（物理化学专业论文）生物兼容的磁性纳米粒子的制备及其在细胞分离方面的研究.pdf

上海师范大学硕士学位论文摘要 中文摘要 论文题目：生物兼容的磁性纳米粒子的制备及其在细胞分离方面的研究 学科专业：物理化学 学位申请人：张春明 指导老师：董亚明教授 随着纳米技术的发展，包含两种或两种以上纳米尺度功能材料的复合纳米粒 子已经成为当前材料学一个越来越活跃的研究领域，且二氧化硅包裹的磁性纳米 粒子也逐渐引起人们的关注。作为种新型的功能材料，磁性纳米粒子在生物医 学、细胞学和生物工程学等领域有着广泛的应用。磁性二氧化硅纳米粒子的广泛 应用主要得益于二氧化硅显著的优点：( 1 ) 生物相容性好，具有生物惰性，极大 地改善粒子的分散性，且在人体中稳定性高；( 2 ) 易功能化，存在丰富的羟基官 能团，可以很容易地与醇类及硅烷偶联剂反应，便于进一步与目标生物分子结合。 将目标生物分子或目标细胞通过功能基团吸附在生物磁性纳米粒子上，在外磁场 作用下可以实现蛋白质提纯，细胞等的分离；在临床医学上，纳米粒子的超顺磁 性、巨大的载药量、良好的生物相容性等优点使其成为一种优良的靶向药物载体； 同时也可以考虑将磁性纳米粒子和荧光物质同时包埋在二氧化硅里形成磁性纳 米荧光粒子。引入荧光性能的磁性纳米粒子在免疫检测、细胞成像、靶向药物追 踪等领域展示了巨大潜力。 故本论文以免疫磁性纳米粒子的制备及其应用作为研究对象，应用化学共沉 淀的方法，制备了磁性纳米粒子，并在其表面包裹二氧化硅，提高了粒子的分散 性，粒径也比较均一，磁性较强，将其进行表面修饰，用其分离出的细胞有较好 的扩增效果。由于制备过程都是在水溶液中完成，减少了造成污染的可能性。 通过本研究，取得了以下几个有意义的结果： 1 、利用化学沉淀法制备的超顺磁性的f e 3 0 4 纳米粒子具有很好的单分散性，且粒 径比较的均一，在3 0 i l m 左右，f e 3 0 4 粒子结晶完整、具有较高纯度，粒子晶型为 尖晶石结构。粒子具有较强的磁性，其比饱和磁化强度达到7 3 1 e m u 僧。在其表 面包裹具有生物相容性的二氧化硅，再在其表面进行化学修饰使其成为生物功能 化的磁性纳米粒子。通过化学连接方法将单克隆抗体连接到生物功能化的磁性纳 米粒子表面使其成为免疫磁性纳米粒子。免疫磁性纳米粒子在外加磁场中即可将 摘要上海师范大学硕士学位论文 目标产物分离和纯化。 2 、将p h e n 苯甲酸稀土配合物包裹到f e 3 0 4 中发现：稀土配合物在掺杂到f e 3 0 4 时， 其结构特性没有受到大的破坏，从而使免疫磁性纳米粒子具有优异的荧光特性。 在磁性纳米荧光粒子的荧光发射光谱中，最大发射峰对应的荧光强度是4 4 1 7 。 3 、将磁性纳米粒子应用于细胞的分离，能够快速有效的分离目标细胞，并在整 个分离过程中对细胞的形态以及活性没有明显影响。另外，本方法与其它细胞分 离技术相比具有许多优点：操作简单、快速，在较短的时间内就能从脐带血中分 离出较高纯度的c d l 3 3 细胞。 4 、使用自制的免疫磁性纳米粒子，从脐血中分离并纯化出c d l 3 3 细胞，并分别 对单个核细胞( 对照组) 和c d l 3 3 细胞( 实验组) 进行红、粒系集落扩增培养 1 4 天、2 1 天。培养的结果表明：用自制的免疫磁性纳米粒子分离出来的c d l 3 3 细胞具有很好的活性，能够很好的增值，形成红、粒系集落。同时根据单个核细 胞( 对照组) 和c d l 3 3 细胞( 实验组) 培养1 4 、2 1 天时的红、粒祖细胞系集落 扩增倍数的比较，可知c d l 3 3 细胞具有更强的增殖能力( p o 0 1 ) ，它是造血 干祖细胞分化抗原标志，从而为临床上各种血液病的治疗提供了一定的技术支 持。 关键词：免疫磁性纳米粒子；化学共沉淀；稀土配合物；造血干细胞。 论文类型：研究报告 a b s t r a c t t h e s i s t o p i c ： s t u d yo n t h ep r e p a r a t i o no fb i o c o m p a t i b l em a g n e t i c n a n o p a r t i c l e sa n dt h e i ra p p l i c a t i o n si nt h ec e l ls e p a r a t i o n d i s c i p l i n e ：p h y s i c a lc h e m i s t r y d e g r e ea p p li c a n t ：c h u n m i n gz h a n g s u p e r v i s o r ：y a n g m i n gd o n g w i t ht h ed e v e l o p m e n to fn a n ot e c h n 0 1 0 9 y ， t w oo rm o r ek i n d so f n a n o m a t e r i a l ss y n t h e s i z e de a c ho t h e rh a sb e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e di n r e c e n ty e a r s t h em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sp a c k e dw i t hs i 0 2h a sa l s ob e e n c o n c e r n e ds i n c et h e i rs i g n i f i c a n tf u n c t i o n sa n da p p l i c a t i o n si n b i 0 1 0 9 i c a lm e d i c i n e ， c e l lt e c h n o l o g ya n db i o l o g i c a le n g i n e e r i n g t h e i r a d v a n t a g e si n c l u d eg o o db i 0 1 0 9 i cc o m p a t i b i l i t y ， 1 0 wb i 0 1 0 9 i c a l a c t i v i t i e sw h i c hc a nc h a n g et h ed i f f u s i o nr a t ea n dt h e i rf u n c t i o n s t h e h y d r o x y lf u n c t i o ng r o u po ft h e s ep a r t i c l e sm a k e si tb o n dw i t ht h et a r g e t m o l e c u l e sa n dr e a c tw it he t h a n 0 1a n ds il a n ec o u p li n ga g e n t a f t e rt h e a b s o r p t i o no nt ot h em a g n e t i cp a r t i c l e s ， p r o t e i n sa n dc e l l sc a nb e s e p a r a t e da n dp u r i f i e dw i t ht h eh e l po fm a g n e t i cf i e l d s t h r o u g ht h ep r o c e s so fp a c k i n gt h em a g n e t i cp a r t i c l e sw i t h f l u o r e s c e n c em a t e r i a l sa n ds i 0 2 ， t h em a g n e t i cf l u o r e s c e n c en a n o p a r t i c l e sc a nb eo b t a i n e d t h e s en a n o p a r t i c l e ss h o wg r e a ta p p l i c a b i l i t y i nt h ef i e l d so fc e l ls e p a r a t i o n ，i i r l m u n i t ye x a m i n a t i o n ， c e l li m a g i n g ， t a r g e tm e d i c a t i o nt r a c k ， a n ds oo n t h et h e s i si sm a i n l ys t u d y i n gt h ep r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no ft h e i m m u n em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw h i c hw e r ep r e p a r e db yu s i n gt h ec h e m i c a l c o p r e c i p i t a t i o na n dt h e np a c k e dw i t hs i 0 2 t h ep a r t i c l e sc a n b ed i f f u s e d w e l li ns 0 1 u t i o n a n dt h e n ， t h en a n o p a r t i c l e sw e r em o d i f i e db yc h e m i c a l r e a g e n t t h en a n o p a r t i c l e sc a nb eu s e df o rs e p a r a t i n gt h ec e l l s t h e l a r g ei n c r e m e n to fc e l l si n d i c a t et h a tt h ew h o l ep r o c e s sw o r k sv e r yw e l l i n c l u d i n gt h ep r e p a r a t i o no fm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s i nt h ea q u e o u s m 摘要上海师范大学硕士学位论文 s o l u t i o nw h i c ha v o i d sa n yp o s s i b l ec o n t a m i n a t i o n i nt h i ss t u d y ，s o m er e s u l t sh a v eb e e no b t a i n e da n ds h o w na sf o l l o w s ： ( 1 ) t h es u p e r p a r a m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r es y n t h e s i z e du s i n gt h e c h e m i c a lc o p r e c i p i t a t i o nm e t h o d f e 3 0 4n a n o p a r t i c l e sh a dg o o dd i s p e r s i o n ， h i g hp u r i t ya n ds p i n e lc r y s t a lf o r m t h ea v e r a g ed i a 硼e t e ro ft h ep a r t i c l e s w a sa b o u t3 0 n m ，a n dt h es a t u r a t i o nm a g n e t i z a t i o ni n t e n s i t yw a s7 3 1 e m u g t h e b i o l o g i c a lc o m p a t i b l em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s w e r eo b t a i n e db y c o a t i n gs i l i c ao n t ot h es u r f a c eo fn a n o p a r t i c l e s t h e b i o f u n c t i o n a l m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r et h e nm o d i f i e db ya m i n og r o u pa n dm o n o c l o n e a n t i b o d y f i n a l l y ， t h ei m m u n i t ym a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r eo b t a i n e d u s i n gt h e s ep a r t i c l e s ，c e l ls e p a r a t i o no ft h ep r o d u c ta n dt h ep u r i f i c a t i o n c a nb ec a r r i e do u ti nam a g n e t i cf i e l d ( 2 ) w h e nm i x i n gp h e n b e n z o i ca c i dr a r e e a r t hc o m p o s i t i o ni n t of 3 0 4 ， i t s h o w e dt h a t t h es t r u c t u r eo f t h ec o r 【l p o s iti o nw a sn o td e s t r o y e d ， s ot h e i m m u n em a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s h a d g o o df l u o r e s c e n c e i nt h em a i n f l u o r e s c e n c ee m i s s i o n s p e c t r u mo f t h em a g n e t i cf l u o r e s c e n c en a n o p a r t 王c l e s ， t h ef l u q r e s c e n c ei n t e n s i t yw a sa b o u t 霉4 1 7 ( 3 ) t h et a r g e tc e l lc o u l db es e p a r a t e dr a p i d l yb ym a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s w h i c hh a dn oi n f l u e n c eo nt h ea c t i v i t ya n dt h es h a p eo ft h ec e l l s c o 忍p a r i n gt oo 乞h e rs e p a r a 乞i o nt e h n i q u e s ，t h 王sm e t h o dh a d 孙a n ya d v a n t a g e s s u c ha s ， s i m p l e ，r a p i d ，a c c u r a t ei no p e r a t i o n ，a n ds oo n t h i sm e t h o dc a n s e p a r a t eh i g h l yp u r i f i e dc d l 3 3f r o mt h ec o r db l o o dw i t h i nas h o r tt i m e ( 4 ) 瑶i t ht h eu s a g eo f ， f o rt h ef i r s tt i m e ，s e l f t n a d ei i i i l u n i t ym a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s ，t h ec d l 3 3c e l l sw e r es e p a r a t e da n dp u r i f i e df r o mt h en a v e l b l o o d t h er e d ，g r a n u l ec o l o n yw a sf o r m e da f t e rt h es i n g l en u c l e a rc e l l s ( c 。m p a r i s o ng r 。u p ) a n dt h ec d l 3 3c e l l s ( e x p e r i m e n t a lg r o u p ) w e r ee u l t u r e d f o r1 4d a y sa n d2 1d a y sr e s p e c t i v e l y t h ec u l t u r i n gr e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h ec d l 3 3c e l l s ，w h i c hw e r es e p a r a t e dw i t hs e l f m a d ei m m u n i t ym a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s ，h a dg o o da c t i v i t i e sa n di n c r e m e n t ，f c ) r m e dt h er e dg r a n u l e c 0 1 0 n y t h em u l t i p l y i n gi n c r e m e n t so ft h er e d ， g r a n u l ea n c e s t o rc e l l s c o l o n y ， w h i c hw e r e。b t a i n e db yc u l t u r i n gt h es i n 9 1 e n u c l e a r c e l l s ( c o m p a r i s o ng r o u p ) a n dt h ec d l 3 3c e l l s ( e x p e r i m e n t a lg r o u p ) f o r1 4 ， 2 1 d a y sr e s p e c t i v e l y ，w e r ec o m p a r e d a n dt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tc d l 3 3 c e l l s ， w h i c hw a st h es y m b 0 1o fh a e m a t 。p o i e t i cs t e mc e l l ， h a ds t r o n g e r m u l t i p l i c a t i o na b i l i t y ( p 0 0 1 ) s o ，t h i st e c h n i q u ec a nb ee m p l o y e di nt h e c l i n i c sa n da 1 1k i n d so fb l o o dd i s e a s e s k e y w o r d s ：i m m u n o m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ： c h e m i c a lc o p r e c i p i t a t i o n ： r a r e e a r t hc o r r i p o s i t i o n ：h a e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l t h e s i st y p e ：r e s e a r c hr e p o r t v 上海师范大学硕士学位论文 学位论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 论文作者签名： 畿铷寸啸游j 月2 归 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 论文作者签名： 璐国驴 别程轹驯 日期：乃萨月2 归 日期：洲咿坚月昨 上海师范大学硕士学位论文 第一章绪言 第一章绪言 l 研究背景 1 1 磁性纳米粒子的研究意义 磁性纳米颗粒以其优越的物理特性，在生物医学领域具有广泛的应用前景。 通过包裹不同的有机官能团，这些磁性颗粒可以运用在酶、蛋白质固定、基因、 放射性药剂、磁共振对比剂、免疫测定、r n a 和d n a 纯化、靶向药物等领域【川。 临床研究表明：超顺磁性的f i e 3 0 4 粒子性能稳定、毒副作用小，具有较好的生物 安全性【5 忉。在静脉注射诊断中，粒径小于5 n m 的f e 3 0 4 粒子由于具有穿透血脑屏 障，在血液中分散性高，更容易被巨噬细胞吞噬而延长半衰期等特点能够提高在 诊断学中的准确度【8 l 。因此，制备超小粒径的磁性纳米颗粒具有重要的应用价值。 超顺磁性物质具有较强的磁响应性，在磁场中具有较强的磁性，在没有外加 磁场存在时，磁性很快消失【9 】磁性氧化铁晶体既可能是铁磁性物质，又可能是 超顺磁性物质、它们的主要差别在于晶体的大小当晶体直径小于3 0i 姐时，磁 性氧化铁就具有超顺磁性，较大的晶体一般具有铁磁性【1 啦! 1 2 磁性纳米粒子的研究现状 磁性纳米粒子( m a 伊e t i cn 觚叩a n i c l e s ，m n p s ) 的种类很多，较常用的有金属合 金、氧化铁、铁氧体、氧化铬等，其中氧化铁( 丫- f c 2 0 3 、f e 3 0 4 ) 磁性材料应用最 多【1 2 】。磁性纳米粒子通过表面共聚和表面改性的方法，能与有机物或高分子聚合 物或无机材料相结合形成核壳结构的磁性复合微球。它既具有磁性，又具有表面 活性基团，能进一步和细胞、酶、蛋白质、抗体及核酸等多种生物分子偶联。在 外加磁场的作用下，磁性粒子能够很方便地和底液分离，具有操作简便和分离效 率高的优点。此外，磁性微球具有大的比表面积，为修饰多种高密度分子探针提 供了基础，在细胞分离、蛋白质纯化及d n a 分离检测等领域显示出广阔的应用 前景。生化及医学等领域对m n p s 的物理、化学及药理学性质如化学组成、粒度 大小、晶体结构、磁功能、表面形貌、吸附性、溶解性及低毒性都有严格要求。 研究高分散、粒度分布均匀，并能方便地进行表面化学修饰的四氧化三铁m 御s 的合成方法具有重要的意义。其主要的合成方法如下： 1 2 1 磁性纳米粒子的制备 第一章绪言 上海师范大学硕士学位论文 1 2 1 1 沉淀法 1 2 1 1 1 共沉淀法 共沉淀法是目前使用最普遍的方法之一，依据的基本原理为： f c 2 + + f e 3 + + o h f e ( o h ) 2 f e ( o h ) 3 ( 形成共沉淀) ( a ) f e ( o h ) 2 + f e ( o h ) 3 一f e o o h + f e 3 0 4 ( p h 9 2 ) ( c ) 反应过程为： f e c i ，- 8 h 1 0 f - c i i h p 弼解予麓馏东中剿鼢贮擞嚣嚣 一定温度广一 2 璺霉曩羞主j 从 1 王匪坐一 永解完全 液中离心分离山来 l l ”“ 去离子水多砍 洗法至p h 7 黑色f o 堋i 柱 箍绥靖加 n h i h ，0 调节p h 一节口h 承群产生大量f e a 体粒子 剽黯潮舯h 尊米婀牲 图1 1f e 3 0 4 纳米粉体的制备工艺流程图 f i g 1 1t h et e c h n i c sf l o wc h a r to ff 色3 0 4 n a n o p a r t i c l e s f e 2 + + 2 f e 3 + + 8 0 h 。= f e 3 0 4 + 4 h 2 0 将f e 2 + 与f e 3 + 的氯化物溶液以一定的比例混合后( 一般物质的量比为1 ：2 或2 ： 3 ) ，用过量的n h 3 h 2 0 或n a o h 等溶液作为沉淀剂，在一定的温度和p h 下，高速 搅拌进行反应，高速离心得到沉淀将沉淀洗涤、干燥，得到纳米级f e 3 0 4 微粒。 李海波等【”】采用共沉淀法，制备了外形为立方体或接近球形的、含有针状颗粒杂 质的f c 3 0 4 超细粒子。韩志萍等【1 4 1 在高纯n ：保护下，制得的f e 3 0 4 纳米粒子比饱和 磁化强度在6 0 e m u g 左右。共沉淀法制备f e 3 0 4 超微粉特点是：设备简单，反应 条件温和，原料价格低廉，工艺流程短，易于工业化生产；且反应过程中成核容 易控制，产物纯净度高；但影响粉末粒径和磁学性能的因素较多，而且都必须严 格控制，否则可能出现团聚现象，使磁学性能恶化。 1 2 1 1 2 改进共沉淀法 采用共沉淀法制备f c 3 0 4 纳米微粒时，沉淀在洗涤、过滤、干燥时易产生团 聚现象，为此许多化学家对共沉淀法进行了改进。改进共沉淀法主要是分散生成 2 上海师范大学硕士学位论文第一章绪言 纳米f e 3 0 4 粒子，并使其不团聚。目前报道改进共沉淀法有两种途径：一是加入 表面活性剂，对制得纳米f e 3 0 4 微粒进行表面改性，使其具有亲油性或亲水性， 最后通过胶溶等方式来获得磁性液体。改性过程中，p h 、表面活性剂的用量及表 面活性剂的成分配比对颗粒改性效果影响很大，目前研究者对此尚有很大的分 歧。王伟等研究表明，酸性和强碱性环境对改性均不利，p h 在8 一1 2 时效果最好， 表面活性剂用量可以通过理论计算。蒋新宇等【1 6 】先通过化学反应生成f e 3 0 4 微粒， 经充分洗涤后再包覆双层表面活性剂，得到粒径为纳米级，同时具有磁响应性和 稳定性强的f e 3 0 4 磁性粒子。二是制得纳米f e 3 0 4 复合粒子。程海斌等【1 7 】采用改进 共沉淀法制得纳米f e 3 0 4 复合粒子能在更宽的p h 范围内稳定分散。研究表明，表 面活性剂、p h 、毛电位对f e 3 0 4 复合粒子分散性有很大的影响。 1 2 1 1 3 化学氧化沉淀法 化学沉淀法基本原理是，在一定温度下，调节含f e 2 + 溶液的p h ，使溶液中生 成f e ( o h ) 2 悬浮液，再采用氧气诱导、空气氧化f c ( o 哪2 悬浮液制得纳米f e 3 0 4 粒 子。孟哲等1 1 8 】在室温下，在p h 为1 0 左右的环境中，采用氧气诱导，使f e s 0 4 溶液 由浅绿色迅速变为墨绿色的粘稠液绿锈( i i ) ，再通过空气氧化，使墨绿色的绿锈 ( i i ) 转化为黑色的悬浮液，制得的样品经抽滤、洗涤、5 0 。c 恒温干燥后进行表征。 结果表明，此法制得的磁粉与粉碎法及化学合成法制得的样品相比，纯度高，磁 性强，粒径小，是一种制备粒径为2 0 一3 0 硼的f e 3 0 4 的非常有意义的方法。 1 2 1 2 水热法 水热法是一种在密闭容器内完成的湿化学方法，与溶胶凝胶法、共沉淀法等 其它湿化学方法的主要区别在于温度和压力。水热法研究的温度范围在水的沸点 和临界点( 3 7 4 ) 之间，但通常使用的是1 3 0 一2 5 0 之间，相应的水蒸汽压是 0 3 4 m p a 。与溶胶凝胶法和共沉淀法相比，其最大优点是一般不需高温烧结即可 直接得到结晶粉末，从而省去了研磨及由此带来的杂质。水热法可以制备包括金 属、氧化物、和复合氧化物在内的6 0 多种粉末。所得粉末的粒度范围通常为0 1 微米至几微米，有些可以几十纳米，且一般具有结晶好、团聚少、纯度高、粒度 分布窄以及多数情况下形貌可控等特点。郑州大学邹大香等人，采用( n 田2 s 0 4 ， f e s 0 4 6 h 2 0 和h 4 n 2 h 2 0 的水溶液，置于聚四氟乙烯内衬的高压釜中，溶液填充 度为7 5 。反应液的起始p h 用稀h 2 s 0 4 和n a o h 溶液来调节。水热处理过程 3 第一章绪言上海师范大学硕士学位论文 结束后，进行过滤、洗涤，将沉淀物自然晾干；然后，将所得粉末用干燥箱在 1 2 0 0 c 下脱水6 h ，研磨得到实验样品。他们研究了在水热过程中反应溶液的起始 p h 、处理时间和处理温度对合成的f e 3 0 4 纳米晶粒纯度和平均粒径的影响。他们 认为当溶液的起始p h 为1 1 、处理时间4 h 、处理温度为1 5 0 的条件下，能得 到纯度高且平均粒径较小的f e 3 0 4 纳米晶粒【1 9 - 2 1 1 。 1 2 1 3 微乳液法 微乳液法是由表面活性剂、油相、水相及助溶剂等在适当比例下混合自发形 成的热力学稳定体系，具有透明( 或半透明) 、低粘度、各向同性、分散相液滴极 其微小和均匀等特点。油包水删o ) 或水包油( o m 型微乳液中的水核是一个“微 型反应器 ，化学反应被限制在水核内，故最终得到的微粒粒径将受到水核大小 的控制。利用该方法制备纳米粉操作简单，颗粒小，但晶型多样。a n u mm 等【2 2 l 在a o t h o n h e p t a n c e 体系中，含0 5 m 0 1 lf e a 2 和0 3 m o l lf e c l 3 ，的乳液与含 n h 3 h 2 0 乳液混合，经充分反应后离心，再用庚烷丙酮洗涤后，经干燥得纳米 f e 3 0 4 颗粒。中南大学何秋星等【2 3 1 利用a e 0 3 + t x l o 作为表面活性剂，工业级煤油 作为油相，正丁醇为助溶剂，分别在f e 2 + f e 3 + 水溶液和n a 0 h 水溶液中形成w 0 微 乳液，采用双乳液混合法制各纳米磁性f e 3 0 4 微粒。 由于具有超顺磁性的纳米磁性材料具有悬浮性好、粒子细微、易于分散、吸 附能力强等一系列优点，所以在磁记录、磁流体、生物医学、吸附材料等领域有 广泛的应用前景【肄2 5 1 在生物医药领域已经有很多磁性材料用于蛋白质及酶的固 定化、细胞分离、靶向给药和d n a 提纯的报道【2 6 1 当磁性材料应用于这些相关领 域时，常常要求其粒子表面和生物物质之间有良好的“铆接 性能，所以需要对 之进行表面改性以得到羧基、氨基、乙二醇基、羟基等功能基团由于纳米f e 3 0 4 的表面羟基并不丰富，所以利用成熟的硅烷偶联剂对其进行改性有一定困难。基 于这种考虑，本研究试图制备磁性纳米f e 3 0 4 和s i 0 2 的复合材料，使之既具有纳 米f e 3 0 4 的超顺磁性质，又具有s i 0 2 比表面积大且易于用硅烷偶联剂进行表面基 团调控的特点 1 2 2 核壳磁性纳米粒子的制备 常用的制备方法主要有溶胶一凝胶法、微乳液法。 4 幽1 2 核壳结构磁性纳米粒子示意图 1 2 2 1 溶胶一凝胶法( s o l g e lm e t h o d s ) 溶胶一凝胶是无机初始粒子( 金属盐或有机金属分予) 经过各种反应，最后形成一 个三维分了网络的过程。会属醇栽的水解、缩聚是最典型的溶胶一凝胶过程： 水解：缩聚： m ( o r ) 4 + h ：o o h m ( 0 r ) 3 + r o h ? _( 0 r ) 3 m o h + h 0 一m ( o r ) 3 _ m ( o h ) 4 + 4 r o h( o r ) 3 m 一0 一m ( 0 r ) 3 + h 2 0 ( 0 r ) 3 m - 0 h + r o m ( 0 r ) 3 _ ( 0 r ) 3 m 一0 - m ( o r ) 3 + r o h 其中m 是金属，r 足烃基。 按采用的原料不同，溶胶一凝胶法分为硅酸盐水解法和s t 6 b e r 法。 ( 1 ) 硅酸盐水解法( h y d r 0 1 y z a t i o no fs i l i c a t e ) 将一定量制备好的磁性纳米粒子或磁流体分散在n a 2 s 0 3 溶液巾，持续搅拌情 况下，缓慢凋节混合液的p h 值，硅酸钠水解生成活性硅酸溶胶，吸附在粒子表丽， 通过陈化一段时间，吸附大量硅溶胶后丌始发生凝胶成膜，在粒子表而生成三维 ? 氧化硅网络，由内而外逐渐变厚，最后形成氧化硅壳层。反应过程是一个成膜 与成核瓦桐竞争的过程，溶液p i i 值调节过低，易导致硅酸水解较快，形成s i 0 2 核的自身成长。a t a r a s h i 等首先通过硅酸钠水解制得1 0 5 0 n m 的s i 0 2 f e 3 0 4 纳 米粒，m 通过热还原f e 3 0 4 粒了、表面活性剂处理，得到乙烯基已二醇基液s i o f e 磁流体。考察了s i 0 2 f e 比、陈化时的p 值、还原温度和时川刈+ 纳米粒粒径和磁 性的影响。l i u 等将约l5 n m 的f e c l 3 超声分散在p 值为l2 一l ： 的n a 2 s 0 3 溶液，在 8 5 下缓慢调节r ) i i 值到6 ，陈化后得剑5 0 8 0 n m 的s i o ! f e 3 0 4 纳米球，并采用氨基 硅烷偶联剂a e a p s 表面功能化，能很好地用于b s a 蛋白质的网定。 上海师范人学硕十! 学何论文 ( 2 js t 油e r 法( s t 6 b e rm e t h o d ) s t 6 b e r 法是采用碱催化正硅酸已酯( t e o s l 制备单分散一：氧化硅粒子的方法。 硅酸盐水解法容易引入杂质离子，且 要j 于制备致密的二氧化砖薄层，目自订己 使用小多。s t 6 b e r 法操作简译，对各反应物用量没有严格控制，最终产物为醇和 水，更多地用于制备核壳结构复合纳米粒子。将一定量的磁性粒子分敞在醇水 溶液中，用氨水催化t e o s 进行水解、缩聚反应，生成s i o ：沉积在磁性粒子表面， 得到核壳结构磁性纳米粒子。其中醇的种类、醇水比、氨水和t i i ( ) s 用量影n 向最 终产物的质量。不同醇类极性不同，会影响粒子表面电荷，从而影响磁性粒子的 分散；醇水比小，粒子易分散，但过小会导致t e o s 水解过快，形成s i 0 2 核自 身成长；氨水直接决定t e o s 水解、缩合的速度，过量会造成反应速度过快和s i 0 2 自身成核生长；t e o s 的用量决定了s i 0 2 壳层的厚度，用量越多，壳层越厚，粒 径越均匀，但磁性也越低。 d e n g 等【2 9 】依据s t 6 b e r 法合成了s i 0 2 f e 3 0 4 磁性纳米粒子，系统地考察了醇的 种类、水用量、p h 值和t e o s 用量对最终产物的影响。l u 等在异丙醇水溶液 中制备了s i 0 2 f e 3 0 4 磁性纳米粒子，通过控制t e o s 用量_ l _ l j 使s i 0 2 壳层厚度在 2 1 0 0 n m 之间变化，并加入硅烷偶联剂改性的荧光有机染料与t e o s 同时进行水 解、缩合反心，将荧光染料包埋在s i o ：壳层中，获得具有荧光性能的s i 0 2 f e 3 0 4 磁性纳米粒子。 s t 6 b e r 法还可用于制备介孔二氧化硅纳米粒子，这在靶向给药系统方面具有 重要意义。图1 3 为制备流程图。z h a o 等【3 1 】在f e 2 0 3 上首先沉积一层均匀致密的 s i 0 ：薄层，然后再同时加入t e o s 和模板剂c 1 8 t m s 进行水解、缩合反应，煅烧去 除c 1 8 t m s 并还原f e 2 0 3 ，得到介孔纳米球m s s i 0 2 f e 3 0 4 。s e n 等【3 2 】将模极剂 c t a b 和t e o s 同时加入f e 3 0 4 悬浮液中，最后通过溶剂萃取去除壳层巾的模板 c t a b ，得到介孔纳米粒子m s f e 3 0 4 ，并成功将其用于磁t 卜物分离。 r u 豢翌燮j 鬻： 图1 3 介孔二氧化砗磁性纳米粒，f 合成示意图 卜 i g 1 3s c h e m a t i ci 1 1 u s t r a t i o no fs y n t h e s iso fm s s i 0 ：m pn a n o p a r t i c l e s 勰一 吼薹| 上海师范大学硕士学位论文第一章绪言 1 2 2 2 微乳液法( m i r c o e m u l s i o n ) 微乳液是两种互不相溶液体在表面活性剂作用下形成的热力学稳定的、各向 同性、外观透明或半透明、粒径1 1 0 0 i l m 的分散体系，一般由有机溶剂、水溶液、 活性剂、助表面活性剂4 部分组成。通常采用反相微乳液，即油包水型( w o ) 制备 纳米粒子，微乳液中的水核可看作是微型反应器，水核半径r 与体系中水与表面 活性剂的浓度比及活性剂种类有直接关系，一定范围内r 随增大而增大。微 乳液法广泛用于制备纯纳米粒子以及核壳结构复合纳米粒子，通常分为两步：( 1 ) 调节各组分用量，形成稳定的微乳体系；( 2 ) 加入新组分或混合不同反应组分微 乳液，引发反应，得到核壳结构纳米粒子。s a n t r a 等【3 3 】采用w 0 型微乳液合成了 s i 0 2 f e 3 0 4 纳米粒子，考察了非离子表面活性剂t r i t o n x 1 0 0 、i g 印a lc 0 - 5 2 0 和 b 嘀9 3 以及n a o h 和n h 4 0 h 对合成纳米粒子的影响，制得粒径1 2 砌的纳米磁性 粒子以及1 2 胁厚的s i 0 2 膜层。y i 等【划首先制备了约1 2 5 姗的丫f e 2 0 3 ，然后在 i g e p a l c o 一5 2 0 环己烷水微乳液体系合成了s i 0 2 丫一f e 2 0 3 纳米粒子，再采用s t 6 b e r 法同时加入t e o s 和模板剂c 1 8 t m s 合成了介孔复合纳米粒m s s i o 狮f e 2 0 3 。 l ( i m 等【3 5 】在微乳体系中将f e 3 0 4 和c d s e z n s 量子点同时包埋在s i 0 2 中，再用 蚴作为模板剂，在最外层形成介孔s i 0 2 得到荧光m s s i 0 2 m p q d 纳米球， 对其表面氨基化后可增加药物装载量，降低释放速率，有望用于荧光追踪靶向药 物载体。 c h o 等【3 6 】采用两步还原法，在c t a b 1 丁醇辛烷水微乳液体系中，首先利用 n a b h 4 还原f e ( i i ) ，得到f e 纳米粒子，再还原a u ( ) 合成了约2 0 n m 的a u 肌纳米 粒。提出了a u 的生长机理，认为首先形成纳米尺度的a u 种子吸附在f e 核的表面， 然后通过种子的生长形成金壳。其中反应物浓度、表面活性剂用量、各步骤反应 时间对最终粒子的影响较大。但是这种方法制备得到的核壳结构还不够完整和对 称，难以完全包裹住内核，而使其易受到一定程度的氧化。 本文将纳米技术与生物技术相结合，发展了具有生物亲和性的核壳型荧光 磁性纳米颗粒。也就是磁性免疫微球。磁性免疫微球( i m m u n o m a 弘e t i cb e a d ) 是包 裹有抗体的磁性微球，磁性免疫微球一般以无机纳米磁性粒子如铁氧化物为核， 在其表面进行单体聚合( 共聚) 反应制备含有功能基团( 如n h ：，一c o o h ，o h 和c o n h 等) 的壳层，这些功能基团可以作为免疫配基与抗体( 抗原) 进行偶联， 7 第一章绪言 上海师范大学硕士学位论文 然后与含有相应抗原( 抗体) 的靶物质特异性地结合形成新的复合物。理想的免疫 磁性微球为均匀的球形、具有超顺磁性，可在磁场作用下滞留而达到快速分离的 目的。免疫磁性纳米粒子的在生物方面的应用主要有以下几方面： 1 3 磁性纳米粒子在生物方面的应用 1 3 1 细胞分离 细胞分离是免疫磁性纳米粒子目前应用的最主要的一个方面。传统细胞分离 技术有密度离心、羊红细胞重新形成、流式细胞分离等，这些方法有的比较费时， 有的十分昂贵。由免疫磁性纳米粒子分离细胞时只需要抗体和一个磁铁，既简便 灵敏又经济快捷。分离细胞有两种方式，用免疫磁性纳米粒子直接从细胞混合液 中分离靶细胞的方法为阳性分离，用免疫磁性纳米粒子去除无关细胞使靶细胞得 以纯化的方法为阴性分离。马东初【3 7 】用g p i i b i a 血小板单克窿抗体结合磁性纳 米粒子分离入骨中的巨核细胞，其纯度达到8 7 5 9 7 1 ，且5 0 的巨核细胞具有 生物活性，且磁性纳米粒子分离的巨核细胞超微结构保持完整，可用于巨核细胞 的细胞生物学和分子生物学等方面的研究。宋振岚等【鲳】采用免疫磁性纳米粒子与 激活的巨噬细胞对1 8 例白血病人的骨髓和外周血进行进化研究发现，体外免疫 磁性纳米粒子可净化2 3 个对数级的白血病细胞。这是一种快速、简便、稳定的 净化方法，有望用于白血病的治疗。 1 3 2 免疫磁性微球的制备，性能和作用原理 免疫磁性微球( i i l l m u n o m a 印e t i cm i c r o s p h e r e s ，i m m s ) 或称免疫磁珠 ( i i n m u n o m a 印e t i cb e a d s ，l m b ) ，是表面结合有单克隆抗体的磁性微球。由于需 要在磁性微球的表面结合上适当的抗体，因此要求所用的磁性微球能通过其表面