靶向性阻断STAT3信号通路增加乳腺癌化疗敏感性的实验研究优秀毕业论文.pdf

目录 缩略词表 1 乒 嚣 中文摘要 2 一 一 皤 英文摘要 4 前言 6刚舀 o 材料和方法 9 1 材料 9 2 方法 1 0 结果 1 7 讨论 2 0 结 仑 2 4 论文图片 2 5 参考文献 o 3 3 综j 丕 3 6 攻读硕士学位期间发表学术论文题目 4 6 临床培训小结 4 7 致谢 4 9 论文声明 5 0 论文审阅认定书 5 l 缩略词英文全称 a d m a d r i a m y c i n a g 4 9 0 d a b d m s o e r f c m i a p i c 5 0 i c c i f n 阿霉素 中文全称 a c y a n o 3 4 h y d r o x y n b e n z y ls t y r e n ea 一氰基一 3 4 一羟基 n a m i n e d i a m i n o b e n z i d i n e d i m e t h y ls m l f o x i d e e s t r o g e nr e c e p t o r f l o wc y t o m e t r y i n h i b i t o ro fa p o p t o s i sp r o t e i n h a l fi n h i b i t i n gc o n c e n t r a t i o n i m m u n o c y t o c h e m i s t r y i n t e r f e r o n j a k s t a tj a n u sk i n a s e s i g n a lt r a n s d u c e r m t t o d p b s p i p r s p s s s t a t 3 m e t h y lt h i a z o l y lt e t r a z o l i u m o p t i c a ld e n s i t y p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p r o p i d i u mi o d i d e p r o g e s t e r o n er e c 印t o r 苄苯乙烯胺 二氨基联苯胺 二甲基亚砜 雌激素受体 流式细胞仪 凋亡抑制蛋白 半数抑制浓度 免疫细胞化学 干扰素 j a k 激酶 信号转导核转录 激活 甲基噻唑基四唑 光密度 磷酸盐缓冲液 碘化丙啶 孕激素受体 s t a t i s t i c a lp a c k a g eo fs o c i a ls c i e n c e s社会科学统计软件包 s i g n a l t r a n s d u c e r sa n da c t i v a t o r so f 信号转录与转录活化因子3 t r a n s c r i p t i o n3 卜 气 徐i i 1 医学院硕士学位论文 靶向性阻断s t a t 3 信号通路增加乳腺癌化疗敏感性的实验研究 中文摘要 目的探讨s t a t 3 信号通路特异性阻断齐t j a g 4 9 0 联合化疗增加乳腺癌细胞株 化疗敏感性的实验研究 并观察a g 4 9 0 对细胞凋亡抑制蛋白s u r v i v i n 表达的影响 方法 1 实验分组 对照组 只加d m e m 培养液 虿 a g 4 9 0 处理组 加入含 浓度1 0 9 m o l l 2 0 9 m o l l 4 0 i t m o l l 8 0 1 x m o l l 1 6 0 1 a m o l l 的培养液 a d m 处理组 加入含浓度0 0 0 5 9 9 m l 0 0 5 i t g m l 0 5 i t g m l 5 1 x g m l 5 0 1 l g m l 的培养液 联 合处理组 2 通过四甲基偶氮唑蓝 m t t 比色法观察a g 4 9 0 a d m 单药及联合用 药对细胞增殖活力的影响 计算细胞生长抑制率和半数抑制浓度 i c 5 0 3 采用流式细胞仪 f c m 检测各实验组乳腺癌m d a m b 2 3 1 细胞株7 2 h 的凋亡率 以及细胞周期的分布 4 应用免疫细胞化学 i c c 染色技术观察各实验组s u r v i v i n 蛋白的表达情 况 实验对照组除加入同等浓度的d m s o 外 均不加任何干扰因素 结果 1 m t t 观察到随着作用浓度的增加和作用时间的延长 a g 4 9 0 对 m d a m b 2 3 1 细胞的抑制作用也随着增强 随着a d m 作用浓度的增加 药物对 m d a m b 2 3 1 细胞的生长抑率也随着升高 与a d m 组相比 a g 4 9 0 a d m 组使 m d a m b 2 3 1 细胞抑制率上升更明显 p 1 2 流式细胞术检测结果显示 a g 4 9 0 使m d a m b 2 3 1 细胞细胞周期阻滞 2 徐州医学院硕士学位论文 在g l 期 a g 4 9 0 组 a d m 组 a g 4 9 0 a d m 组的凋亡百分数均高于对照组 差 异有统计学意义 p o 0 5 a g 4 9 0 a d m 组作用于m d a m b 2 3 1 细胞7 2 h 后的 凋亡百分数为2 0 7 6 士2 7 3 显著高于a d m 组 其细胞凋亡百分比为1 0 3 5 4 2 6 6 差异有统计学意义 p o 0 5 3 免疫组化显示a g 4 9 0 组 a g 4 9 0 a d m 组作用7 2 h 后 m d a m b 2 31 细胞中s u r v i v i n 蛋白表达量明显低于对照组和a d m 组 结果有统计学差异 p 0 0 5 结论 1 a g 4 9 0 抑制人乳腺癌m d a m b 2 3 1 细胞株的增殖 促进细胞凋亡 2 a g 4 9 0 下调s u r v i v i n 蛋白的表达抑制人乳腺癌m d a m b 2 3 1 细胞株的增殖 促进细胞凋亡 3 a g 4 9 0 联合a d m 显著下调s u r v i v i n 蛋白的表达 4 a g 4 9 0 联合a d m 对人乳腺癌m d a m b 2 3 1 细胞株的抑制作用明显增强 提 示a g 4 9 0 联合a d m 对m d a m b 2 3 1 细胞增殖抑制具有协同作用 关键词乳腺肿瘤信号通路j a k s t a ta g 4 9 0 化疗 徐i i 1 医学院硕 i 学位论文 s t u d yo fb l o c k a d i n gs t a t 3s i g n a lp a t h w a yi n c r e a s e d 一一n s e n s i t i z a t i o nt oc h e m o t h e r a p y0 tb r e a s tc a n c e r a b s t r a c t o b j e c t i v e t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fs t a t 3s i g n a lp a t h w a ys e l e c t i v ei n h i b i t o r a g 4 9 0o nc h e m o t h e r a p ys e n s i t i v i t yi nb r e a s tc a n c e rc e l ll i n em d a m b 2 3 1 a n d o b s e r v et h ee f f e c t so fa g 4 9 0o nt h ee x p r e s s i o no fs u r v i v i n m e t h o d s 1 w ec u l t u r e dt h eh u m a nb r e a s tc e l ll i n em d a m b 一2 31c e l l e s s a yg r o u p i n g a n dm e a s u r e d c o n t r o lg r o u p o n l yt r e a t e dw i t hd m s o a g 4 9 0 t r e a t e dg r o u p m d a m b 一2 31c e l lw e r ec u l t u r e da n dt r e a t e dw i t ha g 4 9 0w i t ht h ec o n c e n t r a t i o n so f 10 p m o l l 2 0 t m o l l 4 0 i t m o l l 8 0 1 a m o l l 16 0 p m o l lf o r 2 4 4 8 7 2 h o u r s r e s p e c t i v e l y a d m t r e a t e dg r o u p m d a m b 一2 3 1c e l lw e r ec u l t u r e da n dt r e a t e dw i t h a d mw i t ht h ec o n c e n t r a t i o n so f 0 0 0 5 1 x g m l 0 0 5 1 x g m l o 5 i x g m l 5 1 x g m l 5 0 g m lf o r 7 2h o u r s a g 4 9 0 a d m t r e a t e dg r o u p 2 m t ta s s a yw a su s e dt oo b s e r v et h eg r o w t hs u p p r e s s i v er a t eo fm d a m b 2 3 1 3 t h ef l o wc y t o m e t r y f c m w a su s e dt oi n v e s t i g a t et h ea p o p t o t i cr a t ea n dc e l l c y c l ed i s t r i b u t i o n 4 t h ee x p r e s s i o no fs u r v i v i ng e n e sr e l a t e dt oa p o p t o s i sw e r ed e t e r m i n d e db y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t h ec o n t r o lg r o u pw a st r e a t e dw i t ht h es a m ec o n c e n t r a t i o n d m s o r e s u l t s 1 b ym t t t h ei n h i b i t i o nr a t eo fm d a m b 2 31c e l lw a so b s e r v e do nt h er i s e w i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o na n dt h ee l o n g a t i o no ft h et r e a t e dt i m eo fa g 4 9 0 t h e i n h i b i t i o nr a t eo fm d a m b 2 31e e l lw a so b s e r v e do nt h er i s ew i t ht h ei n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o no fa d m c o m p a r e dw i t has i n g l ea g e n t a d mc o m b i n e dw i t ha g 4 9 0 c o u l dm a k em d a m b 2 31c e l li n h i b i t i o nr i s i n gf u r t h e r m o r e t h ed if f e r e n c ew a s s t a t i c a l l ys i g n i f i c a n t p 1 2 f l o wc y t o m e t 叫r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ec e l lc y c l ew a sr e d i s t r i b u t e d t h eg1 p h a s ee e l lf r a c t i o nw a sc o n s p i c u o u si n c r e a s e dw h i l et h es p h a s ee e l lf r a c t i o n w a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e da f t e rt h ec e l l sw e r et r e a t e dw i t ha g 4 9 0 p 0 0 5 t h e a p o p t o t i cr a t e so fa g 4 9 0 t r e a t e dg r o u p a d m t r e a t e dg r o u fa n da g 4 9 0 a d m t r e a t e d g r o u ph a d i n c r e a s e dm o r et h a nt h ec o n t r o lg r o u p p o 0 5 t h ea p o p t o t i er a t eo f a g 4 9 0 a d m t r e a t e dg r o u pw a s2 0 7 6 a 2 7 3 w h i c hw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n t h a to ft h ea d m t r e a t e dg r o u p 10 3 5 1 2 6 6 p 0 0 5 3 t h ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r ym a yo b s e r v ea f t e ra g 4 9 0 一t r e m e dg r o u p a g 4 9 0 a d m t r e a t e dg r o u pt r e a t i n gm d a m b 2 31c e l l7 2h o u r s i nc o n t r a s tt oc o n t r o l g r o u pa n d a d m t r e a t e dg r o u p t h es u r v i v i np r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e l o b v i o u s l y d o w n r e g u l a t e di nm d a m b 2 3 1 p o 0 5 c o n e l u s i o n s 1 a g 4 9 0i n h i b i t e dc e l lg r o w t h t h em e c h a n i s mo fw h i c hr e l a t e st oa p o p t o s i s i n d u c t i o no nm d a m b 2 3lc e l l s 2 a g 4 9 0i n h i b i t e dt h eg r o w t ho ft h em d a m b 2 31c e l l sa n dp r o m o t e di t s a p o p t o s i sv i ad o w n r e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no f s u r v i v i n 3 t h ee x p r e s s i o no fs u r v i v i nw a so b v i o u s l yd o w n r e g u l o t e da f t e rt r e a t e dw i t h a g 4 9 0c o m b i n e dw i t ha d m 4 t h ea p o p t o t i ci n d e xw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da f t e rt r e a t e dw i t ha g 4 9 0 c o m b i n e dw i t ha d m s u g g e s t i n gt h a tt h ec o m b i n a t i o no ft h e mc o u l de x e r ts y n e r g i s t i c a n t i p r o l if e r a t i v ee f f e c to nm d a m b 2 3 1c e l l k e y w o r d sb r e a s tn e o p l a s m s i g n a lp a t h w a y j a k s t a ta g 4 9 0 c h e m o t h e r a p y 5 乳 原因 全世界每年约有1 2 0 万妇女患乳腺癌 5 0 万妇女死于乳腺癌 其发病率几乎在 世界范围内呈明显上升趋势 全球范围内 北美和欧洲地区是乳腺癌高发区 我国 属于乳腺癌低发国家 但近年来沿海大城市的发病率及死亡率都有所升高 1 1 目前 乳腺癌的治疗模式为手术 放疗 化疗和内分泌治疗为主的综合治疗模式 化疗 在乳腺癌的综合治疗中占有十分重要的地位 化疗药物的应用极大地提高了乳腺 癌患者的生存率 葸环类抗癌药物在乳腺癌化疗中占主导地位 阿霉素是在临床上广泛应用的 一种化疗药物 具有抗瘤谱广 抗瘤作用强等特点 特别是对乳腺癌有显著疗效 2 1 研究表明阿霉素通过多种机理作用于肿瘤 3 1 目前认为阿霉素抗肿瘤的主要作用 机制为嵌入d n a 的相邻碱基对之间 使d n a 链裂解 阻碍d n a 复制 并阻断r n a 聚合酶 抑 i r n a 合成f 4 1 近年来在乳腺癌的治疗过程中出现的化学治疗耐药和化学药物的毒副作用 为乳腺癌的综合治疗效果提出了新的挑战 筛选一些药物以增强葸环类药物的抗 肿瘤作用和或减轻药物毒性减少剂量 可能成为突破肿瘤治疗的 瓶颈 乳腺癌是一个多因素 多突变积累的过程 其发病的病因尚未清楚 近年来随 着分子生物学研究领域的迅猛发展 人们对乳腺癌的发病机理及治疗在分子水平 上的探讨也更趋广泛 并且已取得了一定成果 目前 人们对乳腺癌发生 发展及 转移过程中相关蛋白质的过度表达或异常激活的研究更为关注 其中信号转导与 转录活化因子3 s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t i o n3 s t a t 3 与乳腺 癌的相关性研究尤为引人注目 s t a t 3 过度激活导致细胞的异常增殖和凋亡障碍 促进正常乳腺细胞发生恶性转化 s t a t 3 是信号传导与转录活化因子家族的重要成员 存在于胞浆 激活后能够 6 0 徐州医学院硕士学位论文 转入核内与d n a 结合 具有信号转导和转录调控双重功能 在乳腺癌 头颈鳞癌 结直肠癌 多发性骨髓瘤等多种肿瘤组织中过表达 与肿瘤的增殖 分化 凋亡 转移等密切相关 己被公认为癌基因 以s t a t 3 为靶点的靶向治疗己成为目前肿 瘤治疗的研究热点 近年来 有研究表明 s t a t 3 信号通路过度激活可能介导肿 瘤细胞对化疗药物产生耐药 利用特异或非特异性阻断剂阻断s t a t 3 信号通路可 诱导凋亡 逆转耐药 5 1 目前应用较多的是j a k 激酶抑制剂a g 4 9 0 a g 4 9 0 即q 一氰基一 3 4 一羟基 n 一 苄苯乙烯胺 是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物 分子式为 c 1 7 h 1 4 n 2 0 3 分子量为2 9 4 3 结构类似酪氨酸 可以和受体酪氨酸激酶竞争结合 位点 是j a k 2 激酶抑制剂 可特异性阻断s t a t 3 信号通路 1 已有越来越多的研究 7 9 1 将a g 4 9 0 作为s t a t 3 信号通路阻断剂用于恶性肿瘤的靶向治疗 s t a t 3 下游的靶基因包括 1 0 i b c l 2 b c l x l c y c l i n d m c l 1 s u r v i v i n 等 在人类多发性骨髓瘤 头颈鳞状细胞癌 淋巴瘤细胞中 阻断s t a t 3 信号通路诱 导细胞凋亡 降低抗凋亡基因的表达 这些抗凋亡基因编码b c l 2 家族成员 如 b c l x l 和m c l i t l l 1 3 阻断s t a t 3 信号通路对下游的靶基因如 b c l 2 b c l x l c y c l i n d m c l 1 的研究已有大量报道 但s u r v i v i n 蛋白研究的较少 g r i t s k ot t l 4 1 等用反义核苷酸技术阻断s t a t 3 信号通路 在乳腺癌细胞中微点阵分 析显示s u r v i v i n 作为s t a t 3 下游的一种直接的靶基因 该基因对细胞存活至关重 要 同时发现 s t a t 3 信号通路的持续激活促进乳腺癌恶化及对化疗产生抵抗 至少在一定程度上 诱导抗凋亡蛋白s u r v i v i n 的表达 目前 a g 4 9 0 作为抗肿瘤药物已用于治疗白血病 但由于疗效相对欠佳 限制 了其在临床的广泛应用n 明 同时a g 4 9 0 在其他肿瘤方面尚处于实验室阶段 没有 相关临床治疗指南 而且关于j a k 激酶抑制剂a g 4 9 0 对乳腺癌治疗尚处于实验室 阶段 与化疗药物联合应用研究国内尚未见相关报道 a g 4 9 0 联合化疗对s u r v i v i n 的表达研究尚未见报道 7 徐州医学院硕士学位论文 本课题研究拟采用人乳腺癌细胞系m d a m b 2 31 细胞 应用j a k 激酶选择 性抑制剂a g 4 9 0 联合化疗 探讨其能否增加乳腺癌细胞株的化疗的敏感性 并观 察其下调s u r v i v i n 蛋白表达的能力 为靶向药物联合化疗药物治疗乳腺癌提供一 种理论和实验依据 徐少i 1 医学院硕士学位论文 材料和方法 l材料 1 1 试剂 人乳腺癌细胞株m d a m b 一2 31 a g 4 9 0 a d m s u r v i v i n 抗体 羊抗兔i g g 抗体 即用型s a b c 免疫组化试剂盒 细胞周期试剂盒 d m e m 新生牛血清 m t t 粉剂 p b s 粉剂 d a b 显色试剂盒 胰酶 1 2 主要仪器 k d c 4 0 低速离心机 2 5ul 2 0ul 2 0 0ul 1 0 0 0ul 微量移 液器 m u l t i s k a ns p e c t r u m 全波长酶标仪 h h w 2 1 4 2 0 s 数显电热恒温水温箱 j a 3 0 0 3 n 电子天平 w d 9 4 0 5 b 水平摇床 9 武汉博士德有限公司 武汉博士德有限公司 联科生物技术有限公司 北京索莱宝科技有限公司 四季青生物工程材料有限公司 北京鼎国生物技术有限公司 北京中杉公司 北京中杉公司 美国s i g m a 公司 科大创新股份有限公司 德国e p p e n d o r f 公司 芬兰t h e r m os c i e n t i f i c 公司 上海跃进医疗器械厂 上海精科公司天平仪器厂 北京市六一仪器厂 徐州医学院硕 j 二学位论 y j 1 4 5 0 d 医用净化工作台 4 c 冰箱 8 0 冰柜 制冰机 倒置显微镜 电热恒温干燥箱 c 0 2 恒温培养箱 1 3 试剂配制 1 3 1 4 多聚甲醛 磷酸二氢钠 氢氧化钠 10 0 0 m l p h 7 2 7 4 多聚甲醛 n a 2 h p 0 4 2 h 2 0 n a o h 蒸馏水 4 0 9 1 6 8 8 9 3 8 6 9 9 0 0 m l 美国f o r m a 公司 用n a o h 或h c l 调p h 7 2 7 4 蒸馏水定容至1 0 0 0 m l 4 c 冰箱保存备用 下同 1 3 2 胰酶消化液的配制 0 2 5 9 胰蛋白酶 p b s l 0 0 m l 配成0 2 5 的胰蛋白酶消化液 一次性针式滤器 正压除菌过滤 1 0 m 1 分装 1 周内4 保存 1 周以上一2 0 2 冻存 1 3 3a g 4 9 0 溶液的配制 a g 4 9 0 由i n v i t r i g e n 提供 用d m e m 液配制成母液1 6 0 u m o l l 一次性针式滤 器正压除菌过滤 1 0 m 1 分装 1 周内4 c 保存 1 周以上 2 0 2 冻存 2 方法 2 i 细胞培养 1 0 徐州医学院硕士学位论文 人乳腺癌细胞株m d a m b 2 3 1 常规培养在含有l o d x 牛血清 1 0 0 u m l 青霉素 和l o o u m l 链霉素的培养液d m e m 中 置于3 7 5 c 0 及饱和湿度的培养箱内 根据细胞生长状态待其贴壁生长至8 0 一9 0 融合时 用p b s 缓冲液洗涤细胞两次 后 加入约1 5 m l o 2 5 胰蛋白酶消化细胞 显微镜下观察待细胞大部分变圆后 弃去消化液 加入l o d x 牛血清的d m e m 培养液5 m i 于培养瓶 用吸管吸取瓶内培 养液 反复充分吹打瓶壁细胞 制成单细胞悬液 再根据一瓶传两瓶或三瓶的原 则 加入适量含有l o d x 牛血清 l o o u m l 青霉素和l o o u m l 链霉素的d m e m 培养 液混匀后分别装入各瓶 置于3 7 c 5 c 0 及饱和湿度的培养箱内培养 待细胞生 长状态稳定 呈对数生长期 用于实验 2 2 倒置光学显微镜下观察细胞形态 待细胞生长状态稳定 呈对数生长期 于倒置显微镜下观察细胞形态 2 3 细胞转板培养 取生长状态良好的m d a m b 2 3 1 细胞 采用一般传代方法进行消化 制成单细 胞悬液 取少许细胞悬液于计数板显微镜下计数 稀释到5xi 0 4 r a m 3 的细胞数接 种于置有盖玻片的6 孔或9 6 孔培养板中 待细胞贴壁长至对数生长期即可进行实 验干预 2 4 细胞计数器计数 取生长状态良好的m d a m b 2 3 1 细胞 采用一般传代方法进行消化 制成单细 胞悬液 取少许细胞悬液 计数板上盖玻片一侧加微量细胞悬液 进行计数 血 细胞计数器含有两个室 每个室中细刻9 个i m m 2 大正方形 其中4 个角落之正方 形再细刻1 6 个小格 深度均为0 i m m 在显微镜下 用l o x 物镜观察计数板四角 徐州医学院硕 l 学位论文 大方格中的细胞数 使用时 将计算结果代入下式 得出细胞密度 细胞数 原液 4 大格细胞数之和 4 x1 0 4 2 5m d a m b 一2 3 1 细胞生长曲线的建立 1 按上述计数方法调好细胞浓度 以3x1 0 4 m l 的细胞浓度将细胞悬液 于2 4 孔培养板 每孔2 0 0 u l 共2 4 孔 5 c 0 2 条件下 3 7 c 培养箱常规培养 7 天 2 每天取3 孔进行细胞计数 其结果取平均值 共7 天 以各自均值绘制 细胞生长曲线 2 6 实验分组 实验中将细胞分成4 组 对照组 只加d m e m 培养液 萤a g 4 9 0 处理组 加入终浓度1 0 i t m o l l 2 0 i t m o l l 4 0 i r t m o l l 8 0 p m o l l 1 6 0 1 t m o l l 的培养液 a d m 处理组 加入终浓度0 0 0 5 1 t g m l 0 0 5 p g m l 0 5 1 上g m l 5 1 a g m l 5 0 1 l g m l 的培 养液 联合处理组 a g 4 9 0 2 0 m o l l a d m 0 5 1 x g m 1 2 7m t t 比色分析法检测细胞生长抑制作用 2 7 1 测定a g 4 9 0 a d m 单药对细胞增殖率的影响 1 用小号培养瓶培养细胞 待细胞长满后加入0 2 5 胰蛋白酶进行消化约3 分 钟 d m e m 培养液终止消化 2 移入l o m l 离心管离心 再重悬于培养液 用计数板在倒置显微镜下进行计 数 调整细胞悬液至细胞密度为5 x1 0 4 m l 每孔加细胞悬液1 0 0 1 d 即5 x1 0 3 孔 接 种于9 6 孔板 3 设实验孔 加药 和对照孔 不加药物 只加d m e m 每个浓度再设6 个复孔 1 2 徐州医学院硕士学位论文 箱培养2 4 h 4 8 h 7 2 h 将9 6 孔板置于3 7 c 5 c 0 2 饱和湿度培养 4 换液 对照组加入1 0 0 1 t l 培养液 实验孔分别加入8 0 1 t l 培养液以及不同浓 度的a g 4 9 0 a d m 药物各2 0 1 t l 5 继续培养2 4 h 4 8 h 7 2 h 后取出9 6 孔板 每孔加入m t t 液2 0 1 x l 5 m g m l 3 7 孵育4 h 6 弃去上清液 每孔加入d m s 0 1 5 0 9 l 轻轻振荡1 0m i n 使结晶物充分溶解 7 在自动酶标仪 波长4 9 0a m 上测定各孔光密度值 o d 值 以上实验重复 3 次 8 计算细胞生长抑制率 卜实验组o d 值 对照组o d 值 x1 0 0 同时求出 药物半数抑制浓度i c 5 0 2 7 2 测定a d m a g 4 9 0 联合对m d a m b 2 3 1 细胞增殖率的影响 方法同2 2 1 加入不同浓度化疗药物a d m 以及2 0 1 t ma g 4 9 0 继续培养7 2 h 用上述m t t 法测定细胞抑制率及半数抑制浓度 以上实验重复3 次 联合用药效 果根据文献提供的金氏公式q 值 进行判断 当q l 时表示增强作用 2 8 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率 1 取对数生长期的m d a m b 一2 3 1 细胞 每孔以1 1 0 6 个细胞数 接种于六孔培养 板中 2 4h 后换液 设对照组 不加药物 a g 4 9 0 2 0l am 组 a d m 0 5 u g m 1 组及a d m 0 5 u g m 1 a g 4 9 0 2 0 um 组 每组均重复3 孔 2 培养7 2 h 后收集所有悬浮及贴壁细胞 将培养细胞用0 2 5 胰蛋白酶消化3 m i n 倒置显微镜下见细胞见呈现筛状间隙或者变圆球形 弃去消化液 加p b s 徐州医学院硕士学位论文 3 用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来并移入离心管中 离心1 0 0 0 r m 5 m i n 弃上清液加p h7 4p b s5 m l 再离心1 0 0 0 r m i n 3 m i n 重复3 次 细胞悬液中的碎片 4 加少许p b s 轻轻吹打沉淀的细胞 加入7 0 冷乙醇4 固定1 8 h 以上 5 检测前p b s 洗两次 调细胞浓度为1x1 0 6 m l 加入l m l 的p i 配制染液 酶 终浓度为5 0m g l p i 终浓度为2 0m g l 进行消化 暗处避光染色3 0m i n 上流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率 2 9 s a b c 法检测m d a m b 一2 3 1 细胞中s u r v i v i n 蛋白表达的影响 取对数生长期的m d a m b 一2 3 1 细胞 采用一般传代方法进行消化 制成1x1 0 5 的单细胞悬液 接种于预先铺有盖玻片的无菌6 孔培养板中 每孔2 o m l 培养至 对数生长期 对照组加等体积浓度d m s o 每组设6 个孔 培养7 2 h 后 倾去培养 液 p b s 洗两次 每次3m i n 每孔加4 多聚甲醛2 m l 固定细胞3 0m i n 按以下 流程进行细胞免疫组化染色 1 每孔加入0 0 1 t r i t o n1m 1 孵育1 5m i n 溶解脂质 以增加抗体对细胞膜 的通透性 一 2 p b s 冲洗 3m i nx3 次 3 加入3 h 0 2 孵育1 5m i n 以消除内源性过氧化物酶活性 4 p b s 冲洗 3m i nx3 次 5 山羊血清工作液封闭 室温孵育1 5m i n 倾去 勿洗 6 滴加浓缩型兔抗人s u r v i v i n 抗体 稀释比例1 1 0 0 4 过夜 7 p b s 冲洗 3m i nx3 次 1 4 1 1 1 1 1 1 徐州医学院硕士学位论文 滴加生物素化二抗工作液 3 7 c 孵育3 0m i n 9 p b s 冲洗 3m i n 3 次 1 0 滴加a b c 复合物 3 7 c 孵育1 5m i n l l p b s 冲洗 3m i n x3 次 1 2 滴加新鲜配制的d a b 稀释液 1 2 0 4 6 滴 显微镜下控制显色 阳性显色 为棕黄色 d a b 显色剂使用前按说明严格配制 1 3 p b s 冲洗 3m i nx3 次 1 4 显微镜下观察 并照相 2 8 1 结果判定 双目显微镜下观察 在细胞爬片上 细胞浆核显示呈棕黄或棕褐色 为阳性 反应 且着色强度明显高于背景者为阳性细胞 评分方式结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面进行 1 阳性细胞百分比 阳性细胞百分比1 0 以下 阳性细胞百分比1 0 2 5 以下 阳性细胞百分比2 6 5 0 以下 阳性细胞百分比5 1 7 5 以下 阳性细胞百分比7 5 以上 2 细胞着色强度 无着色 弱 浅棕黄色 中 棕黄色 0 分 1 分 2 分 3 分 4 分 0 分 1 分 2 分 强 棕褐色 3 最后记分 两种记分方法相加 0 1 分为 一 阴性 2 3 分为弱阳性 4 5 分为中阳性 6 7 分为强阳性 2 9 统计学方法 采用s p s s l 3 0 统计软件对数据进行统计学分析 计量资料用方差分析 数值 表达以均数 标准差 孑如 表示 频数表资料及等级资料采用k r u s k a l w a l lh 检验 计数资料用卡方检验 按a 0 0 5 水准 p o 0 5 为差异有显著性 1 6 1 倒 中央 h 后 入对数生长期 2 m d a m b 2 3 1 细胞生长曲线 m d a m b 2 3 1 细胞为贴壁生长的细胞 镜下呈扁平多角形 中央有圆形核 调好细胞悬液浓度 以3 x 1 0 m l 的细胞浓度接种于2 4 孔培养板 每2 0 0 u l 共 2 4 孔 5 c 0 2 条件下 3 7 培养箱常规培养 每天取3 孔进行细胞计数 其 结果取平均值 共7 天 以各自均值绘制细胞生长曲线 见图2 从图2 可 看出 m d a m b 2 3 1 细胞第一 二天生长缓慢 从第三天开始快速生长 进入对 数生长期 第六天开始进入平台期 第七天有所下降 3 m t t 检测细胞增殖结果 3 1 m t t 观察到a g 4 9 0 终浓度为 1 0 9 m o l l 2 0 1 m a o l l 4 0 p m o l l 8 0 1 t m o l l 1 6 0 1 t m o l l 处理m d a m b 一2 3 1 乳腺癌细胞株2 4 h 时 细胞抑制率分别为 8 5 6 2 2 2 1 0 8 9 士2 2 3 2 2 6 9 士3 0 2 3 7 8 7 4 3 2 4 4 2 6 7 士3 3 8 4 8 h 时 细胞抑制率分别为1 9 3 7 士1 4 6 2 2 0 4 4 1 2 7 4 0 3 8 士2 3 7 6 0 2 4 士4 0 1 6 4 8 9 士4 4 5 其i c 5 0 7 6 5 5 9 m o l l 7 2 h 时 细胞抑制率分别为2 8 2 6 士5 1 1 4 2 0 5 4 3 7 5 2 9 2 4 3 5 6 7 1 8 4 士3 4 7 8 0 3 2 士1 9 2 作用7 2 h 的i c 5 0 为 3 6 9 g m o l l 结果表明随着作用浓度的增加和作用时间的延长 a g 4 9 0 对m d a m b 2 3 1 细胞的抑制作用也随着增强 见表1 图3 同时我们发现 随着作用时间延长 至7 2 h 时i c 5 0 值下降 即达到半数抑制率时的药物浓度可相应降低 我们选取小 于7 2 h 的i c 5 0 值2 0 1 t m o l l 用于实验研究 1 7 徐州医学院硕士学位论文 3 2 a d m 终浓度为0 0 0 5 1 t g m l 0 0 5 p g m l o 5 g m l 5 1 t g m l 5 0 1 t g m l 的处理 m d a m b 2 3 1 乳腺癌细胞7 2 h 时 细胞抑制率分别4 5 5 士0 7 7 1 4 2 8 1 7 9 3 1 3 8 1 2 1 0 5 4 1 6 士2 3 0 7 5 7 9 土2 6 1 其i c 5 0 为 3 3 0 1 x g m l 结果表明随 着a d m 作用浓度的增加 药物对m d a m b 2 3 1 细胞的生长抑率也随着升高 呈 剂量依赖性特点 见表2 图4 3 3a g 4 9 0 2 0 1 t m o l l 与a d m 联合处理m d a m b 2 31 乳腺癌细胞株7 2 h 时 细胞抑制率为2 2 8 0 士4 2 4 3 0 7 9 a 6 3 7 5 6 9 7 士4 9 3 7 4 2 9 士4 1 7 8 7 7 0 士4 7 6 其i c 5 0 为o 6 7p m l 与单药相比 a g 4 9 0 与a d m 联合使 m d a m b 2 3 1 细胞抑制率上升更明显 差异有统计学意义 p 1 3 4a g 4 9 0 作用m d a m b 2 31 细胞7 2 h 后的半数抑制浓度 i c 5 0 为3 6 9i t m o l 1 a d m 作用m d a m b 2 3 1 细胞7 2 h 后的半数的抑制浓度 i c 5 0 为3 3 0 1t x g m l 本实验选择小于i c 5 0 的a g 4 9 0 浓度2 0p m o l 1 和a d m 浓度0 5i t g m l 用于研究 4 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率 各实验组经流式细胞术检测的细胞周期及凋亡率数值见表3 及图5 图6 图 7 a g 4 9 0 2 0 m 处理m d a m b 2 3 1 细胞7 2 h 后 细胞周期阻滞于g 1 期 s 期比例明显减少 与对照组相比较 差异有统计学意义 p o 0 5 对照组的凋亡 百分数为6 4 7 士1 6 3 a g 4 9 0 组的凋亡百分数为9 8 3 士1 6 7 a d m 组的凋亡百分数为 1 0 4 2 士2 5 0 a g 4 9 0 a d m 组的凋亡率百分数为2 0 7 6 士2 5 5 与对照组相比 差异有 统计学意义 p o 0 5 a d m o 5i t g m 1 a g 4 9 0 2 0 1 t m 组作用于m d a m b 一2 3 1 细胞后的凋亡率显著高于单用a d m 组 差异有统计学意义 p o 0 5 5 细胞免疫组化检测a g 4 9 0 和a d m 对m d a m b 2 3 1 细胞s u r v i v i n 表达的影响 对照组 a g 4 9 0 2 0l am o l 1 组 a d m o 5ug m 1 组和a g 4 9 0 a d m 2 0 u m o l l 0 5 l ag m 1 组中m d a m b 2 3 1 细胞经作用7 2 h 后 采用s a b c 法检测细 1 8 徐州医学院硕士学位论文 胞内s u r v i v i n 蛋白的表达 结果显示s u r v i v i n 在细胞核和细胞浆中均表达 可见棕 黄色颗粒 n 18 1 a g 4 9 0 组和a g 4 9 0 a d m 组细胞中s u r v i v i n 蛋白表达量明显低于 对照组和a d m 组 结果有统计学差异 p o 0 5 表4 图8 1 9 讨论 乳腺癌是妇女的常见肿瘤 严重威胁着妇女的健康 我国乳腺癌发病率逐年 上升 综合治疗是目前乳腺癌治疗的最佳模式 其中化学治疗是主要的治疗方法 随着乳腺癌是一种全身性疾病的深入认识 人们对乳腺癌的治疗理念从传统的 最 大的可耐受治疗 转向 最小的有效治疗 传统细胞毒性药物仍将是乳腺癌药物 治疗的主题 新一代抗癌药物的陆续问世和应用 化疗药物的剂量加大和造血生 长因子广泛应用 乳腺癌的治疗有了长足的进步 但多药耐药现象仍不可避免 是 导致乳腺癌治疗失败的主要原因 同时化疗副作用也是临床上面临的最常见的问 题 严重阻碍了化疗药物的应用 导致肿瘤治疗失败 近年来对肿瘤细胞生长 增殖 凋亡的分子机制研究的不断深入 针对 h e r 2 n e u 基因研发的单克隆抗体新药h e r c e p t i n 治疗乳腺癌的成功 使我们重新 认识到目前药物治疗正从单纯细胞毒性攻击过渡到分子靶向治疗的新阶段 在许多恶性肿瘤的发生 发展及预后中信号转导通路的重要性越来越受到大 家的关注 近年来发现j a k s t a t 途径的激活 特别是s t a t 3 的激活 对于细 胞的生长 增殖和转化产生重要影响 信号传导与转录活化因子家族 s i g n a l t r a n s d u c e r sa n da c t i v a t o r so f t r a n s c r i p t i o n s t a t 是一类脱氧核糖核酸结合蛋白 由7 5 0 8 5 0 个氨基酸组成 分子量为8 4 11 3 k d a s t a t 3 是信号传导与转录活化因 子家族的重要成员 编码s t a t 3 的基因在人类定位于第1 7 号染色体q 2 1 1 其结 构可分为6 个功能区 1 氨基端的保守序列为s t a t 3 和其他转录因子之间作 用 s t a t 3 二聚体的形成和细胞因子受体间的结合等功能所必需 2 卷曲螺旋 区 3 d n a 结合域 4 s h 2 结构域 其主要功能是促使s t a t 3 分子与活化的受 体形成复合物 介导j a n u s s t a t 的相互作用 使s t a t 3 形成二聚体 5 7 0 5 位酪氨酸磷酸化位点 该位点磷酸化激活s t a t 3 并形成二聚体 是s t a t 3