（植物学专业论文）巴山松与油松的遗传分化和地理分界研究.pdf

巴山松与油松的遗传分化和地理分界研究 摘要 秦巴山区在地理上将中国划分为北方的暖温带和南方的亚热带。它也是许多物种之 间的分界区和过渡区。对秦巴山区物种进行景观遗传学研究，可以探讨该过渡区的遗传 基础以及在当前气候波动下，秦巴生态过渡区的稳定性与可能变迁。同时，也能够揭示 气候过渡带对物种形成的可能影响。本研究以油松和巴山松为例，研究两个物种的种群 遗传结构和地理分化，分析巴山松与油松的亲缘关系，为揭示秦巴山区的生态过渡性质 对物种分化的影响提供参考。 通过对2 9 个油松与巴山松居群共7 4 7 个个体的1 0 个微卫星位点的遗传分析，我们发 现这两种松树显现出在风媒异花传粉的树种中比较高的遗传多样性水平( h 萨o 8 9 1 7 ) ， 居群间有明显的遗传分化( f s t = 0 3 5 1 1 ) 。这可能与它们栖息地生境复杂、间断分散，历 史上发生过瓶颈效应，具有近亲繁殖系统，以及对环境的局部适应相关。种群间的遗传 距离与地理上的距离并无相关性( r = 一0 0 8 8 6 ，p = 0 3 ) 。巴山松主要存在于大巴山，而 油松主要分布在秦岭以北，并在武陵山区和大巴山有一些残余。两者之间的地理分界主 要存在于秦岭山脉、武陵山脉与大巴山山脉的交界处。巴山松与油松存在广泛的基因渐 渗，其中在边界上存在几个具有独特的遗传成分的居群，可能是由于大幅的种间杂交造 成的。 关键词 巴山松，油松，核微卫星，遗传结构，景观遗传学，地理分界 s t u d e so ng e n e ticdif f e r e n ti o nmdtudie sg e n e tde r e n ta t10 na n dicii g e o g r a p h ic ai b o u n d a r ya m o n gp i n u sh e n r y ，m a s t a n d 尸- t a b u li f o r m i sc a r t ( pin a c e a e ) p o p uia tio n s a b s t r a c t q i n l i n g d a b am o u n t a i n sg e o g r a p h i c a l l yd i v i d ec h i n ai n t ow a i m - - t e m p e r a t ez o n et ot h e n o r t ha n dt h es u b t r o p i c a lz o n et ot h es o u t h i ti sa l s ot h eb a r r i e ra n dt r a n s i t i o n a lz o n ea m o n g m a n ys p e c i e s t h el a n d s c a p eg e n e t i c sr e s e a r c hc a r r i e do u to nt h eq i n l i n g - d a b am o u n t a i n sc a n b eu s e dt oe x p l o r et h eg e n e t i cb a s i so ft r a n s i t i o nz o n e ，a n di nt h ec u r r e n tc l i m a t ef l u c t u a t i o n s ， 也es t a b i l i t ya n dl i k e l yc h a n g e so fq i n l i n g d a b am o u n t a i n st r a n s i t i o n a tt h es a m et i m e w e a r ea l s oa b l et or e v e a lt h ep o s s i b l ei m p a c to ft h ec l i m a t i ct r a n s i t i o nz o n eo nt h ef o r m a t i o no f s p e c i e s i nt h i ss t u d y , w eu s et h ee x a m p l eo fpt a b u l i f o r m i sa n d 尸h e n r y it oe l u c i d a t et h e p o p u l a t i o ng e n e t i cs t r u c t u r ea n dg e o g r a p h i cd i f f e r e n t i a t i o no ft h et w os p e c i e s ，t oa n a l y s et h e g e n e t i cr e l a t i o n s h i po ft w os p e c i e s ，a n dt op r o v i d er e f e r e n c ef o rr e v e a l i n gt h ei m p a c to f e c o l o g i c a lt r a n s i t i o n a lq u a l i t i e so nt h es p e c i e sd i f f e r e n t i a t i o ni nq i n l i n g d a b am o u n t a i n s a r e a s 1 1 1 eg e n e t i ca n a l y s i so f2 9p o p u l a t i o i l s 7 4 7i n d i v i d u a l sw a sa n a l y z e db yt e nm i c r o s a t e l l i t e s i t e s a n dw ef o u n dt h a tt h et w os p e c i e sr e v e a lar e l a t i v e l yh i g hl e v e lo fg e n e t i cd i v e r s i t yf h e = 0 8 917 1i nt h e 、订n d p o l l i n a t e do u t c r o s s i n go ft r e es p e c i e s ，a n ds h o wo b v i o u s l yd i s t i n c t g e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o n ( f s t = 0 35 11 ) a m o n gp o p u l a t i o n s i tm i g h tb ea t t r i b u t e dt oc o m p l e x h a b i t a t ，i n t e r m i t t e n td e c e n t r a l i z a t i o n , h i s t o r i c a lb o t t l e n e c ke f f e c t , i n b r e e d i n gs y s t e m ，a n dt h e a d a p t a t i o nt o l o c a le n v i r o n m e n t s t h eg e n e t i cd i s t a n c eb e t w e e np o p u l a t i o n sw a sn o t c o r r e l a t e d 淅t l lg e o g r a p h i cd i s t a n c eo = - 0 0 8 8 6 ，p = o 3 ) ph e n r y im a i n l ye x i s t si nd a b a m o u n t a i n s w h i l ept a b u l i f o r m i sd i s t r i b u t e sp r i m a r i l yt ot h en o r t ho fq i n l i n gm o u n t a i n s w i t l l s o m er e m n a n t si nw u l i n ga n dd a b am o u n t a i n s g e o g r a p h i c a lb o u n d a r i e sl 皤e t w e e nph e n r y i a n dpt a b u l i f o r m i sm a i n l ye x i s ti nt h ej u n c t i o n so fo i n l i n gm o u n t a i n s ，d a b am o u n t a i n sa n d w u l i n gm o u n t a i n s e x t e n s i v ei n t r o g r e s s i o ne x i s t si npt a b u l i f o r m i sa n dph e n r y i i nw h i c h s e v e r a lp o p u l a t i o n sl i e do nt h eb o r d e rh a v eu n i q u eg e n e t i cc o m p o n e n t s ，p r o b a b l yr e s u l t e d f r o md r a s t i c a l l yi n t e r s p e c i f i ch y b r i d i z a t i o n k e yw o r d s ph e n r y i ，pm b u l 折o r m i s ，n u s s r , g e n e t i cs t r u c t u r e ，l a n d s c a p eg e n e t i c s ，g e o g r a p h i c a lb o u n d a r y n 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论 文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和 汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论文 收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：型l l 指导教师签名：上蛑 2 0 ：d 年多月坪日们。年旷月硼 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：樘链 列d 年5 月珥日 西北大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 地理替代现象与景观遗传学研究 我们将一个属内关系亲近的，特征相似而具有各自独立的分布区( 或稍交叉) ，在 空间上依次排开的若干个种称为( 地理) 替代种，替代种间多为直接演化的关系；将这 种现象称为地理替代现象，包括垂直替代和水平替代两种 武吉华等，1 9 9 5 。 物种间的地理替代是一种常见的植物分布模式，它反映了随着热量、水分、土壤等 生态因子的差异，在不同气候带有不同物种分布的生态地理规律。它的成因常与气候的 变化、古地理环境变迁或物种在散播过程中遇到不同的生态条件有关。如落叶松属的分 布区主要在北半球寒温带，但在中欧山地、中国华北和西南山地、日本山地等还有零散 的间断分布，并出现许多地理替代种，其成因为第四纪冰期古气候变化所致。冰期的严 寒使落叶松向南扩展，其后回暖使分布区间断 武吉华等，1 9 9 5 1 。王铁娟等 2 0 0 5 1 分析 了5 种沙蒿分布区内的热量、水分及土壤指标的差异，发现黑沙蒿向东北被褐沙蒿所替代 是因为水热和土壤因子的综合作用；降水的变异是褐沙蒿区与差不嘎蒿，白沙蒿与准噶 尔沙蒿这两对地理替代种发生替代的原因。 地理替代现象对于植物对环境的适应及异地物种的形成有着重要意义【武吉华等， 1 9 9 5 。它提供了罕见的天然实验场地来研究物种生态环境适应和地理物种形成。可以 通过表型特征和基因数据揭示它们如何在进化过程中进行类群分化和居群相互作用的 机制 v a l l i a n a t o sm e ta 1 ，2 0 0 1 。它还能通过研究物种在当地生境中各项生理、生态指 标进一步区分物种是否更适应环境。 目前，对地理替代种和地理替代现象的研究主要是两方面入手。一方面从替代种的 群落分布、组成和替代的规律性来研究：如周道玮等 2 0 0 5 】以系和组为单位探讨了锦鸡 儿属植物各类群的分布规律，各类群内物种或随纬度的变化或随经度的干旱梯度变化呈 现出明显的地理替代分布规律。原始类群起源于东亚，随青藏高原的隆起迁移，就地分 化适应形成不同的类群，形成了现代多样的分布格局。另一方面，是从替代种间的遗传 分化方面入手：如张晓n 2 0 0 5 1 等通过对内蒙古白刺属植物不同地理替代种的种群遗传 第一章前言 结构进行r a p d 分析来揭示物种间的遗传分化和适应性。以上研究方法各有优缺点，我 们可以从影响替代现象形成的生态因子以及遗传结构两方面同时入手对地理替代现象 进行研究，即应用景观遗传学方法来研究地理替代现象。 1 2 景观遗传学 1 2 1 景观遗传学的概念 景观遗传学是景观生态学和种群遗传学相结合而形成的一个新兴研究领域，它的产 生是统计学与计算机技术的结合，源于研究分子遗传学的理论和方法的不断完善和研究 工具的改进【f u n ke ta l ，2 0 0 5 。景观遗传学的概念最早是m a n e l 等在2 0 0 3 年提出的，旨 在提供关于景观环境特征与物种微进化过程( 譬如基因流、遗传漂变和选择) 相互作用 的信息，探究景观异质性与种群遗传结构之间的关系，进而阐明种群内部的进化过程。 其核心问题是：景观空间异质性如何影响种群的空间遗传结构以及种群的命运。景观遗传 学从发现空间遗传格局入手，将这种格局与景观环境特征进行相关性分析，以达到理解 两者之间相互关系的目的 王红芳等，2 0 0 5 。自从这一概念提出后，很多新的统计方法 和软件也如雨后春笋般出现，大量的文章采用了遗传变异空间分布与地理坐标或景观特 征相结合的方法来进行数据分析 h i r a oe ta 1 ，2 0 0 4 ：j a c q u e m y n ，2 0 0 4 ；l i e p e l te ta 1 ， 2 0 0 2 。 1 2 2 景观遗传学的研究方法 景观遗传学一般先确定种群遗传的空间结构特征，其次综合考虑景观特征，从而推 测景观环境对种群遗传结构的塑造作用和对种群进化的影响 e p p e r s o n ，2 0 0 3 ；m a n e le t a 1 ，2 0 0 3 。其中的两个关键步骤即检测基因流的不连续性，然后将基因流的不连续性与 生境片段化及环境特征等联系起来 m a n e l ，2 0 0 3 。根据研究问题的需要，往往选取不同 的遗传标记、统计分析方法。如遗传标记可分为适应性标记和中性遗传标记。统计分析 方法也很多样，如距离隔离格局分析，基因流格局分析，种群遗传与景观格局相关性分 析等。 1 2 3 景观遗传学的研究范围 一般而言，景观遗传学通过量化景观变量和种群遗传结构之间的关系去理解生态过 程对遗传变异的影响 t u r n e re ta 1 ，2 0 0 h 。具体而言，可以应用于以下五个方面： ( 1 ) 2 西北大学硕士学位论文 量化景观格局对遗传多样性的影响 s c r i b n e r e ta 1 ，2 0 0 5 ；c e g e l s k ie ta 1 ，2 0 0 3 。遗传变 异随景观构成和景观格局的不同而变化。s e z e n 等人 2 0 0 5 的研究表明与原生森林相比， 次生森林的景观基质差异会影响哥斯达黎加棕榈的更新格局。 ( 2 ) 辨认阻碍基因流的 屏障。在研究中可以应用遗传学数据来确认基因流的间断以及渐进的过渡带 p a l oe ta 1 ， 2 0 0 4 ；m a n n ie ta 1 ，2 0 0 4 ；f u n ke ta 1 ，2 0 0 5 。它的空间分析技术能检测到传统种群遗 传学方法难以检测到的屏障 g u i l l o te ta 1 ，2 0 0 5 。许多景观特征以及不利的无机环境都 可以充当潜在的基因流屏障。b u c c i 和v e n d r a m i n 2 0 0 0 基于c p s s r 对9 5 个欧洲挪威云 杉种群进行了遗传变异格局分析。他们利用其中的高频单倍型划分出1 6 个遗传同质区， 据此可以对相同遗传同质区的种群采取相同保护措施，避免非同质区间的移植，也可寻 找与不同遗传同质区的适应性相关的基因，从而为合理保护和利用这一物种提供了非常 好的参考。( 3 ) 揭示迁移通道。某些景观变量可以促进基因间的交流，并可能充当了 廊道。景观遗传学方法可以确认廊道的实际位置 b a n k se ta 1 ，2 0 0 5 ；v i g n i e r i ，2 0 0 5 1 ， 帮助我们合理设置保护区和廊道使得各保护区的植物之间基因流畅通或增加隔离。a m y g v a n d e r g a s t 等 2 0 0 8 基于g i s 分析了2 1 种来自加利福尼亚州南部地区的动物的线粒 体d n a 数据分析其地理障碍和遗传多样性，在地理信息系统的基础上为系统保护评估 和土地使用规划作了贡献。( 4 ) 理解某个生态过程中的时空尺度。对特定的一个景观 格局采取不同的考察尺度将会得到大不相同的基因流格局，我们可以据此加深对物种生 物学特性的了解。举例来说，时间对景观遗传格局也具有显著影响，如有的研究小组发 现时间隔离对种群结构的形成有显著贡献，而地理环境和生境的差异对遗传结构并无太 大影响 r a m s t a de ta 1 ，2 0 0 4 。( 5 ) 检验关于物种生态特性塑造遗传结构的假说。 1 2 4 景观遗传学采用的分子标记 景观遗传学常用的分子标记与种群遗传学基本相同。常用的d n a 标记形式有限制 性片段长度多态性标记( r f l p ) 、随机扩增多态性d n a 标记( r a p d ) 、扩增的限制性片段 长度多态性标记( a f l p ) 、d n a 简单重复序列( s s r ) 、可变数串连重复序列( v a r i a b l e n u m b e ro f t a n d e mr e p e a t ，简称v n t r ) 以及单核核苷酸多态性( s n p ) 等。其中，高变异、 等显性的分子标记核微卫星在景观遗传学研究中应用最为广泛。 核基因组微卫星( n u c l e a rg e n o m es i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，n u s s r ) 是近年发展起 来的一种新型高效的分子标记。n u s s r 具有微卫星标记的优点，如( 1 ) s s r 标记技术 仅需微量组织，这在濒危物种的研究中尤为重要。同时微卫星序列短，即使降解的d n a 3 第一章前言 也可能包含足够用来扩增的微卫星位点序列，亦可有效进行分析鉴定；( 2 ) s s r 标记技 术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；( 3 ) 多态性高，实验重复性好，结果稳 定，可靠性高。由于凝胶电泳具有单碱基的高分辨率，所以能检测很高的多态性，遗传 信息量大。一个s s r 最高可检测到2 6 个等位基因；( 4 ) 多数s s r 在高等植物中一般 位于基因组的非编码区，无功能作用，其位点上的错配和突变极少能影响到生物个体的 生存和繁殖力，增加或减少几个重复序列的频率高，表现为中性进化；( 5 ) s s r 标记数 量丰富，标记覆盖整个基因组，而且分布均匀；( 6 ) s s r 序列的两侧顺序常较保守，在 同种不同遗传型间多相同，可以在不同谱系、群体，甚至在属内相近的种间通用；( 7 ) 符合孟德尔遗传方式，呈共显性，可用来鉴定纯合子和杂合子，分析不同材料间的等位 基因多样性，广泛应用于品质鉴定，基因作图等领域【周延清，2 0 0 5 ；杨娅，2 0 0 6 】。此 外，n u s s r 兼顾到核基因组具双亲遗传的特点，虽然核基因常因有位点间的重排和杂合 性存在给研究者加大了难度，但也为杂交、物种形成和网状进化的研究提供了基础，因 此可以用来鉴定种甚至亲缘关系很近的物种，评价居群和个体的遗传差异，现已广泛应 用于植物群体遗传分析及系统发育分析研究。 1 2 5 松属植物的景观遗传学研究现状 国外结合地理坐标或景观特征对松科植物进行的研究已经取得了累累硕果。在松属 植物中，应用景观遗传学可以从不同角度阐述物种的时空遗传结构的细微变化。如 m a h e r a l l h 等 2 0 0 2 通过研究证明了美国黄松种群的水力结构差异仅是其表型可塑性的 结果，与种群沿气候梯度分布的生态型分化无关。小居群可以促使物种交配方式的改变， 可以干扰历史对小尺度种群遗传结构的影响 p a r k e r k ce ta 1 ，2 0 0 1 ；a m u n c i o j re ta 1 ， 2 0 0 4 。但是我国目前仅有北京师范大学、武汉植物研究所等极少数科研机构或高校对 这方面进行研究。北京师范大学生态研究所的生态系统分析与区域评价研究室目前关注 两个物种之一就有油松。天然油松主要分布在华北地区，这一地区是人类活动密集的地 区，可以想象这一地区的森林受到了人类极大的干扰。目前，天然油松林在其原始分布 区的分布是零星和片断化的。作为北方的主要造林树种，天然林的分布区内引入了大量 的人工油松林。他们主要研究的就是这种景观变化对天然油松林的遗传进化产生的冲 击。 1 3 本研究的立题依据与主要内容 4 西北大学硕士学位论文 1 3 1 研究背景 秦岭位于我国中部地区，呈东西走向，是我国南北地理和气候的分界线及长江、黄 河两大水系的分水岭，将动物区系划分为古北界和东洋界。秦巴山区是南部亚热带森 林( 主要是常绿植物) 和北部温带森林( 主要是落叶植物) 间的生物地理障碍。 秦岭西起甘肃省南部，以迭山与昆仑山脉分界。向东经天水南部的麦积山进 入陕西。在陕西与河南交界处分为三支，北支为崤山，余脉沿黄河南岸向东延伸， 通称邙山；中支为熊耳山；南支为伏牛山。山脉南部一小部分由陕西延伸至湖北 郧县。秦岭山间多横谷，为南北交通孔道。秦岭山地对气流运行有明显阻滞作用， 主峰太白山海拔3 7 6 7 2m ，北坡由于西北干冷气流的影响形成暖温带半湿润气候，南坡 被东南湿润气团影响形成北亚热带湿润气候，主脊偏居北侧，水系也不对称。 秦岭地区作为亚热带常绿植物分布的北界和寒温带落叶植物分布的南缘，是横断山 脉、华北、华中植物区系的交汇处，处在中国日本和中国一喜马拉雅2 个植物亚区的 分界线上，是我国南北植物的交汇过渡地带，因此生态系统复杂多样，动植物种类丰富。 反映到植被类型和区系组成上，北坡以华北植物区系占优势，南坡多含华中区系成分，许 多植物是第三纪古老的孑遗种，如独叶草、珙桐、连香树、水青树、杜仲等，在第四纪 冰期期间曾作为是植物迁移的通道 王文采，1 9 9 2 ；张民侠，2 0 0 0 。 巴山山区位于中国西部四川省与陕西省的交界处，为四川盆地、汉中盆地的 界山。它东端伸延至湖北省西部，与神农架、巫山相连；西与摩天岭相接；北以 汉江谷地为界，呈西北东南走向，正处于我国亚热带向暖温带过渡的地带。山峰 大部分在海拔2 0 0 0 米以上，喀斯特地貌发育，有众多峰丛、地下河、槽谷等。主 峰大神农架为位于湖北省神农架林区。大巴山地处北亚热带山地季风气候区，主要 为亚热带环境系统所控制，气候温和，雨量充沛，日照充足，四季分明，自然环境复杂 而优越 黄可，1 9 7 9 。 在秦巴山区中，物种地理替代现象很普遍，如锦鸡几属的植物 周道玮，2 0 0 5 ，忍 冬属植物 孙学刚，2 0 0 0 ，落叶松属植物 赵利峰，2 0 0 1 】。孙学刚等证明横断山北部至 秦岭西段山地是诸多国产忍冬属种系向北方适应性辐射和分化的结点。秦巴山区在种系 的迁入和分化以及该属植物的扩散途径方面起重要的纽带作用，在该地区部分忍冬属物 种发生地理替代现象。与忍冬属物种相比，落叶松属的水平和垂直替代现象更加明了 应 第一章前言 俊生，1 9 8 9 。甚至形态也随着海拔和纬度的升高或降低，呈明显的梯度变化。在各种 落叶松种间，由于属内种间遗传隔离不严格，当两个种的分布区发生接触、不同种个体 共生一起时常形成种间杂交 赵利峰，2 0 0 1 】。 当今对秦巴山区的过渡性研究主要从生态角度出发 孙学刚，2 0 0 0 ；周道玮，2 0 0 5 ， 然而由于山地的海拔差异巨大，植物水平替代规律往往被海拔高度的替代规律所掩盖， 遗传学研究避免了这一问题。同时对对秦巴山区物种进行景观遗传学研究，可以探讨该 过渡区的遗传基础和当前气候波动下，秦巴生态过渡区的稳定性与可能变迁。同时，也 能够揭示气候过渡带对物种形成的可能影响。本研究以油松和巴山松为例，研究两个物 种的种群遗传结构和地理分化，分析巴山松与油松的亲缘关系，为揭示秦巴山区的生态 过渡性质对物种分化的影响提供参考。 1 3 2 科学问题与研究目的及意义 油松( p i n u st a b u l i f o r m i sc a r t ) 在植物分类学上属松科( p i n a c e a e ) 松属( p i n u s ) ， 是中国北方针叶林的优势种，从中国东北蔓延至秦岭山区，以陕西、山西为其分布中心， 跨1 3 个省( 市、自治区) ，分布范围很广【郭军战，1 9 9 8 】。已有证据表明油松天然群体 的遗传距离与地理距离间无明显的相关关系 郭军战，1 9 9 6 ；郭军战，1 9 9 8 。 巴山松( p i n u sh e n r y im a s t ) 是我国特有的珍稀的亚热带针叶松树树种，是m a s t e r 根据h e n r y 采自于湖北房县的6 9 0 6 号标本于1 9 0 2 年命名的，主要分布在与其形态难以区 分的油松分布区的地理南缘：大巴山区，武陵支脉以及云贵高原延伸的余脉上，其中多 分布于米仓山西段和巫山支脉两个地区，巴山中段和云贵高原余脉两个地区分布较少 【张方秋，1 9 9 0 】。天然巴山松林垂直分布范围各地略有不同，在大巴山南坡为海拔 l1 5 0 2 0 0 0 m 【四川植物志编辑委员会，1 9 8 3 ，在大巴山北坡，分布在1 0 0 0 2 0 0 0 m 左 右 张仰渠，1 9 8 9 ，在神农架地区为海拔1 2 0 0 2 6 0 0 m 湖北省植物所，1 9 7 6 1 。 油松和巴山松在形态特征方面表现出细微差别：巴山松的针叶没有油松粗长，巴山 松的球果比油松的球果小，仅具有稍微肿起的鳞脐，而油松有明显肿胀的鳞脐，鳞盾较 肥厚，尖刺较大，种子也较大。此外，巴山松的第一年小枝通常覆有白粉。然而，他们 生长在完全不同的生境：巴山松的生境为温暖潮湿的北亚热带地区，而油松的生境为温 带地区。油松和巴山松的关系正是秦巴山区过渡性与物种分化的集成。同时由于长期以 来分类系统的混乱，巴山松常被视为其他物种的变种被滥砍滥伐，缺乏有效的保护，已 6 西北大学硕士学位论文 成为 几十年来，关于油松和巴山松之间的亲缘关系以及地理分界问题( 即地理替代现象 中，替代种分布区域的划分问题) 一直存在分歧和争议。f l o r a o f c h i n a 认为巴山松是油 松分布区南缘的地理变种 f ul ge ta l ，2 0 0 1 。但更多位学者通过对巴山松的分布、形 态特征、木材解剖、染色体组型、生化特性及幼苗生长分析等方面的研究，都支持巴山 松作为分类学上的独立种 张存旭，1 9 9 6 ；郭军战等，1 9 9 6 ；李长喜和徐化成，1 9 8 9 ； 毛绳绪，1 9 8 9 ；安培钧、赵砺，1 9 9 2 ；薛智德， 1 9 8 9 】。 根据球果形态特征，李长喜和徐化成 1 9 8 9 认为巴山松应做独立种处理，两者的地 理分界在米仓山至巴山一线( 是广义上的大巴山脉的两个组成部分) ，米仓山以及巴山 的北坡分布油松，而武陵、齐跃山、巴山南坡( 狭义) 等地分布着巴山松。一些其他学 者认为巴山松可能向北延伸至秦岭南坡 l e i ，1 9 9 9 年】。不过，基于球果的统计分析、 居群水平上的针叶显著特征，赵昱 2 0 0 9 认为这两种松树的地理界限并不明显。基于近 缘种的形态分析，地理边界可能由于高水平的同源性而扭曲 n y f f e l e re ta 1 ，2 0 0 5 1 。 分子方法为确定遗传边界，并探讨其性质和范围提供了重要机遇 h a r r i s o n ，1 9 9 2 ； a r n o l d ，1 9 9 7 。通过使用叶绿体微卫星( c p s s r s ) ，我们发现油松和巴山松居群问都 表现出了有限的基因流。巴山松从武陵山脉至大巴山山脉北坡均有分布，而大巴山北坡 分布有零散的油松【杨璐，2 0 0 9 。然而，叶绿体微卫星是父系遗传的，并不能完全反映 双亲遗传的核基因组的特点。在这项研究中，我们使用核微卫星标记( n u s s r ) 分析油 松和巴山松2 9 个居群的遗传结构和地理分化。我们的目标是：( 1 ) n u s s r 能否显示出 与c p s s r 相同的、明显的居群隔离? 如果是这样，什么因素可能对这种居群结构的形 成产生作用?( 2 ) 两种松树间是否存在遗传界限? 它是否与形态界限或叶绿体遗传障 碍一致? 这些答案能帮助我们理解两种松树间的系统发生关系，它们可能的进化历史和 基因交换过程的性质。同时，它对巴山松这种稀有特有松树的保护策略以及进一步引种 造林具有实践指导意义，也对秦巴山区的生态过渡性质有较为深刻的了解。 7 第二章材料和方法 第二章材料和方法 21 实验材料 油松是一种广布于中国北方的针叶林树种，它的分布范围从东北的辽宁省一直延续 到西北的青海省，从东经1 0 2 。至u 1 2 2 。，北纬3 2 。至4 3 。贯穿数千公里。在这项研究中， 油松个体只是采自于其南部分布区，而巴山松的样本的取样遍及其分布范围。每个采样 点的标志性样本可以根据针叶的形态特征和球果分辨出，并且保存在西北大学植物标本 室。总共采集了共2 9 个天然居群7 4 7 个个体的针叶( 表l ，图1 ) 。 图1( a ) 居群采样点概况( b ) 居群间的主要地理障碍 f i g 1 ( a ) t h e 曲t m u d o no f s a m p l t h gs i t e s ( b ) k e y g e o g r a p h i c b a r r i e r s = m o s g p o p u l a f i o n s 附注1 ：本研究中两种松树的居群位置。白色圆圈代表形态上的油松和紫色哑圈代表形态上的巴山松。 圆的太小与表3 中的观测杂台度( h o ) 的大小成正比。 t e x tn o t e l ：p o p u l a t i o n l o c a t i o n so f t h e t w op i n e s i n t h es t u d ) | _ w h i t ec i r c l e sr e p m , s e n t e d f 研p n h 耐砷自 a n dp u r p l eo l i e 5 f o ro 巾 m l o 舀c mph e r , r y it h ec i r c l es i z e sw c r 。p t 叩o n i 如叫t ot h eo b s c e d g e n e t i c d i v e r s i t y v a l u e s ( t t o ) i n t a b l e3 西北大学硕士学位论文 表1 两种松树的取样地位置和居群大小( 根据形态) t a b 1t w ok i n d so fp i n es a m p l i n gl o c a t i o n sa n ds a m p l es i z e ( b a s e do nm o r p h o l o g y ) l o c a t i o n s m 。u 1 1 t a ：m s 锄? 1 e 5 l a t i t u d l o n g t u d e a l t i t u d e o n g l 1 1 1 u 1 0 el a i lam o e s v s t e m s n u r n o e r pt a b u l i f o r m i s 宰n 呵( n a n w u t m ) ， s h a a n x i q l 3 23 4 1810 8 4 7 15 0 0 * h z z ( h o u z h e n z i ) ， s h a a n x i q l 3 0 3 3 8 51 0 7 8 31 3 4 0 幸g h j ( g u o h u o j i e ) ， s h a a n x i q l 2 23 3 7 41 0 8 7 61 6 0 0 j k ( j i a n g k o u ) ， s h a a n x i q l 2 23 3 7 21 0 7 0 5l1 5 0 n s ( n i n g s h a n ) ， s h a a n x i q l 2 93 3 3 21 0 8 3 19 0 0 n qf n i n g q i a n g ) ，s h a a n x i d b s2 73 2 8 21 0 6 2 1 8 6 7 h s lm o n g s h i l i a n g ) ， s h a a n x id b s213 2 7 510 7 9 0 l 10 0 z j ( z e n g i 幻， s i c h u a nd b s2 43 2 6 3 1 0 6 1 01 3 5 6 几( j i a n l i a n g ) ，c h o n g q i n g d b s2 03 2 0 2 10 8 8118 9 4 ph e n r y i # d h a h e ) ， s h a a n x i d b s2 33 2 6 31 0 7 4 3 l1 0 0 l p ( l i p i n g ) ， s h a a n x i d b s3 03 2 7 61 0 6 6 41 5 3 8 q s ( q i n g s h u i ) ， s h a a n x id b s2 33 2 6 410 7 7 5 l14 3 # q j p ( q i a n j i a p i n g ) ，s h a a n x i d b s2 43 2 0 210 9 312 0 51 d j k ( d a j i a n g k o u ) ， s i c h u a nd b s18 3 2 5 710 6 6 91410 x ，p i a n g j i a p i n g ) ，s i c h u a n d b s3 03 2 1 21 0 8 1 31 3 2 5 撑h o u p ( h o u p i n g ) ，c h o n g q i n g d b s1931 7 410 8 9 815 0 3 s y ( s h u a n g y a n g ) ，c h o n g q i n g d b s3 03 1 4 81 0 9 8 1 1 5 9 2 z x ( z h u x i ) ，h u b e i d b s2 93 2 0 410 9 6 5 15 2 7 拌b m 饵a n m i a o ) ，h u b e i d b s3 03 1 5 21 1 1 0 1 1 3 3 0 撑h p ( h o n g p i n g ) ，h u b e i d b s3 03 1 7 0 1 1 0 4 31 8 0 0 d f s ( d a f o s h a n ) ，h u b e i d b s7 3 2 4 51 1 0 2 11 0 3 0 # s w d ( s a i w u d a n g ) h u b e i d b s 3 03 2 4 31 1 0 7 51 6 6 1 x j ( x i n i i a ) ，h u b e i d b s 2 13 0 8 51 1 0 8 1 1 5 1 6 h s ( h a n s h u i ) ，c h o n g q i n g w l s2 83 0 7 910 8 5 7 15 0 5 s z ( s h i z h u ) ，c h o n g q i n g w l s3 23 0 2 21 0 8 3 8 1 5 9 5 j f s ( j i n f o s h a n ) ，c h o n g q i n g w l s3 2 2 9 0 31 0 7 1 21 3 0 0 m w ( m i a o w a n ) ，c h o n g q m g w l s 2 73 0 6 710 9 3 212 8 0 w f ( w u f e n g ) h u b e i w l s3 03 0 1 411 0 7 31 2 6 0 z j j ( z h a n g j i a j i e ) h u n a n w l s2 72 9 0 31 1 0 4 3 1 0 9 1 附注2 ：典型的油松， 私典型的巴山松。山系：q l ( 秦岭山脉) ，d b s ( 大巴山区) 和w l s ( 武 陵山区) 。 t e x tn o t e2 ：* - t y p i c a lpt a b u l i f o r m i s ，# - t y p i c a lph e n r y i m o u n t a i ns y s t e m s ：q l ( q i i l l m gm r s ) ，d b s ( d a b am r s ) a n dw l s ( w u l i n gm t s ) 。 9 第二章材料和方法 2 2 实验方法 2 2 1 试剂配制 s t e 预处理液( 1 0 0 m 1 ) ：5 m n a c l1 4 m l ，1 3 - 琉基乙醇2 m l ，1 mt r i s - h c l1 0 m l ，p v p2 9 ， e d t a ( p h = 8 o ) 10 m l 。 2 x c t a b 提取液( 1 0 0 m 1 ) ：1 mt r i s - h c l1 0 m l ，5 m n a c l2 8 m l ，o 5 me d t a 4 m l ，c t a b 2 9 ， 用时加入0 2 1 3 一琉基乙醇。 t b e 母液( 5 x t b e ) ：8 0 0 m l 的水中：j i l k s 4 9 的t r i sb a s e 和2 7 5 9 的硼酸，：j i , k 2 0 m l 的0 5 m e d t a ( p h = 8 o ) ，搅拌溶化，定容至1 l ( p h 8 3 ，室温保存) 。 1 2 丙烯酰胺：1 0 0 m l5 x t b e 中加x 5 8 9 丙烯酰胺及2 9 甲叉双丙烯酰胺( 丙烯酰胺： 甲叉双丙烯酰胺= 3 9 ：1 ) ，水浴加热( 3 7 c ) 使之溶解后，加水定容至5 0 0 m l 。用滤纸过 滤到棕色瓶中在室温下避光保存。 l o a v s ( 过硫酸铵) ：称取l g 超纯过硫酸铵溶于1 0m l 超纯水1 0 m l ，4 c 保存( 贮存 液有效期为2 3 周) 。 l o a d i n gb u f f e r ：取去离子甲硫胺5 0m l 及lr r d 的0 5 me d t a ( p h = 8 0 ) ，j j l 入c y a n o l 0 1 2 5 9 ，溴酚蓝0 1 2 5 9 ，混匀后4 c 保存。 染色液：取无水乙醇l o o m l ，冰醋酸5 m l ，加水8 0 0 m l 后再j 1 ) k 2 9 硝酸银，最后定容 为1 0 0 0 m l ，室温下贮存于棕色瓶中。 2 2 2 总d n a 的提取 d n a 的提取是进行p c r 扩增的关键步骤。只有获得高品质的d n a ，才能获得清晰 稳定的p c r 扩增结果。本研究了改良的2 x c t a b 法【王关林等，1 9 9 8 提取油松和巴山松的 全基因组d n a ： 1 取硅胶干燥的针叶3 4 针，用剪刀剪碎后加入适量p v p 、抗坏血酸、石英砂、 液氮于研钵中快速研磨。 2 转移粉末至已编号的2i i l l 离心管中，加入8 0 0p ls t e 预处理液，振荡混匀，冷 冻离心( 4 1 0 0r p mx 1 0 m i n ) 、 3 弃上清液，加入9 0 0 山2 x c t a b ( 6 5 预热处理) 提取液，充分混匀后置于6 5 1 0 西北大学硕士学位论文 水浴锅中4 5 6 0r a i n ，期间每1 0 分钟震荡混匀一次。 4 冷却至室温，加入9 0 0g l 氯仿异戊醇(