（控制科学与工程专业论文）定量蛋白质组学质谱平台肽段检测效率预测研究.pdf

国防科学技术大学研究生院硕士学位论文 摘要 目前，生命科学研究已进入后基因组时代，研究重点已经从遗传信息的发现 转移到功能解析，蛋白质组学试图直接从整体上定性和定量地研究某一生物样本 在特定条件下表达的全套蛋白质，是后基因组时代的研究热点。随着研究的不断 深入和实验技术的发展，定量蛋白质组学已逐渐成为其研究重点。在定量蛋白质 组学中，对来自生物样品的复杂蛋白质混合物进行精确定量是核心工作。对于特 定的蛋白质组来说，蛋白质表达丰度动态范围很大、物理化学性质高度复杂，以 生物质谱技术为代表的高通量、高灵敏度实验平台是进行蛋白质组学研究的有效 手段和关键技术。生物质谱的分辨率、准确度、重复性、动态范围、通量等性能 指标随着蛋白质组学的发展得到了不断提高。但是，技术的进步并不能解决所有 问题，并且由于从样品制各到实验数据处理，需要经过复杂的步骤，引入了不可 忽视的系统误差，也严重影响了定量分析的精度。目前，鸟枪法实验策略在蛋白 质组研究中应用广泛，在实验处理中，需要将蛋白质酶切，得到肽段，然后进行 色谱分离、软电离、一级质谱分析、二级质谱分析等复杂步骤，才能最终得到包 含肽段序列和丰度信息的质谱信号一质谱图。在这些步骤中，肽段都会产生一定 的损失，并且损失率和肽段自身物理化学属性以及肽段混合物之间的交互作用有 关，导致即使在同一质谱平台上，不同肽段的可检测性差别也很大，成为制约蛋 白质定量一个重要因素。由于很难获得大规模标准定量数据，目前国际上对肽段 可检测性的研究还停留在定性方面，仅仅考察肽段在特定质谱平台上能否被鉴定。 本文在对质谱实验数据定量分析的基础上，首先明确和定义了肽段检测效率 的概念。为计算肽段的检测效率，接着开发了利用肽段鉴定结果文件提取肽段定 量指标的软件工具p e p x i c ，并通过与当前公认的无标定量软件s p e c a r r a y 、 s u p e r h i m 、m s i n s p e c t 相比较，证实了p e p x i c 具有良好的性能。随后，从肽段质 谱实验分析的过程和原理出发，提取了用于预测肽段可检测性的物理化学特征， 并对这些特征进行了统计分析，利用偏最小二乘法对原始特征进行了优化。最后， 基于构建的特征向量，使用支持向量机回归方法建立了肽段检测效率预测模型， 通过5 倍交叉验证对预测模型评估，预测平方相关系数和均方误差分别达到了 0 8 9 、0 0 0 2 ，证实了预测模型具有良好的性能。 关键词：定量蛋白质组学，质谱平台，定量算法，肽段检测效率 第i 页 国防科学技术大学研究生院硕士学位论文 a b s t r a c t a tp r e s e n t ，l i f es c i e n c eh a sg o n ei n t ot h ep o s t - g e n o m ee r a , a n dt h ef o c u sh a s t r a n s f e r r e df r o mg e n e t i ci n f o r m a t i o nd i s c o v e r yt of u n c t i o n a l a n a l y s i s p r o t e o m i c s a t t e m p t st oc h a r a c t e rt h ee x p r e s s i o no ft h ef u l ls e to fp r o t e i n sf o rab i o l o g i c a ls a m p l e u n d e r s p e c i f i cc o n d i t i o n sq u a l i t a t i v e l ya n dq u a n t i t a t i v e l y a l s o ，p r o t e o m i c sb e c o m e sa l l i m p o r t a n tf i l do fl i f e s c i e n c ei np o s t g e n o m ee r a w i mt h ec o n t i n u o u sa d v a n c eo f q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c sa n dt h ed e v e l o p m e n to fe x p e r i m e n t a lt e c h n i q u e s ，q u a n t i t a t i v e p r o t e o m i c sg r a d u a l l yb e c o m e sah o tt o p i ci np r o t e o m i c s i nq u a n t i t a t i v ep r o t e o m i e s ，t h e c o r ei s s u ei st h ea c c u r a t eq u a n t i f i c a t i o no fc o m p l e xp r o t e i nm i x t u r e sf r o mb i o l o g i c a l s a m p l e s f o ras p e c i f i cp r o t e o m e ，b e c a u s et h ed y n a m i cr a n g eo fp r o t e i ne x p r e s s i o n a b u n d a n c ei sl a r g e ，a n dt h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so fp r o t e i n sa r e h i g h l y c o m p l e x ，b i o l o g i c a lm a s ss p e c t r o m e t r yt e c h n o l o g y ，w h i c hh a st h ec h a r a c t e r i s t i c so fh i g h t h r o u g h p u ta n dh i g hs e n s i t i v i t y ，i sa ne f f e c t i v et o o la n dac r i t i c a lt e c h n o l o g yf o r p r o t e o m i c sr e s e a r c h i nr e c e n ty e a r s ，t h er e s o l u t i o n ，a c c u r a c y ，r e p e a t a b i l i t y ，d y n a m i c r a n g e ，t h r o u g h p u ta n do t h e rp e r f o r m a n c e so fb i o l o g i c a lm a s ss p e c t r o m e t r ya r ei m p r o v e d g r e a t l ya c c o m p a n yw i t ht h er a p i da d v a n c eo fp r o t e o m i c s h o w e v e r ，t h ea d v a n c e si n t e c h n o l o g yc a l l n o ts o l v ea l l p r o b l e m s ，f o re x a m p l e ，i tn e e dm u l t i p l es t e p sf r o m b i o l o g i c a ls a m p l ep r e p a r a t i o nt oe x p e r i m e n t a ld a t ap r o c e s s i n g ，t h es y s t e m a t i ce r r o r st h a t a r ei n t r o d u c e d 研t l le a c hs t e pc a nn o tb ei g n o r e d ，t h e s ee r r o r sm a ya f f e c tt h ea c c u r a c yo f p r o t e i nq u a n t i f i c a t i o ng r e a t l y a tp r e s e n t ，t h es h o t g u ns t r a t e g yi sw i d e l yu s e di nt h ep r o t e o m er e s e a r c h i no r d e r t oo b t a i nm a s s s p e c t r a , w h i c hc o n t a i nt h ei n _ f o r m a t i o no fp e p t i d es e q u e n c ea n d a b u n d a n c e ，t h ef o l l o w i n gs t e p ss h o u l db eg o n e t h r o u g h ：p r o t e i nd i g e s t i o n , c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n ，s o f ti o n i z a t i o n , m a s ss p e c t r o m e t r ya n a l y s i sa n dt a n d e m m a s ss p e c t r o m e t r ya n a l y s i s i ne a c hs t e p ，p e p t i d ew i l lb el o s ti nac e r t a i nr a t e a n dt h e l o s sr a t e sa r er e l a t e dw i t ht h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so fp e p t i d e s ，a sw e l la s t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np e p t i d em i x t u r e s e v e ni nt h es a m em a s ss p e c t r o m e t r yr u n ，t h e d e t e c t a b i l i t yo fd i f f e r e n tp e p t i d ea r eq u i t ed i f f e r e n t t l l i ss h o r t c o m i n gb e c o m e st h e b o t t l en e c ko fp r o t e i nq u a n t i f i c a t i o n b e c a u s ei ti sh a r dt oo b t a i nl a r g e s c a l es t a n d a r d q u a n t i t a t i v ed a t a , c u r r e n tr e s e a r c h e s o fp e p t i d e d e t e c t a b i l i t ya r e f o c u s e do nt h e q u a l i t a t i o n ，i no t h e rw o r d s ，r e s e a r c h e r so n l ye o n s i d e rt h a tw h e t h e rap a r t i c u l a rp e p t i d e c a nb ed e t e c t e do nas p e c i f i cm sp l a t f o r m i nt h i s d i s s e r t a t i o n ，b a s e do nq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fm a s ss p e c t r o m e t r y e x p e r i m e n t a ld a t a , f i r s t l yw er e d e f i n e dt h ec o n c e p to fp e p t i d ed e t e c t i o ne f f i c i e n c yo n t h ev i e wo fq u a n t i f i c a t i o n s e c o n d l y ，i no r d e rt oc a l c u l a t et h ed e t e c t i o ne 筋c i e n c yo f p e p t i d e ，w ed e v e l o p e das o f t w a r et o o ln a m e dp e p x i c p e p x i cc a nb eu s e dt oe x t r a c t p e p t d i eq u a n t i t a t i v ei n d e xu s i n gp e p t i d ei d e n t i f i c a t i o nr e s u l t s c o m p a r e dw i t ht h e 第i i 页 国防科学技术大学研究生院硕士学位论文 c u r r e n tw e l l r e c o g n i z e dq u a n t i t a t i v es o f t w a r es p e c a r r a y ，s u p e r h i ma n dm s l n s p e c t ， p e p x i cw a sc o n f i r m e d 晰t 1 1ag o o dp e r f o r m a n c e s u b s e q u e n t l y ，f r o mt h em a s s s p e c t r o m e t r ya n a l y s i sp r o c e s sa n de x p e r i m e n t a lp r i n c i p l e ，w ee x t r a c t e dt h ep h y s i c a la n d c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fp e p t i d e st h a tc a nb eu s e dt op r e d i c tt h ep e p t i d ed e t e c t a b i l i t y ， p e r f o r m e ds o m es t a t i s t i c a la n a l y s i st ot h e s ec h a r a c t e r i s t i c s ，a n dm a d e ac o m p r e s s i o nt o t h eo r i g i n a lc h a r a c t e r i s t i c su s i n gp a r t i a ll e a s t - s q u a r e s ( p l s ) m e t h o d f i n a l l y ，w e c o n s t r u c t e dap r e d i c t i o nm o d e lo fp e p t i d ed e t e c t i o ne f f i c i e n c yu s i n gs u p p o r tv e c t o r r e g r e s s i o n ( r - s v m ) m e t h o db a s e do nt h ee x t r a c t e df e a t u r ev e c t o r s ，a n dt h e na s s e s s e d t h ep r e d i c t i o nm o d e lu s i n g5 - f o l dc r o s s - v a l i d a t i o n t h ea s s e s s m e n tr e s u l t ss h o w e dt h e p r e d i c t i o ns q u a r e dp e a r s o n sc o r r e l a t i o na n dm e a ns q u a r e de r r o rr e p e c t i v e l yr e a c h e d 0 8 9 、0 0 0 2 w h i c hc o n f i r m e dt h a tt h ep r e d i c t i o nm o d e lh a dag o o dp e r f o r m a n c e k e yw o r d s ：q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c ，m a s ss p e c t r o m e t r y ，q u a n t i t a t i v ea l g o r i t h m ， p e p t i d ed e t e c t i o ne f f i c i e n c y 第i i i 页 国防科学技术大学研究生院硕士学位论文 表目录 表1 1 不同质量分析器原理和一般特点。3 表1 2 肽段可检测性预测工具l l 表2 1 一些被广泛认可的肽段鉴定工具及其特点1 6 表2 2 定量分析软件2 2 表2 3 各软件定量数据质量总体差异比较2 4 表2 4 各软件c v 统计量对比2 5 表3 1 标准蛋白质数据集2 8 表3 2b i a t e c h 5 4 数据集中蛋白质组成和蛋白质含量2 9 表3 3 肽段各序列特征之间及各序列特征与肽段检测效率相关性分析3 2 表3 4 部分物理化学特征之间的相关性3 4 表3 5 特征优化前后预测性能对比4 0 表4 1 支持向量机回归方法在不同特征集上评估结果5 0 表4 2 支持向量机回归方法使用不同回归类型评估结果5 l 表4 3 支持向量机回归方法使用不同核函数评估结果5 2 表4 4 不同回归预测方法评估结果5 3 第1 i i 页 国防科学技术大学研究生院硕士学位论文 图目录 图1 1 基于s h o t g u n 策略质谱分析实验流程6 图2 1 基于w e b 的m a s c o t 进行高通量肽段鉴定的基本流程1 6 图2 2 肽段序列及其母离子同位素峰簇1 7 图2 3 肽段母离子质谱峰及其峰内离散采样点18 图2 4x i c 构建过程2 0 图2 5p e p x i c 肽段定量流程图21 图2 6 各软件检测到的肽段数2 2 图2 7 各软件定量数据的m a p l o t 。2 3 图2 8 各定量软件定量技术可重复性对比2 4 图2 91 0 次重复实验肽段归一化强度的c v 分布2 6 图3 1b i a t e c h 5 4 与人类蛋白质组、s o n e i d e n s i s 中蛋白分子量分布对比2 9 图3 2 质谱实验数据处理流程图3 l 图3 3 序列特征相关聚类3 3 图3 4 特征相关聚类( 部分结果) 一3 5 图3 5 各提取成分对肽段检测效率的解释能力4 0 图3 6 特征选择前后预测模型5 倍交叉验证散点图4 l 图4 1 肽段酶切概率计算流程图4 3 图4 2 肽段检测效率计算流程图4 4 图4 3 支持向量机分类超平面示意图4 5 图4 4 支持向量机结构示意图4 5 图4 5 支持向量机线性回归原理图4 6 图4 7 基于不同特征集的预测模型5 倍交叉验证散点图5 0 图4 8 基于支持向量机不同回归类型的预测模型5 倍交叉验证散点图5 l 图4 9 基于不同核函数的预测模型5 倍交叉验证散点图5 3 第1 v 页 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表和撰写过的研究成果，也不包含为获得国防科学技术大学或其它 教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 学位论文题目：定量蛋自履塑堂厦遭壬垒丛壁拴型教室亟趔盈究 学位论文作者签名一垒衾遂曼日期：如，7 年月片日 学位论文版权使用授权书 本入完全了解国防科学技术大学有关保留、使用学位论文的规定本人授权 国防科学技术大学可以保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅；可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文 ( 保密学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文题目： 定量蛋自匮丝堂魇谱壬鱼肽壁拴测兹窒亟型砑究 学位论文作者签名：垒全兰监 作者指导教师签名： 日期： 日期： 、 ， 月 月 ， 【 年 年 川呷j 国防科学技术大学研究生院硕士学位论文 第一章绪论弟一早珀了匕 随着很多基因组计划( 特别是人类基因组计划) 的完成，数以万计的基因序列已 经被测定，这同时给生物学家带来了一个巨大的挑战，即如何解读在生理或病理 条件下细胞或生物组织所呈现出的基因表达模式，阐明基因结构与功能的关系。 为解决这些问题，蛋白质组学作为功能基因组学的重要支柱，于2 0 世纪9 0 年代 中期应运而生【l 圳，以电喷雾电离质谱( e s i m s ) 和基质辅助激光解吸电离飞行时间 质谱( m a l d i t o f m s ) 为代表的现代生物质谱技术大大加速了蛋白质组学的发 展。随着蛋白质组学研究的深入发展，研究者逐渐从对蛋白质混合物进行定性分 析，过渡到对各种蛋白质表达量的定量研究。为此，一些研究小组从实验技术手 段作了很多努力，并提出了定量蛋白质组学的概念1 4 5 j 。这一概念的提出，标志着 蛋白质组技术的不断改进和完善，蛋白质组学研究已从对蛋白质的简单定性向精 确的定量方向发展。 目前，质谱技术已成为定量蛋白质组学的核心技术。基于质谱的蛋白质组学 定量技术的理论基础在于肽段丰度可以用质谱峰的信号强度来表现，基于质谱的 定量技术主要可分为两大类：( 1 ) 基于稳定同位素标记的有标定量技术；( 2 ) 基于肽 段质谱峰强度或图谱计数的无标定量技术。现有的定量技术主要着眼于不同时刻 或不同状态下蛋白质的差异表达，还无法实现对蛋白质组中各组成蛋白质精确定 量。这主要是因为定量蛋白质组学质谱平台的实验过程包含多个实验步骤，从样 品制备到数据获取，每个中间环节都会影响肽段能否被检测到，更会影响质谱响 应( m a s ss p e c t r o m e t r yr e s p o n s e ) 或者称为图谱信号强度和肽段真实丰度( a b u n d a n c e ) 之间的关系。2 0 0 6 年，t a n g 等【6 j 从肽段能否被鉴定角度提出了肽段可检测性( p e p t i d e d e t e c t a b i l i t y ) 的概念，并且基于肽段和其在母体蛋白质中相邻区域序列特征，使用 前向反馈神经网络模型，建立了肽段可检测性预测模型。而在现有的质谱平台中， 不仅存在肽段能否被鉴定到问题，而且对于已鉴定到肽段还存在检测灵敏度差异 问题。肽段检测灵敏度差异问题也是目前绝对定量蛋白质组学研究的关键问题。 1 1 质谱平台的组成和原理 自j o s e p hj o h nt h o m s o n 于1 8 8 9 年发明了第一台抛物线质谱装置以来，质谱 技术取得了突飞猛进的发展【7 ，引。最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子 量，随着离子光学理论的发展及质谱技术的改进，其应有范围涉及多个学科领域， 在固体物理、冶金、电子、航天、原子能、化学等领域均有应用。特别是2 0 世纪 9 0 年代以来，e s i 和m a l d i 等新的质谱技术的应用使质谱分析的灵敏度和质量检 第1 页 国防科学技术大学研究生院硕士学位论文 测范围大大提高，使得在p m o l ( 1 0 。1 2 ) 甚至f r n o l ( 1 0 。5 ) 浓度的水平上准确地分析分子 量高达几万到几十万道尔顿的生物大分子成为可能，从而使质谱技术真正步入了 生命科学的研究领域并得到迅速的发展。 在蛋白质组研究中，质谱平台不仅仅指用于质荷比分析的质谱仪，还包括样 品预处理、蛋白质混合物的预分离、蛋白质酶切、肽段的色谱分离等样品处理系 统和生物信息学数据分析工具。质谱仪是利用带电离子在电场或者磁场中的运动 规律来测量离子的质荷比的检测仪器，一般包括进样和电离、质量分析器、离子 检测器等部件。本节主要介绍与肽段检测灵敏度比较密切的反相色谱( r e v e r s ep h a s e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 分离、电离、质量分析器、离子检测器等质谱平台 的主要组成部分。 1 1 1 反相色谱分离 反相色谱是指以强疏水性的填料作固定相，以可以和水混溶的有机溶剂做流 动相的液相色谱。它是一种通用性的液相色谱方法，可以分离多种混合物，应用 极广。 在蛋白质组研究中，反相色谱常常和质谱相结合，构成色谱质谱联用技术， 也是定量蛋白质组学质谱平台的重要组成部分。它利用肽段疏水性差异将肽段混 合物分离，使之按照一定的顺序先后进入质谱仪进行分析，从而降低某一时刻进 入质谱仪的样品复杂度，增强质谱仪的分析能力。质谱平台中的r p l c 一般使用 梯度洗脱( g r a d i e n te l u t i o n ) 的方法。首先在进样过程中将肽段吸附在色谱柱的固定 相上( s t a t i o n a r yp h a s e ) ，然后使用流动相( m o b i l ep h a s e ) 将肽段洗脱下来。由于流动 相疏水性介质的浓度按照线性梯度增强，亲水的肽段先被洗脱，然后疏水的肽段 逐渐被洗脱，通过进样系统依次进入质谱分析，这样就减小了某一时刻质谱分析 的样品的复杂程度。反相色谱分离的物理模型有直观的“塔板理论 ( p l a t et h e o r y m o d e l ) 1 9 】和根据扩散方程和质量守恒得到的偏微分方程理论【1 0 1 。肽段经过色谱分离 后，其浓度流出曲线的峰值时间称为色谱保留时f 司( r e t e m i o nt i m e ，r t ) b i 】。肽段的 色谱保留时间由肽段的序列、样品组成、环境温度、死区时间等因素决定【1 2 1 。 1 1 2 电离技术 由于质量分析器不能对中性的肽段或者蛋白质进行分析，需要首先使其带上 电荷才能够进行质荷比分析。因此，电离技术必不可少。早期的电离技术有快原 子轰击( f a s ta t o mb o m b a r d m e n t ，f a b ) 、化学电离( c h e m i c a li o n i z a t i o n ，c i ) 、电子轰 第2 页 国防科学技术大学研究生院硕士学位论文 击( e l e c t r o nb o m b a r d m e n t ，e b ) 等，但是这些电离技术火都比较剧烈，容易引起过多 化学键的断裂。因此，它们均不适合用于肽段或者蛋白质的分析。 在蛋白质组研究中，被广泛使用的电离技术是e s i i ”】和m a l d i 1 4 】等软电离技 术。e s i 是利用强电场使质谱仪进样端由毛细管流出的液滴带电，在逆向气流的 作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至产生的库仑 斥力与液滴表面张力达到雷利极限，液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重 复使最终的液滴非常细小呈雾状，这时液滴表面的电场非常大，使被测物离子化 并以单电荷或多电荷离子的形式进入质量分析器。m a l d i 是通过将分析物分布在 特定的基质上形成晶体，然后用激光照射晶体，基质分子吸收激光能量，样品解 吸附，基质和样品之间发生电荷转移使样品分子电离，同时基质气化，将样品离 子带入质量分析仪。e s i 和r p l c 能够方便地联用，并且能够使肽段带上多电荷， 可以扩大肽段的分子量分析范围。m a l d i 一般只能使肽段分子带上单电荷，质谱 图较简单，适合多组分样品的分析，且能耐受一定程度的盐和缓冲液。另外，由 于m a l d l 分析时激光是以脉冲方式使分子电离，恰好与飞行时间( t i m eo f f l i g h t ，t o f ) 质量分析器相匹配，组成了基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱 ( m a l d i t o fm s ) ，使其同时具备t o f 质量分析器适用范围广和灵敏度高的优点。 1 1 3 质量分析器 质量分析器是质谱仪的核心部件。按照测量质荷比原理的不同分为t o f 、四 极杆( q u a d r u p o l e ) 、离子阱( i o nt r a p ) 、傅立叶变换( f o u r i e rt r a n s f o r m ) 和电场轨道阱 ( o r b i t r a p ) 等多种类型。表1 1 中给出了这些质量分析器测量质荷比的基本原理。不 同的质量分析器在精度、分辨率、灵敏度、质量检测范围等方面各不相同。例如 t o f 具有比较高的精度，但是容易受到环境温度等因素的干扰；而离子阱对不同 质荷比和不同丰度的离子的灵敏度不同，精度也比较低，但是可以用来存储离子， 可以方便地进行离子筛选和多级质谱分析；f t 具有很高的精度，但是需要离子累 积，产生一张图谱所需要的时间比较长。此外，表1 1 列出了不同质量分析器的 特点，在所给出的参考文献中有这些质量分析器原理的详细介绍。 表1 1 不同质量分析器原理和一般特点 四极杆离子阱线性t o f反射t o f f t m s 电子轨道阱 原理离子在离子在交变电场中离子在均匀同线性离子在磁场离子在交变 交变电的运动，是否在阱电场中的飞 t o f 中的运动：电场中的： 场中的中运动由广义坐标行时间和质 聊z ：七旦 眈= k 告运动荷比的关： 。4 p u 一a j2 a ，2 一七 m ，打z = 2 e u 三2 第3 页 国防科学技术大学研究生院硕士学位论文 吼= 一q r = - 七i 2 e u 确定的稳定区决定 精度 0 0 l o 0 1 ( 1 0 0 p p m ) 0 0 2 0 2 0 0 0 1 o 0 0 0 5 ( 1 0 0 p p ( 2 0 0p p m ) ( 1 0 p p m )( 3 0 0 0 0 01 0 0 0 01 0 0 0 01 0 0 0 0 比范 围 扫描秒级 秒级 微秒级微秒级秒级秒级 速度 特点代价代价低、方便正负代价低分辨率和高分辨率、高分辨率、 低、方离子转换，适合用精度比线高精度高精度 便正负 于m s “性t o f 离子转好 换 串联 m s 2 m s “ m sm s 2m s “m s “ 质谱 串联精度和精度和分辨率较好一般不可用母离子选 高分辨率、高分辨率、 质谱分辨率择受限制高精度高精度 特点较好 参考 1 5 】【1 5 】【1 5 1【1 5 】【1 5 】【1 6 】 文献 应用q -q - s t a rq s t a rl c ql t q - f tl t q - s t a ra b l 4 7 0 0a b l 4 7 0 0 l t qo r b i t r a p l c q a b l 4 8 0 0a b l 4 8 0 0 l t q 注：( 1 ) 各公式含义见相应的参考文献；( 2 ) 灵敏度、分辨率、动态范围等指标随仪器生产商不 同而变化；( 3 ) l t q 、l c q 、l t q - f t 和l t q - o r b i t r a p 是热电从 ( w h e r m of i n n i g a n ，s a nj o s e ，c a ) 的产品，a b l 4 7 0 0 、a b l 4 8 0 0 、q - s t a r 是应用生物系统公司( a p p l i e db i o s y s t e m s ) 的产品。 1 1 4 离子检测器 在质谱仪器中，离子检测器可谓是整个仪器的“眼睛 【1 7 1 。常用的离子检测 器有电子倍增器、微通道板( m i c r o c h a n n e lp l a t e ，m c p ) 检测器、闪烁检测器、感应 电荷检测器等。 第4 页 国防科学技术大学研究生院硕士学位论文 电子倍增器在2 0 世纪3 0 年代末就已被应用于质谱仪器中，具有灵敏度高、 噪声低、响应快、对空气稳定，能直接接收离子等优点，至今仍被广泛应用。电 子倍增器分为分离式和隧道式两种类型1 1 7 j 。两种类型电子倍增器的检测原理相似： 当具有较高动能的正离子打在特制材料制作的转换打拿极上时，能够使打拿极释 放出电子，这种电子具有一定的初动能，在打拿极与电子倍增器之间的电场力作用 下，电子被加速后打在电子倍增器上，由于电子倍增器通道中存在着持续的电势 梯度，使得电子被不断加速，加速后的电子能够再次撞击到电子倍增管壁上，然 后释放出比入射电子多数倍( 典型的为4 倍) 的电子，释放出来的二次电子被电场继 续加速，进行下一级的撞击和放大。放大的增益主要取决于通道长度与内径之比、 电极材料、电极系统的聚焦性能( 取决于电极形状、倾斜角度与电位分布等) 、二 次电子的加速电压、入射离子的能量等i l 引。 微通道板检测器是将电子倍增器微型化后集成而来。它由很多小的直管式电 子倍增器并联组成，排列成紧密的蜂巢状。每个通道直径大约为几十微米，厚度 为几个毫米，离子撞击微通道入口附近的表面产生二次电子，同电子倍增器一样， 多次撞击产生的电子流最终被检测。由于电子的路径较短，得到的信号脉冲较窄( 大 约1n s ) ，噪音较低，线性动态范围较宽( 1 0 4 - 1 0 8 ) 。通常，可以采用2 个或多 个微通道板串联的方式增大增益。 闪烁检测器是为适应m a l d i 发展而来，打破了电子倍增器对较大质荷比离子 的检测限制。同电子倍增器一样，闪烁检测器也是利用离子产生的二次效应来检 测。其差别在于电子倍增器是离子打击阴极产生二次电子，而闪烁检测器是离子 打击闪烁体产生光子，然后用光电倍增器来检测电流。 感应电荷检测器，亦称为成像电流( i m a g i n gc u r r e n t ) 检测器，常与傅立叶变换 离子回旋共振( f t i c r ) 质量分析器联用的检测器。在i c r 中，不同质荷比的离子 在不同的轨道上以不同的频率运动，感应电荷检测器通过对离子运动频率的检测 来分辨不同质荷比的离子。 除上述常用检测器外，最近还出现了一些新型离子检测器，如低温检测器、 微球板( m i c r o s p h e r ep l a t e ，m s p ) 检测器、基于电荷耦合器件( c h a r g e c o u p l e dd e v i c e ， c c d ) 的阵列检测器等。 1 1 5 小结 从以上对质谱平台核心部件的介绍来看，几乎每个实验过程都有不同的实验 仪器可供选择。所以，选择不同的实验仪器可以组合成多种质谱平台。由于不同 实验仪器的实验性能存在差异，所以组成不同的质谱平台之间必然存在检测差异。 目前，t h e r m o 公司生产的l t q f t 质谱仪具有高精度、高通量的特点，已在定量 第5 页 圈防科学技术大学研究宅院硕士学位论文 验数据而展开。 1 2 基于质谱的定量蛋白质组学 随着实验技术的快速进步和问题的不断探索和深入分析，蛋白质组研究取得 了众多的标志性成果，而更加有价值的则是肽段可检测性等新问题的发现和提出。 定量蛋白质组学在生物标志物发现，临床样本诊断等方面有重大的应用前景，在 研究中越来越受重视。其基本的研究方法是通过实验测量，发现不同状态下蛋白 表达差异模式或者大规模地对蛋白质进行绝对定量。 121 基于质谱的定量蛋白质组学面临的挑战 目前，质谱分析是定量蛋白组学研究领域中一项支撑技术i ”】。而“鸟枪法” ( s h o t g u n ) 足其丰流实验策略，一般包括蛋白质酶切 如胰蛋白酶) 、色谱分离和质谱 分析等步骤，得到包括一级图谱( m ss p e ) 和二级图谱( m s m ss p e c t m n ) w 实验 信息，然后利用搜库等算法解析图谱，鉴定、定量肚段和蛋白质。整个流程如图 1 1 所示。 陶1l 基于s h o t g u n 策略质谱分析实验流程 s h o t g u n 策略是一种高通量的实验簧略，在蛋白组研究中发挥了重要作用。但 是，在基于s h o t g l m 策略的质谱实验中，通常可观察到同一个蛋白质的不同组成肽 段对应的质谱响应信号强度不同( 离子流色谱峰面积代表了肽段的整体响应) ，这说 明相同浓度的不同肽段的检测效率是不同的，而且大部分鉴定到的蛋白质只有部 分组成肽段会被检测到。这抟均表明不间肚段的可检测性存在差异，其主要原因 第6 贞 带管笆一分一 国防科学技术大学研究生院硕士学位论文 在于：( 1 ) 样品准备阶段：蛋白提取、溶解等会造成蛋白质的损失或者降解，而损 失多少和蛋白质的物理化学性质有关，从而导致不同蛋白质的提取效率不刚2 0 j ； ( 2 ) 蛋白质酶切阶段：不同肽段的酶切效率不同，存在误切、漏切及色氨酸氧化等 现象【2 l l ；( 3 ) 在线分离阶段：肽段疏水性差异会导致分离效率不同。作为极端例子， 强亲水性和强疏水性肽段很难吸附或洗脱，均难于进入质量分析仪而未能被检测 到田】；( 4 ) 肽段电离阶段：不同肽段电离效率不同。因为同一时间有大量肽段争夺 数量有限的质子，导致仅部分肽段被电离，所以共洗脱肽段( c o e l u t i n gp e p t i d e ) f n - 存 在抑制现象【2 3 1 。此外，因混合物中难挥发性化合物影响肽段雾滴蒸发而导致的离 子抑制效应以及气相中肽段之间非共价相互作用亦会对电离产生影响【2 铊6 1 ；( 5 ) 肽 段检测阶段：质量分析仪检测精度和检测范围的限制导致部分肽段不能被检测到， 被检测到的母离子仅有部分被选择做二级惰性气体诱导碰撞( c i d ) 碎裂，并且离子 导入系统和离子检测器对不同离子捕获效率也会存在差异；( 6 ) 数据库搜索阶段： 同一软件不同搜库参数设置或不同版本得到的鉴定结果都会不一致，不同软件得 到的结果则被证明有很大的互补性【2 7 j 。此外，整个质谱平台分析过程中，环境因 素【2 吼、实验过程中引入的干扰如基质【2 9 】以及图谱中包含的噪声【3 0 1 都会影响图谱质 量，最终也会导致仅有部分肽段被可靠鉴定且已鉴定到肽段检测效率存在差异。 总之，蛋白质组学平台的每一环节都可能在肽段检测中引入偏性，最终导致不同 肽段可检测性不同。 对于实验产生的质谱图，不仅关心峰的位置( 对应的m z ) ，还关心峰的强度， 以及峰强度所代表的肽段量的关系。肽段可检测性差异致使很难确定强度弱的峰 是因为所代表的肽段在样品中含量少还是检测效率低，所以，被鉴定肽段对应的 质谱响应不能直接作为定量结果，以致于很难判断样品中蛋白质的绝对或或相对 含量。因此，肽段可检测性差异使得肽段对应的质谱响应难以给出准确的定量信 息，给蛋白质定量带来了极大的挑战。 1 2 2 基于质谱的定量蛋白质组学现有的技术手段 为了更好的理解细胞机理和寻找生物标志物( b i o m a r k e r ) ，越来越多的研究旨在 定量刻画蛋白质组的特征。作为蛋白质定量分析的关键技术，生物质谱定量通常 可分为两大类：有标定量技术和无标定量技术，这两类方法的基础在于肽段丰度 可以用质谱的响应信号强度来表现。 有标定量技术是建立在同位素稀释理论基础之上的1 3 1 】，即同位素标记的肽段 和未标记的肽段化学性质没有明显差异，由此认为它们在色谱分离和质谱检测过 程中具有相同的检测效率，而质谱仪可以区分它们的质量差，从而得到不同生物 样品来源的蛋白质相对定量结果。目前，多种标记技术已在不同的质谱平台上应 第7 页 国防科学技术大学研究生院硕士学位论文 用，包括在细胞生长过程中引入的代谢标记，如1 5 n 标记【3 2 】和细胞培养液中稳定 同位素氨基酸标记( s i l a c ) 【3 3 】；在肽段酶切过程中引入的1 8 0 标记【3 4 , 3 5 1 ；通过化学 反应引入的同位素编码亲和标签(