（微生物学专业论文）杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究.pdf

学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 y 】；i 6 1 2 6 8 9 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名：幽 日期：丝坐! ! 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：叠鱼 日期：弦嚏。侈 剪哀厢癌尤学2 0 0 4 屈砑士学岔越卫杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究 摘要 内生真菌普遍存在于植物体中，其重要性正日益受到关注，不同植物体内的内 生真菌种类与数量也不相同，自然界中存在大量的内生真菌资源有待开发。本研究 选取杜仲e u c o m m i au l m o i d e so l i v 为研究材料，进行其内生真菌资源的研究工作。结 果从不同地区杜仲组织中共分离到2 5 4 株内生真菌菌株，分属于蜜孢霉s p h a c e l i a 、 刺孢壳c h a e t o m e l l a 、交链孢a l t e r n a r i a 、壳明单隔孢属d i p l o d i n a 、刺盘孢 c o l l e t o t r i c h u m 、匐柄霉s t e m p h y l i u m 、头孢霉c e p h a l o s p o r i u m 、球座菌g u i g n a r d i a 和 青霉菌p e n i c i l l i u m 等真菌属中。从两个采集地点来看，南京地区内生真菌类群比西 安地区类群较丰富、优势种群分离率较高；从植株部位上看，叶片组织内生真菌类 群较枝条和树皮丰富，且分离率高：此外，一些菌株还表现出一定的组织特异性。 在所研究的杜仲内生真菌类群中，刺孢壳比较普遍存在，且分离率较高，属优势种 群之一。生物活性研究表明：刺孢壳c h a e t o m e l l a 菌株z 18 的发酵代谢产物具有较广 谱的抗菌作用和较高的抗氧化活性，t l c 与h p l c 检测显示它的抗氧化活性成分中 可能含有与芦丁相同或相似的黄酮类化合物。刺孢壳c h a e t o m e l l a 活性菌株z 1 8 在不 同的固体和液体培养时，不同碳源、氮源、培养温度、p h 值、装液量以及生长因子 等条件对其生长有不同的影响。在马铃薯葡萄糖培养基和马丁氏培养基中生长较好； 比较适宜的碳氮比、培养温度、p r t 值、装液量和转速分别为1 0 ：1 ，2 5 。c ，p h6 ， 1 5 0 m l 2 5 0 m l 和2 0 0 r p m ；v b l 、v b 6 和叶酸等维生素以及c a 2 + 、f e 2 + 、m 9 2 + 等无机 离子均能不同程度地对其产生促生长作用。利用随机引物扩增多态性( r a p d ) 分析 优势的刺孢壳c h a e t o m e l l a 种群表明，其d n a 多态性与宿主来源和分离部位存在一 定相关性，同一地区的菌株之间亲缘关系较近，分离自同一部位的菌株之间亲缘关 系也比较近。菌株表现出一定的地理分化和宿主组织分化。 关键词：杜仲，内生真菌，多样性，生物活性，培养性状 南京师范大学2 4 强硬士学位论文 杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究 a b s t r a c t e n d o p h y t i cf u n g ie x i s tw i d e l yi nt h eb o d yo fp l a n t s t h ep e o p l eh a v eb e e np a y i n g m o r ea t t e n t i o nt ot h e m t h e r ea r ed i f f e r e n tk i n d sa n dq u a n t i t yo fe n d o p h y t i cf u n g ii n d i f f e r e n tp l a n t s m a j o r i t yo ft h er e s o u r c e sa r et ob et a p p e d i no u rs t u d yo ne n d o p h y t i c f u n g if r o me u c o m m i au l m o i d e so l i v + ，2 5 4s t r a i n so fe n d o p h y t i cf u n g iw e r ei s o l a t e df r o m t h a tp l a n ti nd i f f e r e n tr e g i o n s t h e ya r ei d e n t i f i e da ss p h a c e l i a ，c h a e t o m e l l a ，a l t e r n a r i a ， d i p l o d i n a ，c o l l e t o t r i c h u m ，s t e m p h y l i u m ，c e p h a l o s p o r i u m ，g u i g n a r d i aa n dp e n i c i l l i u m b a s e do n m o r p h o l o g i c a lt a x o n o m y i ti sf o u n d o u tt h a te n d o p h y t i cf u n g ig r o u pi nn a n j i n g h a sl a r g e rq u a n t i t yo fg r o u pa n dh i g h e ri s o l a t i o nr a t i ot h a ni nx i a 1 1 i ti sa l s ot r u ei nt h e l e a f t h a ni nt h et r e s sa n db a r k c h a e t o m e l l a s p e x i s tm o r ew i d e l yi nt h a tp l a n t si nd i f f e r e n t r e g i o n sa n dt h ei s o l a t i o nr a t i oi sm o r eh i g h e r i ti so n eo f t h ed o m i n a n t so ft h ee n d o p h y t i c f u n g if r o me u c o m m i au l m o i d eo l i v i nt h es t u d yo fb i o a e t i v i t yi t i s p r o v e dt h a t t h e f e r m e n t a t i o nl i q u i do ft h es t r a i no fz 1 8 ( c h a e t o m e l l as p ) c a ni n h i b i tt h eg r o w t ho f m u c h b a c t e r i aa n ds o m ep a t h o g e n i cf u n g ia n di th a sh i g ha n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y i ti si n d i c a t e db y t l ca n dh p l ct h mi t sa n t i o x i d a t i v ec o m p o n e n t sm a yi n c l u d ef l a v o n e l i k ec o m p o u n d s w h i c ha r es a n l eo rv e r ys i m i l a r 、 ，i 恤r u t i n t h ec u l t u r a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h es t r a i no fz 18 ( c h a e t o m e l l as p ) w a sa l s os t u d i e d i ti ss h o w e d t h a ti tc o u l dg r o ww e l li np o t a t od e x t r o s e l i q u i dm e d i u ma n dm a r t i n sm e d i u m t h eo p t i m u mc n ，t e m p e r a t u r e ，p h ，l o a d a g eo f c o n i c a lf l a s ka n dr o t a t es p e e df o rm y c e l i u mg r o w t ha r e1 0 ：1 ，2 5 c ，p h6 ，1 0 0 m lm e d i a v o l u m ei n2 5 0 m lf l a s k sa n dl o o r p mi ns p e e dr e s p e c t i v e l y t h ev i t a m i ns u c ha sv i t a m i n b l ，b 6 ，f i - h a n d i n o r g a n i c i o n ss u c ha sc a 2 + , f e 2 + a n d m 9 2 + c o u l dp r o m o t e t h eg r o w t hr a t e o fz 18i nd i f f e r e n td e g r e e g r o u po fc h a e t o m e l l aw h i c hi sd o m i n a n ti sa n a l y z e db yt h e m e a t h o do fr a p d ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) i ti sp r o v e dt h a tt h ec l u s t e r r e s u l t so fs t r a i n su s e di nt h es t u d yw e r ec e r t a i n l ya s s o c i a t e dw i t hh o s t sg e o g r a p h i cr e g i o n s a n dt h ep a r to ft h eh o s tw h e r es t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o m t h es t r a i n si nt h es a m er e g i o n s h o w e dah i g h e rg e n e t i cr e l a t i v i t yw i t hh i g h e rs i m i l a r i t yi n d e x e sa m o n g t h e ma n di ti sa l s o t r u ei nt h ec a s eo f s t r a i n si s o l a t e df r o mt h e , s a l r n ep a r to f t h ep l a n t k e yw o r d s ：e u c o m m i au l m o i d e so l i v ；e n d o p h y t i cf u n g i ；d i v e r s i t y ；b i o a c t i v i t y ； c u l t u r a lc h a r a c t e r i s t i c s 4 蔚赢师麓7 擎2 d 舛届酾士 啦趁立杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究 一、综述 1 植物内生真菌的生物多样性 早在1 0 0 多年前，人们就发现了在健康植物组织的内部有微生物的存在，这类 微生物被称为植物内生菌( e n d o p h y t e ) ，是指生活在植物组织内的微生物，用以区分 那些生活在植物表面的表生菌。植物内生菌包括内生细菌和内生真菌两类。有关内 生真菌的概念，从d eb a r y ( 1 8 6 6 ) 首次提出到现在，已经经历了一系列的发展。目 前的研究中，内生真菌指的是：那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内， 对植物组织没有引起明显病害症状的真菌( p e t r i n i ，1 9 9 1 ) 【】，这一概念已被广泛接 受。其涵盖面很广，包括菌根真菌及对宿主暂时没有伤害的潜伏性植物病原真菌。 由于内生真菌生活于没有外在感染症状的健康植物组织内部，其存在和作用长 期以来一直为人们所忽略。从1 9 世纪8 0 年代以来，内生真菌研究的重要性才开始 逐渐被人们所认识。而只有到2 0 世纪3 0 年代发现造成畜牧业重大损失的牲畜中毒 是由于食用了感染内生真菌的牧草之后，内生真菌的研究才得以广泛深入地开展起 来。内生真菌由晟初的发现、检测、分离培养和鉴定分类，到8 0 年代以后研究它们 对植物的有益影响、次生代谢产物，不断深入，目前本领域的研究兴旺而活跃。 内生真菌几乎存在于所有目前已经研究过的植物中，分布广、种类多，多样性极 其丰富。对其宿主植物可产生多种有益影响，如促进生长、增强抗逆性、生存竞争 力等：在植物微生态系统中发挥着重要作用；发挥这些作用的物质基础是内生真菌 产生的丰富多样的具生物活性的次生代谢产物，在农业和医药业中具有重要的应用 潜力。这些都表明对内生真菌的研究有着十分重要的理论意义和经济价值。 1 1 植物内生真菌的物种多样性 目前，从已经研究过的植物来看，未发现没有分离到内生真菌的，因此可以推 断内生真菌在植物体内是普遍存在的。地球上植物种类繁多，栖生于植物组织内的 内生真菌的种数也是极为庞大的。根据p e t r i n i ( 1 9 9 1 ) 【1 】估计，地球上高等植物有2 5 万种，若按现有资料1 种植物内可分离到4 - - 5 种特有内生真菌来计，内生 真菌总数应超过1 0 0 万种。可见内生真菌资源存在着丰富的物种多样性，有着巨大 的研究潜力。 每一个植物体都是一个丰富的内生真菌物种资源库。通常，从一种植物中可分 蔚蒴帮癌艿学2 0 0 4 届研士! 笋岔垃膏 杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究 离得到的内生真菌为数种至数十种，甚至多达数百种。f i s h e r 等( 1 9 9 3 ) 【2 1 从光亮大 戟e u c a l y p t u sn i t e n s 分离得到6 0 多种内生真菌。s t r o b e l ( 1 9 9 3 ) 从短叶紫杉t a x u s b r e v i f o l i u m 的树皮中分离出2 0 0 多种微生物。在亚热带、热带雨林植物中，内生真菌 的这种物种多样性更为突出，h y d e 等( 1 9 9 7 ) 【4 】经过对澳大利亚热带棕榈树内生真 菌的全面研究，指出平均从每种棕榈树内可分离到约1 0 0 种内生真菌。a n o r l d 等 ( 2 0 0 0 ) 1 5 】分析了巴拿马中部雨林中两种植物叶子中的内生真菌，结果发现分离自 8 3 个健康叶片上的内生真菌就多达4 1 8 个形态种。近1 0 年来，国内外在文献中有过 报道的内生真菌多达二百余种【6 】。 植物内生真菌生活在植物体这一特殊的生境内，与植物长期共处，共同进化， 这就使二者在进化过程中必然相互影响、从而形成一些新的真菌种类。如从短叶紫 杉中发现的t a x o m y c e sa n d r e a n a e l 7 j 、从雷公藤植物中发现的c r y p t o s p o r i o p s i sc f q u e r c i n a l 8 1 。g l e n n 等人( 1 9 9 6 ) 【9 】从牧草中分离得到1 0 余个新种，它们类似于枝顶 孢霉a c r e m o n i u m ，但因两者在遗传本质上存在明显不同，而建立了一新属 n e o t y p h o d i u m 。这从另一角度说明了植物内生真菌还可能具有很多潜在的新物种。 在内生真菌研究中，由于研究方法的局限性( 如有的内生真菌自身不能在人工 培养基上生长或生长极其缓慢，而致使研究者们无论用怎样的营养培养基也不能把 它分离出来：有的内生真菌在人工培养基上不产生子实体而无法对其进行鉴定) ，所 获得的内生真菌数量和种类十分有限，使得研究者对内生真菌物种多样性的研究受 到了一定的限制，而使报道具有一定保守性。 另外，有关内生真菌中的一类生活于植物地下组织中的类群内生菌根真菌， 也具有丰富的物种多样性。目前全球报道的a m 真菌已有约2 0 0 种，并不断有新种 报道。其寄主植物的多样性在一定程度上决定了a m 真菌的多样性( a 1 - r a d d a d a m ， 1 9 9 3 ) 【1 0 。f e a r 等( 1 9 8 9 ) 从多株果树根围分离出2 2 种a m 真菌，t r u f e m 等( 1 9 8 9 ) 从1 0 5 0 个玫瑰根围分离到2 1 种，赵之伟等( 1 9 9 7 ) 从蕨类植物根系中分离到6 种， t a d y c h 等( 2 0 0 0 ) 从一种固沙草a m m o p h i l aa r e n a r i a 根围分离到2 8 种，s t u r m e r 等 ( 1 9 9 9 ) 从桉树e u c a l y p t u sd u n n i i 根围发现新种：s c u r u b r a ，张英等4 2 0 0 3 ) 从我 国都江堰地区5 8 种植物根围分离到5 属4 7 种，李建平等4 2 0 0 3 ) 从金沙江干热河 谷7 5 种植物根际分离到6 属4 4 种a m 真菌【l l - b 。而且，a m 真菌的物种多样性在野 生植物上高于栽培植物已得到证实【1 4 ，这是由于自然植被中野生寄主植物种类较多， 赢方帮疽才学2 0 w 眉研士学岔玲3 t -杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究 生态环境多样；而农田中栽培作物品种单一，自然环境单调，再加上传统农业措施 的不利影响，破坏了a m 真菌的多样性。 1 2 植物内生真菌的遗传多样性 由于内生真菌的研究只是从近二十年来才开始被人们所关注，在这一领域中， 研究较集中在其分离、培养、鉴定以及它们对植物的有益影响及活性代谢产物等方 面。因此与普通真菌的遗传多样性相比，有关内生真菌在这方面的研究就显得单薄 了许多。 就目前研究来看，植物内生真菌具有较丰富的遗传多样性。a n o r l d 等( 2 0 0 0 ) i s 对分离自雨林植物中的内生真菌的研究初步表明，4 1 8 个形态学种的内生真菌中至少 有3 4 7 个不同的基因型分类元。s c h a r d l 等人( 1 9 9 1 ) 1 5 】利用限制性片段长度多态性 技术( r f l p ) 对a c r e m o n i u m 进行遗传多样性分析，通过染色体组中特定基因座的遗 传序列对比证实了a c r e m o n i u m 与香柱菌属e p i c h l o e 之间具有较为密切的关系。 m c c u t c h e o n ( 1 9 9 3 ) ，l a p p a l a i n e s ( 1 9 9 9 ) ，r e d d y ( 1 9 9 8 ) 【6 】等利用分子系统学手段 如r a p d 技术进行内生真菌的遗传多样性分析，结果都表明同一种内生真菌往往具 有多样化的遗传型。h a e m m e r l i 等( 1 9 9 2 ) 【1 6 】通过对分离自不同寄主毛榉、栗树、橡 树的3 0 株内生真菌d i s c u l au m b r i n e l l a ( b e r k b r ) s u t t o n 进行了r a p d 和r f l p s 分析，结果表明这些内生真菌菌株之间存在丰富的遗传多样性，而且其d n a 多态性 与它们宿主的起源有关。g l e n n 等人( 1 9 9 6 ) 【9 的研究也表明1 0 种牧草内生真菌在遗 传本质上与其类似属枝顶孢霉属存在一定差异。 1 3 植物内生真菌的生态多样性 1 3 1 类群多样性 植物内生真菌，根据其来源和系统特征可被划分为明显的两大生态类群：麦角 类系统禾草内生真菌和非麦角类系统内生真菌【 】。前者是从草本植物内分离出来的， 与宿主具有明显的互惠共生关系，后者从树木和灌丛植物中分离所得。禾草内生真 菌仅有少数属和种，在植物不同组织内广泛分布，寄主范围广，寄主常被一种真菌 感染；而非禾草内生真菌的特征则与之相反：具有分类单元多样性，在植物不同组 织内的分布具有限制性，寄主范围窄，寄主可同时被多种真菌感染。就目前研究结 果来看，内生真菌分布于较多种类的属中，但大多数内生真菌都属于子囊菌及其无 赢赢万强力学2 0 0 4 届历士学岔蘑戈杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究 性型，包括核菌纲( p y r e n o m y e t e s ) 、盘菌纲( d i s c o m y e t e s ) 和腔菌纲( l o c u l o a s c o m y e t e s ) 的许多种类，也包括少数担子菌和接合菌。 1 3 2 分布多样性 植物内生真菌的分布具有很丰富的多样性，主要表现在以下几方面：不同地域 植物中，同一地域植物不同组织中，宿主植物不同生理特性以及宿主所处不同生境 中等等。 处于不同的地理区域中的同种植物，其内生真菌类群分布不同，具有一定多 样性。f i s h e r 等( 1 9 9 4 ) 发现q u e r c u si l e xl 叶子上的内生真菌类群在英格兰、马略 卡岛、瑞士三地分布明显不同，蒲葵l i v i s t o n ac h i n e n s i s ( j a c q ) r b r 叶片内生真菌类 群在香港和百慕大两地也明显不同i i s , 1 9 。 同一地区同一种植物上的内生真菌类群基本相似，但是在同一植物的不同组织 中，内生真菌分布也不相同。如有研究报道表明桉树叶上不同组织叶柄和叶顶 端尚的内生真菌分布的种类明显不同，在植物不同部位如叶柄、茎、根的内生 真菌类群分布也存在差异。许多研究结果均支持这一假说：一些内生真菌种类具有 一定的组织专一性【1 7 , 2 0 , 2 1 j 。 内生真菌也随植株或组织年龄的不同而具有明显不同的丰度和分布。一般地， 随着年龄的增加，植物内生真菌种类和丰度也随之增加，主要是因为较长年龄的树 通过空气雨水等传播有更多机会被真菌反复侵染，以及随年龄增加，植株生理状况 和树木树皮结构发生改变，从而更易被真菌侵染i 翻。另外，内生真菌类群的生态分 布也受树届的高度和郁闭度的影响。一般情况，在密度较大、较封闭、均质的树冠 上，内生真菌的种类、数量和丰度均比较高。 内生真菌类群在不同生境( 指宿主) 中、不同气候条件地区( 如温带和热带) 间的分布也有明显区别，一些腐生菌，如草本枝孢c l a d o s p o r i u mh e r b a r u m ( p e t s ) l i n k ，出芽短梗霉a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ( d eb a r y ) a m 等常在温带地区植物中分离 到，却很少在热带地区植物中分离到。同样，某些真菌类群如刺盘孢c o l l e t o 护i c h u m c o r d a ，茎点霉p h o m as a c c ，拟茎点霉p h o m o p s 括( s a c c ) b u b 等属中的一些种类，常 分布于热带地区植物中，一般较少在温带地区植物中分离到【朋。内生真菌的分布还 会受到其它环境因子的影响，如采集地的温度、湿度、季节的变化、地点的高度、 周围其它植物类群和环境污染程度。 筒府茆菪戈擎2 0 0 4 届掰壬学岔越卫 挂 牵汀生真菌资潦和活性菌株生物学的帮步姘究 1 4 植物内生真麓次生代谢产物的多样性 总结前入研究绩果，植物内生真菌w 产生多种多样具生物活性的次生代谢产物， 如抗胂瘤灞性物质、抗生素类物质、杀虫类耪质、植物生长调节裁等多稀活性物葳， 从而直接绒间接地对其宿主j 焱物的生长发育、繁髓、与环境的适应性等各方面产生 定静影响。 植物内生真菌w 以产生抗肿瘤等活性物质如紫杉醇、各种生物碱。s t m b e l 等 ( 1 9 9 3 ) 批3 】扶短对紫彩t a x u sb r e v i f o l i a 熬瓣疫串分离褥裂撩毙够产生紫杉簿戆囊 生真菌t a x o m y c e sa n d r e a n a e 。其后，图内外先后报道从多种植物中也分离得剽了多 转悲产生紫杉醇魏悫生寞麓犯4 引】。选套多篇文章掇道内生真菌产生冀它具有抗癌作 用的生物碱。如张玲琪等( 1 9 9 9 、2 0 0 0 ) 曙2 0 3 】分别从桃几七s i n o p o d o p h y l l u m h e x a n d r u m 、 长春花c a t h a r a n t h u sr o s e u s 中分离到能够产生鬼臼毒素和长春新碱的内生真菌镂等。 植物肉生真菌遥可醣产擞多种抗垒豢物质。鄢文欣和谭仁祥( 2 0 0 0 ) 捧l 献黄花蔫 a r t e m i s i at t t l n z t c i 和蒙古蒿a m o n g o t i c a 的茎内分离到的内生真菌中含脊多种抑菌性物 簇如炭瘗蔼酸( c o l l e t o t r i ca c i d ) 等。器公藤t r i p t e r y g e u mw l t f o r d i i 肉垒粪藿霹产垒荻 型环肽抗缴素( c r y p t o c a n d i n ) 和酰胺生物碱( c r y p t o c i n ) ，分别对癣麓及白色念珠菌 蒡羹对稻瘗瘸蘩( p y r i c u l a r i a g r i s e a ) 等多争争瘸纛蘩鸯较强蘩杀终鬟。s i g h n 等( 2 0 0 0 ) 3 4 1 从一株朱鉴定的内生真菌c r l l 5 的发酵液中分离到一种对多种细菌和白色念珠菌 瓷掇蓉传耀戆十二旗纯合物。 禾本科植物内嫩真菌能够产生多种具有杀虫性的物质，如有机胺类、毗咯墼西 睫娄、殍l 哚二旗锈生物类以及麦角碱等数十种生物碱。这数生物碱舆有抗病原菌、 抗线虫等多种生物擎活性。其中大多数对食苹昆窳及哺乳动物有较强豹毒桂。 内生真菌长期和宿主植物生活在一起，对植物的生长发育具有熬要作用。研究 表明接物内生真菌霹叛奁按产生或闻按逸侄逶宿主檀物产垒菜些辍耪激素，辩箕宿 主植物的嶷长进行调节作用。如密花礤斛d e n d r o b i u md e n i f l o r u m 菌根菌能够产生赤 箨素( g a 3 ) 瑟舅。禽线莲a n o e c t o c h i l u sr o x b u r g h i i 等兰麓撩魏蠹生囊麓也毙够产生赤 霉素( g a 3 ) 、吲哚己酸( i a a ) 、脱落艘( a b a ) 等植物生长调节剂”。 2 桂仲的活往秘痰及其经济价值 杜4 e e e u c o m m i a 抒l m o i d e s o l 撤是一幂申落叶乔术，为单科单属单种胎稀有孑遗植物， 蔚靠舻莎力学2 0 0 4 居丽士学岔地卫杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究 是我国传统的名贵中药材。在神农本草经中杜仲早己被列为中药上品，它具有 抗氧化( 抗衰老) 、降压、消炎、抗癌等多种功效。 杜仲具有多种药理作用，是因为它含有丰富的生物活性物质。近二十年来，国 内外学者对杜仲功能成分进行了大量的研究工作，从中分离出了几十种化学成分， 有：松脂素类( 如松脂素二葡萄糖甙) 、环烯醚萜类( 如桃叶珊瑚甙) 、有机酸( 如绿 原酸) 、黄酮类及糖类、氨基酸、维生素等。其中，松脂素二葡萄糖甙是杜仲中主要 降压成分，其疗效平稳、无毒、无副作用【”】；桃叶珊瑚甙则是杜仲的利尿作用直接 关系，同时具有较强的抗菌作用3 8 1 ；绿原酸和黄酮类物质等具有广泛的抑菌消炎、 抗氧化、抗衰老等功效，黄酮类化合物还具有扩张冠状血管、促进血液循环等作用 3 9 - 4 1 。另外，许多研究还证实，杜仲具有减肥、抗动脉硬化、抗疲劳、防癌抗癌等 保健功能。从医疗、保健、食品开发及生态科学等各方面来看，杜仲具有较大的开 发价值和前景。 传统上，杜仲一直以皮入药而不是用叶入药。中药学认为杜仲的药效是由于杜 仲胶的作用，含有杜仲胶是杜仲的特征之一，以胶多者药效为佳，杜仲皮含胶比杜 仲叶高，故应以皮入药。而现代医学研究则证实，杜仲胶不溶于水，真正起药效作 用的不是杜仲胶，而是其它水溶物 4 2 。一些研究还进一步证明了杜仲叶与皮的化学 成分基本一致，具有同等功效及药理作用f 4 3 , 4 4 。张康健等人的研究表明，杜仲叶中的 各种药用成分含量丰富，除维生素含量基本相当外，其余的均高达数倍1 4 5 1 。杜仲以 叶代皮用作医药和保健品的原料，已得到国内外医学界的一致认同。 杜仲无论是直接入药、作为保健品，还是从中提取各类活性物质，其原料均直 接来自于杜仲植物体本身，杜仲药材现在已出现野生资源严重枯竭，人工栽培时间 长、产量质量均不稳定，药材市场供求矛盾突出等问题【4 “。目前有关内生真菌方面 的研究活跃而有意义，尤其是内生真菌可产生与宿主相同或相似生理活性成分这一 事实更给予我们以提示，因此本研究进行了杜仲内生真菌资源调查及活性研究，努 力挖掘内生真菌资源，并期望从中开发出有价值的可产生某些杜仲活性成分的菌 种，为进一步利用这些微生物资源提供有价值的资料和研究基础。 商醇咖湛才学2 0 0 4 届顼士学岔趁立杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究 二、杜仲内生真菌资源类群与分布的初步研究 近二十多年来，植物内生真菌资源受到日益广泛的关注，但相对于其它真菌类 群的研究来说，人们对内生真菌的认识还很肤浅。在自然界中有关真菌存在数量的 估算中，内生真菌也没有被包括在内 4 7 1 。就目前研究结果来看，内生真菌是普遍存 在于植物体内的，而且不同植物体内的真菌种类与数量也不相同。杜仲e u c o m m i a u l m o i d e s o l i v 是杜仲科杜仲属中的一个单种成员，是我国特有树种，其内生真菌资源 尚未见报道。本研究从南京和西安两地采集了杜仲组织，对其进行了内生真菌资源 的分离鉴定、类群组成、分布以及多态性的初步研究。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 杜仲组织来源 杜仲叶、枝条和树皮等组织材料于2 0 0 3 夏季采自江苏省南京( 紫金山、老山以 及南京师范大学校园) 和陕西省西安市郊。 1 1 1 培养基 分离、菌种纯化及保藏均采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基。 马铃薯葡萄糖固体琼脂培养基配方：马铃薯2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，琼脂1 8 9 ，水 1 0 0 0 m l 。 1 2 方法 1 2 1 采样方法 在采样地点随机选择相隔一定距离、树龄较高的5 - l o 棵杜仲树来采取杜仲叶片、 二年生枝条、树皮等各组织。采样后，置于保鲜袋中，于4 。c t 保存备用，采样后8 小时内处理样品。 1 2 2 内生真菌分离方法与分离率计算 组织分离法【4 8 】：取杜仲叶片、树皮及二年生枝条，自来水冲洗后剪成0 5 e r a 2 大 小的小块，以7 5 的酒精浸润3 0 s 后转入1 o 的升汞溶液中进行表面消毒2 r a i n ，无 菌水冲洗3 4 次后，移植于马铃薯葡萄糖琼脂平板上，在2 6 。c ；温a 箱中培养，待叶片 切口边缘长出菌丝后，纯化2 - 3 次接入试管斜面保存菌种。 赢席茆老力学2 0 0 4 詹研土学岔坦卫 杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究 剪块方法( 以剪叶片为例) ；从每一叶片剪下8 块大小均为o 5 c m 2 左右的小片， 芳尽量保证剪下的小块代表了叶片的各个不同部位，如叶尖、叶缘、叶柄基部以及 中央叶脉附近等。一个平板上种植8 个组织小块。 不同部位的组织小块数量均为2 5 0 个左右，定时观察各小块切口边缘处生长的 真菌菌落，鉴定并计数。以菜类真菌的总菌株数除以分离所得的所有菌株总数表示 该菌在总菌株中所占的比例；以某类真菌的总菌株数除以总的组织小块数表示某组 织中此菌的分离率，即每1 0 0 个组织小块中可分离到多少株该类真菌菌株。 1 2 3 菌种鉴定与制片方法 通过分离纯化，对菌种分别进行平板培养之后观察其菌落特征，根据分离到的 真菌子实体的特点分别制成切片或挑片，再通过显微观察，研究其子实体产孢结构 和孢子的形态结构特征，根据这些特征依据真菌的形态分类学原理进行鉴定 4 9 , 5 0 ，初 步确定各菌的分类地位。 子实体制片有多种方法，如直接挑取制片、徒手切片制片和石蜡切片制片等。 其中，丝孢半知菌直接挑取制片，腔孢半知菌和子囊菌进行了徒手切片和石蜡切片 制片。 2 结果 2 1 菌种分离和鉴定结果 2 1 1 杜仲内生真菌类群组成 从杜仲各部位组织中共分离获得内生真菌2 5 4 株凄 显微形态观察，按a i n s w o r t h ( 1 9 7 1 ) 系统鉴定为2 亚门、3 纲，4 目，6 科，9 属( 见表1 ) 。分别为蜜孢霉s p h a c e l i a s p 、刺孢壳c h a e t o m e l l as p 、交链孢a l t e r n a r i as p 、壳明单隔孢d i p l o d i n as p 、刺盘 孢c o l l e t o t r i c h u ms p 、匐柄霉s t e m p h y l i u ms p 、头孢霉c e p h a l o s p o r i u ms p 、球座菌 g u i g n a r d i as p 和青霉菌p e n i c i l l i u ms p 。从表l 可以看出，杜仲内生真菌中，在目的 分类水平上以丛梗孢目( m o n i l i a l e s ) 和球壳孢目( s p h a e r o p s i d a l e s ) 为优势种群，分 别占总菌株数的4 7 6 3 和2 5 2 0 ；在科的分类水平上以球壳孢科、瘤座菌科、暗梗 孢科为优势种群，分别占总菌株数的2 5 2 、2 4 4 1 和2 1 2 6 ；在属的分类水平上 以密孢霉属s p h a c e l i a 、刺孢壳c h a e t o m e l l a 为优势种群，分别占总菌株数的2 4 6 1 和2 0 8 7 。另外，有2 1 2 6 的菌株因不产生子实体而无法进行鉴定。 南京师范大学2 0 0 4 霜碗士学位论文 杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究 表1 杜仲内生真菌类群组成 t a b 1t h ec o r n p o s i t i o no f e u d o p h y t i cf u n g if r o me u c o m m - au l m o i d e so l i v 亚门纲目科属 分离部位所占比例 半知菌 亚门 交链孢霉a l t e r n a r i a 平 暗梗孢科 匐柄霉船叩 岫“月，单 叶片、枝条 叶片 173 2 39 4 丝孢纲丛梗孢茸疳座蕾科密孢霉跏口d 缸甲 叶片、枝条 2 44 1 头孢霉c e p h a l o s p o r i n m 单 丛梗孢科 青霉菌p e n i c 自1 1 j u ms p 树皮 树皮 l5 7 0 3 9 刺孢壳d l 僻姗捃妇s p 叶片、枝条 2 08 7 球壳孢目球壳孢科 腔孢纲壳明单隔孢d 叫。商m 印 叶片、枝条 43 3 霁盘孢目黑盘孢科刺盘孢c o h e t o r h c h u me p 叶片、枝条 47 2 于囊翦 腔蕾纲座囊莓目座囊菌科璋座酋函枷d 眺ds p 叶片 1 1 8 末产生于实体的茁株 2 l2 6 2 1 2 杜仲内生真菌主要类群形态特征 杜仲内生真菌分属于9 属，其培养特性与形态特征见表2 。 1 3 南京嫦范太学2 0 0 4 磊碗士学位论文杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究 衰2 杜仲内生真菌形态特征 t a b 2 m o r p h o l o g yo f e n d o p h y t i c f u n g i f r o m e u c o m m i a u l m o i d e s o l i v 茁啦歼疆分拄、青嗣、完色遗啊 翁莲白色常生勃色i 蠹稿老鹅尊t 蕾搜冀褐色i 】生膏卑艇船 主爱卧状砧性嘞艟下蔓示为摆子分生俺予盘碟盘状一l 生州毛 刺盘徊4 , 7 2琦茹坎子商后耘薛蔫上蛇生刺毛喀辐色异分_ 裹墨先措量 c 。日枷护1 。瓒 拄条黑色点状韵馈下蛊示为璜端嵛虫：分生翅子梗嫂犏色胄雨 ， 生翅子盘井生舟子氍椭瓣彤j 巳色七革艟 孵蠕饨嘲 壳明单蕊舟 啸p l o d i n o ，p 一，话鬻镳耋i 、蒸簸瓣薰 知翌冲片巍麓黧撼鬟知：患冲，烈叶片黧警黧二：茎基戮热篡 煮 辑舟格戡丹藕 蛐= 艰，榭皮毪拶懑醛：骚i 头翻譬 l5 7榭皮 生任茁垃致东霸躺b 竺三詈兰! 苎苎弗：。皂：、1 至三： c 妒 口如妒口瞳胁砷 辩格蠹赍壹 生馏于完雹毕肥履再张、雨报j 品 墨e 。r d i a 朋一片鹭蚕至黧曩篓 。一。e 一片擞销絮篡三蠹蚤黧善气主s 4 南苈帮疽力擎2 0 0 4 届研壬学岔趁卫 杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究 2 2 不同地点和杜仲组织的内生真菌分布与组成 2 2 1 不同地点杜仲内生真菌组成比较 对来自于西安和南京两地的杜仲叶片和枝条进行了分离，其中内生真菌的组成 和分布比较结果见表3 。 表3 不同地区杜仲内生真菌的分布和组成 t a b 3d i s t r i b u t i o na n dc o m p o s i t i o no f e n d o p h y t i cf u n g if r o me u c o m m i au l m o i d e so l i v i nd i f f e r e n tr e g i o n s 从表中可以看出，在四个采样地点中，南京各地区杜仲内生真菌分离率普遍较 高，类群较丰富、优势种群分离率较高，而西安地区分离率较低，种类也较单调， 差异比较明显。 由此可以初步看出，杜仲内生真菌的类群组成及分布与其宿主所处地理位置不 同有一定关系，也反映出同一植物在不同的地理区域具有不同的内生真菌类群分布。 2 2 2 不同组织杜仲内生真菌组成比较 对分离自不同组织的内生真菌组成进行了比较，可以看出，杜仲不同组织中， 叶片内生真菌分离率最高，达2 2 7 4 ，真菌类群也较丰富，而枝条和树皮中，内生 真菌分离率较低，一般不超过3 ，真菌类群也较单调，尤其是树皮，仅分离到两个 类群：头孢霉c e p h a l o s p o r i u ms p 和青霉菌p e n i c i l l i u ms p ，而且这两类真菌表现出一 定的组织特异性。分离自三个不同杜仲组织的内生真菌类群与分布存在着差异。 另外，不产生子实体而无法鉴定的菌株般均分离自叶片组织中，也表明叶片 筒意掰藩戈拶2 0 0 4 ，茸嚣叠擎岔蘑j f枉 孛内生真菌援源和蠕性菌株生物学鲍韶参研究 中的真菌蹙群更为丰富。 袭4 牡伸不嗣组织豹内生嵩营组成 t u b ac o m p o s i t i o no f e n d o p b y t i cf u n g if r o md i f f e r e n tt i s s u e so f e u c o m m mu l m o i d e so * v ； 2 2 3 分布总况 从不嗣地点和不同组织串所分离得剿的杜仲内生真菌总的分离率以及优必种群 懿表5 骈示，各冀蔼稀群在不同遣点赣缔隧及挺讳不两缝缓内的分布如表6 掰示。 从袭5 中可以看出，无论来自哪实验采熊地点的杜仲组织，叶片中内嫩真菌 分离率慧爱较高，一般于2 2 - 3 2 之阙不等。英次是援条释耱菠，辩者蠹生爽麓分 离率都较低，一般不超过3 。相应地，叶片组织中的优麴种群分离率也较枝条和树 友戈裹，觳为9 1 2 。 表6 显示了不同内生真菌类群在不问地点杜仲和杜仲不同组织内的分布情况， 可以看出，嚣安熄送比南京地区杜傍内生真菌率度相对较小、类群较单一；树皮组 织比叶片、枝条组织内生真菌类群较单一。而藏，叶片与枝条中存在的内生冀菌类 群有一定的相似性，从树皮中分离碍到的内生真菌则与时片、枝条明显不同。 表5 不同地点杜仲与杜仲不筒组织的分离率及其优势种群 t a b 。5 p r o p o r t i o n a n d d o m i n a n t s o f e u d o p h y t i c f u n g i f r o m e u c o m m a u u l m o i d e s o l i v i n d i f f e r e n tr e g i o n sa n d f r o m d i f f e r e n tt i s s u e s 不同地点 币脚部位分离翠1 甬蕃磊磊丽耋笋笔鬟