（海洋生物学专业论文）斑马鱼drsarm基因的克隆与初步功能研究.pdf

斑马鱼o r - s d p d i 基因的克隆与初步功能研究 斑马鱼d r - s a r m 基因的克隆及功能的初步研究 专业：海洋生物学 硕士生：黄鑫 导师：徐安龙教授 摘要 作为一种模式生物，斑马鱼在诸多领域得到研究者的青睐。近几年的积累， 更使斑马鱼成为免疫学研究领域的一颗新星。斑马鱼中发现了高等动物t l r 信 号通路( t 0 1 1 一l i k er e c e p t o rs i g n a l i n g ) 的大多数同源分子，预示着该通路在斑马鱼中 的保守性，但功能方面的研究还有待深入的开展。在实验室建立的杀鲑气单胞菌 ( a e r o m o n a ss a l m o n i c i d a ) 感染斑马鱼的抑制性差减杂交( s u p p r e s s i o ns u b t r a e t i v e h y b r i d i z a t i o n ，s s h ) e d n a 文库中，我们发现了人类含t i r 结构的接头分子 s a r m 在斑马鱼中的同源分子d r s a r m 。s a r m 在线虫中的同源分子已经被证 明参与免疫功能，而最近的研究表明人类s a r m 分子是作为t l r - 3 和t l r 4 介 导的信号通路的一个抑制因子存在的。 d r - s a r m 基因定位于斑马鱼1 5 号染色体，其编码的蛋白长7 1 3 个氨基酸， 具有三个保守的结构域，分别是t i r 结构域( t o l l i n t e r l e u k i n1r e c e p t o r ) ，s a m 结构域( s t e r i l ea - m o t i f ) 和a r m 结构域( h e a t a r m a d i l l o - m o t i 0 。d r - s a r m 分子在进 化上保守，与人类s a r m 的氨基酸同一性高达6 l 。 应用实时定量p c r 的方法，我们研究了斑马鱼d r - s a r m 基因的组织表达模 式，结果显示d r - s a r m 基因在斑马鱼大脑中有相对较高的表达。我们用细菌、 病毒及病原相关分子模式( p a t h o g e na s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a t t e r n s 。p a m p s ) 纯组 分分别刺激斑马鱼，并分析刺激前后d r - s a r m 基因表达模式的变化。实时定量 荧光p c r 结果显示d r - s a r m 基因的m r n a 拷贝数在杀鲑气单胞菌( a e r o m o n a s s a l m o n i c i d a ) 、脾脏肾脏坏死病毒( i n f e c t i o u ss p l e e na n dk i d n e yn e c r o s i sv i r u s 1 1 1 斑马鱼d r - s 4 r m 基因的克隆与初步功能研究 i s k n v ) 以及不同p a m p s 的刺激下均出现不同程度的上调。为了研究d r s a r m 的亚细胞定位情况，我们将d r - s a r m 与绿色荧光蛋白g f p 融合，在h e k 2 9 3 t 细胞中过量表达。绿色荧光显示d r - s a r m 在细胞浆表达，并且在细胞核的附近 有聚集。我们进一步将g f p 与缺失了特征结构域的d r - s a r m 突变体融合，发 现s a m 结构域可能对于d r - s a r m 在h e k 2 9 3 t 细胞中的定位起重要作用。接 下来，我们在h e k - 2 9 3 t 细胞中过表达d r s a r m ，发现其对n f k a p p a b 和斑 马鱼i f n 报告基因均没有激活效应，这一结果与人类s a r m 的情况一致。但是， 当我们将斑马鱼d r - t r i f 和d r - m y d 8 8 分别与d r - s a r m 共转染h e k 2 9 3 t 细 胞时，发现d r s a r m 对两个接头分子激活报告基因的效应都有抑制，这有别于 人类s a r m 特异性抑制t r i f 的现象。虽然这种抑制效应还需要进一步的实验来 证实，但是我们有理由推测在斑马鱼中d r - s a r m 分子的功能可能与入类s a r m 存在差异。 关键词：斑马鱼；d r - s a r m ：t l r 信号通路 l v 斑马鱼d r - s a r m 基因的克隆与初步功能研究 i d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fd r s a r mf r o m z e b r a f i s h ，d a n i or e r i o m a j o r ：m a r i n eb i o l o g y n a m e ：x i n h u a n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o ra n l o n gx u a b s t r a c t a sap o w e r f u lv e r t e b r a t em o d e lo r g a n i s m ，z e b r a f i s h ( d a n i or e r i o ) i sa r i s i n gs t a r t ou n d e r s t a n di m m u n i t y t o l l l i k er e c e p t o rs i g n a l i n gm o l e c u l e sw e r ep r e d i c t e d c o n s e r v e di nz e b r a f i s h h o w e v e r , w oa r es t i l ll a c ko ff u n c t i o n a li n s i g h ti n t ot h e s e m o l e c u l e s h e r e , f r o mo u rs u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) e d n a l i b r a r i e so fz e b r a f i s h ( d a n i or e r i o ) c h a l l e n g e dw i t ha e r o m o n a ss a l m o n i c i d a , w e i d e n t i f i e dat i r - d o m a i nc o n t a i n i n ga d a p t o r ，d r s a r m t h ed r s a r mo r t h o l o gi n n e m a t o d e sw a si d e n t i f i e da l li m p o r t a n tr o l ei ni n n a t ei m m u n i t y o n l yr e c e n t l y , t h e d r - s a r mh o m o l o g u ei nh u m a nw a ss h o w e dt of u n c t i o na sa l li n h i b i t o ro f t l r 3a n d t l r 4s i g n a l i n g t h ed r - s a r mg e n ew a si d e n t i f i e do nc l l r o m o s o m e1 5 ，e n c o d i n gap r o t e i no f 7 1 3a m i n oa c i d sw h i c hh a st h r e ec o n s e r v e dd o m a i n s ：t i r ( t o n i n t e r l e u k i nl r e c e p t o r ) ，s a m ( s t e r i l ea - m o t i f ) a n da r m ( h e a t a r m a d i l l o - m o t i f ) b l a s ts e a r c h s h o w e dd r - s a r m p r o t e i ns h a r e da ni d e n t i t yo f 6 1 w i t hh u m a ns a r mp r o t e i na n d w a sh i g h l yc o n s e r v e de v o l u t i o n a r i l y u s i n gr e a l t i m ep c i lw ef o u n dt h a td r s a r mw a sl l i g l l l ye x p r e s s e di n z e b r a f i s hb r a i nr e l a t i v d ya n dr e s p o n d e d a c t i v e l yu p o nc h a l l e n g ew i t hb a c t e r i a 0 e r o m o n a ss a l m o n i c i d a ) ，v i r u s ( i n f e c t i o u ss p l e e na n dk i d n e yn e c r o s i sv i r u s ，i s k n v ) o rp a m p s ( p a t h o g e na s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a t t e r n s ) ，s u g g e s t i n gt h a td r s a r mm a y v 斑马鱼d r - s a r m 基因的克篷与初步功能研究 h a v ei m p o r t a n tf u n c t i o n si nz e b r a f i s hd e v e l o p m e n ta n di m m u n i t y s u b c e l l u l a r l o c a t i o na n a l y s i su s i n gd r - s a r m - g f pf u s i o np r o t e i ni n d i c a t e dd r - s a r mw a s l o c a l i z e di nc y t o p l a s mo fh e k 2 9 3 tc e l l sa n dh i g h l yc o n d e n s e di nc e r t a i na r e an e a r t h en u c l e u s w ef u r t h e rc o n s t r u c t e dg f pf u s i o nc o n s t r u c t sw i t ht r u n c a t e dd r s a r m p r o t e i n s , s h o w i n gt h a tt h es a md o m a i n sm a y h a v ea l li n d i s p e n s a b l er o l ei nt h i sk i n d o fs u b c e l l n l a rl o c a t i o n o v e r e x p r e s s i o no fd r - s a r mi nh e k - 2 9 3 tc e l l sf a i l e dt o a c t i v en f k a p p a ba n dz e b r a f i s hi f nr e p o r t e rg e n e s ，s i m i l a rw i t ht h en e g a t i v er o l eo f h u m a ns a r m h o w e v e r , o n fp r e l i m i n a r yr e s u l t sf u r t h e ri n d i c a t e db o t ho ft h e d r - t r i fa n dd r - m y d 8 8d e p e n d e n tt l rs i g n a l i n g sw e r en e g a t i v e l yr e g u l a t e db y d r s a r m ，i nc e n t r a r yw i t ht h et r i f - t a r g e t e dr o l eo fh u m a ns a r m a l t h o u g h f u r t h e re x p e r i m e n t sa r en e e d e df o rc o n f i r m a t i o no f0 1 1 1 r e s u l lw ep r o p o s et h a ta u n i q u er o l eo f d r - s a r mm a yb ee x i s t e di nz e b r a f i s h k e yw o r d s ：z e b r a f i s h ；d r - s a r m ；t o l l - l i k er e c e p t o rs i g n a l i n g v i 斑马鱼d r - s a 刎基因的克隆与初步功能研究 缩略语 a m p ( a m p i c i l l i n ) b p ( b a s ep a i r ) e d n a ( c o m p l e m e n t a r yd n a ) c f u ( c l o n e f o r m a t i o nu n i t s ) d e p c ( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ) e b ( e t h i d i u mb r o m i d e ) e e o l i ( e s c h e r i e h i ae o l i ) e d t a ( t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ea c i d ) e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) k b ( k i l o b a s e ) k df k i l od a l t o n ) m i n ( m i n u t e ) m r n a ( m e s s e n g e rr n a ) o r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) p b s ( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ) p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) p e g ( p o l y e t h y l e n eg l y c 0 1 ) r a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d s ) r n a s ea 限n ae n z y n l ea ) r p m ( r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e ) s d s ( s o d i u md o d e c y ls l u f a t e ) s e c ( s e x ：o n d ) t r i s ( t r i s - ( h u d r o x y m e t h y l ) 一a m i n o m e t h a n 曲 t l r d r s a r m 氨苄青霉素 碱基对 互补d n a 克隆形成单位 焦碳酸二乙酯 澳化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 表达序列标签 千碱基对 千道尔顿 分钟 信使r n a 开放阅读框 磷酸盐缓冲液 多聚酶链式反应 聚乙二醇 e d n a 末端快速扩增技术 核糖核酸酶a 每分钟转数 十二烷基硫酸钠 秒钟 三( 羟甲基) 氨基甲烷 t o l l l i k er e c e p t o r 受体家族 斑马s a r m ( s t e r i l ea l p h aa n d h e a t a m a d i l l om o t i fc o n t a i n i n g m o l e c u e ) 蛋白 斑马鱼d r - $ a i 叫基因的克隆与初步功能研究 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指 导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引 用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：豸庭 日期：砷年i 月7 。日 斑马鱼d r - s a p , h 基因的克隆与初步功能研究 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定 机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢 利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室 被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：髫、鑫 日期：可司年f p 月p 日 导师签名： 删：7 ，妒o 日 斑马鱼d r - s a r m 基因的克隆与初步功能研究 i i 模式生物斑马鱼 i i 1 概况 第一章绪论 斑马鱼( 图1 1 ) 属鲤科短担尼鱼属 a n i or e d o ) ，体型纤细，成体长3 - 4 c m ， 纺锤形，稍侧扁，因从头至尾布满深色条 纹而得名。成熟母鱼每隔一周左右可产卵 一次。卵子体外受精，体外发育，孵出后 约3 个月达到性成熟。发育温度要求在 2 5 3 1 之间，对水质无特别要求。 斑马鱼个体小，易养殖，维持费用 图1 1 斑马鱼 也很低，能大规模繁育，且具有胚体透 f i z1 - 1z e b r a f i s h 。d a n i o r e r i o 明，胚胎发育同步等优点，这在一定程 伯弩乏：= 萎：盖：竺瑟芸裔著g 枷 度上弥补了其他经典模式生物( 如线虫， 果蝇，爪蟾及小鼠等) 的不足。关于斑马鱼的研究已有四十多年的历史，美国国 立生物技术信息中心( n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n , n c b i ) 文献 数据库( p u b m c d ) 关于斑马鱼研究文献记载可以追溯到1 9 5 5 年。然而，真正让斑 马鱼受到世界范围关注的是美国俄勒冈大学分子生物研究所从事脊椎动物神经系 统发育的g e o r g es t r e i s i n g e r 教授。1 9 8 1 年，他在n a t u r e 上发表的关于斑马鱼人工 雌核发育的研究论文( s t r e i s i n g e re ta 1 ，1 9 8 1 ) 使斑马鱼开始受到生物学家们的关 注，全面探索的序幕也由此拉开。经过几十年的积累，斑马鱼的研究者们已经积 累了大量的资源，建立了一系列的技术平台。在国际斑马鱼资源中心( z e b r a f i s h i n t e r n a t i o n a lr e s o u r c ec e n t e r ，z i r c ) 等网站f ( h t t p ：z f i n o r g e g i - b i n ) 可以获知这 些资源的详细信息。 斑马鱼o r - s a r m 基因的克隆与韧步功能研究 i i 2 斑马鱼作为研究模型的优势 在体外培养的细胞的基础上建立起的研究基因功能的平台仅仅能提供部分的 信息，生物机体水平才是研究基因功能完整模式。一系列模式生物的建立真是为 了弥补细胞水平研究的不足。这其中，小鼠无疑是目前最理想的实验动物，当然 也存在诸多的不足。 t r e d e 等较详细的综述了斑马鱼做为模式生物的独特优势( 表1 1 ) ，这其中斑 马鱼透明而又极容易获得的胚胎以及与哺乳动物相似的胚胎发育机制成为斑马鱼 作为免疫学研究模型的一大亮点。经过几十年的发展，围绕斑马鱼已经建立了一 系列的功能平台( t r e d e ，e t a l ，2 0 0 4 ) 。斑马鱼胚胎完全透明，神经、肌肉、心脏、 血管、血球在可见光显微镜下清晰清楚，l a n g e n a u 等人成功的构建了t 细胞被荧光 标记的转基因斑马鱼系，观察到了t 细胞发育，迁移等过程( l a n g e n a u ，e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 这一特性也使斑马鱼胚胎成为独特的感染模型，应用荧光标记的病原菌，研究人 员观察到了细菌在斑马鱼体内的复制及巨噬细胞聚集并吞噬细菌的过程( v a nd e r s a t , e la l ，2 0 0 3 ；d a v i s ，e ta l ，2 0 0 2 ) 。此外，斑马鱼体外授精，精子可用e n u 或逆 转录病毒进行饱和诱变( t r e d e ，e ta 1 ，2 0 0 4 ) ，这有利于研究者在较大规模水平筛 选特定表型鱼系用于后续研究。转基因( l o n ge ta ，1 9 9 7 ) ，m o r p h o l i n o k n o c k d o w n ( s u m m e r t o na n dw e l l e r , 1 9 9 7 ) 以及在积极探索q b s i r n a ( d o d de ta 1 ，2 0 0 4 ； b o o n a n u t a n a s a me ta 1 ，2 0 0 3 ) 等一系列技术的相继成熟将有助于斑马鱼成为功能 基因组时代的明星生物。 表1 - 1 模式生物小鼠和斑马鱼的优劣势比较( t r e d e e t a 2 0 0 4 ) t a b l e1 - 1 c o m p a r i s o no f a d v a n t a g e so f m o u s ea n dz e b r a f l s h ( t r e d ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 2 斑马鱼d r - s a h v 基因的克隆与初步功能研究 1 , 2t l r ( t o l ll i k er e c e p t o r s ) 信号通路简介 天然免疫系统是古老的宿主防御系统，在从植物到人类大多数的多细胞生物 中存在。在无脊椎动物中，天然免疫是抵抗病源生物入侵的唯一防线。在高等哺 乳动物中，天然免疫作为机体免疫系统的第一道防线也发挥着重要的作用，不仅 要负责自我一非我识别，还要区分治病微生物和非治病微生物，同时在激活，促 进和协调机体的适应性免疫方面也有重要的作用( a k i r aa n dh e m m i ，2 0 0 3 ；j a n e w a y , p f a l 2 0 0 2 ) 。 有一类称为模式识别受体( p a t t e r nr e c o g n i t i o nr e c e p t o r s ，p r r s ) 的分子在天然 免疫识别过程中扮演着异常重要的角色，这些分子大多由生殖细胞编码( g e r m l i n e e c o d e d ) 。p r r 会被一类称为病源相关分子模式( p a t h o g e na s s o s i a t e x lm o l e c u l a r p a t t e r n , p a m p ) 的组分激活，继而引起机体的免疫反应。p a m p 是在大量病源微 生物中比较保守，并且在宿主中通常不存在的一些分子组分特征。一些典型的 p a m p 包括：脂多糖，肽聚糖，病毒双链r n a 。鞭毛，单链r n a ，去甲基化的 c p gd n a 等( w e s t e ta ，2 0 0 6 ) 。 t o l l 样受体( t l r ) 是表达在树突状细胞和巨噬细胞表面的p r r ( d e l n e s t ee ta 1 。 2 0 0 7 ) ，t l r 的名称源自果蝇中的蛋白分子t o l l 。1 9 8 8 年，研究者在筛选果蝇中与 胚胎极性相关基因的过程中发现该家族的第一个分子，并命名为t o l l ( h a s h i m o t o , e t a 1 ，1 9 8 8 ) 。在果蝇中，t o l l 分子通过调节相关的信号通路，最终导致抗菌肽相关基 因的激活，引起果蝇的免疫反应( l e m a i t r ee ta 1 ，1 9 9 6 ；m e d z l f i t o ve ta 1 ，1 9 9 7 ； h o f f m a n n , 2 0 0 3 ) 。t o l l 和高等哺乳动物的t l r 分子均属于一型跨膜蛋白，胞外片段 含有富含亮氨酸的重复基序( l r r ) ，胞内片段含有t i r 功能域。哺乳动物中，t l r 4 分子最先被克隆鉴定出来。研究发现t l r 4 分子可识另o l p s ，并导致f l d n f - k a p p a l 3 介 导的炎症反应的产生( p o l t o r a k , e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。随着人类基因组测序的完成，人类t l r 家族的成员相继被鉴定出来，目前人类中该家族己发现1 1 个成员( a k i r ae ta1 ， 2 0 0 6 ) 。这些成员结构类似，但在功能上不尽相同，它们通过识别不同的p a m p ，激 活各自迥异的下游信号通路，引起特异的免疫反应，以应对不同病源微生物的感 染( a k i r ae ta1 ，2 0 0 6 ) 。人类t u t 家族分子功能的逐步揭示在全世界范围内掀起了研 究t l r 分子及天然免疫系统的热潮。这一家族分子也引起了比较免疫学家的兴趣， 不同物种中的t l r 分子相继被克隆鉴定出来，众多的实验数据证明t l r 分子在进化 3 斑马鱼d r - s a r m 基因的克隆与初步功能研究 上是一类非常保守的分子 ( p u r e e l le ta l ，2 0 0 6 ：t a k e d a ，2 0 0 5 ：b e u t l e re ta 1 ，2 0 0 2 ) ，其 功能在进化过程中的分化与演变至今仍是各国学者研究的热点。 1 3 在t l r 介导的信号通路中起关键作用的接头分子 t l r 通过胞外的l r r 区分不同的p a m p ，进而引起胞内功能域的构象变化， 募集胞内一到两个接头分子。受体与接头分子的结合可进一步激活相关信号通路 导致核因子n f - k a p p a b a p 1 或者干扰素调节因子i r f 3 7 。这些因子的激活有效的 促进天然免疫系统对于入侵宿主的防御，并在一定程度上激活适应性免疫系统 ( a k i r a , e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 目前研究者在人类中共发现了五个参与t l r 信号通路的信号分子，包括 m y d 8 8 ( m y e l o i d d i f f e r e n t i a t i o n p r i m a r y - r e s p o n s e g e n e8 8 ) ，m a l ( m y d 8 8 一a d a p t o r - l i k e p r o t e i n ) , t i u f ( t i r - d o m a i n - c o n t a i n i n ga d a p t o rp r o t e i ni n d u c i n g 疆n m ， t r a m ( t r i f - r e l a t e d - a d a p t o rm o l e c u l a r ) 以及s a r m ( s t e r i l ea a n da r m a d i l l o - m o t i f c o n t a i n i n gp r o t e i n ) ( o n e i l la n db o w i e , 2 0 0 7 ) 。t l r 信号传导的关键结构是存在于所 有t l r 分子胞内区的t i r 结构域( t o l l i n t e r l e u k i n - 1 ( i l - 1 ) r e c e p t o r f r m ) d o m a i n ) 。这 一结构域同样存在于接头分子的结构q b ( o n e i l l ，2 0 0 0 ；m e d z h i t o ve ta l ，2 0 0 1 ) 。同 t l r 分子类似，这些接头分子在不同物种间是相当保守的。人类中s a r m 分子的 功能最近被揭示出来( c a t t y , e ta 1 2 0 0 6 ) ：s a r m 与t r i f 相互作用，并对t r i f 的 功能进行干涉。至此，人类基因组中所有含有t i r 结构域的接头分子的功能都或 多或少的浮出水面。研究者推测，在t l r 信号通路中，受体分子和接头分子是通 过共有的t i r 结构相互作用并传递信号的。配体分子与受体分子同源或异源的多 聚的结合，被认为导致了结合后受体分子的构象的改变，而这种改变为接头分子 与受体分子的结合创造了机会或者说这种构象的改变导致了受体分子与接头分子 的结合，进一步引发了下游的信号传导( b r o w ne ta 1 ，2 0 0 6 ；n u n e ze ta 1 ，2 0 0 7 ； t o s h e h a k o ve ta 1 ，2 0 0 7 ) 。五个受体分子中，除s a r m 以外，对整个信号通路都起 者正调控的作用。这一水平的信号通路又可大致分为m y d 8 8 依赖型和m y d 8 8 非 依赖型( a k i r a e ta ，2 0 0 6 ) 。m y d 8 8 是第一个被发现的接头分子( l o r de ta 1 。1 9 9 0 ) ， 实验证明大部分受体分子引起的信号传导都需要接头分子的m y d 8 8 的参予 ( w e s c h ee t a l ，1 9 9 7 ；m e d z h i t o v e t a l ，1 9 9 8 ) 。t r i f 是m y d 8 8 非依赖型信号传导中 4 斑马鱼d r - s a r m 基因的克隆与初步功能研究 起作用的接头分子，t l r 3 与t r l f 而不是m y d 8 8 结合成为所有t l r 分子中的另 类( y a m a m o t oe ta 1 ，2 0 0 2 ；o s h i u m ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。另外，t r i f 通过t r a m ( f i t z g e r a l d e t a l ，2 0 0 3 ) 参与了经由t l r 4 的信号传导。m a l ( h o r n g e t a l ，2 0 0 1 ；f i t z g e r a l de t a l ， 2 0 0 1 ) 和t r a m 作为接头分子不能独立的起作用( s h e e d ye ta l ，2 0 0 7 ) ，前者作为桥 梁分子介导t l r 2 或者t l r 4 与m y d 8 8 的相互作用( h o m g ，e ta l ，2 0 0 2 ；f i t z g e r a l de t a 1 2 0 0 2 ) ，后者被认为作为t r i f 分子的桥梁分子特异性参与t l r 4 信号传导 ( y a m a m o t o e ta 1 ，2 0 0 2 ；o s h i u m ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。而最近的研究发现，s a r m 是唯一一 个对t l r 信号通路起负调控的接头分子( c a t t y , e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 图l - 2 含t i r 结构域的接头分子结构示意图( 引自o n c i l l le t 以，2 0 0 7 ) f i g 1 - 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f a r c h i t e c t u r e so f t i r - d o m a i n - c o n t a i n i n ga d a p t o r s ( o n e i l l le ta 1 ， 2 0 0 7 ) 斑马鱼脚q 栅基因的克隆与初步功能研究 图i - 3t l r 信号传导网络( 引自o n e i l le ta ，2 0 0 7 ) f i g 1 3t l rs i g n a l i n gn e t w o r k ( o n e i l le l 出2 0 0 7 ) 1 4s a r m 分子的研究进展 人类中s a r m 分子早在2 0 0 1 年就已经被克隆出来( m i n ke l a ，2 0 0 1 ) ，但一直 以来，作为极可能是t l r 信号通路中最后被发现的接头分子，其功能研究一直不 是很顺利。直到2 0 0 6 年c a r y 等才取得了实质性的突破( c a r r y , e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。作为 t l r 通路中含t i r 结构域的五个接头分予中唯一一个起负调控作用的分子，s a r m 成为t l r 通路研究的又一热点。 1 4 1s a r m 分子的发现 2 0 0 1 年，m i n k 等人( m i n ke ta 2 0 0 1 ) 利用生物信息学的方法搜索到果蝇蛋白 c g 7 9 5 1 ( a c e s s i o nn o a a f 5 0 4 9 1 ，该记录己被更新。) 引起他们兴趣的是，该蛋 白序列中含有一种独特的结构域组合，s a m s ( s t e r i l ea - m o t i f s ) 和a r m ( h e a t a r m a d i l l o - m o t i f ) 结构域( r a m a c h a n d e re ta 1 ，2 0 0 4 ；k i me ta ，2 0 0 3 ) 。s a m 结 构域分布广泛，进化上保守，从酵母到高等哺乳动物中都有发现。从含有s a m 结 构域分子的功能来推断，s a m 的功能也成多样化的趋势( k i me ta 1 ，2 0 0 3 ) 。因此仅 6 斑马鱼d r - s 脚基因的克隆与初步功能研究 仅通过s a m ，我们无法推知该分子的功能。a r m 结构域( c o a t e se ta t ，2 0 0 3 ) 是长 约5 0 a a 的随机重复序列，同s a m 类似，该结构域进化上高度保守，在真核生物 中广泛存在。但在当时，并没有报道t i r 结构域的存在，目前己更新过的a a f 5 0 4 9 1 的注释中已包含了t i r 结构域( o n e i l le ta 1 ，2 0 0 3 ；w e f t se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。m i n k 等进 一步搜索到了人类中相应的同源体存在的证据。该基因的部分c d n a 序列存在于 n a g a s e 等报道的人类大脑的文库中( n a g a s ee ta 1 1 9 9 8 ) 。m i n k 等继而完成了对 s a r m 基因的克隆和初步的鉴定。人类s a r m 基因定位在1 7 号染色体长臂l 区1 带( m i n ke t 以，2 0 0 1 ) 。该区域基因密度很高，在进化上保守。s a r m 基因最早的 e d n a 在人类脑文库中发现，但m i n k 等的实验结果却显示s a r m 基因在肝脏和肾 脏中特异表达( m i n ke ta ，2 0 0 1 ) 。 1 4 2s a r m 分子的功能探索 对s a r m 分子功能研究的突破是在线虫中。l i b e r a t i 等和c o u i l l a u l t 等几乎同 时报道了线虫中与人类s a r m 分子同源的t i r 1 参与线虫免疫调节的功f 1 ( l i b e r a t i e t a t ，2 0 0 4 ；c o u i l l a u l t e t a l ，2 0 0 4 ) 。t i r - 1 发现使s a r m 分子成为t l r 通路中进化 地位最古老的接头分子，其他四个接头分子在线虫中均没有相应的同源体。t 1 r 结 构域被证明广泛存在于参与机体先天免疫的重要通路t l r 信号通路中。线虫中仅 有t o l - i 和t i r - i 含有t i r 结构域( h a r r i s ，e ta 1 ，2 0 0 3 ) ，这一发现使研究者很自然 的猜想t i r - i 在线虫的免疫防御体系中起着特定的功能。 l i b e r a t i 等报道了t i r - 1 分子五种不同的剪接形式，它们都含有s a m 和t i r 机构域，只是n 端序列长短不同( l i b e r a t ie ta t 。2 0 0 4 ) 。令人惊异的是t i r 1 和人类 s a r m 分子的同源性相当高，s a m 和t i r 结构域区域的氨基酸相似性达到6 3 。 l i b e r a t i 等揭示t i r 1 在线虫对抗革兰氏阴性和阳性菌的过程中至关重要，他们迸 一步揭示了t i r 1 在p m k - 1 信号通路的上游起作用( l i b e r a t ie ta 1 2 0 0 4 ) ， p m k - i ( k i me ta 1 ，2 0 0 2 ) 是哺乳动物p 3 8 m a p k 的同源分子，已被证明是线虫天然 免疫的重要调节分子。该研究组同时证明人类s a r m 分子在细胞中过量表达对 n f k a p p a b ，i r f 3 都没有激活( l i b e r a t ie ta 1 ，2 0 0 4 ) ，预示着s a r m 分子迥异于另 外四个接头分子的功能。c o u i l l a u l t 等则证明了t i r 1 在线虫抗真菌感染的过程中 是不可或缺的，进而发现用r n a 干扰的方法将t i r - 1 沉默之后，相应抗菌肽的表 7 斑马鱼脚q 删基因的克隆与初步功能研究 达量降低，都表明t i r - 1 是线虫先天免疫防御系统的重要组成部分( c o u i l l a u re ta l ， 2 0 0 4 ) 。 2 0 0 6 年，c h u a n g 的研究组发现，t i r - 1 的功能并不局限于免疫方面，在调节 神经系统发育方面也有重要的功能( c h u a n g , e ta l ，2 0 0 5 ) 。t i r - 1 通过影响线虫中的 m a p k 通路，调节神经元嗅觉受体的表达。研究组首次报道了t i r l 的不同结构 域功能的差异。t i r 结构被认为在信号传导中起作用，s a m 结构对分子在线虫体 内的定位至关重要，而n 端序列则显示具有负调节的作用( c h u a n g , e t a l 2 0 0 5 ) 。 人类s a r m 分子自发现以来，其做为接头分子在t l r 信号通路中的功能一直 是个迷。c a r y 等人无疑在这方面取得了不小的突破( c a t t y , e t a l ，2 0 0 6 ) 。l i b e r a t i 等 证明了s a r m 分子对于n f k a p p a b ，i r f 一3 的激活没有任何作用，c a r y 等则在研 究该分子与其他接头分子的相互影响过程中发现了s a r m 能够特异性的阻断t r i f 介导的通路( c a t t y , e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。他们首先验证了l i b e r a t i 等人的结果，但是发现外 周血淋巴细胞( p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a r s ，p b m c s ) 经l p s 刺激后，s a r m 基 因的表达量大幅上调( c a r r y , e ta ，2 0 0 6 ) 。一些含有t i r 结构的t l r 信号通路的抑 制因子，如s t 2 ，s i g i r r 等，同样存在这样的情况( l i e w e t a l ，2 0 0 5 ) 。研究者准 确的推断s a r m 分予极可能具有相似的抑制功能。深入的研究为我们提供了 s a r m 分子的功能模型( 图1 _ 4 ) 。s a r m 作用于t l r 3 和t l r 4 信号通路( c a t t y , e t a 1 ，2 0 0 6 ) ，两支通路的激活都能导致c c l 5 ( r a n t e s ) ( a k i r a , “a 1 ，2 0 0 6 ) ，i f n - f l 和肿瘤坏死因子t n f 的表达。t l r 4 通过桥梁分子t r a m 与t r i f 结合最终可致 干扰素调节因子i r f 3 等效应分子的激活。t l r 3 可与t r i f 直接作用介导下游信 号传导。简化的模型可以理解成，细胞在静息状态下，s a r m 与t r i f 有微弱的相 互作用，在p a m p 分子( l p s