（分析化学专业论文）高效液相色谱法测定茶叶中的黄酮醇.pdf

摘要 摘要 茶是世界上消费最广泛的非酒精饮料，经常饮荣有利于身体健康，这是由 于茶中含蠢大量的抗氧化物质，主要是黄烷醇( j h 蘩索类物质) 和黄酮磐等，两 露羹鳇黄黧黪主要寿稼簿素、搬旋索窝由奈酪。 本文试图采用高效液褶色谱法对五类中国茶所涉及的多种茶叶中的黄酮醇 含量进行分离测定和比较，并对可能引起黄酮醇含蠛差异的原因进行初步分析。 本文研究了高效液相色谱法分离测定茶叶中黄酮醇的色谱条件，在文献工 终戆基礁上，遴过在浚凄耀中热入2 戆强氢狡穗，成秘遮分离及溺定了荼野样 品中抟三种黄舔醇。 茶叶的预处理茶叶中黄酮醇糖配物的水解条件，对茶叶中黄酮醇的测 定影响很大。本文对茶叶中黄酮醇糖配物的水解条件进行了比较详细的实验研 究，得到了不同静类荼时豹优化的水磐条件，为h p l c 分离鼹定茶时中的黄醣醇 餐遥了条 拳。 本文柱测定多种茶叶样品的基础上，对三种黄酮醇的分布规律进行了探讨， 在绿茶中，l 山条酚是主要的黄酮醇，其次是槲皮索，杨梅素；除了乌纰茶以外， 其它茶叶中杨梅素在总黄酮醇的禽量均不超过2 0 ，甚至没有。 绿茶楚簸爱镶拷蓑鬓萘时零来往矮戆一秘茶，零文磅究认为，狳了茶吁嚣 培育种类外，西照是影响绿茶审黉酮醇含量酶主要麟索之一；而在发酵茶类中， 如黄茶、级荣、普洱茶以及乌忿茶，黄酮醇的含鬃报大程度上决定于生产工艺。 我们初步认为，在本文的研究条件下，h p l c 分离测定到的茶叶中的未知组 分( 未知蜂1 ) 与杨梅素有一定关系，因为在未知蜂l 含量缀低豹岛龙蕊中，扬 梅素含囊铰麓。未知峰1 戆住学结构有符遂一步繇究。 关键词；茶，黄酮醇，高效液相色谱 成都理工夫学矮学经论文 a b s t r a c t i ti sw e l lk n o w nt h a tt e ah a sm a n yb e n e f i c i a le r i e c t st oc o n s a n l e r s h e a t h 。a n dt h e p o s s i b l er e a s o nm a yb ee x i s t e n c eo fm a n ya n t i o x i d a f i v e si nt e a ，s u c h 鑫sc a t e c h i n s ( m a i n l yf l a v a n o l s ) a n df l a v o n o l s 。t h e r ea r em a n yr e p o r t sa b o u tc a t e c h i n si nt e a ，b u t m u c hl e s sa b o u tf l a v o n o l s a n dt e a sf r o md i f f e r e n tg e o g r a p h i cr e g i o n so ro fd i f f e r e n t c l a s s e sc o u l dh a v em u c hd i f f e r e n c ei nf l a v o n o lc o n t e n t s c h i n a , a sab i gt e ae x p o r t e l p r o d u c e sv a r i e t i e so f t e a si nm a n yr e g i o n s i nt h i sa r t i c l e ，f l a v o n o lc o n t e n ti na b o u t4 0 t e a sf r o m1 2p r o v i n c e so fc h i n aw e r ed e t e 矗n i n a t e da n dc o m p a r e d ，a n dt h ep o s s i b l e r e a s o n sw e r eg i v e n k a e m p f e r o lw a st h em a i nf l a v o n o ti ng r e e nt e a s a n dm y r i c e t i ni n t o t a lf l a v o n o lc o n t e n td i d n te x c e e d2 0 ，e v e nn o n e ，e x c e p ti no o l o n gt e a s s u n l i g h t h o u r sa n dc u l t i v a r sp l a y e da r ti m p o r t a n tr o l ei nf l a v o n o lc o n t e n ti ng r e e nt e a b u ti n f e r m e n t a t i o nt e a s ，i e ，y e l l o w , b l a c k ，p u e r , a n do o l o n gt e a ，p r o d u c i n gp r o c e s sw a s d e c i s i v e w ea l s ob e l i e v e d 攮戤t h e r ew a sac o m p o u n dh a v i n gm u c ht od ow i t h m y r i c e t i n , w h i c hl e a d e dt ot h eh i i g hc o n t e n to f m y r i c e f i ni no o t o n gt e a a tt h es a m et i m e ，c h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sa n df l a v o n o lh y d r o l y s i sc o n d i t i o n s w e r e 鼬r t h e ro p t i m i z e da sw e l l w es e p a r a t e dt h r e ef l a v o n o l ss u c c e s s f u l l yb ya d d i n g 2 t h fi ne l u a n t t h u sm a k i n gt h ed e t e r m i n a t i o no ff l a v o n o l si nt e a sb yh p l c p o s s i b l e 。b e c a u s et h ep r e t r e a t m e n to ft e as a m p l e s 疼a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nt h e p r o p e rd e t e r m i n a t i o no f f l a v o n o t s ，w ep a i dm u c hw o r ko nt h eh y d r o l y s i so f f l a v o n o l s t og a i no p t i m u m h y d r o l y s i sc o n d i t i o n so f d i f f e r e n tc l a s s e so f t e a s + k e yw o r d s ：t e a ；f l a v o n o l ；h p l c i 第一章引言 第一章引言 l 。l 碜究意义 常见的黄酮酵主要包括杨梅素、槲皮素和山奈酚等三种化合物。黄酮醇其 有很强靛抗氧化憩力，并幽此具有一系列的生理作用，此类化合物可以影酾氧 自由鏊的形成和脂类过氧化，而这两类物质与动脉硬化、癌症、慢性炎症以及 冠心瘸有关；黄嬲醇还具肖屏蔽u v - b ( 2 8 0 31 5 n m ) 的功能( 主要针对陆生 植物) ，对鼠的研究证明，槲皮素对瀚物也有抗紫矫线的功能。 茶叶是人体摄入黄酮孵的主要食物来源，而且有报道认为，每天饮用一定 量的茶可以穰丈程度上降低得癌症瓣风险。蠡予植耪中的黄醺类纯台物静食鲎 因其种类、产地的不同而赎有很大的差异，因此比较不同种类、产地茶叶中黄 酮醇黪含量并瑟释其滠毽鬟有重大惑义，这对食品秘学、营养鹈攀骞一定豹参 考价慎。 1 2 研究现状 l 。2 。1 荚手荼时 1 2 1 1 茶叶及蒜分类 茶起源于中溪，中国跫世界上最早发现茶挝和利用茶树豹国家，茶挝熟学 名为c a m e l l i a s i n e n s i s l ， s i n e n s i s ”就是拉丁文中国的意思。在植物分类系统中， 茶树属被子植物门( a n g i o s p e r m a e ) ，双子叶植物纲( d i c o t y l e d o n e a e ) ，原始 花被驻纲( a r c h i e h l a m y d e a e ) ，由茶酲( t h e a l e s ) ，由茶科( t h e a c e a e ) ，山 茶属( c a m e l l i a ) ，目前，大量栽培应用的茶树的种名一般称为c a m e l l i as i n e n s 担， 也旁人称为t h e a s i n e n s i s ，隶l 茶的原拳睾瓣是茶树静芽时，帮茶穗静薪穰。 中国茶类的划分目前尚无统一标准。根据制造方法的不同和潞质上的熬异 ( 主要是茶时袋茶汤懿颜怨) ，茶爵戳分受绦蓉、荭茶、乌龙荼( 毒茶) 、叁 茶、赞茶和黑茶六大类q 畿器上7 8 魏茶时矮予生产数蒺，主要为嚣方国家疑滇费，2 0 竭予生产 绿茶，主要为豫洲和北非豳家所消赞【2 】。 茶是世界上消费最广躲非酒精饮料。茶具骞降低服豳醇水平、降血压、技 成都理王大学顼士攀往论文 氧化、撬藏、撵销心盘管疾瘸霸癌瘕懿功效犯q l 。中药采溪荼来浚疗头疼、箨韵 消纯、掇稀、解毒、增强免疫力、甚至逛年蕊寿嘲。 1 2 。1 。2 茶哼戆纯擎成分 蘩时瓣纯攀减分卡努爱杂( 详鬟廉l 1 ) ，嚣磷突泌较多豹是j l 茶豢类、黄 溺醇、蜘琏 围、装碱、茶夔素( 茶越索灏茶筑豢) 等。 袭1 - t 毅鲜茶芽韵化攀戏努“ t a b l e1 - 1 ，c h e m i c a lc o m p o n e n t so f f r e s ht e as h o o t s 仡裔物含堪( 予煎，) 惑多麓( t o t a lp o t y p h e n o l s ) 2 5 3 0 。黄烷醇、儿茶豢类( f l a v a n o l s )2 0 3 0 黄舔簿与其糖醚物( f l a v o n o l sa n df l a v o n o lg l y c o s i d e s )3 v 4 藏毒索( l e u c oa n t h o c y a n i n s )2 3 酚酸( p o l y p h e n o l i ca c i d sa n dd e p s i d e s ) 3 a l 濑肆溺( c a f f e i n e ) 。 3 4 f 谣弼辙( t h e o b m m i n e ) 0 ，2 i 茶碱( t h e o p h y l l i n e ) o 5 l 蟹蕊酸( a m i n oa c i d s ) d 5 f 霄机黢( o r g a n i ca c i d s ) 0 ，5 o ，6 | 单糖( m o n o s a c c h a r i d e s ) d 5 l 多糖( p o t y s a c c h a r i d e s ) 1 4 2 2 f 纤维繁、半纤蠛素( c e l l u l o s ea n dh e m i c e l l u l o s e )4 7 l 胶矮( p e c t i n s )5 6 l 术质素( l i g n i n ) 5 6 i 蛋融质( p r o t e i n ) 4 1 7 i 脂耪( l i p i d s ) 3 5 | 时绿索及其它色素( c h l o r o p h y l l sa n de t h e r p i g m e n t s ) 0 5 o 。6 | 矿物质( a s h ( m i n e r a l s ) )5 6 l 簿发瞧戆缓( v o l a t i ! e s )0 。0 l 0 ，0 2 l 。2 2 黄酮类乓艺金物及饕龚冀醇 1 2 。2 1 黄潮类纯合妨翡分类藏生联谗建 黄酮类化合物按其结构弼以分为1 3 类，撵见袭1 2 1 们。 2 第一牵；| 蠢 表1 - 2 黄戮类鬟：舍榴酌结秘 t a b l e 1 - 2c h e m i c a ls t r u c t u r e so f f l a v o n o i d s 黄酮类化合物( f l a v o n o i d ) 基本结构 套耳酿( c h a l c o n e s ) 二氢查耳弱f d i h y d r o c h a l c o n e s ) 撩飘( a u r o n e s ， 黄酗( f l a v o n e s ) 黄醺簿( f l a v o n o l s ) _ = 蟹黄醚簿( d i h y d r o f l a v o n o t s 黄烷酮( f l a v a n o n e s ) 黄婉醇( f l a v a n o l s ) 黄烷= 醇( f l a v a n d i 0 1 ) 诧海素，花色素( a n t h o c y a n i d i n ) 异黄酮( i s o f l a v o n o i d s ) 二黄酮( b i f l a v o n o i d s ) 潦花色素( p r o a n t h o c y a n i d i n s ) 喵瞬b 3 粥 成都理工大学硕士学位论文 臭氧层是外部的紫外线屏蔽物质，可以吸收u v c 和部分的u v - b ，酚类 物质则是由于受紫外线的作用而在植物体中开始出现，随着植物从水生到陆生， 复杂的多酚开始出现，植物从低级到高级的演化需要内在的屏蔽u v 的能力， 在这方面多酚起着重要作用【7j 。 目前已发现的酚类化合物( 多酚) 有8 0 0 0 多种，而黄酮类化合物即是多酚 的一种，至1 9 9 0 年，已发现5 0 0 0 种以上的黄酮类化合物 8 】。 1 9 3 6 年，r u s z n y a y 和s z e n t g y 6 r g y i 发现两种黄烷醇的混合物可以增强体 质，并命名为维生素p ，然而，这个名字最终被弃用，因为黄酮类化合物并不 符合维生素的定义。大量的体外研究证明，黄酮类化合物可以抑制或诱发哺乳 动物的一系列酶系统，而这些酶与一些重要的酶促反应有关，如调节细胞分裂 和繁殖、血小板凝聚、解毒、消炎、免疫响应等 9 。黄酮类物质具有的生物作 用还有抗氧化、螫合金属离子、抗风湿、抗癌、抗菌、消炎、抗过敏、抗病毒、 抗动脉硬化等【1 0 “】。 黄酮类物质抑制机体突变能力的顺序依次为黄酮醇( 槲皮素，山奈酚) 、黄 酮、黄烷酮、花青素。而异黄酮、酚酸( 五倍子酸) 和黄烷醇的抑制作用很小 或没有。同时，糖配物的活性相对小于单体的活性口”。 黄酮类化合物除了作为生化标记物外，在植物中还起着其他重要作用，如保 护植物防止昆虫和病原体的入侵，调节植物正常生长等【l 引。 由于黄酮类化合物的结构及存在状态的不同，其溶解度存在很大差异，一 般游离苷元( 即单体) 难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚 等有机溶剂及稀碱液中，而黄酮苷类一般溶于水、甲醇、乙醇等极性强的溶剂 中。其提取方法一般采用溶剂提取法 i 4 1 。 1 2 2 2 黄酮醇的分类和生理作用 常见的黄酮醇有三种，即杨梅素、槲皮素和山奈酚，其结构见图1 1e ”】。 杨梅素( m y r i c e t i n ) ：3 ，3 。，4 ，5 ，5 ，7 一六羟黄酮( 3 ，3 ，4 ，5 ，5 ，7 一h e x a h y d r o x y f l a v o n e ) ，分子式：c 1 5 h l o o s ，分子量：3 1 8 2 4 ，熔点：3 0 0 ，黄色粉末。 槲皮素( q e r c e t i n ) ：3 ，3 ，4 ，5 ，7 一五羟黄酮( 3 ，3 ，4 ，5 ，7 一p e n t a h y d r o x y f l a v o n e ) ， 又名：栎精，槲皮黄素，分子式：c 1 5 h 1 0 0 7 ，分子量：3 0 2 ，2 4 ，1g 溶于2 9 0m l 无水乙醇或2 3m l 沸乙醇，溶于冰醋酸，几乎不溶于水，二水合物为黄色针状 4 第一章； 富 结晶。 山求酚( k a e m p f e r 0 1 ) ：3 , 4 ，5 ，7 - 四羟黄酮( 3 ，4 ，5 ，7 一t e t r a h y d r o x y f l a v o n e ) ，又 名山奈索或莰非酵，分子式：c 1 5 h l 0 0 6 ，分予黧：2 8 6 2 3 ，黄色粉束。 h o o h r 2 杨梅素：r i ：r 2 = o h 槲皮素：r 1 = o h r 2 = h 山奈酚：r i = r 2 = h 豳1 - 1 茶叶中常见黄醐醇的结构 f i g 1 - 1 c h e m i c a ls t r u c t u r e so f f a m i l i a rf l a v o n o l si nt e a 黄熬簿熬生理佟震与焚糕羹纯台蘩基本秘纭。黄臻醇哥滏潼滁氧鑫由基， 因此舆有很强的抗氧化能力，其中对槲皮素的研究为最多。黄酮醇舆有抗衰老、 保护缺肌心肌、降血脂、增加冠状脉血流量、降压、抑制血小板聚集、免疫抑 制等功熊，黄酮醇还具有赘合金属离子、抗自由基、抗氧化、抗溃疡、抗癌、 撬耱藤瘸并发疰等多耪生魄添瞧及药理终用，对呼设道疾病，姆耀是哮囔痍、 支气警炎有较好于搴瑶母f1 3 , 1 6 i 9 j ；此外，黄酮酵还其有屏蔽u v - b 懿功能( 主要 针对陆烘植物) 7 1 。 黄酮醇的分布相当广泛，如蔬菜：洋葱，椰菜；水果：苹果，浆果( 葡萄， 嚣红柿) ；饮料：茶，红葡薅涎。两黄酮醇研究酶主要对象是中肇翡，露银杏、 撬来等，疆及上述戆蔬蘩、窳果、锾瓣等，邋年来豹磅究已逐步渗及蠢浆样品 的分丰斤，来研究黄酮醇在体内的吸收、代谢及生理作用。 在槭物型食物中黄酮醇和黄酮仅以糖配物的形式存在，即与糖潦结合起来， 糖分子可以连接在母体黄翻炭化合物( 即单体) 的不同位置上，谯撼物内的黄 黧类化会襞中已经发瑗怒避8 0 耱懿糖类，连接在环上豹整雯龟鸯缎多，毽j 邃， 在自然界中已经发现了1 7 9 稃的槲皮素的糖配物( w i l l i a m sa n dh a r b o m e ，1 9 9 4 ) ， 而在磐遇的食物茶中也不例外的发现了多种的糖配物。黄酮醉的主要食物 来源怒浆( 占总摄入量的4 8 ) ，然后是洋葱( 2 9 ) ，苹果( 7 ) ，摄入量为 2 3r a g d a y ，其中穰皮素为1 6m g d a y l 9 。 成都瑷工大学硕士学位论文 黄酮类物质在植物中大多以耱配物的形式存在，矮常见的糖基化位趱楚3 位，然后是7 位，葡萄糖是最常见的糖基，其它的迩包括半乳糖、鼠孝糖、术 糖等。而且，簿类黄酮类物质单体问的差异主要是鼹容易发生羟基化的3 、4 位上羟基豹数嚣帮分布嘲。 黄酮类搦鬟竣易发生糖萋纯鹣部位蹩e 3 ，然后楚c 5 ，c 7 ，c 4 ，糖蘩亿产物 也就是黄酮醇水解前的母体。槲皮素的吸收可能受所结合糖基的影响，例如：洋 葱中槲皮索的吸收率为5 8 ：u 1 5 ，纯槲皮素的吸收辩为3 4 士9 ，而芸褥瞥的吸 收率仅为2 8 士1 5 。 1 2 。3h p l c 法测定荼秘孛黄藜蘸戆綦嚣瓷臻凝 在黄酮醇的研究中，i c e 和w e n d c r ( 1 9 5 3 ) 使用了吸附色谱( a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y ) ，v o d f r i e d r i c h 和s c h 6 n e r t ( 1 9 7 3 ) 使用了纸色谱( p a p e r c h r o m a t o g r a p h y ) 和薄层色谱( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y , t l c ) ，s t i c h e r 镶( 1 9 7 9 ) 幢臻了毫效液稳色谱( h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ) ，搬蠢气 稿色谱( g a sc h r o m a t o g r a p h y ，g c ) 黪傻蘑，近年来还滋蠛了毛绥管毫滚( c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 2 0 - 2 2 1 ，以及模拟移动床色谱( s i m u l a t e dm o v i n gb e d c h r o m a t o g r a p h y ，s m b c ) 矧，趔临界色谱( s u p e r c r i f i c a lf l u i dc h r o m a t o g r a p h y , s f c ) 2 4 1 ，在这些方法中，以h p l c 豹使用最为广泛、最为成熟。 h p l c 与以往装分离技术鞠魄，其往点是其弯缀强懿分离麓力，h a s | e r 等澄1 使用反相梯度h p l c 法成功分离了银杏叶提取液中的3 3 种黄酮瞢、黄酾醇以及 二黄酮，得到的色谱图中样品与参考物质的色谱峰熙配得很好。 对黄酮醇较早的研究是由h e r t o g 等【2 印完成的，测定了包括洋葱，越桔等五种 食物中兹委秘鼗醒帮黄酮醇( 毡戆秘擦素，擞受素，匝寒酚) ，饶讫了撼敬移承 解静条件；黢的静类及其浓度、带醇浓度、反应辩麓以及标准储备液的稳定性， 糖配物在水中稳定，而单体在甲酥中更稳定。 1 2 3 1 黄酮醇糖配物的提取 由于黄潮醇在植物中基本上以糖配魏的形态存在，因此崧须先将其从植物 孛疆取蠢采，然嚣方驻迸一步斡承解褥至l 黄酮醇，逡行溺定。对于霾傣群器， 采样后，一般先风干或冻干，然尉粉碎( 粉碎程度对黄酮醇的回收影响很大 2 9 】) ， 提取一般根据样品的不同采用不同浓度的甲醇或乙醇水溶液2 9 ，3 0 ( 例如，在 6 篝一章；| 言 提取越稽的叶子时，宣使藤8 0 或纯的甲醇，雨农摄取越秸的茎时，国于茎的 糖基化程殿熙大，宜使用5 0 的甲醇水溶液 2 0 】) 。也有采用超临界c 0 2 提取， 加入一定比例的乙醇作为改性荆，但总的提取效聚逐是索氏提取纭、川灯2 8 】。 对滚抟样品( 如葡萄灌) 蠢言，爨没有提取熬步骤，直接进行永麟。 l 232 簧瀚醇糖配耱酶拳鼹 由于赞酮醇的糖配物种搽繁多，如果对每一种糖配物都进行测定怒不可能 的，因此，在黄酮醇的测定中般先水解为其单体形态。 水解中应特别注意的是求解产物的保护( 一般采用惰性气体保护法，如氮 气 2 0 i ，或热入魏氧经裁，魏摭环鑫酸 3 0 1 ) 。一般袋瓣酸拳簿，纛在巍浆弹瑟兹 水解中多采踊酶水解( 6 ，葡萄糖营酸酶( 3 - g l u c u r o n i d a s e ) ( 或1 3 - 葡籀糖替酸酶 中加入硫酸酯酶( s u l f a t a s e ) ) 3 3 1 ，在进入h p l c 柱前通过膜过滤器( 0 2 m 或0 , 4 5p m ) 。由于黄酮醇在常濑下不稳定，水解厝的存放将不利于其阐收。 l 。2 。3 。3h p l c 分离 在黄嗣薅鲍测定中，分褥缝莱缀大程度上取决予h p l c 静分离瞧耱，霞鲍， h p l c 具体操作条件的选择怒各种黄酮类化合物，尤其是各种黄酮醇之间较好 分离的决定性因素。 黄酮豢优台物豹测定基本上都采用反耜c 1 8 挫，般柱漫设定为2 5 4 0 ， 遴襻量麓2 0 旺，滚羲稳流速梵1 0m l m i n 左意，袋弱等度或攥度浚掇，流魂 相一般为乙腈或甲醇与不同酸( 甲酸，乙酸，磷酸) 的不同浓度的混合溶液【1 0 1 1 1 2 0 埘3 4 嗡】，也有采用三元溶剂系统，逐渐增强疏水性，改变p h 慎，米达到 较好的洗脱效果，其组成为n i l 4 h ：p 0 4 溶液一磷酸一乙腈。 黄瑟酪戆定经依器是色漤漶嚣保整嚣阕数及u v - v i s 光谱嚣、荧光瞧爱、电 化学性质、麓谱谱圈、生物灞性图等；定量酶方法般为外标法、蠢标法和标 准加入法。 1 2 3 4 紫外检测器( u v ) 及光电二极管阵列检测嚣( d a d ) 黄酮酪农2 0 0 4 0 0 n m 有聪个啜牧带，带i ( 3 0 0 3 8 0 n m ) 是由b 环静两桂 酝系统弓| 越豹，蒂i i ( 2 4 0 2 8 0 n m ) 是交a 强戆零攀酝系凌孚| 起静瑟壤，由于在 2 5 9 n m h 释1 2 8 0 n m 处有干扰峰，放u v 检测器设定的寇慧波长一般为3 7 0 n m 左右【2 5 3 0 3 4 1 3 。u v 和d a d 是测定黄酮孵中使用最广泛的检测器，但检测限( l o d ) 稍差， 7 成都褒工大学硬士学经论文 蘩采爱摭转换法，灵敏褒露餐弱怒赢，l o d 为5n g m l ，接近予荧光帮邀化学检 测器，线性范围为4 7 0 0n g m l ，根据基质的不f 弼有变化。定性一般采用保留时 间和u v - v i s 谱图肼2 22 7 1 。 l 2 3s 冀窀硷测器 在赞瀚簿的测定中，报掇其备方越的性质，还有蟪俄学检测器( e c d ) 、 质谱检溺器( m s ) 3 8 - 3 9 1 、茨光检测器( f d ) 3 3 ，嘲帮嫩亿检测器( b c d ) 4 t t 等的使用。 1 2 , 。3 6t i p l c 法溅踅茶哼孛瓣赞溯簿 h p l c 法在茶叶成分测定中的鹰餍，默测悫儿装素类物质较多，如k a io n c 羲u 【嘲等分辑了搬浆羁露滚喀| 豹( + ) 。c a t e c h i n ( c ) ，( 一* e p i c a t e c h i n ( e c ) ，卜) 一g a l l o c a - t e c h i n ( g c ) ，卜) - e p i g a l l o c a t e c h i n ( e g c ) ，( 一) - c a t e c h i ng a l l a t e ( c g ) ，( 一) - e p i c a t e c h i n g a l l a t e ( e c 嘞，- g a l l o c a t e c h i ng a l l a t e ( g c g ) 章n ( 一* e p i g a l l o c a t e c h i ng a l l a t e 疆g e g ) 等，释j k 茶素类化合裙，榉懿先用，d 葡萄糖蛰羧酶裙硫酸酪酶承髂，然霞鬻隧 穗摹取滚提绒，r p 。h p l c 分离惹熙黪仑检测器捻测。 其它的些研究也包括茶多酚( 儿茶素类，黄酾醇) 作为整体的撬取敷及工 艺的优化 4 3 “- 4 4 。 餐鬟雩予茶时中戆黄醚黪貔漤| | 定鞭道不多。 样赫预处瑕的方法对测定结果影响较大，一般采用的方法有：c l g 或强阴离 子交换穗，滚滚攀取( 乙羧乙臻、乙醚等) ，袋考整羧遴祥驻5 q 霹。 对于茶叶中黄酮醇的测定，研究比较详细的是h u a f uw a n g 等1 5 】，但研究 豹茶时孽申豢毙较寿隈，主要磷究了榉鑫中黄翻簿戆提取秘测定方法。伉纯了茶 叶中黄酮簿糖配物的水解条件：水勰时闻对三释黄戮醇瓣影响，在2 h 之内，杨 梅素纛辫发索均毫达到最离产攀，霹出袭酚在3h 之巍始终在增长；盐酸浓发 ( 1 0 ，3 0 ，6 0m o l l ) 对样黯中黄酮醇的影响，选择6m o t l 的h c i ，水解2h ， 不同溶剂和溶剂浓度的影响，实验了三种溶剂：乙醇，甲醇，丙酮，丽采用6 0 的乙醇永溶滚稳驻、窳辫爨竞金。迩彳尊窭鳍论，磨痒瓣荼时要琵没薅碎懿蘩时 的产率离出大约3 6 。 s i b e lk a r a k a y a 等毪1 测定了茶睁漫滚中黄戮释静含鬃，谈交茶中黉瓣酵( 裰 皮素，杨梅索，山奈酚) 测定结果的差异可能撼由于红荣的种类，地理因索， 客 第一章$ l 富 环凑条馋，热王工艺等不瓣弓| 起筑。 1 3 研究思路 麓建磺究h p l c 法测定茶对中筵酮醇豹热谱祭 牛翻飙茶叶中提取的蔌鞭醇 的水解条件，然后测定多种不阕释类的茶时梯鼷中黄酮醇的含量，并研究其中 懿勰掺瞧，并对绿茶中黄颡黪豹食鬟与疆照熬关装进行探讨，莠对务类袋时中 黄酮醇含蹙的可能的影响豳索做一定推测。 1 3 1 寿攀鼎预处理 校懑蓬家密入凌检验糗疫鼹煞檬准( s n 0 9 1 9 - 2 0 0 0 ) ，蒋萘时襻熬夜1 3 0 下干燥2 7m m ，磨碎后过2 0 髫筛，用分静予天平准确称取1 0 0 0g 茶时样品， 与4 0 m l6 0 的乙醇溶液( 含抗环瞧酸2g 范) ，5 m l6 m o l l 酶h c l 滚会，在 9 5 圆流2 小时，将回流水解后的溶液过滤腐，用流水冷却，随腊立即用6 0 豹乙醇承溶滚( 含凌嚣蠢簸2 9 l ) 定骞，超黟波髂蕊孱，致大约2 m l l | 毙溶液， 用o 4 5g m 的膜过滤器过滤，取2 0 旺注入h p l c 柱中，进行分析，黄酾醇的 鑫塞浚示蔻每巍予澡样瑟中黉藏黪秘毫蹇数。 1 3 2 初步色谱条件 枣蠢准样品与酸水解样鼹的测定，采用y w g r p - c l s 桂( 1 5 0 4 。6 m m ，1 0 9 m ) ， 漉动磺稳耩：擎醇一隶( 3 0 ：7 0v v ) ( 含1 煞擎羧) ( a ) 与1 0 0 攀酵( 转) ， 梯度淋洗为2 5 8 6 b ，5 0 分钟，流速1m l m i n ，标准趋线从0 0 1 t 0 1 ( 6 个 水平) m m l ，定量使甭矫标法。柱温设定为2 5 。梭溅波长3 7 0 n l t l 。 1 3 3 祭叶中黄酮醇的提取条件试骏 务耱提取条俘臻在文献缀遴熬鏊萋塞上，慕建单因素实验。 ( 1 ) 盐酸的浓度：3 ，4 ，5 ，6 ，7 5 ，1 2m o l l ( 2 ) 拳麟薄闯：0 5 ，i ，l ，5 ，2 ，2 5 ，3 ，4 ，6 h ( 3 ) 溶剂的种类；甲醇，乙醇 ( 4 ) 溶铡 乙醇) 的浓度：0 ，2 0 ，4 0 ，6 0 ，8 0 ，1 0 0 1 3 4 确霆h p l c 分离荼卧审案酾醇麴最佳售游祭搴# 镬文献擞道的基璐上，投攥奉实验孛掰使瘸浆离散滚摆色落仪和色谱拄， 同时依据待测备色谱峰的分离情况，逐步改变梯度洗脱程序或流动褶组成，最 终获得满意的分离度。 9 成都瑷工大学硕士学位论文 1 3 5 确定荼时中黄酮醇糖配物的选定水解条律 由于黄黼醇在茶叶中基本上以糖配物的形式存在，而测定时的对蒙是单 体，而且黄酮醇的单体与不同糖熬结合所形成的糖配物的水解条件不完全相同， 不圈类静茶时中的黄酮醇可能舆有不嚣类豹糖配貔。疆她，在文献的蒸勰上我 们必臻对鸯一类茶盱静求解条馋遴行萋舞究察总结。 1 3 6 讨论决定不同种类茶叶中黄目同醇含量的影晌因素 茶叶中黄酮醇的含量受多萃巾因素的制约，根据我们所能得到的资料，对绿 茶中黄酮醇的含量与日照的关系，以及各类茶叶之间的差异的可能原因进行一 定翡搽讨。 第二章实验部分 第二章实验部分 2 1 实验仪器与试剂 2 。1 。1 实验便纛 岛津( s h i m a d z u ) 裔效液相色谱仪( 带光电二极管阵列检测器) ；o d sy w g 柱( ( 1 5 0 4 6 m m ) ，1 0 m ；保护柱2 0 4 6n k r r l ，1 0 “m ，大涟伊利特) ； 趣声波清洗器( 上海科导超声仪器有限公司) ；电子分析天平；分析天平；o 4 5 g m 膜过滤器；礤钵；拣缎；烘箱；2 0 蟊爨等。 2 1 2 褰验试弃l j 杨梅素( 7 0 0 5 0 ) ( 9 5 ) 为标准物质，购于f l u k a 公司； 山奈酚( 1 1 0 8 6 1 ) 、槲皮索( 1 0 0 0 8 1 ) ( 9 7 3 ) 为标准物质( 对照晶) ，购于成 都市药晶检验所( 中国蓟黯生物制品检定所，j e 京) ； 举簿( h p l c 级，天津枣秘密欧证学试裁嚣发中心) ； 无水乙醇( 分橱筑，上海有机化工试荆研究所) ； 抗坏血酸、甲酸、盐酸( 分析纯，重庆北碚精细化工厂) ； 茶叶( 茶叶超市购买) ； h p l c 窝铡样嗣水为夔蒸馏求； 2 。2 实验方法 2 2 1 杨梅素、槲皮素和山奈酚标准溶液的配制与储备 用电子分析天平准确称取杨梅素、槲皮索和山奈酚标准物麟器0 0 1 0 0g ，溶 子擎黪中，然后转移至5 0m l 容量瓶中，惩甲黪定容，振荡摇匀，邸褥浓度为 0 2m g m l 的标准豹囊鼹餐液。将魏储备液予4 t 缳存，三个嚣之蠹稳定。 2 2 2 赞酮醇标准曲线的绘制 用移液管分别移取杨梅素、槲皮素和山祭酚标准储备液各1 o o ，2 0 0m l 至 2 5m l 容量瓶中，用甲静定容至亥度，得到8 0g g m l 和1 6 0 , t t g m l 的混合标准 溶液。砖予8 0g g m l 黪溪会标准溶滚，逡襻爨分爨必5 0 ，1 0 0 ，1 5 + 0 ，2 0 0g l ； 而对予1 6 0 , g m l 的混合标准溶液，进样蹩分剐为1 2 5 ，1 5 0 ，1 7 5 ，2 0 0u l ， 根据棒标准物质色谱峰的峰面积和其相应的浓度绘制三种黄酮醇的标准校正曲 线。 2 。2 。3 秀法的可褥性 成都理二i 大学矮圭学德论文 方法躲可行瞧暹过测定豹精密度秘基牧率采袭承。潋平行测定5 次所褥鲸挺 对标准偏差作为精密度。方法的检测限定义为引起三倍于基线噪声的信号所对应 的浓度。 2 2 。4 糕麓串粪戮醚酌撬取蔫测定 所有的茶叶榉品均购予强她的茶时超市。 绿茶、黄荼辩红茶、蓉溺茶、鸟龙茶鼹提取条件蠢蕊不麓。 对于绿茶和黼茶，1g 磨碎的茶叶，过2 0 嗣筛后蚤予1 0 0m l 圃底烧瓶中， 燕入4 0 m l 乙醇( 含2g l 抗爨瘦酸) 帮擒m l 4 5 m o l l 熬盐酸，鼍：9 5 下承 浴回流2 sh ，水解后的溶液立即用自来水冷却，转移纛1 0 0m l 窬攘耨中，庵 5 0 兹乙醇定容纛翔疫，趣声波 擘热籍，取大约l 2m l 爝0 4 5g m 貘= l 窭滤嚣过 滤，进样分析。 对于红茶、游洱茶和乌龙荣，赫酸浓度为6m o l t l ，水解时间为1 5h ，其它 条传稳阅绦茶。 2 2 5 毽港转橱条 半 在本文中聚爝酶色谱桂羚爱穗y w g c l 8 棱( 1 5 0 4 6 m m ，1 0g m ) ，隧及黼样 填料的保护柱( 2 0 4 6 m m ) 。光谱的扫描范围为1 9 0 4 5 0n l t l ，定凝波长为3 7 0 n t t l 。疆濑设定为2 5 。 经过蜜验对 研究得至前色谱洗脱条件为： 线拣张发洗麓；滚凄提a ( 警藜一攀酸一溪鬣姨稳( t h f ) ，9 7 ：l ：2v 耐v ) ， 流动相b ( 水一甲醇一甲酸一四氢呋喃( t h f ) ，7 7 ：2 0 ：1 ：2 “v v m 。 洗脱程序为：o 3m i n ，2 0 a ；3 7m i n ，2 0 4 0 舢7 1 5r a i n ，4 0 5 0 a ； 1 5 2 0r a i n ，5 0 7 5 a ；2 0 2 5r a i n ，7 5 a ；2 5 2 6m i n ，7 5 2 0 矗；2 6 3 0r n i n ， 2 0 a 。 1 2 第三章结果与讨论 第三章结果与讨论 3 1 茶叶中黄酮醇糖配物水解后的定性与色谱条件的选择 茶叶中黄酮醇的定性通过h p l c 法来进行，主要依据为色谱峰的保留时间和 u v - v i s 光谱图；色谱条件的选择则在文献的基础上，通过改变淋洗液的梯度洗脱 程序和组成来获得具有足够分离度的各待测物质色谱峰，并确定最终的色谱条 件。 3 1 1 样品色谱峰的定性 色谱峰的主要定性依据为色谱峰的保留时间和u v - v i s 光谱图。图3 - 1 为标 准物质和样品中三种黄酮醇的u v - v i s 光谱图。 通过图3 - 1 ，我们可以看出，相同时间下样品中的山奈酚和标准物质的u v - v i s 光谱图非常接近，虽然杨梅素和槲皮素的具有一定的差异，但最大吸收波长仍然 是一致的，基本上可以确认是同一物质，这些差异可能是由于样品基体中的其它 物质所带来的吸收引起的。 成都理工大筚硕士学位论文 豳3 - l 标准物艨和样品中三种黄酮醇的u v - v is 光谱豳。1 样品，2 一标准物质。a 杨梅 素，b 一槠素，e 一山奈酚 f i g 。3 - 1u v - v i ss p e c t r ao f t h r e ef l a v o n o l si ns t a n d a r da n ds a m p l e + 1 一s a m p l e ，2 一s t a n d a r d 。a ” m y r i c e t i n ，b q u e r c e t i n ，c k a e m p f e m l 3 。1 。2 爨谱条馋的蕊撵 检测波长：根据u v - v i s 扫撼结果，各种黄酮醇的在3 0 0 3 8 0n m 之间的鼹 大吸收波长为：杨梅素( 3 7 2r a n ) ，槲皮索( 3 7 0n m ) ，由聚酚( 3 6 7n m ) ，所以最 终定鬃硷溺波长逡择在3 7 0n m 。柱澄：2 5 。 流渤棚：a ( 甲醇一甲酸一t h f ( 心氢呋喃) ，9 7 ：1 ；2v ，v ) ，b ( 水一甲醇 一甲酸一t h f ，7 7 = 2 0 ：1 ：2 v v v ) 。梯度洗脱的程序见表3 - t 。 袭3 - 1 禚度浇聪稷淳 t a b l e3 - 1 g r a d i e n t e l u t i o n p r o g r a m m e 浚幼耀敬缝裁( 甲酸秘疆缀狭淹( 强硬) ) 麴逡耩及焚偿曩： 为了在3 0m i n 内获得良好的峰形釉分离度，我们试验了不同的流动相组成， 提出了加入一定爨的四氢吠嘱( t h f ) 的色谱分离条件。褥到了比较满意的分离 效果，各种缓箴流动葙瓣色谱餮懿图3 。2 3 6 所示。 篓三雯丝墨曼塑堡 匿2 茶 跨样箍程3 7 0n m 簸的离皴滚桐色谱鼙。瀵 一来豁，2 一辆褥囊，3 一糕受紊，4 一由袭酚；溅洗滚：a ( e p 薅) ，b ( 承一翠酵，8 0 ：2 0v v ) f i g 3 - 2 h p l cc h r o m a t o g r a mo f at e as a m p l ea t3 7 0n l n p e a k s ：l “u n k n o w n ，2 一m y r i c e t i n ，3 一 q u e r c e t i n ，4 一k a e m p f e r o l 。s o l v e n tc o n d i f i o n s ：a ( m e t h a n 0 1 ) ，b ( w a t e r m e t h a n o l ，8 0 ：2 0v v ) 从图3 2 可以看出，当流渤相中没有加入甲酸和t h f 时，峰1 翱2 几乎完 全薰蹙( 邋过后磷的实验，我稻知道峰l 和晦2 怒重叠躲两个峰，雨量瀵l 与杨 梅繁珂戆熬有一定翡关聚) ，琵且各个淫魏纛鹱嚣撬逶。 图3 - 3 茶叶样品谯3 7 0n m 处的离效液楣色谱图。峰1 一未知，2 一杨梅素，3 一槲皮素，4 一幽奈酪。游洼滚ta ( 早薅一翠黢，9 9 ：1 ，v v ) ，b ( 永一单黪一孕酸，7 9 ： v v ) f i g 3 - 3h p l ce h m m a t o g r a mo fat e as a m p l ea t3 7 0n l n p e a k s ：t u n k n o w n ，2 m y r i c e t i n ，3 一 q u e r c e t i n ，4 一k a e m p f e r 0 1 s o l v e n tc o n d i t i o n s ：a ( m e t h a n o l f o m a i ca c i d ，9 9 ：1 ，v v ) , b ( w a t e r m e t h a n o l f o r m i ca c i d ，7 9 ：2 0 ：1v v ) 当流动相中只加入1 甲酸，峰l 、2 得到部分分离，而且锫个峰的拖尾得到 了绞大改蛰，冕辫3 3 。 1 5 艘都理工大学硕士学位论文 圈3 - 4 装时样品在3 7 0t i m 处的高效液相甑谱圈。峰1 一未知，2 杨梅素，3 一槲皮素，4 一由奈酚。淋洗液：a ( 甲薛一t h f 9 9 ： ，v v ) 。b ( 永一甲酵一t h f ，7 9 ：2 0 ： v v v ) f i g 3 - 4h p l cc h r o m a t o g r a m