（应用化学专业论文）Bcl2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选.pdf

b ci - 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选摘要恶性肿瘤是威胁人类健康与生命的重大疾病之一，其发病率和死亡率逐年升高，而目前临床仍然缺乏非常有效的药物。近年来的研究发现肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡失衡所致，调控细胞凋亡成为了当今抗肿瘤药物设计的一个全新靶点。细胞凋亡受体内外多因素调控，其中b c | - 2 基因( b 淋巴细胞基因- 2 ) 及其相关蛋白是目前一致公认的细胞凋亡调节者。b ci - 2 基因在许多肿瘤细胞都高表达，其基因产物b cl _ 2 蛋白阻止细胞凋亡是肿瘤发生和耐药形成的重要原因之一。由于b c | - 2 基因只在肿瘤细胞中高效表达，且其生物学功能在正常细胞中不是绝对需要的因此，拮抗b c i _ 2 蛋白功能的抑制剂将可能没有或只有极小的毒副作用。z 2 4 是通过基于b ci - 2 蛋白结构的计算机虚拟药物筛选和结构优化得到的一个b c 卜2 蛋白抑制剂，体内和体外活性测试结果表明，z 2 4对b c 卜2 ( b 细胞淋巴瘤) 和v e g f ( t i n 管内皮生成因子) 具有双重的抑制作用。它对多种肿瘤动物模型均具有显著的体内抑瘤活性，对血管内皮细胞有选择性抑制作用，并明显抑制鸡胚尿囊膜( c a m ) 新生血管的生成。z 2 4本研究通过分析z 2 4 与b c i _ 2 蛋白的相互作用特点j 1 1 3 b c i - 2 蛋白活性中心对配体的要求，对z 2 4 进行了结构改造设计，并对部分结构改造物进行了合成，共合成目标物4 0 个，其结构都经过1 h n m r 、m s 等测试方法确证，部分化合物还通过元素分析测试。药理实验结果表明，目标化合物中t m p - 9 ，t m p - 2 0 ，t m p - 2 2 ，t m p - 2 3 ，t m p 一2 9 ，t m p 一3 1 ，t m p - 3 7 共7 个化合物选择性较好且毒性较低，具有i ；1 ：1 j 1 3 性对照z 2 4 相当或更好的选择性。其中t m p 一9 ，t m p 一2 2 ，t m p 一3 1 表现出相当好的选择性，有望成为新的b ci _ 2 蛋白有机小分子抑制剂。关键词：抗肿瘤药物，b c i - - 2 ，z 2 4 ，细胞凋亡，结构改造，抑制剂i id e s i g n ，s y n t h e s i sa n ds c r e e n i n go f t h ed e r i v a t i v e so f t h ec o m p o u n dz 2 4a st h ei n h i b i t o ro fb c l 一2p r o t e i na b s t r a c td e s p i t et h ep r o g r e s si nb a s i ca n dc l i n i cm e d i c a ls c i e n c e s ，c a n c e ri ss t i l lt h es e c o n dm o s tf r e q u e n tc a u s eo fd e a t hi nt h ew o r l d t r a d i t i o n a lt r e a t m e n t so fc a n c e ro f t e nh a v es t r o n gs i d ee f f e c t s r e c e n t l y , t h es t u d i e di no n c o l o g yr e v e a l e dt h a ta p o p t o s i sw a si n v o l v e di nt u m o r g e n e s i sa n dm u l t i d r u gr e s i s t a n c ei nc a n c e rt r e a t m e n t t h ef i n d i n g si n d i c a t e t h a tb l o c k i n go ft h ea p o p t o s i s - i n d u c i n gp a t h w a yc o u l db ea n o t h e rm e c h a n i s mf o rm u l t i d r u gr e s i s t a n c e ( m d r ) t h er e g u l a t i o no fa p o p t o s i sh a sb e e nb e c o m ean o v e lt a r g e tf o ra n t i c a n c e rd r u gd e s i g nb c l 一2p r o t e i n ，ab c l 一2g e n ep r o d u c t ，i sa2 5 k dam e m b r a n ep r o t e i nt h a tp r e v e n t sc e l la p o p t o s i si so v e r e x p r e s s e di nm a n yh u m a nc a n c e r sb c l 一2 so v e r - e x p r e s s i o ni sa s s o c i a t e dw i t ht u m o rd e v e l o p m e n to rp r o g r e s s i o na n dr e s i s t a n c et oc h e m o a n dr a d i o t h e r a p y b e c a u s et h eb c l - 2g e n ei so n l yo v e r - e x p r e s s e di i lt u m o rc e l l sa n di t sf u n c t i o ni sn o tn e c e s s a r yi nn o r m a lc e l l s ，t h eb c l - 2i n h i b i t o rm a yh a v en oo rl o w e rt o x i cs i d ee f f e c to nn o r m a lc e l l s z 2 4i sas p e c i f i ca n de f f e c t i v ei n h i b i t o ro ft h eb c l - 2p r o t e i n t h er e s u l t s ，nv i t r oa n di nv i v o , s h o w e dt h a tz 2 4h a dg o o de f f e c to fi l ia n t i c a n c e ra n di n d u c i n ga p o p t o s i s i ts h o w e dt h ed o u b l ei n h i b i t i o nt ob c l 2a n dv e g f z 2 4i nt h i ss t u d y , as e r i e so fb c l - 2i n h i b i t o rc o m p o u n d sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h es t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h ez 2 4a n dt h er e q u i r e do ft h eb c l - 2p r o t e i n sa c t i v ec e n t e rt oi t sl i g a n d 4 0c o m p o u n d sw e r es y n t h e s i z e d s t r u c t u r e so ft h e s ec o m p o u n d sw e r ei d e n t i f i e db y1 h n m r ,m sa n de l e m e n t a r ya n a l y s i s a c c o r d i n gt ot h eo b s e r v e dr e s u l t s ，7c o m p o u n d ss h o w e dg r e a t e rp o t e n t i a la c t i v i t i e st h a nz 2 4i no v e r e x p r e s s i v eb c l - 2h e l ac e l ll i n e s a m o n gt h e s ec o m p o u n d s ，c o m p o u n dt m p 9 ，t m p _ 2 2a n dt m p - 31s h o w e da t t r a c t i v es e l e c t i v i t y , w h i c hd e s e r v e dg r e a t e rs t u d y k e yw o r d s ：a n t i - t u m o rd r u g ；a p o p t o s i s ；z 2 4 ；b c l 一2 ；d e r i v a t i v e s ；i n h i b i t o ri vm i ：毫升h ：小时m o l ：摩尔符号说明r a i n ：分钟：摄氏度g ：克广西大学硕士学位论文b c l - 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选1 1b c 卜2 蛋白家族第一章前言b 细胞淋巴瘤白血病一2 ( b c l 一2 ) 基因于1 9 8 4 年f h t s u j i m o t o 首先发现【”。1 9 8 8年试验报告b c l 一2 基因可使细胞存活时间延长。1 9 9 0 年进一步确i 正b c l 一2 基因具有抗细胞凋亡的功能后，b c l 一2 基因作为重要的凋亡抑制基因，在多种肿瘤中得到研究。现已发现的b c l 一2 家族的系列成员包括抑制细胞凋亡的b c l 一2 、b c l x l 、b c l w 、a 1 、m c t 一1 、b f l 一1 、s u r v i v i n 。1 等：促进细胞凋亡的b c l x s 、b a x 、b a d 、b a k 、b i m 、h r k 、p u m a 等【3 ，4 】。虽然该家族内各成员在不同组织中表达各不相同，但他们在结构上有共同之处：一是在碳端有一疏水跨膜结构域( t m ) ，决定蛋白的亚细胞( b h l 一b h 4 ) ，其中阴l 和b h 2 为他们所共有，参与b c l 一2 家族成员的二聚化；b h 3 结构域是b c l 一2 家族成员促凋亡活性不可缺少的；实验证实，缺乏b h 4 或含突变b h 4 的b c l 一2 突变体均不能阻止细胞凋亡，因此认为b h 4 结构域是b c l 一2 家族成员抗凋亡活性所必需的。b c l 一2 基因定位于人染色体，1 8 q 2 1 3 由2 3 0 k b 组成，含三个外显子，3 和5 端分别有5 3 k b 和1 4 k b 的非翻译片断。正常情况下，不表达或低表达旧。1 2 肿瘤与b e i - 2 蛋白恶性肿瘤是人类三大死亡原因之一。据世界卫生组织调查，目前全世界每年有1 0 0 0 万人患恶性肿瘤，7 1 0 万人死亡。据有关专家预测，到2 0 2 0 年，每年新发恶性肿瘤病人将达到2 0 0 0 万。我国卫生部去年对国内死亡率最高的前五位疾病进行排名，恶性肿瘤名列首位，恶性肿瘤致死人数占总疾病死亡人数的2 4 3 9 。全国每年新发恶性肿瘤患广西大学硕士学位论文b c l 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选者2 0 0 万人，死于恶性肿瘤的人数达1 5 0 万。基于以上所述的现实，各国政府，研究机构和制药公司长期以来一直对抗肿瘤药物开发予以高度重视和投以巨资，肿瘤治疗也得到不断发展。肿瘤化学治疗( 以下简称化疗) 是肿瘤治疗的三个基本手段之一，用于肿瘤治疗药物经过5 0多年的发展，已取得了巨大的成就，获得了一大批不同作用机制的临床抗肿瘤药物。但遗憾的是它们都有不同程度的毒副作用，因而在临床上使许多病人不能坚持连续接受治疗；另外，化疗耐药和肿瘤转移是目前抗肿瘤药物研究的另一个重要问题，肿瘤抗药性和肿瘤转移性的产生，常常使肿瘤治疗达不到预期的效果。因此，如何解决抗肿瘤药物的毒副作用和耐药问题，以及如何阻止肿瘤转移成为当今抗肿瘤药物研究的焦点。近年来，分子肿瘤学和分子药理学的发展使肿瘤发生的本质得以逐步阐明：大规模快速筛选、组合化学、基因工程等先进技术的发明和应用加速了药物开发进程；抗肿瘤药物的研究与开发已进入一个崭新的时代。目前或在相当一段时期内，传统细胞毒性药物仍将是肿瘤药物治疗的主体，细胞毒性药物的主要缺陷是对实体瘤疗效差，不良反应大，易产生耐药性。近年来的l 临床医学研究结果证实，肿瘤发生是细胞增殖与凋亡失衡所致；肿瘤化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡途径受阻为肿瘤产生耐药的重要原因之一。因此，调控细胞凋亡成为当今抗肿瘤药物设计的一个新靶点。细胞凋亡受细胞内外多因素调控，其中b c l - 2 基因( b 淋巴细胞基因- 2 ) 及其相关蛋白是目前一致公认的细胞凋亡调节者，b c l 一2 基因在许多肿瘤细胞都高表达，其基因产物b c l 一2 蛋白阻止细胞凋亡是肿瘤发生和耐药形成的重要原因之一。由于b c l 一2 基因只在肿瘤细胞中高效表达，且其生物功能在正常细胞中不是绝对需要的，因此，拮抗b c l 一2 蛋白功能的抑制剂将可能对正常细胞没有或只有极小的毒副作用。1 3b c 卜2 蛋白的肿瘤调节机制b c l 一2 蛋白由2 2 4 个氨基酸组成，包括4 个保守的功能区b h l 、b h 2 、b h 3 和b h 4 2 。它通过与b a x 等促细胞凋亡蛋白进行蛋白相互作用来发挥控制细胞凋亡的功能【3 】。生物学实验已经证实，凋亡拮抗蛋白( 如b c l 一2 ) 和凋亡激活蛋白( 如b a x ) 形成异二聚体或同二聚体调节两者之间的平衡。b c l 一2 和b a x 蛋白间的这种广西大学硕士学位论文b c l 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选平衡是细胞接受死亡信号后是否进行凋亡的一个检查点( c h e c k p o i n t ) ( 见图11 ) 【4 】。当b c l 一2 与b a x 之间的杂二聚被打破时，b c l 一2 的保护功能也就消失，这表明b c l 一2 必须与b a x 结合才能产生作用。在b c l 一2 的b h l 和b h 2 上进行定点致突变结果表明，这两个区域对b c l - 2 与b a x 结合是重要的。b h l 上的单个氨基酸g l y l 4 5 被a l a n i n 或者g l u t a m i c 取代和b h 2 上的g r p l 8 8 被a l a n i n 或者g l u t a m i c 取代和b h 2 上的g r p l 8 8 被a l a m i n e 取代后将完全破坏b c l 一2 与b a x 结合而使其失去凋亡抑制作用【5 】。当b c l - 2 超量表达时，它与b a x 杂二聚，死亡得到抑制1 3 】。因此，b c l 一2 与b a x 的比例决定了b c l 一2 b a x 杂二聚与b a x b a x同二聚的数量，同时决定细胞死亡的敏感性。图卜1b c l 一2 蛋白家族相互作用模型图f i g u r e1 1 m o d e lf o rb c l 一2f a m i l yp r o t e i ni n t e r a c t i o n可以设想，通过调节这些成员之间的比率来改变死亡域值，在理论上应该影响癌症治疗的结果。例如，能够选择性地打开二聚体的小分子也许能加速肿瘤细胞的凋亡和增加化疗的敏感性。广西大学硕士学位论文b c l - 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选，1 4b c i 一2 蛋白抑制剂z 2 4 的发现郑志兵博士等应用基于b c l 一2 蛋白结构的计算机虚拟药物筛选方法，对含有二十五万个小分子化合物的a c d 数据库进行筛选( a v a i l a b l ec h e m i c a ld i r e c t o r y ，m d l ，i n f o r m a t i o ns y s t e m s ，i n c ，s a nl e a n d r o ，c a ) ，得到8 0个b c l 2 蛋白的潜在配体。对其中部分化合物进行合成，并在h e l a 和s i h a两种肿瘤细胞株上进行了抑制试验，结果表明：化合物( l d ) 能有效地抑制肿瘤细胞生长，而且还对高表达b c l 一2 的肿瘤细胞表现出一定的抑制选择性。因此，将化合物( l d ) 确定为先导物。进一步的结构优化，发现了化合物z 2 4 ，其活性和选择性明显优于先导物l d 。体内和体外活性测试结果表明，z 2 4 对多种肿瘤动物模型均具有显著的体内抑瘤活性，对血管内皮细胞有选择性抑制作用，并明显抑制鸡胚尿囊膜( c a m ) 新生血管的生成【”。hz 2 4图1 - 2 先导化合物和z 2 4 的结构f i g u r e1 - 2 s t r u c t u r eo f t h el e a dc o m p o u n da n dz 2 41 5z 2 4 对b c i - 2 ( b 细胞淋巴瘤) 和v e g f ( d n 管内皮生成因子) 的双重抑制作用、b c l 一2 阻止细胞凋亡很好地阐明了其与肿瘤的发生、生长和耐药的关系。而b c l 一2 阻止血管内皮细胞凋亡，e e l 一2 与其它新生血管形成刺激因子，如v e g f v e g f r ，在诱导和加速血管形成时的彼此关联作用，这些进一步阐明了其与新生血管形成的关系。特别是b c l 一2 能够维持除了血管生成因子的血管细胞的存活，还能诱导产生更多的v e g f ，使得许多血管抑制剂在b c l 2 大量表达的情况下，几乎失去了应有的作用。4广西大学硕士学位论文b c l - 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选我们以前的研究发现，对b c l - 2 蛋白有选择性抑制的小分子对v e g f 刺激的血管内皮细胞生长也有明显的抑制作用，从v e g f r 和b c l 一2 蛋白活性中心结构对比来看，两者有相似之处，而且z 2 4 与v e g f r 和b c l 一2 蛋白活性中心都能较好的对接，这说明我们设计的化合物具备双重抑制作用的可能，深入的作用机制研究还有待进行。显然能开发对v e g f 和b c l 一2 具有双重抑制作用的小分子将显得更有价值。1 6 其它新b c i - 2 蛋白有机小分子抑制剂的研究进展近些年来，随着研究者们对b c l 2 蛋白抑制剂研究的重视出现了一大批新型的有机小分子抑制剂。这些分子量小于7 5 0 道尔顿的小分子化合物通常比寡核苷酸或小肽具有更高的膜渗透性和可能更好的成本效率。1 6 1a b t 一7 3 7 1 1 z l美国伊利诺州阿伯特实验室的菲西科( s t e p h e nw f e s i k ) 和同事运用核磁共振、平行合成和分子结构设计的方法发现了抗凋亡蛋白b c l 一2 、b c l x l 和b e l w的小子分抑制剂a b t - 7 3 7 ( 化学结构见图1 6 1 ) 。a b t - 7 3 7 和相关化合物在多种肿瘤细胞系中对化疗和放疗表现出了协同作用，在单独使用时对表达的癌性淋巴和小细胞肺癌的细胞系有强效抵抗作用。它比以前描述过的任何抑制剂强度大三个数量级，可能会具有疗效。1 6 2y c l 3 7 1 2 3 lp e d r oj r 等运用基于分子结构的计算机筛选目标化合物发现了y c l 3 7 ( 化学结构见图1 - 6 - 2 ) ，它是一种新颖的优秀的b e l - 2 的小分子抑制剂。y c l 3 7 不仅能选择性的杀死过表达的肿瘤细胞而且对其它各种基本细胞不受影响。它是第一个对体外癌细胞b c l 2 抑制剂选择性难以控制提出异议的例子。1 6 3h a l 4 1 【16 】h u a n g 的研究组1 刀以b c l x l 与b a k 的b h 3 区域结合复合物的高分辨三维结广西大学硕士学位论文b c l 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选构为模板构建了b c l 2 蛋白的三维结构，以它为靶点筛选具有约1 9 万个化合物结构的m d l a c d 3 d 数据库，得到选择性最佳的h a l 4 1 ( 化学结构见图1 - 6 - 3 ) 。h a l 4 1 是一种可渗透入细胞的非肽类小分子化合物，可与b c l 一2 的表面凹槽结构结合竞争性取代b a k b h 3 而诱导细胞凋亡【1 8 】。体外研究证实，1 1 a 1 4 1 可造成b c l 2 高表达的急性白血病细胞及淋巴瘤细胞凋亡。1 6 4 生物碱c h o l e r y t h ri n ec h a r t 课题组【1 9 】通过高通量筛选方法对含有1 0 74 2 3 个天然萃取物的库进行了筛选，最后得到一个亲和力较好的生物碱e h e l e r y t h r i n e ( 化学结构见图1 - 6 - 4 ) 。实验显示，c h e l e r y t h r i n e 可以促进线粒体释放细胞色素c ，且其诱导高表达b e l x i的人成神经细胞瘤s h s y 5 y 细胞( 对许多放疗耐受) 及高表达b c l 一2 的鼠i l 3依赖的早幼粒细胞系f d c p 1 发生凋亡的浓度范围较低，i c 5 0 为1 5i tm o l l b i a c o r e 实验室【2 0 】在一万个化合物中通过看其在b a x 和b c l x l 的相互抑制能力，仅仅得到一个能诱导超过5 0 的抑制剂c o m p o l l l l da 5 。在b e l x l 转染m c f 7 细胞的实验中发现，c o m p o u n d a 5 的亲合力是毫微摩尔级，而h a l 4 1是微摩尔级的。而且，c o m p o u n da 5 也能抑制b a x 的同型二聚体，这是细胞凋亡级式中一个很重要的一步。、h a m i l t o n 研究组【2 1 1 曾成功地利用三联苯骨架来模拟q 螺旋，其交错的构象可以很好地模拟q 螺旋的表面。他们根据b c l x l 与b a k 的b h 3 区域结合复合物的高分辨三维结构设计的c o m p o u n d4 具有很高的亲合力。对接及n m r 研究证实它的确结合于b e l x l 的疏水凹槽中。但其类药性及水溶性都不太好，可能是细胞活性不佳。6广西大学硕士学位论文b c l - 2 蛋白抑制剂7 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选图1 - 6 - 3 h a l 4 1f i g u r e1 - 6 - 3 h a l 4 1o 、c h 3b rb r图1 6 5 c o m p o u n da 5f i g u r e1 - 6 - 5 c o m p o u n d a 5l 。一t7o图1 6 2 y c l3 7f i g u r el _ 6 - 2 y c l 3 7o图1 6 4 c h e l e r y t h r i n of i g u r ei - 6 - 4 c h e l e r y t h r i n e犷oo图1 - 6 6 c o m p o u n d4o h举喽广西大学硕士学位论文b c l 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选1 7 临床应用抗肿瘤药物的现状肿瘤药物治疗的历史己久，但真正的肿瘤化学治疗起始于二十世纪4 0 年代第一个抗肿瘤药一氮芥用于肿瘤治疗以后。经过5 0 多年的发展，抗肿瘤药物的研究已取得了巨大的成就，获得了一大批不同作用机制的临床抗肿瘤药物( 见表l 1 ) 。从表中抗肿瘤药物的治疗结果来看，虽然这些药物都具有明确的作用机制和治疗效果，但是，它们都有不同程度的毒副作用。表1 - 1 几大类抗肿瘤药的代表药物、作用机制和毒副作用t a b l e1 - ls e v e r a lk i n do fa n t i t u m o r sm e d i c i n e sa n dt h e i r sf u n c t i o nm a c h i n e - m a d ea n dp o i s o n o u ss i d ee f f e c t药物类型常用抗肿瘤药作用机制毒副作用烷化剂抗代谢药环磷酰胺、异环磷酰与核酸或蛋白质胺、其它氮芥类发生烷化反应氟尿嘧啶j 优福定、阿糖胞苷、e n o c i t a b i n e 、甲氨喋呤、巯嘌呤抑制或拮抗d n a合成物质的代谢骨髓抑制，恶心呕吐，脱发，肝肾功能损害等。骨髓抑制，粘膜损害，上消化道症状，肝肾损害等。抗肿瘤抗生素阿霉素类、阿克拉霉抑制d n a 和域脱发，骨髓抑制，口腔炎素、米托葸醌、丝裂r n a 的合成或心脏毒性。霉素c 、博来姆素、复制新抑癌菌素等植物碱类白金错构体类激素类其他长春新碱、长春碱、长春花碱酰胺、足叶乙甙顺铂、碳铂、n e d a p l a t i n三苯氧胺、l h r h拮抗剂门冬酰胺酶、丙卡巴肼切断d n a 双链轻微骨髓抑制作用，神经末梢损害，肺部损害与d n a 结合而抑制癌细胞的分裂增殖与激素受体结合拮抗激素的正常生理作用肾脏毒性，恶心呕吐，骨髓抑制表现类似激素水平过低而引起的症状分解肿瘤细胞生长骨髓抑制所需的必需氨基酸或阻碍d n a 或r n a 的合成8广西大学硕士学位论文b c l - 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选第二章目标化合物的设计本研究以z 2 4 为先导化合物，采用基于量子化学，计算机图形学，分子力学和结构生物学发展起来的计算机辅助药物设计( c o m p u t e r a i d e dd r u gd e s i g n ，c a d d ) 技术，并结合分子对接方法，设计新的基于b c l - 2 受体3 d 结构的抗肿瘤活性抑制剂。2 1d o c k ( 分子对接) 在分子设计中的应用分子对接( m o l e c u l a rd o c k i n g ) 是研究小分子配体与受体生物大分子相互作用，预测其结合模式和亲和力的一种重要的理论模拟方法。分子对接可有效地确定与靶受体活性部位空间和电性特征匹配互补的小分子化合物，广泛应用于数据库搜寻及虚拟组合库的设计和筛选研究中【2 2 - 2 3 】。由美国加州大学k u n t z 等人开发的d o c k 程序是目前应用最广泛的一个分子自动对接及数据库搜寻算法，最新版本为d o c k 4 0 ( h t t p ：w w w c m p h a r m u c s f e d u k u n t z ) 2 a - 2 7 1 。本文将分子对接应用到分子改造中，通过有机小分子与受体的对接，观察有机小分子与受体相互作用密切的位点，计算有机小分子与受体之间的相互作用力等，依此作为先导分子结构改造的依据。利用m s i 公司的a f f i n i t y ( 它是一套用于自动对接( d o c k i n g ) 配体( 客体) 到受体( 主体) 的程序。对给定的由配体分子和受体分子组成的体系，a f f i n i t y 能自动地依据配体受体复合物能量变化，并遵循能量降低原理，查找最佳的配体和受体结合结构) 模块软件，将z 2 4 等分子对接到b c l 一2 受体的活性位点。在进行分子对接时，a f f i n i t y 将分子分为两部分，即非结合区域( 非活性区域) 和结合区域。对接时非结合区域保持刚性，而结合部位原子和配体原子可移动。对于给定的b c l 一2 受体一小分子配体复合物体系，a f f i n i t y 首先对初始结构进行优化，优化得到的构象和能量分别被存为构象和能量的最初标准。接着用平移，旋转和扭曲变化的随意组合来移动配体分子，对移动获得的新构象，如果受体与配体之间靠的太近，相互作用能太大，则继续在空间移动配体分子，直到它处于一个满9广西大学硕士学位论文b c l - 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选足相互作用能判据的位置。然后对新构象进行优化，并将优化结果与最初标准进行比较，通过结构相似性判据和能量判据来决定该构象是否作为一个可能合理的复合物结构。对前后获得的复合物构象进行比较，如果均方根偏差大于0 0 5 r i m ，同时两者能量差处于可接受的范围内时，新的构象将被接受，储存起来，否则将被淘汰。如果新构象的能量比最初的构象能量低，则将新的构象能作为新的能量标准。继续对配体分子移动和优化，并将优化后的构象与前面所储存的构象进行比较，同时用新的构象能与最低能量进行比较来决定该构象是否被接受。如此反复一直到获得预定数目构象为止。在分子对接的过程中，考虑了溶剂化效应，介电常数取基于距离的模式，与网格计算有关的其它参数取为缺省值。收集的构象个数为1 0 个，选择构象的能量判据值为3 0 k c a l ，配体分子每次允许移动最大距离为0 - 3 n m ，最大角度为1 8 0 0 0 度，对z 2 4 分子中需要自由旋转的化学键均允许自由旋转。优化时极小化1 0 0 0 步。在此基础上综合考虑复合物能量与结构因素确定z 2 4 与b c l - 2 的结合模式。以下是分子对接的结果。图2 - 1 为b c l 一2 蛋白活性中心负像f i g u r e2 - 1 f o rt h en e g a t i v e p r o t e i na c t i v a t e dc e n t e r图2 2 为化合物z 2 4 与b c l 2 蛋白活性中心的对接结果的情况f i g u r e2 - 2 f o rc o m p o u n d sz 2 4b c l - 2b c l 一2p r o t e i na c t i v a t e dc e n t e rw i t ht h er e s u l t so f d o c k i n g从上图我们可以知道z 2 4 7 与b c l 一2 蛋白活性中心在静电势和形状上有较好的互补。1 0广西大学硕士学位论文b c l - 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选2 2z 2 4 的结构改造设计虽然z 2 4 具有良好的活性和选择性，但它的稳定性不是很理想，我们推测可能与酰胺氮原子的曼尼希部分容易脱去有关，故本研究设计如下结构的化合物，希望通过延长一个碳原子来增加分子的稳定性。根据z 2 4 先导化合物的结构特点，并参考b c l 一2 蛋白活性中心对配体的结构要求，即：1 】化合物空间结构对活性的影响；2 ) 取代基电性的变化对化合物活性的影响；3 ) 氢键对化合物活性的影响；4 ) 分子柔性对化合物活性的影响；5 )分子理化性质的变化，如稳定性，水溶性等，设计了以下结构改造物，见通式z 2 4r 1 = h ；c l ；fr 2 =之c 之之y 呲c - 吼：卜眦r 3 =r 叽g 毗矿c q “2户br ，”吼v o 时。一p ，l ! i 广西大学硕士学位论文b c l - 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选第三章目标化合物的合成3 1 阳性药z 2 4 的合成路线hhh图3 1z 2 4 的合成路线f i g u r e3 1t h er o u t eo f s y n t h e s i sz 2 4熔点仪( 温度未经校正)r y - i 熔点仪干燥箱d z f 6 0 5 0 型真空干燥箱低温反应槽d s l 1 4 0 0 低温反应槽天平i 也1 3 0 电子天平核磁仪日本电子j n m e c a - 4 0 0 超导n m r 仪质谱仪m i c r o m a s sz a b s p e e 高分辨磁质谱仪实验部分1 2o广西大学硕士学位论文b c l - 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选3 2 阳性药z 2 4 的制备3 2 1吲哚酮踪( 2 ) 的合成n h 2 n h 2hh12该反应为w o l l f f - k i s h n e r 反应，反应产率较高。根据原料溶解性选用无水甲醇为反应溶剂，反应温度为甲醇回流。由于反应产率较高，且化合物( 2 ) 为中间体，故未对反应条件作进一步优化。实验操作步骤：将吲哚醌2 5 9 ( 0 0 1 7 m 0 1 ) 和无水甲醇2 0 n 1 l ( o 5 m 0 1 ) 、8 5 水合肼3 0 9( o 0 4 3 m 0 1 ) 按顺序置于5 0 m l 圆底烧瓶中，缓慢升温至反应液回流，反应1 小时。点薄层板( 展开剂：乙酸乙酯：石油醚= l ：1 ) 监控反应无原料即停止反应，迅速将其置于冰浴中冷却0 5 小时，抽滤，用甲醇洗涤，得土黄色粉末。于6 0干燥箱真空干燥，次日称重2 5 5 9 ，收率9 3 ，m p ：2 1 5 2 1 8 c ( 2 1 9 c ) 6 。t l c( 展开剂：乙酸乙酯：石油醚= 1 ：1 ) 检测为单一斑点。3 2 2 吲哚酮( 3 ) 的合成ohh23吲哚腙( 2 ) 在强碱条件下反应，放出氮气，得吲哚酮( 3 ) 。本实验使用强碱，条件较苛刻，所以操作中要求严格无水。实验操作步骤：广西大学硕士学位论文b c l 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选在2 5 0 m l 的圆底烧瓶中，将2 o g 金属钠溶于1 0 0 m l 的乙醇中，加热回流3 0分钟后蒸馏，得绝对乙醇( 金属钠9 9 5 ) 。将去除氧化表皮的金属钠2 o g 切丝后投入到5 0m l 的绝对乙醇中，至全溶，制得乙醇钠。在6 0 7 0 c 、搅拌下分次投入吲哚腙5 0 9 ( 0 0 3 4 m 0 1 ) ，同时通入大量氮气，以保证隔绝空气，加完后持续反应4 5 m i n ，点板监控反应( 乙酸乙酯：石油醚= 1 ：1 ) ，待原来基本反应完毕后停止反应。迅速将反应液倾入5 2 0g 冰中，出现大量灰色固体。用1 0 h c l 调至p h l ( 至突变色) ，固体全部溶解，加入n a c l 使溶液饱和，用2 4 0 m l ( 8 0 m l x 3 ) 无水乙醚萃取。加入2 5 o g 无水硫酸钠干燥过夜，抽滤，蒸干乙醚，以5 0 m l 水溶解固体，置于4 c 冰箱中过夜结晶，得褐色针状结晶2 8 9 9 ( 收率7 0 ) ，m p ：1 2 5 - 1 2 7 。3 2 33 - 吡咯次甲基一2 一吲哚酮“) 的合成o谢h34此反应为酮的a h 与羰基的脱水缩合反应，哌啶作为催化剂。由于醛容易被氧化，所以该反应需在氮气的保护下隔绝空气反应，以减少副反应的发生。实验操作步骤：将2 一吲哚酮1 4 9 ( 0 0 1 l m 0 1 ) 、2 - 吡咯甲醛1 6 9 ( 0 0 1 7 m 0 1 ) 、无水甲醇1 4 m l 、哌啶0 4 5 m l ( 0 0 0 5 m 0 1 ) 依次加入到2 5 m l 圆底烧瓶中，同时氮气保护，防止醛被氧化。在室温下搅拌，逐渐有橙黄色固体出现。反应2 4 小时后，点板( 乙酸乙酯：石油醚= 1 ：5 ) ，原料点消失，停止反应。抽滤，用甲醇洗涤，得黄色固体，真空干燥( 干燥剂：无水c a c l 。) 过夜，得2 1 2 9 产品，收率9 6 4 m p l 2 3 1 2 6 文献1 2 5 1 2 7 c 【9 】。广西大学硕士学位论文b c i 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选3 2 4卜哌啶亚甲基- 3 - n 比咯次甲基一2 一吲哚酮( 5 ) 的合成h+h+ 竺礤+ 一【| ，l 【山l o45实验操作步骤：将多聚甲醛o 2 2 9 ( o 0 1 2 m 0 1 ) 、哌啶0 6 0 3 9 ( 0 0 0 8 m 0 1 ) 、无水乙醇1 5 m l置于2 5 m l 圆底烧瓶中，避光，通氮气保护，加热回流1 5 小时，使多聚甲醛解聚并生成曼尼希中间体。加入3 一吡咯次甲基一2 一吲哚酮1 0 9 ( 0 0 0 5 m 0 1 ) ，回流2 5小时，点薄层板( 乙酸乙酯：石油醚= 1 ：5 ) ，原料点消失，停止反应。于搅拌下缓慢冷至室温，得细小淡黄色针状结晶，抽滤，以乙醇和水分别洗涤固体，以除去原料和哌啶。真空干燥，得1 3 4 9 产物，收率9 2 ，m p1 3 1 1 3 2 1 2 。3 2 57 2 4 盐酸盐的制备由于曼尼希碱在溶液中不很稳定，易异构和分解，成盐时需快速进行。另外，为防止成盐时酸的残留而使盐更易吸潮，酸碱的摩尔比应尽量保持1 ：1 。基于此种想法，成盐时需先用h p l c 检测z 2 4 碱的纯度。制备通法如下：将1 5 0 m l 无水乙醚置于5 0 0 m l 圆底烧瓶中，冰浴冷却约5 以下，加入曼尼希碱，搅拌使绝大部分碱溶解，迅速滤去不溶物。将饱和h c l 一乙醚逐滴加于碱中溶液中，析出黄色固体，滤出固体，用无水乙醚洗涤数次，真空干燥，即得盐，在隔绝空气和避光下保存。广西大学硕士学位论文b c l - 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选3 3 目标化合物的合成3 3 1 目标化合物合成+ ”_ 一o h h c i + 。i ? “鬯业竺+n 一+u 二二二= 二= 二二二兰二一hc 1 7、o hc o n c h c i1n h 2c o n ch 2 s o r 12棒q 一。3 3 2关键中间体合成讨论吲哚酮氮烷基化产物是本研究的一个关键中间体。文献曾报道2 一吲哚酮在n a h 催化下，于d m f 溶剂中，与卤代烃发生烷基化的反应。从实验重复情况来看，反应所需要的时间较长，反应条件较为苛刻( 需要无水操作) ，尤其产率不高。后来采用相转移催化方法( k 2 c 0 3 ，t b a b ，k i ，丙酮) 来合成吲哚酮氮烷基化产物，产率有所提高，但反应时间较长。曾经有过文献报道k f a l z 0 3 试剂催化烷基化反应条件比较温和产率也较高。经实验后，发现k f a 1 2 0 3 试剂不仅价格低廉，制备简单，可以长期保存和回收重复使用，最重要的是在它的催化下，可以使许多原来需要苛刻条件( 如强碱，高温等) 的反应能在温和条件下进行，不仅安全可靠，还提高了产率。因此，本研究采用k f a 1 2 0 3 作催化剂来烷基化反应来制备吲哚酮氮烷基化产物。反应溶剂与温度的选择也是很重要的，初步实验结果表明使用未经过无水处理的乙腈，反应产率较低；反应温度偏高( 9 0 ) ，虽然缩短了反应时间，但是1 6刚杰y 呲刚太y勉半町未q广西大学硕士学位论文b c l - 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选副反应较多，产率太低。因此，反应温度控制在8 0 8 5 之间。反应的进程采用t l c 方法来监控，展开剂为石油醚：乙酸乙酯= l ：2 。选择2 ，4 ，6 ，8 ，1 0 小时等几个反应点检测，当反应产物和原料点变化不大时，反应产物量不变时确定为反应的终点，约为4 小时。根据以上对温度、反应溶剂、催化剂，反应时间等条件的研究，最终选用如下实验方法来合成中间体吲哚酮氮烷基化产物，见下反应式。孓。xh3 3 3 主要中间体的制备k f a 1 2 0 3无水乙睛回流4 hro3 3 3 15 - 氟一2 一吲哚酮的制备a n 一( 2 一肟基) 一乙酰基一4 一氟一苯胺( i ) 的制备4 5 0 0 9 ( 0 2 7 2 m 0 1 ) 水合三氯乙醛，6 5 0 0 9 十水硫酸钠置于2 0 0 0 m l 三口瓶中，加入6 0 0 m l 水，搅拌使固体溶解成均相。2 7 8 0 9 ( 0 2 4 8 m 0 1 ) 对氟苯胺。5 5 0 0 9( 0 7 9 m 0 1 ) 盐酸羟胺溶于4 0 0 m l 水和2 2 5 m l 浓盐酸中。稍冷后，将此溶液倒入反应瓶中加热回流2 - 3 m i n 。抽滤，用4 x5 0 m l 水洗涤，自然凉干，得灰白色针状固体4 6 0 6 9 。取粗品1 0 0 0 9 ，用水重结晶，得白色针状结晶( i ) ，m p1 5 9 - 1 6 1 文献值1 6 0 ，产率8 3 7 。b 5 - 氟一吲哚醌( i i ) 的制备将1 2 3 0 m l 浓硫酸置于5 0 0 m l 三口瓶中，加热至6 0 。c ，在此温度下，将2 9 6 0 9 ( 0 1 6 1 m 0 1 ) 1 分批加入反应瓶中，维持温度在6 0 7 0 ( 2 ，加完后，升温至8 0 ( 2 左右反应2 0 m i n 。冷却，将反应液倒入碎冰中，待冰块溶解后，抽滤，用5 2 5 m l 水洗涤，抽干，得红色固体，2 3 1 7 9 ，m p2 2 6 - 2 2 8 c 文献值2 2 7 c 产率8 7 2 。c 5 - 氟一2 一吲哚酮( i i i ) 的制备将2 8 0 5 9 ( 0 1 7 m 0 1 ) i i ，悬浮于2 0 0 m l 无水甲醇中，加入3 0 o g 水合肼( 6 5 ) ，微回流1 h ，回流结束后，将此溶液冰浴冷却0 5 h ，析出黄色结晶，过滤，用水洗涤，置于空气中晾干后，于真空干燥至恒重，得2 9 3 9 中间体5 一氟吲哚腙在绝干燥条件下，将2 0 9 金属钠溶于5 0 m l 绝对无乙醇中。称取5 2 3 9 上述广西大学硕士学位论文b c l - 2 蛋白抑制剂z 2 4 结构改造物的设计、合成与筛选制得的中间体，在氮气保护下，将其每隔1 0 分钟分批加入到醇钠溶液中，不断搅拌，控制反应温度在6 0 一7 0 v 。待反应物加完后，继续加热回流至产生的氮气放完( 约0 5 h ) ，将液体迅速倒入冰中，搅拌使固体物质溶解后，用1 0 盐酸调至p h= 1 ，用2 2 5 m l 乙醚萃取，无水氯化钙干燥，过滤，浓缩，得到灰白色粗品。将粗品用5 0 m l 水( 加少量活性碳) 进行重结晶。得纯品( ) 2 6 8 9 ，收率6 5 2 ，m p l 2 3 1 2 6 文献1 2 5 - 1 2 7 。3 3 3 25 一氯一2 - v 哼l 哚酮( ) 的制备合成方法同5 一氟一2 - v 哼l 哚酮的制备。3 3 3 3催化剂k f - a 1 2 0 3 的制备将3 7 克氟化钾在1 0 0 毫升水中完全溶解后，加入6 3 克的中性氧化铝，室温下搅拌1 0