（应用化学专业论文）新型生物酶荧光分子探针的合成与性能研究.pdf

摘要 众所周知，在临床生化检验中各种酶活力的测定都是很重要的酶学诊断指标。随着 荧光探针技术的不断发展，荧光探针的高灵敏性、可视性、操作简单等特点越来越受到 人们的关注。特别是近些年来，荧光探针技术越来越多的应用到临床医学、生物学等各 领域，作为细胞生物学和生物医学的特种试剂和诊断药物。 2 ( 2 羟基苯基) 苯并咪哗( h p b l ) 及其衍生物是一类重要的荧光化合物，它们可以通过 激发态分子内质子转移过程( e s i p t ) 发射具有大的s t o k e s 位移的特征荧光，这类化合物 对开发新型荧光探针、高能辐射探测器、塑料发光体以及聚合物紫外稳定剂有着重要意 义。因此，研究此类化合物的合成及其荧光特性具有重要的理论意义和应用价值。 主要内容如下： 1 以取代水杨醛和邻苯二胺为原料，合成了h p b i 衍生物2 a 2 d ，中间产物在吡啶 存在下与三氯氧磷反应，在碱性条件下水解，得到了系列能提高碱性磷酸酶测量准确度 的荧光探针2 苯并咪唑基苯基磷酸钠盐。并通过紫外光谱和荧光光谱测定与碱性磷酸 酶反应前后的光谱变化。与国际临床化学联合会( i f c c ) 推荐的a m p - - b u f f e r 方法相 比，操作更为简单，测定更为准确。 2 合成了n 【3 ( 2 苯并咪唑基) 4 羟基苯基 马来酰亚胺酸( b i h p m a ) ，n 3 ( 2 苯并 咪唑基 4 乙酸酯基苯基 ( b i h p m a a ) 和马来酰亚胺( b i h p m ) n 3 ( 2 苯并咪唑基) 4 一羟 基苯基，马来酰亚胺( b i h p m ) ，在基本荧光发射团上分别引入了羧酸基；酯基；双键活 性基团。提高了探针分子的水溶性，脂溶性和生物相容性。测定了三种巯基探针与b 巯基乙醇，巯基乙胺，巯基甲酸丙酯，巯基乙酸反应前后荧光光谱变化，并将它们应用于 h e p g 2 4 人源肝癌细胞) 细胞和l - c y s ( l - 谷胱甘肽) 中巯基的测定，结果证明了该类化合物 作为细胞内巯基荧光探针的可行性。 关键词：苯并咪唑荧光探针碱性磷酸酶巯基合成 a b s t r a c t i ti sw e l lk n o w nt h a tv a r i o u sc h e m i c a la n db i o l o g i c a la c t i v i t yo ft h ee n z y m ea r ev e r y i m p o r t a n td i a g n o s t i ci n d i c a t o r si nc l i n i c a lt e s t i n g t h eh i g h l ys e n s i t i v i t y , v i s i b i l i t y ，s i m p l e o p e r a t i o no ft h ef l u o r e s c e n tp r o b ea r em o r ea n dm o r eb e i n gc o n c e r n e dw i t ht h et e c h n i c a l p r o g r e s so ff l u o r e s c e n tp r o b e e s p e c i a l l yi nr e c e n ty e a r s ，f l u o r e s c e n tp r o b et e c h n o l o g ya l e m o r ca n dm o r ce x t e n s i v e l y 七函暑a p p l i e dt oc l i n i c a lm e d i c i n e ，b i o l o g ya n do t h e rf i e l d s ，u s e d i nc e l lb i o l o g y , b i o - m e d i c a la ss p e c i a l t yd r u g sa n dd i a g n o s t i cr e a g e n t s 2 - ( 2 一h y d r o x y p h e n y l ) b e n z i m i d a z o l e ( h p b i ) a n di t sd e r i v a t i v e sa r ea s e r i e so fi m p o r t a n t f l u o r e s c e n tc o m p o u n d si nt h ec a s eo ft h e i ri n t e n s ee m i s s i o np r o p e a i e sv i ae x c i t e d s t a t e i n t r a m o l e c u l a rp r o t o nt r a n s f e r ( e s i p t ) m e a n w h i l e ，t h eh p b id e r i v a t i v e sa r eu s e f u la san e w s e r i e so ff l u o r e s c e n tp r o b e s ，h i g l l e n e r g yr a d i a t i o nd e t e c t o r , p l a s t i cs c i n t i l l a t o r sa n dp o l y m e r u l t r a v i o l e ts t a b i l i z e r s s oi ti so fg r e a ti m p o r t a n c et os t u d yt h es y n t h e s i sa n df l u o r e s c e n t c h a r a c t e r i s t i c so ft h e s ec o m p o u n d s t h i sa r t i c a li n c l u d e st w op a r t sa sf o l l o w s ： 一也三 1 h p b id e r i v a t i v e s ( 2 a - 2 d ) 殛多s y n t h e s i z e dw i t h s u b - s a l i c y l a l d e h y d e a n d 1 ，2 - p h e n y l e n e d i a m i n ea st h el a wm a t e r i a l s ( 2 a - 2 d ) e n t e r e di n t or e a c t i o nw i t hp h o s p h o r u s o x y c l d o r i d ei np y r i d i n ep r i o rt oh y d r o l y s i si n a l la l k a l i n em e d i u mt o y i e l dt h et a r g e r c o m p o u n d - - - 2 - b e n z i m i d a z o l e p h e n y l p h o s p h a t ea n db e t t e rt h a nt h ea m p b u f f e rm e t h o du s e d f o r t h ed e t e r m i n a t i o no fa l k a l i n ep h o s p h a t a s ea c t i v i t yt or a i s et h ea c c u r a c yo fa n a l y s i s 2 ac o n v e n i e n tm e t h o dt os y n t h e s i z et h r e ek i n d so fn o v e l2 - ( 2 h y d r o x y p h e n y l ) b e n z i m i d a z o l ei no r d e rt oi m p r o v et h es o l u b i l i t i e so ft h ef l u o r o p h o r e sw i t hs u b s t i t u e n t ( s ) o f c a r b o x y l ，e s t e ra n dd o u b l e - b o n dw h i c ha r ea i m e df o rd e t e r m i n i n gt h es u l p h y d r y lg r o u pw a s r e p o r t e d 1 1 l ec o r r e s p o n d i n gp h o t o - p h y s i c a lp r o p c r t i w e r ec h a r a c t e r i z e db yu l t r a v i o l e t a b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c es p e c t r ai nm e t h a n 0 1 t h e ya l s ob eu s e df o r - - s ；hi nh e p g 2a n d l - c y s a n dt h ec e l l u l a re x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a tb i h p m a , b i h p p aa n db i h p mc a n b eu s e da sf l u o r e s c e n tp r o b e sf o r - s hi nc e l l s k e yw o r d s ：b e n z i m i d a z o l e ，f l u o r e s c e n tp r o b e s ，a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，s u l f h y d r y l ，s y n t h e s i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取 得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 墨盗墨兰太望 或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名彬 签字目期：娜年 72 月箩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 墨盗墨墨盘堂有关保留、使用学位论文 的规定。特授权墨盗墨墨盘鲎 可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编， 以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复本和电子 文件。 由于部分资料需要保密，解密后适用本授权说明 学位论文作者签名嘭研多 导师签名：研互 ， 签字日期：椰年7 2 ，月 7 歹日 签字日期：蜥口月f 矿日 第一章文献综述 1 1 荧光概述 1 1 1 荧光的产生 第一章文献综述 分子都含有电子，电子在不停地运动着，根据量子理论，运动着的电子处于一系列 不连续的能量状态( 即能级) 中，电子遵守一定的规则，可以从一个能级向另一个能级 跃迁，并伴随着能量差相对应的特定能量的吸收或释放。一般情况下，电子总是处于能 量最低的能级( 基态) 。在一定的条件下，电子可吸收能量( 如光能，热能，电能，机 械能等) 跃迁到较高能级( 激发态) ，这个过程叫激发。处于激发态的电子是不稳定的， 它总是要跃迁回到基态，并将多余的能量释放出来。跃迁方式可能是辐射跃迁，也可能 是非辐射跃迁。以非辐射跃迁时，能量大多转化成热能，而以辐射方式跃迁时，能量转 化成相应波长的光，这个过程叫发射。 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐射方 式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也短，这种发 射光，叫荧光i l - 2 1 。1 8 3 8 年b r e w s t e r 首先描述了荧光现象，但荧光一词，是由s t o k e s 在 1 8 5 2 年提出的。 3 2 & 1 0 3 2 & l 0 2 s 1 o 磊 萎 疑 i 2 l 毛 0 ， 2 t o 厶南如厶 嘶嗫牧 荧光礴光 图1 - 1 分子吸收和发射过程的能级图 f i g 1 - 1 l e v e lm a po fa b s o r p t i o na n de x c i t a t i o n 第一章文献综述 荧光分子的第一激发态与基态的能差是一定的，因而荧光波长不随激发光波长的改 变而发生变化。分子激发过程中吸收的能量一般高于荧光辐射释放的能量，二者之差以 热的形式损耗，因此荧光波长比激发光波长要长，其差通常为5 0n m 7 0n m ，当有机化 合物分子内可以形成氢键时，则增至1 5 0 n m 一2 5 0n l n ，这一规律称为s t o k e s 位移。荧光 的强度受许多因素的制约，如激发光源能量、吸收强度、量子效率等。 1 1 2 影响荧光性质的环境因素 荧光分析信号的产生涉及对光子的吸收和再发射两个过程，这两个过程都是瞬间 的，而在两个过程之间存在一相当短的时间间隔，一般为1 0 。8s ，在这一时间内处于激 发态的分子发射荧光而回到基态的去活过程与各种无辐射( 非发光) 过程是相互竞争的。 因此荧光的强度取决于分子结构及其所处的环境因素【3 j 。 1 温度 荧光试剂的荧光量子产率和荧光强度通常随溶液温度的降低而增加：反之，则减弱。 一般在2 0 时，温度引起的荧光淬灭作用就有表现，随着温度的升高，淬灭作用加剧。 在2 0 以下荧光量子产率随温度变化稍不明显，因此进行荧光染色过程中，为取得良 好的荧光效果，应注意温度的控制。 2 溶剂效应 溶剂的性质对荧光物质的荧光强度有明显的影响，通常荧光强度随着溶剂极性的增 大而增强。如& 羟基喹啉在氯仿、丙酮、乙腈中的荧光强度随着溶剂极性的增加而增强。 3 p h 值对荧光的影响 如果荧光物质带有酸性或碱性取代基时，溶液p h 值的改变对其荧光强度将有很大 影响，荧光物质的酸式或碱式的光谱也会有明显差别。值得注意的是，一些荧光物质在 酸性或碱性溶液中发生水解，发生环的破裂或键的断开，使荧光强度改变。因此，必须 区分是p h 值对荧光强度的影响还是不可逆的化学变化引起的荧光强度的变化。 4 荧光探针浓度的影响 浓度对荧光强度的影响很明显。在稀溶液中的荧光强度与荧光探针的浓度呈线性关 系；浓度增加到一定程度时，荧光强度保持恒定，即使再增加浓度，荧光强度也不发生 变化，若浓度再增加，超过一定限度，荧光强度将随着浓度的增加而减弱。荧光探针液 的浓度一般为1 0 一1 0 。5m o l l 。 5 荧光淬灭 各种原因使荧光探针的荧光强度降低，以致荧光探针的荧光强度与浓度不呈线性关 系，这种现象称为荧光淬灭。荧光淬灭导致荧光物质的荧光效率降低或激发态寿命缩短， 导致荧光强度的降低。荧光淬灭主要有碰撞淬灭、能量转移、氧的熄灭作用、荧光物质 的自淬灭等。 第一章文献综述 1 2 有机荧光探针 1 2 1 概述 在生物染色剂中有一类可被紫外线或蓝紫光( 短波长光) 激发而发射荧光的染料，称 为荧光染料( 荧光色素) ，现在应用的一些染料也可被长波长光线激发，这些荧光色素常 统称为荧光探针。 作为探针的试剂必须具备： ( 1 ) 探针与被研究分子的某一微区必须有异性结合，且结合比较牢固； ( 2 ) 结合的探针必须对环境条件灵敏； ( 3 ) 结合的探针不影响被研究的大分子的结构和特性。 有机荧光探针对环境变化非常敏感，已广泛应用于具有生物活性的物质物化性质和 结构的测定，特别是近十年来，有机荧光探针染料同时也被用于电子学、聚合物化学、 医药、法医和其他各种领域。 1 2 2 荧光探针在活细胞中的应用和发展 1 8 8 5 年，e h r l i c h 用亚甲蓝作为第一个重要的活体染料，并阐明了它对神经组织的 亲和性。吖啶染料是治疗锥虫病的有效药物。e h r l i c h 用吖啶黄素对老鼠体内的这种原 生动物进行标记，并取得显著效果。这种染料也因其能影响锥虫而被称为“锥黄素。 显微镜学家用明视野显微镜观察了这类染料和微生物的结合。p r o v a z e k 把各种荧光探针 和药物( 如莹黄素，曙红，中性红，奎宁等) 加到纤毛豆形虫的培养液中，并用荧光显 微镜观察了细胞的染色荧光。这种实验方法的基本目的是把各种类型的物质( 不管是染 料还是无色药物) 引入细胞，假定它们服从一定的分布规律并在一定的条件下富集在细 胞的特定成分中，那么他们在荧光显微镜的暗视野中可以突出显示细胞的部分结构。 1 9 1 4 年，荧光探针引入荧光显微技术中，标志着实验细胞学向前迈了一大步。 p r o v a z e k 首次描述了活体荧光探针。以前，曾有人用活体染料，包括荧光探针，实验原 生动物，但只限于用明视野显微镜观察。1 9 3 2 年匈牙利药物学家把几种不同的荧光探针 注入预先感染了锥虫的动物体内，创立了活体荧光探针技术。荧光显微镜下的血涂片观 察表明，染料和核酶及带血锥虫的基本部分有特异结合。2 0 世纪3 0 年代由于对化学疗 法特别感兴趣，人们做了各种努力，试图确定染料在什么位置和动物及人体内的疟原虫 结合。人们在荧光显微镜下发现，在所实验的各种荧光探针中，米帕林( 奎时因， q u i n a c r i n e ，即阿的平) 在注射后的1 0 m i n 内能被循环淋巴液选择吸收。把吖啶黄素加 到成纤维细胞培养液中，在显微镜下可看到，实验浓度下它能阻止细胞的分裂。r e y n o l d s ( 1 9 8 5 ) 曾用荧光吲哚碳花青染料标记脂蛋白，在体外研究动脉粥样硬化形成过程中脂 蛋白的代谢。通过这些研究，人们明白某些氨基吖啶能优先与细胞核成分结合。对这种 结合机制的研究，导致了染料对核酸的亲和力的发展。这种强相互作用已为体外及低p h 区固定细胞中的纯化核酸所阐明。 第一章文献综述 1 2 3 体内荧光探针 在e h r l i c h 阐明荧光黄能示踪眼内液体的流动之后，t h i e l 将裂隙灯显微镜加以改 进，以观察眼内染料的荧光。荧光显微镜用的光源是经聚光镜会聚的透射光，对大多数 不透明的活器官标本无法观察。1 9 2 9 年，e l l i n g e r 和h i r t 对荧光显微镜作了重大改进， 在这种荧光显微镜中，光源的垂直入射光直接通过侧边的透光管，经物镜会聚于样品上， 发射的荧光沿透光管返回到观察者眼中。别的基本部件还有相应的滤光片和一个浸在水 中的物镜。这台被称作“体内活体显微镜”的仪器，可以认为是一台落射荧光显微镜。 他们用这种显微镜观察了动物体内注入荧光探针后的肾脏的微循环。荧光黄和吖啶黄素 的稀溶液被用于研究尿液形成的生理学。其他很多科学家对体内活体荧光显微镜产生了 性趣，并实验了各种荧光探针，如亮碱性染革黄棕g ，樱草灵黄，r h e o n i na ，噻唑素 ( t h i o f l a v i n e ) 等。1 9 8 3 年，人们用这种荧光新技术观察了活体皮肤，肝脏，肾脏，结 膜和肾上腺。为满足生物学研究的需要，活体荧光探针必须在等渗，无毒和无淬灭剂的 条件下使用。 近年来，用于现代落射荧光显微镜，显微荧光扫描仪，高灵敏摄像机，数据实时采 集器等现代化仪器和方法的应用，微循环的体内活体显微术又重新受到欢迎。有人在将 低密度脂蛋白( l d l ) 进行酰化，然后与一种荧光探针二十八烷基吲哚碳花青结合，当 肝窦内皮细胞摄取这种l d l 后，便可用荧光显微镜进行鉴定。研究人员将荧光标记的l d l 经门静脉注入大鼠体内。一周后处死大鼠，取出肝脏标本进行常规组织学检查，并用大 鼠内皮细胞单克隆抗体进行免疫组织化学染色。结果发现：在正常肝实质组织中，肝窦 内皮细胞出现荧光，而大血管内皮未出现荧光染色，说明仅肝窦内皮细胞能摄取乙酰化 的l d l 。 1 2 4 分子结构与荧光特性 荧光的发射与强度主要与染料的分子结构有关。事实证明，荧光物质分子一般都含 有发射荧光的基团( 称为荧光团) 以及能使吸收波长改变并伴随荧光增强的助色团l ”l 。 1 共轭体系对荧光的影响 通常增加分子p 电子共轭体系长度可提高荧光效率并使荧光红移。空间位阻效应的 存在能破坏分子的共平面性及共轭程度，从而使荧光减弱。立体异构对荧光强度也有影 响，如反式二苯乙烯是强荧光型的，顺式二苯乙烯由于位阻效应的存在则无荧光特性。 2 取代基对荧光的影响1 6 j 大部分有机荧光物质分子中带有芳环，芳环上引入取代基的种类和所处位置对荧光 化合物的荧光性能均有影响。 通常给电子基团可使荧光增强，如n r i r 2 ，o r ( r 1 ，r 2 = h ，c h 3 ，c 2 h 5 ) 等。吸电 子基团使荧光减弱，如 c = o ，一n 0 2 ，c o o h ，c h o ，c o r ( r - c h 3 ，c 2 h 5 等) ，n = n ， 卤素( a ，b r ，1 ) 等。还有一些影响不明显的取代基，如：r ，s 0 3 h 等。分子两端分别 引入给电子和吸电子基团可使染料发生红移并伴随荧光的增强。氨基的引入可使荧光增 强。有些取代基能改变染料的性质，例如环状多烯化合物是致癌的，但其吸电取代基衍 第一章文献综述 生物却具有实际应用价值。 3 分子环构化对荧光的影响 染料分子的闭坏对荧光的产生非常有利，可以增加分子共平面性和刚性而使荧光增 强。许多本身无荧光或荧光很弱的化合物与金属螫合产生的具有环状结构的螯合物显示 较强的荧光。分子内含有羟基并可形成分子内氢键多数情况下能使荧光强度提高。 1 2 5 有机荧光探针分类 目前最常用的有机类荧光探针有以下几种： 1 香豆素类 大多数香豆素荧光染料为黄色，带有绿色荧光。但香豆素的母体结构是无色的，且 在常温下没有荧光。取代后的香豆素衍生物，特别是给电子基团的取代，将增加其荧光 量子产率。如4 甲基7 羟基香豆素、7 二甲氨基香豆素，在它们的分子结构中不但含有 六元环，而且含有羰基，在一定条件下也可与被标记物发生反应，用于细胞内p h 的测 定、牛血清蛋白检测。 2 萘酰亚胺荧光染料1 7 - 9 萘酰亚胺类有机荧光染料是一类非常重要的功能染料，近年来在国际和国内研究非 常活跃。本类荧光染料的分子结构具有共平面性、较大的共轭体系，分子结构中一端具 有强的给电子基团，另一端具有强的吸电子基团，这种“吸一供电子共轭体系”中电子 很容易受到光的照射跃迁产生荧光。 3 菁类 菁染料近年来应用在红外激光染料、非线性光学材料和生物大分子荧光标记等方 面，主要是以吲哚环和苯丙噻唑、苯丙噫唑活苯丙吲哚等含氮杂环为骨架1 1 0 j 。 4 酞菁类 在酞菁的基本结构中，周边取代的官能团可以是烷基、苯并基团、杂环等，中心可 容纳n i 、z i l 、p t 、s i 、g e 等原子【l l l ，但酞菁染料的缺点是溶解度小、体积大，会影响 生物分子其他性能1 1 2 】。 5 罗丹明、荧光素及其它荧光染料 罗丹明类染料的荧光量子产率较低，而其最大吸收波长一般在6 0 0n m 左右，受样 品背景干扰相对较少，是常用的荧光探针。荧光素类染料具有较好的荧光量子产率以及 良好的水溶性，最大激发波长在5 0 0n m 左右，但s t o k e s 位移小，容易光致变色，光淬 灭率高，对p h 敏感性科1 3 j 。 吖啶类染料可与r n a 及d n a 结合，其阳离子形式还可以与蛋白质、多糖和粘多糖 等大分子静电结合，对活细胞具有渗透性，在高浓度下与蛋白质结合后荧光量子产率降 低，是较常用的碱基对嵌入荧光分析染料。 嗯嗪类染料由于n 原子的吸电子作用，能使波长红移8 0a m ，但同时造成了量子产 率和摩尔消光系数的下降。该类荧光染料已被用作生物探针1 1 4 】。 在众多有机荧光探针中，2 ( 2 羟基苯基) 苯并咪唑( h p b i ) f l z 其衍生物是一类重要的荧 第一章文献综述 光化合物，它们可以通过激发态分子内质子转移过程( e s i p t ) 发射具有大的s t o k e s 位移 的特征荧光，以其特有的性能在越来越多的领域内有着广泛的应用前景。 1 3 苯并咪唑类荧光化合物 1 3 1 概述 咪唑类衍生物是一类重要的生物配体，它在碱性磷酸酯酶，碳酸酐水解酶和超氧化 物歧化酶，参与金属离子的配位，对于它们的生物功能起着至关重要的作用1 1 5 , 1 6 ，在医 药、卫生和保健等领域有着广泛应 1 7 , 1 8 j 。其中苯并咪唑类衍生物是一种含有两个氮原 子的杂环化合物，可作为药物中间体，制备人、畜的驱虫药物和柑橘属果类的杀真菌剂， 以及果品保鲜剂，具有杀菌、抗癌等活性。由于其结构的优越性和生理活性、反应活性 以及其它优良特性，故它的应用十分广泛1 1 9 1 。因此，几十年来苯并咪唑及其衍生物的合 成及应用研究从未间断，至今仍十分活跃1 2 0 l 。 羟基苯基苯并咪唑类化合物是一类具有大的s t o k e s 位移值和较大的荧光量子收率 的荧光化合物，具有特征的荧光特性，可作为探针用于细胞生物学和生物医学的特种试 剂和诊断药物。 1 3 2 国内外对苯并咪唑类化合物研究动态 国外关于苯并咪唑类化合物及其衍生物的研究很多，如德国b o e h r i n g e ri i l g c l h e i m 公 司研制的降压药，瑞典a s t r a 公司研制的新型胃质子泵抑制剂奥咪拉畔等药物均为苯并 咪唑类化合物及其衍生物。日本茨城大学的藤井合成了系列羟基苯基苯并咪唑( h p b i ) 衍 生物作为锌离子荧光探针【2 l l 。国内苯并咪唑类化合物及其衍生物研究也很多，主要用于 医药、农药等方面。 1 3 3 苯并眯唑类化合物的生物活性 苯并咪唑类化合物的生物活性是多种多样的，既有与d n a 的相互作用，也有对多 种受体和酶的抑制作用，如作为d n a 拓扑异构酶的抑制剂、h i v 逆转录酶的抑制剂等。 这一特点使得它成为多种新药设计合成的目标。它们还是一类重要的生物配体，它在碱 性磷酸酯酶，碳酸酐水解酶和超氧化物歧化酶，参与金属离子的配位，对于它们的生物 功能起着至关重要的作用1 2 2 , 2 3 1 ，在医药、卫生和保健等领域有着广泛的应用。其中苯并 咪唑类衍生物具有杀菌、抗癌等活性。由于其结构的优越性和生理活性、反应活性以及 其它优良特性，故它们的应用十分广泛。 1 3 4 苯并咪唑类化合物的应用 苯并咪唑衍生物及其会属配合物一直都是研究热点，之所以引起人们极大的研究兴 趣，主要是由于这类化合物具有良好的生物活性。 第一章文献综述 早在2 0 世纪6 0 年代，苯并咪唑及其甲基、苯基衍生物就用于生物制药，显示出很 好的商业价值。随着人们对其性质的深入了解，发现苯并咪唑衍生物在有机溶剂及水 溶液中能发射出较强的荧光，因此人们利用其荧光量子产率较高的特性，将其应用于鉴 别和分析有机化合物、药物，以及用于生物大分子的荧光标记【2 4 1 。 苯并咪唑是一个有趣的杂环化合物，许多药物是苯并咪唑衍生物或其配合物。其中 最重要的两类是抗寄生虫药和质子泵抑制剂。1 9 6 1 年人们发现了苯并咪唑具有抗肠道线 虫作用，由此导致苯并眯唑类驱虫药的发展。2 0 世纪8 0 年代末出现的质子泵抑制剂主 要都是苯并咪唑类衍生物，具有抑制胃酸分泌作用，对溃疡的治愈率很高。苯并咪唑衍 生物作为配体与过渡金属离子形成的配合物，可用于生物分子的模拟，例如维生素b 1 2 就是苯并咪唑核苷酸与可啉环系的内络盐。近几年来，苯并咪唑衍生物作为配体应用于 放射性药物及抗炎药物的研究异常活跃。苯并咪唑衍生物还可用作铜铝等金属防腐剂、 光敏剂、无银照相、表面活性剂、荧光增白剂及光敏染料等。苯并咪唑可用作抗辐射剂， 效果达9 0 。聚苯并咪唑由于高热稳定性、化学稳定性、低温稳定性及粘结性好，又具 不燃性及抗吸潮性，已广泛用于太空服装等空间用材料。 1 4 碱性磷酸酶探针的研究进展 1 4 1 碱性磷酸酶简介 碱性磷酸酶的活性测定就是临床上最常见的血清酶活力测定目标之一【2 s 捌。碱性磷 酸酶( a l p 或a k p ) 是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向 胆外排出的一种酶i z t - z g l 。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有a k p l 、 a k p 2 、a k p 3 、a k p 4 、a k p 5 与a k p 6 六种同功酶。其中第1 、2 、6 种均来自肝脏， 第3 种来自骨细胞，第4 种产生于胎盘及癌细胞，而第5 种则来自小肠绒毛上皮与 成纤维细胞。 碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝 炎等的检查i 刈。患这些疾病时，肝细胞过度制造a l p ，经淋巴道和肝窦进人血液，同时 由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。因此可以通过 对人体内碱性磷酸酶含量的检测来监测控制肝脏疾病的发生。血清中a l p 活力的增高还 与骨骼疾病相关，如纤维性骨炎、骨软化病掣3 1 3 3 l 。 由于a l p 的强稳定性和底物的多样性，也被用于酶联放大镧系发光法( e a l l ) ，或 用作酶联免疫吸附测定( e l i s a ) 的标记物i 弹矧。此外，其在免疫测定和分子生物学中作 为追踪器的应用也越来越广泛1 3 丌。因此，建立准确、简单的新方法对于a l p 活性的测 定显得尤为重要。 1 4 2 碱性磷酸酶的分布 碱性磷酸酶是一种分解单磷酸酯的水解酶。它的活性中心包含了两个锌离子和一个 镁离子，又是一个典型的金属酶。a l p 由l v e n em e d i g r e c e a n u 于1 9 11 年首先报道。近 第一章文献综述 二十年来，a l p 的性质，结构，作用机理，活力调控等方面均有不少突破性的研究成果 p 引。更为重要的是a l p 和其他许多酶有相近的催化底物，这些酶包括磷酸甘油酯变位酶 ( e c 5 4 2 1 ) ，p h o s p h o p e n t o m u t a s e s ( e c 5 4 2 7 ) 等。它们具有异构酶、水解酶和 裂解酶的活性，参与磷酸化、构成一个酶的超家族有广泛且重要的功能。另外，由于a l p 催化许多有机物和无机物的磷酸化反应，使其生化检测、药物和化妆品生产中广泛应用。 近年来，组织非特异性a l p 的研究是一个热点，特别是2 0 0 7 年5 月在法国h u n i n g u e 举 行第五届国际碱性磷酸酶研讨会进步促进了对碱性磷酸酶的研究。 除了少数高等植物外，碱性磷酸酶几乎分布在所有的生物体内。在大肠杆菌中，它 在细胞内合成后，由信号肽引导转运到外胞周质中1 3 9 。在人和一些动物体内，a l p 广泛 分布在多种组织和细胞中，包括肝细胞、肠粘膜上皮细胞、成骨细胞、胎盘、血管内皮 细胞、胸腺、肺、脾、睾丸、中性粒细胞和淋巴细胞。哺乳动物中肠a l p 主要位于上皮 细胞刷状缘，胎盘组织中的酶则位于合胞体滋养层表面上。在肝脏，a l p 主要分布于胆 小管的表面细胞膜及肝窦状隙。在骨组织中，a l p 存在于软骨细胞、成骨细胞和骨细胞 中。在人和狗的肝内，肝a l p 集中在肝脏的胆小管膜，每克肠和肾组织含有较高的a l p 活性，在各组织细胞中a l p 有可溶的、锚定的和膜结合的几种形态1 4 0 - 4 5 1 。 a l p 在脊椎动物早期发育中就开始表达1 4 6 1 ，不同类型的a l p 具有时间和组织特异性。 在小鼠中，a l p 活性首先在4 细胞晚期出现于分裂球之间的细胞表面，胚胎植入前就表 达两种类型的a l p ：e a l p 和t n a l p 。前者属于组织特异性a l p 但不同于i a l p ，在胚胎早 期高表达1 4 n 。7 一1 4 天的胚胎t n a l p 表达量超过前者，随后在晚胚泡期的内细胞团和前 原肠期的外胚层中表达。在器官发生时期，a l p 在体节中胚层、神经管、肠上皮和原生 殖细胞中均表达。在鸡胚的发育中，排卵4 5 d 的卵膜鞘细胞就开始表达a l p 活性。随 后，在胚胎的多种组织中如脑、神经管、脊索、骨骼等都有表达。在另一种原索动物海 鞘中，a l p 在原肠晚期内胚层开始表达，而其他组织中只有微量表达【矧。随发育的进行， 在内胚层中的表达更明显而在其他组织中逐渐消失，因此a l p 常被用作海鞘内胚层分化 的标志。 1 4 3 碱性磷酸酶的生理功能 a l p 能催化许多有机磷酸酯单体产生醇和磷酸离子，或者是把磷酸离子从有机物转 移到另外一个有机物的氢氧基团上。如果磷酸离子受体是水分子，则是一个分解反应。 尽管已经有大约1 0 0 年的研究历史，a l p 家族在体内有哪些确切的反应底物仍然不 是很清楚。在人先天性低碱性磷酸酶病中，发现磷酸乙醇胺、无机焦磷酸和5 一磷酸吡 哆醛的富集。从细菌到哺乳动物进化上的保守性可以断定其参与基本的生物化学反应 l 矧。其中报道最多的是参与动物骨骼发育。碱性磷酸酶在小肠、乳腺和胎盘等器官的高 表达揭示其和营养吸收、物质转运有密切联系。迄今为止，有大量的工作集中在研究其 病理状态下的异构体类型以期为疾病诊断提供参考，在低等生物中的相关研究非常少。 组织非特异性碱性磷酸酶( t n a l p ) 在骨骼钙化中起到重要作用，t n a l p 基因错义突 变导致的缺陷会表现为低磷酸酯酶症唧j ，t n a l p 的突变导致骨骼不能正常钙化，在人的 不同年龄期都有发送生，但是在围产期发生的后果非常严重，常导致佝偻病和软骨病甚 第一章文献综述 至死亡1 5 。切除小鼠t n a l p 基因后体内酶活性降低，其中磷酸乙醇胺、5 一磷酸吡哆醛 等酶底物浓度增加，1 0 天小鼠就可观察到骨骼发育异常，结果证明t n a l p 对鼠出生后发 育特别是骨骼钙化非常重型5 2 l 。 s a n e c h ir k 和v a nh o o fv o 等报道，a l p 至少在理论上有很多生理学功能，包括： 胚胎发育、细胞分化、脂质转运调控、肠和肾磷酸盐转运，胰腺氯离子通道调控、神经 中枢组织代谢和骨的形成1 5 1 5 2 j 。有证据表明a l p 能提高皮下胶原中磷酸离子而促进胶原 的钙化【5 3 j 。 骨中t n a l p 产生羟基磷灰石结晶所必须的p i i s 4 1 。同时，t n a l p 能水解组织矿化的抑 制剂- - p p i ，使p p i 维持在一个合适的浓度。p y t i d o x a l 一5 - p h o s p h a t e ( p l p ) 也是淋巴细 胞中t n a l p 中的生理学底物【5 引。从s a o s - - 2 骨肉瘤细胞分离的t n a l p 在生理p h 下，能 水解磷酸乙醇胺( p h o s h o e t h a n o l a m i r e ) 和p l p 。单氟磷酸盐( m o n o f l u o r o p h o s p h a t e ) 也是t n a l p 的底物l 州。人a l p 异构体能水解带不同脂肪链的磷脂( e g g 、p h o s p h a t i d a t e a n d d i o e o y l ，d i s t e a r o y l ，d i p a l m i t o y l ，d y m y t i s t o y l a n d d i l a u r o y l p h o s p h a t i d a t e s ) 。p a l p 和i a l p 能水解脱氧胆酯钠和二月桂荃酸盐等磷酸盐【5 7 】。 a l p 也参与核苷酸的代谢。纯化后的骨t n a l p 有广泛的催化底物，能水解a t p ，a d p ， a m p ，p p i ，g l u c o s e 一1 一p h o s p h a t e ，g l u c o s e 一6 一p h o s p h a t e ，f r u c t o s e 一6 一p h o s p h a t e ，g l y c e r o p h o s p h a t e ，b i s 一( p - n i t r o p e y l ) 一p h o s p h a t e 和p n p p 。a l p 其他的一些催化特性也值 得一提，纯化的小鼠i a l p 能在g l u c o s e - - 6 - - p h o s p h a t e 、a t p 、a d p 、p p i 或p n p p 的水 解中参与将p i 合成p p i i s s 。在p h = 8 5 条件下，以9 1 y c e r o p h o s p h a t e 或c r e a t i n e p h o s p h a t e 作为磷酸供体，小牛i a l p 能催化硫胺生产单磷酸硫胺。t n a l p 也有磷酸二酯 酶活性，在n p p l 一起作用时能有助维持细胞外p p i 的浓度。怀孕期间p a l p 还参与i g g 的分子转运，p a l p 能结合到i g g 的f c 部分，作为f c 的一个受体，参与到将i g g 从母体 循环系统转运到胎儿的循环系统中型5 9 , 6 0 j 。 1 4 4 在诊断医学上的应用 碱性磷酸酶在临床诊断上应用广泛，很多e l i s a 试剂盒是以该酶为基础设计的。该 酶可以标记核酸，比如s o u t h e r n b l o t 中的罗氏地高辛标记试剂盒就能用到a l p 叫；还 有陈压西1 6 2 j 用碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒d n a ；z h i m i n g i 叫 用a l p 标记h b v 探针诊断血清中的h b v 含量。 除标记核酸外，很多临床诊断试剂盒中是用该酶标记相关蛋白、单抗多抗、金黄色 葡萄球菌白( s p a ) 。比如魏梅生1 6 4 j 用a l p 标记南方菜豆花叶病毒抗体检测该病毒，应 用于海关防止该病毒自境外传入国内。 随着a p a a p 技术的进展，使的该酶在e l i s a 中应用更广泛，灵敏度更高。如s a k h a r o w 用a p a a p 方法诊断免抗h i v 病毒时灵敏度比常规e l i s a 提高4 - 1 6 倍1 6 5 1 。 1 4 5 在其他领域的应用 近年来，随着生物医药高技术向医药和化妆品制造领域中渗透及应用，国际上许多 医药及生物工程技术专家投身于药品和美容化妆品的研究中，投入大量人力物力，研究 第一章文献综述 开发相应产品，现在已取得领先的研究、生产和经营地位。 a l p 是一种碱性条件下具有较高活性的酶，在机体各组织和血清中有着广泛的分布。 因此锌原子可作为a l p 的辅基，所以可以通过测定血清a l p 的活性来判断机体对锌元素 的吸收利用情况，a l p 的活性提过意味着几天对锌的利用率较高，反之亦然。近年来， 血清a l p 活性常被奶牛锌营养状况的判断依据陋j 。a p e a r s 证实，血浆锌水平和a l p 活 性呈正相关，但嗜中性粒细胞中a l p 活性与血浆中的a l p 活性无关，因此认为同时测定 嗜中性粒细胞与血浆中的a l p 活性才能作为奶牛体内锌营养状况的判断指标1 6 刀。有人指 出利用碱性磷酸酶活性作为评价菌根真菌对植物生长效应的生理指标。 1 4 6 碱性磷酸酶的检测方法 a l p 在碱性条件下能催化磷酸酯类水解，所以测定a l p 酶活力的常规方法就是用它 水解含有磷酸单酯结构的底物，测定产物的生成量或者生成速度。由于a l p 对底物专一 性比较低，实验室和临床诊断用于测定该酶的底物就很多【鲫，比如p 一甘油磷酸钠、磷 酸苯二钠、磷酸对硝基酚二钠盐、磷酸酚酞、磷酸麝香草酚酞、q 一萘酚磷酸、葡萄糖 一l 一磷酸、腺嘌呤二核苷酸、磷酸丙酮酸等【矧。 图1 2a l p 体外催化反应机理 p i g i - 2i nv i t r or e a c t i o n sc a t a l y z e db ya l k a l i n ep h o s p h a c a s c 目前，临床和实验室常规测定a l p 的方法主要有以下两种： 1 苯基磷酸钠终点比色法( k i n d - k i n g ，e n dp o i n t ) 1 7 0 , 7 1 j 在一定p h 和温度条件下，a l p 分解磷酸苯二钠，使之水解释放出游离的酚和磷酸， 酚在碱性溶液中与4 一氨基安替毗林作用，经高铁氰化钾氧化为红色醌类衍生物，根据 红色深浅与同样处理的标准酚比色，测定酶活力高低。该方法精度比较高，试剂便宜且 采用设备简单，国内以前很多实验室和医院采用这种方法。但由于试剂不容易保存且与 国际标准不同现在已经比较少的使用。原理如下： 第一章文献综述 4 p 攀n a 2 h p 0 4 + n a 2 0 h 2 0 9 0 h p h l o 4 p 誓今一 卜 =：、：d 磷酸苯二钠 酚 口。h 酚 h 3 c 、n n - c ；o 4 h + h 3 c p c 、n = e o n = 2 6 9 2 7 1 ；收率：8 3 5 。 l 王( r d 3 r , 锄吐) ：3 3 4 4 ( n h ) ；1 4 7 8 ( p h ) ；7 2 3 ( c b r ) ；1 2 4 6 ( c - o ) 1 hn m i 王( 3 0 0 m h z ，d m s o d 6 ) ：d 8 5 0 ( s ，1 h ，a rh ) ，7 7 4 ( d d ，2 h ，a ri - 1 ) ，7