（细胞生物学专业论文）马蓝细胞悬浮培养及其靛蓝、靛玉红的提取与分析.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 。成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他入知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 论文使用授权的说明 日期：w 以s 和 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名 日期：硎8 。箩。；口 艚刻酥妇轹厂弘钇 醐：毗上 福建农林大学硕士学位论文 摘要 本试验以马蓝的种子为外植体，诱导培养获得马蓝愈伤组织，从而建立马蓝细胞悬浮 系，并从中提取、分离出马蓝靛蓝、靛玉红；研究不同水平或组合的激素、氮源、磷源、 碳源、肌醇、细胞接种量条件等对马蓝细胞生长及其靛蓝、靛玉红合成的影响，从而建立 马蓝悬浮细胞生长及其靛蓝、靛玉红合成的动态曲线。研究结果如下： 1 用m s + 0 2 m g l - t 2 ，4 d + 1 0 m g l - 1 n a a + 1 0 m g l 1 b a 培养基可获得大量繁殖速度 快、生长均匀一致的愈伤组织。 2 靛蓝、靛玉红的h p l c 检测体系：色谱柱：c 1 8 柱( w a t e r s2 6 9 5 2 9 9 6 ) 、流动相：甲 醇水( 9 0 ：1 0 ) 、流速：0 5 m l m 酊1 、检测波长：2 9 0r 皿、温度：室温。细胞悬浮培养约 2 0d 时，培养1 9 干重细胞可提取靛蓝、靛玉红含量分别为1 3 5 和o 4 2m g ( d w ) f 1 。 3 马蓝细胞悬浮培养培养条件优化结果表明：以2 5 5m g l k h 2 p 0 4 + 2 4 7 5m g l 1n h 4 n 0 3 + 1 5 0m g l d 肌醇+ 5 0g u 1 蔗糖改良的m s 为基本培养基并添加酸水解酪素、谷氨酰胺、 脯氨酸，激素配方为0 4 m g u 1 2 ，4 一d + 3 0 m g l d n a a + o 1 m g l 1 l m o 2 m g l 1 b a ，配 合每2 0m l 培养液中接种o 0 4g 哪左右的细胞，为最适培养条件。 4 以最适培养条件进行培养，建立马蓝悬浮细胞生长与靛蓝、靛玉红合成的动态曲线结 果表明：0 3 d 为生长迟滞期，3 - 2 1 d 的对数生长期，2 1 2 7 d 为生长平稳期，在第2 4 d 马蓝细胞生长到达曲线顶峰，即可获得最大的马蓝细胞生物量，2 1 3 9g ( d w ) u 1 ，2 7 d 时马蓝细胞靛蓝、靛玉红含量达到最大值，分别为2 8 4 4m g ( d w ) l 、8 7 8m g ( d w ) l 。 此后，马蓝细胞生长量及其靛蓝、靛玉红含量开始下降。 关键词：马蓝细胞悬浮培养靛蓝靛玉红h p l c 福建农林大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , t h ei n d i g o t i na n di n d i r u b i nw e r eo b t a i n e df r o mt h es u s p e n s i o n c e l l sc u l t u r e d i nt h ee s t a b l i s h e dc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r es y s t e mw i t ht h ec a l l ii n d u c e df r o mt h es e e do f s t r o b i l a n t h e sc u s i a ( n e e s ) d k t z e o nt h es t u d yo fi n f l u e n c eo fd i f f e r e n tc o m b i n a t i o n so f h o r m o n e ，n i t r o g e ns o u r c e ，p h o s p h o r u ss o l f f c 宅，c a r b o ns o u r c e ，i n o s t o la n dt h ec e l li n c u l a t e d a m o u n to nt h es t r o b i l a n t h e sc u s h 2 ( n e e s ) d k t z e c e l lg r o w t ha n ds y n t h e s i z a t i o no ft h e i n d i g o t i na n di n d i r u b i n , t h ed y n a m i cc u r v e sw e r ee s t a b l i s h e di no r d e rt ot h eh i g h e s ty i e l do ft h e i n d i g o t i na n di n d i r u b i nt h o u g hc e l ls u s p e n s i o no fs t r o b i l a n t h e sc u s i a ( n e e s ) d k t z e 1 p l e n t yo fm o r eu n i f o r m l ya n dq u i 出yg r o w i n gc a l l u sw a sh a r v e s t e df r o mt h em sm e d i u m w i t h0 2 m e l 2 ，4 d ，1 0 r a g l n a a ，1 0 m g l b a 2 t h eh p l c s y s t e m o ft h e i n d i g o t i n a n di n d i r u b i n ：c18 ( w a t e r s 2 6 9 5 2 9 9 6 ) ， c h 3 0 h - 1 - 1 2 0 ( 9 0 ：1o ) ，0 5 m l m i d 1 ，2 9 0 皿a ta b o u t2 0d a y s ，t h ec o n t e n to ft h ei n d i g o t i na n d i n d i r u b i nw a s1 3 5m g ( d w ) 一g - ，0 4 2m g ( d w ) 一g - r e s p e c t i v e l y 3 a f t e ro p t i m i z e dc u l t u r ec o n d i t i o nf o rc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e s t c u l t u r ec o n d i t i o nw a st h em o d i f i e dm sm e d i u mw i t h2 5 5m g l k h 2 p 0 4 ，2 4 7 5m g l 一 n i - h n 0 3 ，1 5 0 m g l i n o s i t o l ，5 0 9 l s u g a r a n d 0 4 m g l 1 2 ，4 d ，3 0 m g l - 1 n a a ， 0 1 i n g l k t , 0 2 m g l b a ，a n da d d e d0 0 4g ( d w ) c e l li n2 0 m ll i q u i dm e d i u m 4 u n d e rt h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n , t h ed y n a m i ca m v e sb e t w e e nt h es t r o b i l a n t h e sc u s i a ( n e e s ) d k t z e sc e l lg r o w t ha n ds y n t h e s i z a t i o no ft h ei n d i g o t i na n di n d i r u b i ns h o w e dt h a t t h es t r o b i l a n t h e sc u s h 2 ( n e e s ) d k t z e sc e l lg r o w t hr e a c h e dt ot h et o pa tt h e2 4 t hd a ya n dt h e b i o m a s sw a s21 3 9g o ) w ) 。l 一，a n dt h ec o n t e n to ft h ei n d i g o t i na n di n d i m b i nr e a c h e dt ot h e t o pa tt h e2 7 也，a t2 8 4 4m g ( d w ) l 1 、8 7 8m g ( d w ) l - 1 k e yw o r d s ：s t r o b i l a n t h e sc u s i a ( n e e s ) d k t z e ，c e l l ，s u s p e n s i o nc u l t u r e ，i n d i g o t i n ，i n d i r u b i n , h p i c 2 福建农林大学硕士学位论文 1 前言 1 1 药用植物细胞培养的研究概况 1 1 1 药用植物细胞培养概述 当今世界在“回归自然”思潮的影响下，寻找天然药物的呼声日渐高涨，而中药以其丰 富的资源、独特的疗效、毒副作用少等特点，已引起世界各国的普遍关注，药用植物的需 求量越来越大。目前，世界7 5 人口依赖从植物中获取的药物，除化学合成之外，人类 大量依赖植物次生代谢物作为药物1 1 - 2 。药用植物是中药的主要来源，在中国传统医学中 具有重要地位。我国是世界上首屈一指的中草药生产大国和应用大国。目前，常用传统药。 材约4 0 0 种，其中年短缺量占2 0 左右【3 】，市售中成药中，从植物中提取的药物或经半合 成的药物仅占商品的2 0 1 4 - 5 1 。而可用于治疗疾病的药用植物有1 1 1 4 6 种，其中有2 8 0 种 可以通过人工栽培获得原料，其余种类全部来源于野生资源，目前，在我国的药用植物资 源当中，只有7 0 0 种左右中药植物用于临床治疗，还有一万多种的药用植物没有被作为中 药材或者药源开发利用【6 j 。随着中药现代化的快速发展，对中草药需求量日益增加，野生 资源已远远不能满足需求，而长期采挖以及滥用资源致使植被破坏、生态恶化，许多野生 药用植物的蕴藏量大大减少，有许多原料性药用植物资源目前已面临资源枯竭的威胁。同 时鉴于野生驯化和人工栽培过程中药用植物物种退化和面临濒危灭绝的棘手问题，长期以 来没有得到解决。其中下降幅度比较大的有甘草、天麻、刺五加、黄芩、银柴胡、苍术、 知母、防风、半夏、大黄、羌活、紫草等，有些种类已很难找到野生种【7 8 1 。如何保护濒 危和紧缺中药材资源的修复和再生，防止退化和灭绝，是保障药用植物资源的可持续利用 和中药产业的可持续发展的关键问题。因此，为了解决这些药用植物，特别是那些药效明 显、生境特殊、引种困难的药用植物的资源日渐匮乏的问题，科研人员、相关企业和一些 政府部门作了大量工作，在保护我国的药用植物资源，促进资源的有效利用发挥了一定的 作用，为植物药产业的可持续发展奠定了良好的基础 9 - 1 3 】。 药用植物所以能够发挥防治疾病的作用，是因为其体内含有一些药理活性成分，包括 酚类化合物、萜类化合物、含氮化合物三大类【1 4 以5 】。由于植物细胞具有全能性，即植物体 内的任何一个细胞都包含整体植物全部的遗传信息，在一定条件下具有发育成一个完整植 株和合成次生代谢产物的能力。这为通过植物组织和细胞培养来获得其药用活性成分提供 了新的途径。随着不断的探讨研究，药用植物组织培养方面已取得了巨大的成绩：如培养 方法已从固体、液体、悬浮培养，深层大罐发酵发展到液体连续培养；培养材料也从药用 3 福建农林大学硕士学位论文 植物的根、茎、叶、胚、果实、种子等组织器官，这些组织器官诱导出愈伤组织或冠瘿组 织。目前这项技术己发展成- f - j 精细的实验技术。在选材消毒、接种培养、诱导筛选、继 代保存、分离鉴定等方面建立了一整套完整的技术方法【l q 。利用现代生物组培技术直接获 得这些次生代谢产物用于药物生产，有保护植物资源、生产周期短、不受地区和季节限制、 个体差异小、便于工业化生产等优点，具有较大的社会效益、经济效益和生态效益1 1 4 ，1 7 1 。 组织培养技术在药用植物研究中的应用愈来愈广泛。除了理论研究外，组织培养主要 用于药用植物的快速繁育及有效次生代谢产物的提取等方面。据报道，迄今为止，利用植 物次级代谢物细胞工程己研究4 0 0 多种植物。从培养细胞中分离到6 0 0 多种次级代谢产物， 其中6 0 多种在含量上超过或等于亲本植物【1 们。采用大量培养药用植物细胞培养来生产各 种植物药可以避免常规栽培中不利气候条件、病虫危害、地理环境和个体差异的限制。通 过人为调节细胞生长和代谢合成，实现工业化生产，可提高效益、降低成本，而且采用现 代生物技术可以筛选出高表达量的细胞株和寻找到新的药用成分。由此看来，药用植物细 胞培养显然是实现中药现代化的一条重要途径。组织培养技术做为扩大药用植物资源量的 途径之一，有着广阔的前景。 1 1 2 国外药用植物细胞培养研究进展 植物细胞培养技术的出现源于植物全能性理论的出现。植物细胞全能性的设想于1 9 0 2 年由h a b e r l a n d t 提出【1 9 。2 们，1 9 4 8 年得到了证实，这为进行植物细胞培养工作奠定了理论基 础。1 9 3 4 年，w h i t e 培养成功了蓍茄苗的根尖组织。1 9 3 9 年，w h i t e 等人提出了器官的薄壁 愈伤组织可以移置，并能长期培养，1 9 6 4 年，b u t c h e r 1 9 - 2 0 等人作了多种植物的根培养。 1 9 6 9 年，s t r e e t 成功地取得了茎尖、叶、花，果实的培养。在此基础上，又作了许多植物 愈伤组织的根原基和苗原基的发生、细胞分化、静止组织的细胞分裂和各数植物次生代谢 产品合成的研究。1 9 5 3 年，m u 拥烟草的愈伤组织，在液体培养基的振荡器中破碎，则碎 片在悬浮液中，产生了单细胞和小细胞群，这些细胞能分裂，并可继代繁殖 2 1 】。1 9 5 6 年， r o u t i n e 和n i c k e l 首先提出用植物细胞培养生产有用次生代谢产物，从这以后的几十年里， 研究工作得到了迅速发展。目前，植物次生代谢产物的生产多数集中在制药工业中一些价 格高【2 0 】，产量低，需求量大的化合物上，如紫杉醇、长春碱、紫草宁、人参皂苷等。 2 0 世纪8 0 年代成为该领域发展的黄金时期，科学家们取得了一系列重大突破。大规模 植物细胞培养技术经过几十年的努力研究己取得很大进展，植物细胞大量培养用以生产植 物次生代谢物已成为生物工程的重要组成部分，并逐渐完善成为一门利用植物细胞体系 ( 培养细胞) ，通过现代的生物工程手段( 细胞大量培养、次生代谢物及其调控、细胞突变及 4 福建农林大学硕士学位论文 其筛选等) ，进行工业规模生产，以获得各种产品的新兴的跨学科技术 9 , 2 2 - 2 3 1 。1 9 8 0 年，i b a r a l d 成功进行了人参p a n a xg i n s e n gc a m e y e r 细胞的工业化发酵培养，反应器的规模达到 2 00 0 0k g 。1 9 8 5 年t a b a t a 在紫草l i t h o s p e r m u me r y t h r o r h i z o ns i e b e tz u c c 细胞工业化培 养生产紫草素( s h i k o n i n ) 上的成功，在药用植物发酵培养的历史上具有里程碑的意义【2 4 之5 1 。 目前工业上用的紫草素，主要来自于发酵培养。近两年，高丽参的器官培养成功地进行了 工业化，反应器的规模已经达到1 00 0 0k g 2 6 。1 9 8 1 年t a b a t a 等对紫草植物细胞进行悬浮培 养，获得了紫草宁衍生物，至u 1 9 8 3 年日本首先成功地进行了紫草宁衍生物工业化生产。之 后，黄连细胞培养生产小蘖碱、长春花细胞生产阿吗碱的规模都达到了5 0 0 0 l ，长春花细 胞培养生产蛇根碱和阿吗碱都已进入了工业化生产。德国人也建立7 5 、7 5 0 、7 5 0 0 、1 5 0 0 0 、 7 5 0 0 0 l 系列搅拌式生物反应器组成的植物细胞工厂，并利用这些反应器培养了紫松果菊细 胞，生产免疫活性多糖网。 迄今，全世界已对近千种植物进行了细胞培养研究，生产的天然产物包括药品、香料、 色素、食品、化妆品等5 0 0 多种【2 引。有些药用植物种类已实现工业化生产，如通过希腊毛 地黄细胞培养物中生产地高辛，从日本黄连细胞培养物中生产黄连碱，利用紫松果菊细胞 生产具免疫活性的多糖，利用人参细胞培养物生产人参皂甙，利用紫草细胞培养技术生产 紫草宁等 2 9 。3 0 】。 近年来，应用植物细胞大量培养的生产与研究主要集中在一些天然、稀有、濒危、药 效明显、经济价值较高的药用植物上，如西洋参、长春花、雪莲、红豆杉、青蒿等。现在 已有9 种红豆杉植物建立了细胞悬浮培养系统，培养技术的研究取得了很大进展【3 ”4 】。日 本s m t o 【3 5 】曾从短叶红豆杉t a x u sb r e v i f o l i an u t t 和东北红豆杉t c u s p i d a t as i e b e t z u c c 中 进行愈伤组织的诱导、筛选得到的细胞株，可在4 周培养时间内细胞增殖5 倍，同时紫杉醇 含量达到o 0 5 ，比原来的红豆杉树皮紫杉醇含量增加了1 0 倍。融c l n l n l 【1 9 , 3 6 1 从6 种紫杉醇 属植物中进行愈伤组织的诱导，均获得产生紫杉醇的细胞株，其中2 个细胞株在悬浮培养 条件下培养超过2 9 个月和1 6 个月，悬浮培养细胞的紫杉醇含量大于2 0m g l 。l i u 等【1 9 ，3 7 】 还考察了无机磷对西洋参细胞悬浮培养的影响，研究表明，浓度为0 6 5m m o l l 的磷最有 利于西洋参细胞的生长，而1 2 5m m o l l 的磷为皂苷合成( 9 6 0m g l ) 的最适浓度。 1 1 3 我国药用植物细胞培养研究进展 我国的药用植物组织培养研究，可以追溯到2 0 世5 0 年代。1 9 6 4 年，罗士韦教授等 首先报道了人参组织培养获得成功的研究成果。1 9 8 3 年，全国第一届药用植物组织培养 讨论会召开，当时全国已有3 0 多个单位，1 0 0 余人从事药用植物的组织培养研究。其中 5 福建农林大学硕士学位论文 以广西药物所的罗汉果快速繁殖，山东大学生物系与荷泽地区中药材试验站的怀地黄去病 毒研究和中国药科大学人参工业化生产的中间试验为代表性的研究成果。自此，我国药用 植物的组培研究迅速发展。1 9 8 6 年，由我国科学工作者编写的有关专著药用植物组织 培养问世。到目前为止，我国的科技工作者在药用植物组织培养方面已取得了巨大的成 绩，组织培养技术水平也在不断迸步：如培养方法已从固体、液体、悬浮培养，深层大罐 发酵发展到液体连续培养；培养材料也从药用植物的根、茎、叶、花、胚、果实、种子等 组织或器官，这些器官诱导出愈伤组织或冠瘿组织1 3 甜。 近4 0 年来我国经离体培养获得试管植株的药用植物已有金线莲、白芨、番红花、铁 皮石斛、绞股蓝、苦丁茶、南洋金花海巴戟等1 0 0 余种，其中大多数为珍贵的药用植物。 我国科技工作者利用植物组织或细胞的大量培养直接生产药物的研究也取得了很大进展： 目前从各种培养物中产生的药用成分已有约2 0 0 余种。其中药用成分含量超过或等于原植 物的有3 0 余种，包括人参皂苷、人参皂苷元、三七皂苷、甘草甜苷、甜叶菊苷、柴胡皂 苷、葛颓皂苷、川芍咳、地奥配质、地高辛、熊果苷、奠若碱、东奠苔碱、烟碱、小劈碱、 阿吗碱、蛇根碱、萝美木总碱、总异黄酮化合物、映喃色围、哈尔明、怠酣、柴草宁、迷 选香酸、胰岛素、左旋四氢巴马亭、辅酶q 1 0 、l 谷氨酰胺、r - 色氨破、蛋白酶抑制剂( 蛋 白质) 等等。 2 0 世纪9 0 年代以来植物的细胞培养已不再停留在三角瓶培养的实验室水平，取而代 之的是以生物反应器为标志的大规模工业化培养。特别是近年来气升式生物反应器的发明 与应用，使药用植物细胞的大规模培养生产药用成分成为可能。如从喜树茎段愈伤组织培 养生产喜树碱；从山莨菪的细胞培养生产天仙子胺、l 莨菪碱和红古豆碱；从苦瓜的细胞 培养生产类胰岛素；从紫草细胞培养生产紫草宁；从日本黄连细胞培养生产小菜碱；从红 豆杉细胞培养生产紫杉醇：从长春花的细胞培养中生产长春碱和长春新碱；从人参属的人 参、西洋参、三七中提取人参皂苷和人参多糖；从白芷的悬浮细胞培养中生产次生代谢物 i m p e r a t o r i n 治疗皮肤病；从千层塔中提取治疗老年痴呆和改善单纯记忆障碍的石杉碱；从 雷公藤的细胞培养生产治疗类风湿关节炎的雷公藤甲素；从戟叶薯蓣的愈伤组织和悬浮细 胞生产避孕药物中的主要原料肾上腺皮质类固醇，等等。目前，可通过对光叶黄皮树 ( p h e l o d e n d r o nc h i n e n s i sv a r g l a b r i u s c u l u m ) 组织培养而得到小檗碱，虽然，其得率仅为 0 0 4 4 ，远低于原植物1 t 3 9 - 4 0 l ，但毕竟可以从愈伤组织中得到小檗碱。此外，用黄连 ( c o p t i sc h i n e n s i s ) 的叶、叶柄及茎做外植体诱导愈伤组织，也可获得含量相当于黄连根茎 的小檗碱。从盾叶薯蓣( d i o s c o r e az i n g i b e r e n s l s ) r p 产生一种地奥素( d i o s c i n ) ，它具有祛痰， 6 福建农林大学硕士学位论文 止咳，消炎和脱敏作用，它的组织培养已获得成功1 4 1 1 ，其产率已达愈伤组织的0 4 6 ， 这虽然比原植物的产率2 5 4 5 要低，但通过改进，可能会有所改善。从有名的中药延 胡索( c o r y d a l i sy a n h u s u o ) 的组织培养物中得到了包括四氢巴马亭在内的总碱，含量接近或 超过原植物中的含量【4 2 弗】。千金藤属植物头花千金藤、血散薯的愈伤组织均古生物碱，其 含量接近自然植株【4 “7 1 。延胡索愈伤组织均不含生物碱，而分化成小鳞茎后则不管在固 态或液态培养基中其生物碱的含量均达自然植株水平1 4 引。地黄培养植株其糖含量与自然植 株基本一致，而茎培养品的梓醇含量、叶培养品的铁的含量则明显增高 4 9 1 。黄芪愈伤组织 中总皂甙含量茎培养品高于叶培养品，如在培养基中加入有机锗则含量均有提高【5 0 1 。穿心 莲愈伤组织中穿心莲内酯与穿心莲新甙虽较原植物低，但显示出愈伤组织能台成二萜内 酯，适当改善条件亦有可能达药用水平【5 。 细胞培养还可以将各种初级化合物，转化成医药上更有效的化合物。依靠植物将特殊 物质转化为更有效的生理活性物质，被认为是植物细胞培养应用方面的一个最有希望的领 域，比用微生物和化学合成更容易实现某些化合物化学结构的特殊修饰。如南洋金花悬浮 培养物对酚有糖基化作用，使酚类药物的有效性显著增强。毛曼陀罗的培养细胞能快速将 氢配转化为熊果苷，使后者在作为利尿剂和泌尿器消毒剂时所用剂量减少，疗效提高。 为加速植物细胞培养技术商业化生产进程，各国科学家开发各种悬浮细胞培养生物反 应器，一方面不断改进培养技术，如控制培养的气相环境，加入刺激剂、大孔树脂吸附剂 等；一方面发展新的培养方法，如高密度培养、连续培养等。以期得到一种适合于植物细 胞工业化生产的培养方式。目前国内外用于药用植物细胞悬浮培养的反应器主要有搅拌 式、鼓泡式、气升式、振动混合式。 1 1 4 药用植物组织、细胞培养研究存在问题及展望 综上所述，近代生物技术在传统药用植物研究中的应用，尽管尚处于实验室阶段，而 且明显地存在着基础理论研究滞后的现象，但近2 0 年来所取得的进展令人鼓舞，前景诱 人。生物制药作为生物工程研究开发和应用中最活跃、进展最快的领域，被公认为是2 1 世纪最有前途的产业之一。与传统生产方式相比较应用生物技术进行传统药材生产有以下 几个优点1 1 1 ( 1 ) 药材( 或活性成分) 的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条 件与土壤环境等因素的制约，可排除病虫害的侵袭与农药残留量的困扰，使药材质量稳定。 ( 2 ) 通过特定的生物转化反应，生产人们需要的活性成分。( 3 ) 通过对活性成分生物合成路 线进行遗传操纵，提高目的产物的产量。( 4 ) 通过加入或删除基因而改变其遗传特性，达到 大幅度提升有效成分产量或合成新的活性产物。 7 福建农林大学硕士学位论文 植物组培技术的应用，的确为药用植物的开发开辟了新的领域，尤其在解决药源不足 方面功不可末。但组培技术在生产方面真正进行工业化大生产，为国民经济的发展作出贡 献，还有很多的困难【5 2 ，5 3 】：( 1 ) 许多珍稀药用植物的快繁技术不够成熟，虽然组培试验再生 苗能成功，但仍存在外植体玻璃化严重、污染率高等问题，不能进行批量生产，也不能真 正用于资源的开发和保护。( 2 ) 通过愈伤组织或悬浮培养繁殖出的植物易出现不良变异，使 药材品质、抗性、产量均受影响，造成损失。( 3 ) 有相当数量的重要药物在培养细胞中不 存在或含量甚低。毛地黄愈伤组织培养物产生约1 5 种强心甾，但强心甾的种类和数量在 随后的继代中明显减少。( 4 ) - 1 - 业化生产所要求的药用植物细胞和器官培养以及它们次生代 谢产物的合成的基本知识还非常缺乏。植物细胞的活力以及在反应器中受各种理化因子的 影响最近才开始有所研究，远远落后于人们对微生物和动物细胞培养的认识。( 5 ) 次生代谢 物的合成需要一段很长的过程，其中还包括多种酶类之间的协同和相互抑制，这种生物 合成比在微生物和哺乳动物细胞中合成重组蛋白或只有一两个基因决定的蛋白质的过程 要复杂得多。这也是为什么植物细胞和组织培养的商业化还没有取得成功的一个重要原 因。( 6 ) 药用植物细胞和器官培养的经济成本相当昂贵。这项技术必须要有高成本的生物反 应器以及能维持适宜生长条件的各种辅助控制仪器和严密的操作控制程序方可实现，而这 些都需要很高的成本。 药用植物细胞培养技术的高速发展，不仅可有效保护我国的天然中药资源不受破坏， 而且可以使中药更好地满足人们的需要。它将促进我国中药原料和药材新生产方式的形 成，将给传统的中药产业带来巨大的变革，对中草药走向现代化、走向世界产生积极的作 用【9 1 。目前我国正在加快中药现代化、标准化、国际化的进程，中药产业正面临着前所未 有的机遇和挑战。毫无疑问，今后植物组织培养技术在药用植物研究中的应用将具有十分 广阔的应用前景【3 射。 1 2 影响植物细胞培养产生次生代谢物的因素 1 2 1 外植体对细胞生长及次生代谢物产生的影响 同一植株不同部位的组织进行培养时，其产物或产物积累量不同。陈学森窨【弭5 5 1 报道， 银杏叶来源的愈伤组织黄酮含量为1 5 ，茎段来源的愈伤组织为1 o ，而子叶来源的愈伤 组织仅为0 3 。m i s c h e n k o 等【5 6 】在茜草愈伤组织培养过程中发现，来源于叶柄和茎的愈伤 组织葸醌累积量比来源于茎尖和叶的愈伤组织高。徐咏梅等【5 7 l 对杜仲、乔林与叶林2 种栽 培模式下树皮中次生代谢物的含量差异研究发现，乔林树皮中杜仲醇、总黄酮和杜仲胶的 含量均比叶林树皮中的高，而叶林树皮中绿原酸、京尼平甙酸和桃叶珊瑚甙比乔林树皮中 8 福建农林大学硕士学位论文 的高。因此，利用植物细胞培养生产次生代谢物时，选择能诱导出疏松易碎、生长快速且 具有较高次生代谢物合成能力的愈伤组织的外植体非常重要。 1 2 2 培养基对细胞生长及次生代谢物产生的影响 1 2 2 1 培养基的种类对细胞生长及次生代谢物生长的影响 在细胞培养中，愈伤组织生长和次生代谢物产生的最佳培养基一般是不一致的。钟青 平等【5 8 】研究不同培养条件下的栀子愈伤组织生长和栀子黄色素的产生时发现，b 5 、m g 5 基本培养基有利于愈伤组织生长；m - 9 基本培养基有利于黄色素合成。甘烦远等认为m c 培养基对红花愈伤组织生长和生育酚的形成最有效【5 9 】。因此在组织培养时可以采用二步培 养法，根据生长及代谢的需要，调整基本培养基。 1 2 2 2 培养基组分对细胞生长及次生代谢物生长的影响 1 2 2 2 1 碳源对细胞生长及次生代谢物生长的影响 蔗糖常用作为碳源，浓度为2 5 e 6 0 1 。一般认为它被植物组织细胞壁内的蔗糖酶分解 为葡萄糖和果糖后再被细胞吸收利用，而且对于维持培养基的渗透压也具有重要作用。也 可以外加葡萄糖、果糖或麦芽糖作为碳源。对于通常使用的单糖则需要一定的浓度，增加 其浓度会减慢生长并提高产率，但浓度过高，则会导致生物合成能力的丧失。 不同的培养细胞适合生长和次生代谢物积累的碳源种类不同。郑穗平等【6 l 】，在研究玫 瑰茄细胞生长和花青素生成时发现，蔗糖作为碳源，细胞的生长量高，葡萄糖作为碳源， 细胞花青素的含量高。赵德修等【6 2 】研究发现，5 蔗糖+ 1 葡萄糖组合对雪莲愈伤组织生 长不仅有利，而且细胞中总黄酮的含量也最高。 1 2 2 2 2 氮源对细胞生长及次生代谢物生长的影响 氮源是指能向细胞提供氮元素的营养物质。氮元素是植物细胞的重要组成元素之一， 也是生物碱等次物代谢物的组成元素。氮源是植物细胞生长、繁殖和生物碱等次生代谢物 的生产所必不可少的营养物质。植物细胞培养通常采用一定量的硝酸盐和铵盐作为混合无 机氮源，单独以铵盐或者硝酸盐为氮源，都对细胞的生长和次生代谢物的生成不利【6 3 1 。 氮源对次生代谢物的产率有很大影响。陈永勤等【删报道，培养基中n 0 3 。浓度高有利于 愈伤组织的生长，n h “浓度高抑制愈伤组织生长，但显著提高了紫杉醇的含量。陈浩等【6 5 】 研究发现，硝态氮对茶愈伤组织儿茶素的形成最为有利，氮质量浓度为1 5 m m o l l 时愈伤组 织生长量最高，高氮浓度则导致儿茶素含量急剧下降。 1 2 2 2 3 磷酸盐对细胞生长及次生代谢物生长的影响 植物细胞培养需要各种无机元素，其中磷酸盐的浓度对细胞生长和次生代谢物的生产 9 福建农林大学硕士学位论文 有很大影响。磷是在细胞生命活动中起重要作用的d n a 、k n a 、a t p 等许多生物活性物质 的组成元素，对细胞分裂、繁殖、生长和新陈代谢有重要意义。因此磷是植物细胞培养中 不可缺少的重要元素。在植物细胞培养中通常由磷酸盐提供细胞所需的磷元素。 培养基中磷酸盐浓度的变化对细胞生长和次生代谢物合成的影响有所不同。一般来 说，高浓度的磷酸盐有利用细胞生长，但却不利于次生代谢物的积累，相反，降低磷酸盐 浓度，可提高次生代谢物的产量，却抑制细胞的生长。在烟草细胞培养生长尼古丁和长春 花细胞培养生产阿里马斯和酚醛塑料及骆驼蓬生产哈马碱的结果与之类似【6 3 】。但在毛地黄 的细胞培养中，增加磷酸盐，可以促进洋地黄毒的合成【6 3 j 。 1 2 2 2 4 外源植物激素对细胞生长及次生代谢物生长的影响 植物激素是在植物体内合成并从产生的部位运输到其它器官和组织对生长发育起到 调控作用的微量有机物，也叫内源激素。植物生长调节剂是人工合成的具有植物激素活性 的化学物质，也叫外源激素。在组织培养中通常把植物激素和植物生长调节剂一起都称为 植物激素。植物激素包括5 大类：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类、脱落酸、乙烯。 韩爱明等1 6 6 1 在研究生长调节物质对高山红景天细胞生长及红景天苷积累的影响时发 现，在不同生长调节物质组合中，以n a a 和6 b a 组合效果最好，生物量和红景天苷含量 都最高。姜玲等以银杏幼叶诱导的愈伤组织进行细胞悬浮培养发现，k t 与n a a 组合，n a a 与6 b a 组合均能使细胞干重和黄酮糖苷含量同时提高，而g a 3 和2 ，4 d 对黄酮糖苷有明显 的抑制作用。同一激素对不同植物会有不同的结果，例如，应用高浓度激动素对紫花曼陀 罗愈伤组织中生物碱的生产起抑制作用，而在马氏山培养物中却促进生物碱的生产【佩6 引。 此外，前体物质的添加也对细胞生长及次生代谢物生长有影响，在培养基中添加椰 子汁( c w ，5 2 0 ) 、酵母提取物( y e ，0 0 5 0 1 ) 、麦芽提取液( m w ，0 0 2 0 1 ) 等 对药用植物细胞生长及次生代谢物生长也有一定作用。郑光植等【6 9 】研究表明，云南红豆杉 悬浮细胞适宜的培养基为b 5 ，当添加椰子汁( c m ) 、酪蛋白氨基酸( c a ) 和水解乳蛋白 ( l h ) 3 种有机物时，均能提高培养细胞中紫杉醇的含量，而且c m 和c a 还能促进细胞的 生长。培养基的酸碱度对次生代谢物的分泌也很重要。不同的植物要求的酸碱度不同，不 过大多数植物适宜生长在弱酸性环境，p h 值为5 6 5 8 。 1 2 3 环境条件因素对细胞生长及次生代谢物产生的影响 1 2 3 1 光照对细胞生长及次生代谢物生长的影响 光照对植物细胞细胞培养有重要影响。大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生长 要求一定波长的光的照射，并对光照强度和光照时间有一定的要求。朱新贵等【7 0 】研究发现， 1 0 福建农林大学硕士学位论文 蓝光是促进玫瑰茄悬浮细胞产生花青素的最有效单色光，红光和橙光无效，其它单色光随 其波长接近蓝光正效应增强。元英进等【7 1 1 研究单色光对长春花愈伤组织影响时发现，蓝光 对细胞生长和生物碱积累均有促进作用，红光和黄光不如白光，绿光有抑制作用。杨振堂 等【7 2 】认为增加光照能增加杜仲含胶量，但愈伤组织增殖倍数降低，杜仲胶生产的总效率以 暗培养为好。 1 2 3 2 温度对细胞生长及次生代谢物生长的影响 植物细胞的生长、繁殖和次级代谢物的生长需要一定的温度条件。在一定的温度范围 内，细胞才能正常生长、繁殖和次级代谢物的生长。一般植物组织培养的温度在2 0 3 0 c ， 超过3 0 c 对生长具有明显的抑制作用。次生代谢物的积累对温度的依赖性不同，不同的培 养材料略有差异。h a z e l l 将烟草的两个品种n c 2 5 1 2 和m a r y l a n d a m m o t h 的愈伤组织分别 在2 0 、2 5 和3 0 下培养，n c 2 5 1 2 在2 0 和2 5 下生长均较适宜，m a r y l a n d m a m m o t h 贝l j 在2 0 。c 时增长较多；但从尼古丁的含量来看，两个品种均在2 5 。c 时得率最高【7 3 】。 另外，维持细胞的存活和增殖对溶氧浓度有一定的要求，一定范围提高溶氧浓度能提 高细胞生长速度，但是过高的溶氧浓度对细胞生长有抑制作用。目前，气体成分对植物细 胞培养影响的研究仍处于初级阶段，它们的作用机理还不明确，深入探索有关机理对优化 培养条件、提高培养效率有重大意义。 虽然细胞培养的成本较高，但是由于一些天然植物有效成分含量低，或难于进行化学 合成，或其天然产物具有很高的效用，因此它们有着巨大的市场需求和高昂的售价。成功 的植物细胞培养是解决天然植物资源匮乏、活性成分不稳定等问题的有效途径。植物细胞 培养生产次生代谢物的研究已经有了很大的进展，且前景广阔。 1 3 高效液相色谱法( h p l c ) 在药物检测上的应用 高效液相色谱叫g l lp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r p h y ) j 丕p - i 称为高压液相色谱( 1 l i 曲 p r e s s u r el i q u i de h r o m a t o g r p h y ) 、高速液相色谱( 1 l i g hs p e e dl i q u i dc h r o m a t o g r p h y ) 、高分离 度液相色谱衄g hr e s o l u t i o nl i q u i dc h r o m a t o g r p h y ) 、或现代液相色谱( m o d e ml i q u i d c h r o m a t o g r p h y ) ，是2 0 世纪6 0 年代末期，在经典液相色谱的基础上发展起来的新型分离 技术。目前高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面，都达 到了和气相色谱法相媲美的程度，并保持了经典液相色谱对样品适用范围广、可供选择的 流动相种类多和便于用作制备色谱等优点，已在生物工程、制药工业、食品工业、环境监 测、石油化工等领域获得广泛的应用。 该色谱法具有四个特点：( 1 ) 分离效能高：由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相 1 1 福建农林大学硕士学位论文 色谱填充柱的柱效可达0 1 2 - - 5x 1 0 4 块，m 理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱1 0 3 块 m 理论塔板数的柱效。( 2 ) 选择性高：由于液相色谱柱具有高柱效，并且流动相可以控制和 改善分离过程的选择性。因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合物及其 同分异构体，还可以分析在性质上极为相似的旋光异构体，并已在高疗效的合成药物和生 化药物的生产控制分析中发挥了重要作用。( 3 ) 检测灵敏度高：在高效液相色谱法中使用 的检测器大多数都具有较高的灵敏度。如被广泛使用的紫外吸收检测器，最小检出量可达 1 0 母g ；用于痕量分析的荧光检测器，最小检出量可达1 0 。1 2 9 。( 4 ) 分析速度快：由于高压输 液泵的使用，相对于经典液相色谱，其分析时间大大缩短，当输液压力增加时，流动相流速 会加快，完成一个样品的分析时间仅需几分钟到几十分钟 7 4 - 7 5 1 。 高效液相色谱法在植物药物中应用广泛【7 6 - 1 ，如，在植物药物资源开发，植物药物加工 炮制及提取工艺，药物最适栽培年限和最佳采收季节确定，药物质量评定以及药典中都有 广泛应用。在质量评定中，高效液相色谱法可用于植物药物的定性及定量分析，尤其在干 扰因素较大时表现出较大的优越性。如用c 1 8 柱检测板蓝根中的靛蓝、靛玉红，流动相为 甲醇：水( 9 6 ：4 ) ，用2 8 0 n m 波长定量检测。测定结果表明，在0 2 5 - 4 m g l 范围内线性良好， 回收率为8 9 8 9 2 。 植物药越来越受到人们的重视，据报道，全世界大约有7 0 的人口医疗依靠各种类型 的植物药。对植物药的兴趣主要基于以下两个原因，一是人们普遍认为植物药具有较小的 毒性，二是用合成方法寻求新药物越来越困难，同时已有的西药对一些疑难病症无能为力。 植物药分析的主要目的【_ 7 。7 】是：( 1 ) 通过真实样品和未知样品的图谱对比，控制植物药的质 量；( 2 ) 分离测定植物药中的活性组分，保证临床用药和药理研究的质量：( 3 ) 为活性组分 的制备分离摸索条件：( 4 ) 开发新的中药资源。目前已研究出大量的药用植物活性组分色谱 条件及方法，主要可分为生物碱类、苷类、黄酮类、有机酸等几大类。 h p l c 具有专属性强、灵敏度高等特点，既可用于分离也可用于定量分析，适用于各 种各样的植物药物。因此在药物成分的分离与测定方面能够充分发挥其优势。而且随着计 算机软件的开发、专家系统的应用、检测手段的进步、各种联用技术的出现以及其他一些 相关问题的解决，h p l c 在药物研究中将会发挥越来越重要的作用。 1 4 中草药马蓝的研究概况 马蓝s t r o b i l a n t h e sc u s h 2 ( n e e s ) d k t z e 7 胡别名青黛、靛蓝、南板蓝根，叶经加工成千 叶入药称为大青叶，茎、叶加工成一种深蓝色的粉末入药称为青黛，是爵床科马蓝属的一 种草本植物，主要分布于中国华南和西南地区，是常用中药。近年研究开发为重要的抗癌 1 2 福建农林大学硕士学位论文 药物。中国药典自1 9 9 5 年版起，将其作为新增中药品种收载。马蓝性寒、味苦、归心、 胃经、具有清热解毒的功效，用于温病发斑、丹毒、流感、流脑等。药理试验表明，马蓝 根对金色葡萄球菌和肺炎杆菌有良好的抑制作用，马蓝叶中含有抗癌有效成分靛玉红【7 9 】。 明末宋应星在天工开物中记载，马蓝是古代重要的布料蓝色染色剂，用手揉搓马蓝叶 片，若未及时除去，会在手上出现难以去除的蓝色斑块。马蓝的化学成分报道有自桦脂醇、 羽扇豆醇、羽扇烯酮、大黄酚、靛蓝、氨基酸类、葸醌类、甾醇类、色胺酮和靛蓝、靛玉 红 7 9 - 8 0 l 等。含有的酚类物质特别丰富，在组织培养中特别容易褐化。近年来关于马蓝的研 究主要集中在以下几个方面。 1 4 1 马蓝的植物学研究及栽培加工技术 爵床科马蓝属，多年生草本或亚灌木，一次性开花结实。茎直立，多分枝，基部木质 化。叶稍不等大，对生，叶柄长1 - 2 e r a ，叶片倒卵状长圆形，长5 - 2 0 e m ，宽2 5 7 e r a ， 先端渐尖，基部渐窄，边缘有浅锯齿，侧脉4 8 对，幼时脉上被褐色细软毛。穗状花序，