t01ga t a gaa t a i g ra l c t a t c l t c l 一! p i 卜- - - 一 二暑书j 会互珠2 褒含三会罢冷g c a 0 2 ta g g f g a t a g l t ca l c t a t c l t c l _ _ j i _ j 图1 - 2 t e t 操纵子序列 号碱基代表回纹序列的中心碱基：箭头表示回纹序列5 方框内则代表与t e t r 蛋白直接作用的碱基序列 f i g 1 - 2 s e q u o f t h et w ot e to p e r a t o r s a s t e r i s k si n d i c a t et h ec e n t r a lb po f t h ep a l i n d r o m e ，a i t o w si l l u s t r a t et h ep a l i n d r o n d c n a t u r e o f t h es e q u e n c ea n db o x e s i n d i c a t e b p t h a t m d i r e c t l y c o n t a c t e db y t e t r 在原核生物中，t e t 嗵过与r n a 聚合酶竞争结合到含有t e t 操纵子的启动子区而抑制转录。 这一通过空间位阻调控基因表达的原理在细菌中是非常普遍的机制，但是在真核生物中却很 少见，真核生物大多通过蛋白与蛋白之间的相互作用来激活或者阻遏转录。然而，起初时， 人们通过瞬间表达原生质体试验却证明了这一通过空间位阻的调控模式在真核生物中也可以 应用成功【9 】。两操纵区位于花椰菜花叶病毒c a m v 3 5 s p t o m o t e r 的t a t a 盒侧翼，利用野生型 c a m v3 5 s 启动子控$ 0 t e t r 基因的表达，表达得t e t r 蛋白能有效的阻遏经修饰过的c a m v3 5 s 启 动子，推测可能是由于其干扰了转录起始复合物的装配从而影响了其功能，并且，阻遏可以 通过加入四环素t e 得到解除。 但是，利用这一调控模式将其转基因植物时，却并没有立刻得到有效的表达，表明在目 的启动子整合到染色体中后，目的基因却不能有效表达。据此，人们提出两种建议，首先， 在瞬间表达中3 5 s ：t e t r 能大量的表达t e 取阻遏蛋白。在转基因一个细胞可以表达上百万的t e 喂 阻遏蛋白分子；其次，就是关于操纵区的位置效应。系统分析了2 2 种包含单个的且在不同位 置t e t o 操纵区( 图l - 3 ) ，结果表明t e t r 的阻遏效应与t e t o 操纵区在启动子区的位置有着很大 的关系。例如，当t e t o 操纵区的3 端与t a t a 盒的5 端之间只有1 个碱基，阻遏非常有效； 西南大学硕十学位论文 但当他们之间有3 个碱基时，阻遏效应就大大降低；当达到5 个碱基时，完全没有阻遏效应“。 i s s鲥 4 r ：1f ，：， r 。? 。1 一r r i 1 盈溺霸目髓圈。同匠习 _ _ _ _ _ - _ _ - _ f 1 _ _ _ - _ _ - - _ _ _ r ? 1r 1f = 。， -_m r 。? 。_ 1 c 。，一 r。o r。1。 r 。! 。_ 1 r ! ，_ _ _ _ _ _ _ _ 一 r 。? 1f = 1 一 r 。：。1l = = = 1 一 广_ = 另- 1 丽i 一 i竺：!扣也!型 - o i l _ _ _ = = - - 一= = = 一 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - _ j i - _ _ _ - - 二：二- - - - - - - _ 一- - - - - 一_ _ _ - - _ _ - - - 。_ - - _ _ _ 一 l _ _ _ ；= - ；_ 一- 二= 一 - - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ j - 图1 - 3 通过加或不加t c 处理培养的原生质体检测基因表达 每一个小正方形代表3 5 s 启动子衍生物中从- 2 8 2 到+ 3 0 处的各个碱摹，除了激活序列和t a t a 盒。其他 序列的改变不会影响启动子的活性。黑色、灰色以及白色部分代表1 9 碱基的t e t 操纵区：黑色表示t e t r 对转录具有负调控作用；灰色表示t e t r 对转录具有微弱的负调控作用；白色表示t e t r 不能影响转录在转 基因中，只有三个操纵子相互协调才能起到严紧阻遇作用t s s 表示转录起始位点 f i g 1 - 3e x p r e s s i o nw a sm o n i t o r e da f i e ri n e u b a 6 0 no f p r o t o p l a s t sw i t ho rw i t h o u tt c o n l yt h er e g i o nf r o m2 8 2t o + 3 0o f t h ec a m v3 5 sp r o m o t e rd e r i v a t i v e si ss h o w nw i t t ie a c hb pb e i n g r e p r e s e n t e d b y o n es q u a r e e x c e p t f o r a c t i v a t i n gs e q u e n c e - 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