（环境工程专业论文）硫化物生物转化为单质硫的研究.pdf

摘要 摘要 水体中的硫化物具有腐蚀作用、对生物产生不良影响影响，在废水处理过程中会影 响厌氧消化，降低出水水质。利用生物方法处理含硫化物废水不但能够有效降低水体中 硫化物的含量，而且能够氧化硫化物生成单质硫，实现废物资源化。 本课题从酸性土壤筛选出一株具有硫化物氧化能力的化能自养细菌，命名为t l 1 ， 并对菌株t l 1 的菌落形态、菌体形态、鞭毛进行了观察实验，对革兰氏染色等生理生 化指标进行测定。通过对菌株t l 1 的1 6 s r d n a 序列进行测定，并与g e n b a n k 数据库 中相关菌种进行比较，构建了系统发育树，结合菌落、细胞形态和生理生化特性鉴定菌 株t l 1 为那不勒斯硫杆菌( t h i o b a c i l l u sn e a p o l i t a n u s ) 。 通过实验了解了菌株t l 1 生长曲线及生长过程中p h 的变化，进而研究了转速、盐 度、温度、p h 、金属离子、硫化物浓度对菌株t l 1 脱硫效果的影响，结果表明：1 7 0r m i n 、 3 0 、初始p h 7 5 条件下菌株的脱硫效果最佳：当盐度大于0 6 时对菌株生长产生抑 制；在摇瓶实验中硫化物浓度高于2 4 0m g l 时，菌体活性受到严重影响。 在升流式好氧反应器中接种菌株t l 1 ，对反应器中硫化物生物转化为单质硫的特 性进行研究。在生物脱硫反应系统中，能够实现通过调节o r p 控制反应器系统的运行 状态，进水硫化物浓度3 5 0m g l ，水力停留时间3h 条件下，通过调节反应器曝气量控 制系统o r p 保持在3 7 0m v ，能够维持9 5 以上的硫化物去除率和8 5 以上的单质硫回 收率。反应系统内随着o r p 的升高，生成的单质硫颗粒粒径会增大。o r p 保持在一4 2 0m v 和3 7 0m v 时粒径主要集中在0 0 5 - 0 5u l n 和2 1 1u m 两个粒径范围内，当o r p 提高 到3 2 0m v 时，粒径范围则集中在2 1 3u n l 和1 0 0 - - - , 7 0 0u n l 两个粒径范围内，表明菌体 代谢会产生更多有利于硫颗粒聚集的胞外聚合物。生物脱硫系统o r p 的升高会使菌体 代谢产生胞外聚合物的成分发生改变，含疏水基团成分的量升高，引起单质硫颗粒亲水 性发生改变，单质硫颗粒疏水性明显增强。 关键词：生物脱硫，那不勒斯硫杆菌，o r p ，单质硫颗粒 a b s t r a c t t h ec o r r o s i v ea n dn e g a t i v ee f f e c t so fs u l f i d eo nt h eo r g a n i s mc o u l di n f l u e n c en a e r o b i c d l g e s t i o nd u r i n gw a s t e w a t e rt r e a t m e n tp r o c e s s d e s u l f u r i z a t i o nb y b i o l o g i c a lm e t h o dc a nn o t o n l yr e d u c es u l f i d ec o n t e n ti nw a s t e w a t e r , b u ta l s oo b t a i na sr e s o u 】r c eu t i l i z a t i o n a d e s u l f u r i z i n gc h e m o a u t o t r o p hs t r a i nw a si s o l a t e da n dn a m e dt l 1i nt h es 伽v t h e o b s e r v a t l o no fc o l o n ym o r p h o l o g y , m y c e l i a m o r p h o l o g y , a n df l a g e l l u mw e r ei n v e s t i g a t e d a n d g r a ms t a i na n do t h e rp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a li n d e x e sw e r e a l s oi d e n t i f i e d m o r e o v e r ap h y l o g e n e f i ct r e ew a sc o n s t r u c t e d b yc o m p a r i n gw i t ht h ep u b l i s h e d16 sr d n as e q u e n c e so f t h er e l a t i v eb a c t e r i as p e c i e s a sar e s u l t ，t h i s s t r a i nw a si d e n t i f i e dt ob et 1 1 e s 仃a i no f t h i o b a c i l l u sn e a p o l i t a n u s t h eg r o w t hc u r v ea n dt h ec h a n g eo fp hd u r i n gc e l lg r o w t hw e r ei n v e s t i g a t e d a n dt l l e e f f e c to fd i f f e r e n tr o t a t i o n a l s p e e d ，s a l i n i t y , t e m p e r a t u r e ，p h ，m e t a li o i l sa u l ds u l f i d e c o n c e n t r a t i o no nt h es t r a i nw a sa l s os t u d i e di ns h a k ef l a s kc u l t u r e t h er e s u l ts h o w e d 廿1 a tt h e s t r a i nr e a c h e dt h eo p t i m u md e s u f u r i z a t i o ne f f e c ta tt h ec o n d i t i o no f17 0r m 洒，3 0 。c i n i t i a l p h 7 5 w h e ns o d i u ms u l f i d ec o n c e n t r a t i o ni nt h ew a t e rw a sa b o v e2 4 0 m g l t h es t r a i nw a s r e s t r a i n e d t h ed e s u l f u r i z i n g e f f i c i e n c y a n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h es u l n l r p a r t i c l e sw e r e i n v e s t i g a t e di nt h ea i r l i f tr e a c t o ru s i n go x i d a t i o nr e d u c t i o np o t e n t i a l ( o r p ) a st h ec o i l n o l f a c t o r w h e nk e e p i n go r pa t - 3 7 0m v , i n f l u e n ts u l f i d ec o n c e n t r a t i o na t3 5 0m l ，h y 出i a u l i c r e t e n t i o nt i m e ( h r t ) a t3h ，s u l f i d er e m o v a lr a t ew a so v e r9 5 a n do v e r8 5 m o r e o v e r t h e s u l f u rp a r t i c l e ss i z ew a se n l a r g e dw i t ht h ei n c r e a s eo fo r p w h e n k e e p i n go r p a t 4 2 0m v a n d - 3 7 0m v , t h es u l f u r p a r t i c l e sa tt h er a n g eo f0 0 5 - - - 0 5u ma n d2 - - - 11m n w h e no r p w a s 3 2 0m vt h es u l f u rp a r t i c l e sw i l lb ea tt h er a n g eo f2 - - 1 3u ma n d10 0 7 0 0 啪t 1 1 i sr e s u l t e l n d i c a t e dt h a tc e l lc a ns e c r e t ee x t r a c e l l u l a rp o l y m e r i cs u b s t a n c e sw h i c hb e n e f i c i a lt os u j 鼬 p a r t i c l e sa g g r e g a t i o n i nt h i sb i o l o g i c a ld e s u l f u r i z a t i o ns y s t e mm ei n c r e a s eo fo r p l e a dt o c h a n g eo fe x t r a c e l l u l a rp o l y m e r i cs u b s t a n c e s w h i c hl e a dt oh y d r o p h o b i c i t ye n h a n c e d c o m p o s i t i o nt h a th y d r o p h o b i cg r o u pi n c r e a s e k e yw o r d s ：b i o l o g i c a ld e s u l f u r i z a t i o n ，t h i o b a c i l l u sn e a p o l i t a _ n u s ，o r p , s u l f u r p a r t i c l e s i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是蠢人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容扣纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：1 ：习巡导师签名：华垦塑： 日矶4 乜一 第一章绪论 1 1 研究背景 第一章绪论 1 1 1 硫化物的产生与危害 1 1 1 1 硫化物的产生 硫化物的产生有自然因素和人为因素。 自然界中的硫有三种形态，元素硫、无机硫化物及含硫有机物。这三者在化学和生 物作用下相互转化着，构成硫的循环【l 】。在自然界中硫化物由硫酸盐还原而成，通常有 两条实现途径，即同化硫酸盐还原反应和异化硫酸盐还原反应。同化硫酸盐还原反应是 指硫酸盐通过生物( 微生物、植物) 吸收，同化为含s h 基的有机物。有机含硫化合物 通过腐化细菌的分解作用而放出h 2 s ，该反应过程称为同化硫酸盐还原反应。厌氧条件 下，水中存在有机碳源和硫酸根时，由硫酸盐还原菌( s b r ) 还原硫酸盐生成硫化氢。 人类的生产活动加速了硫化物的产生。随着人类对自然资源的开采与工业应用，在 许多生产过程中，产生了大量的硫化物。在轻工、制造等行业，如制革废水、造纸废水、 酒精生产废水、矿选废水、垃圾渗滤液等排放的有机废水中含高浓度硫酸盐或硫化物【2 1 ， 见表1 1 。 表1 1 不同行业废水中硫酸盐或硫化物的含量 t a b 1 一lc o n t e n to fs u l f a t eo rs u l f i d ei nd i f f e r e n ti n d u s t r y 1 1 1 2 硫化物的危害 硫化物主要以气态h 2 s 和溶于液体的s 2 两种形式存在。 硫化氢是硫化物中的气体形式，它是一种无色气体，具有特异的臭鸡蛋气味。它可 以溶于各种液体中，如水、乙醇、乙醚、碱性碳酸盐和碳酸氢盐溶液等。硫化氢从含有 硫化物的废水中逸散到空气中，在极低的浓度下就可以使人们感到不舒服。硫化氢被吸 入人体后，会对呼吸系统、循环系统、消化系统及神经系统造成不同程度的影响，有资 江南大学硕士学位论文 料表明，长期接触硫化氢还会对人体留有后遗症。表1 2 中列出了不同浓度硫化氢对人 的影响1 3 1 。 表1 2 不同浓度的硫化氢对人的影响 t a b l e1 - 2i m p a c to fd i f f e r e n ts u l f i d ec o n c e n t r a t i o no nh u m a n 水体中硫化物的危害主要包括：腐蚀作用、对生物健康的影响和对厌氧消化的影响 【4 】 o 水体中的硫化物可与铁在水中由非生物学氧化而生成的f e 2 + 起作用，形成f e s 和 f e ( o h ) 2 ，这是造成铁管锈蚀的主要原因。硫化物在潮湿条件下会被细菌氧化成亚硫酸 ( h 2 s 0 3 ) 及硫酸( h 2 s 0 4 ) ，从而具有腐蚀性。水中的硫化物对人与动、植物的健康也 有影响，饮用水中的硫化氢在浓度为o 0 7m e c m 3 时就能影响水的味道，浓度达到o 1 5 m e j m 3 ，即影响新放养的鱼苗的生长和鱼卵的成活，3 - - 4 5m e ：, m 3 即对柑橘类根产生影 响，对高等植物根的毒性很大。高浓度有机废水采用厌氧法处理非常合适，既可去除污 染，又可产生清洁能源甲烷，但在厌氧处理含高浓度硫酸盐废水时，厌氧消化过程中 会产生硫化物，硫化物对产甲烷菌具有毒害作用，对甲烷的产量和产率都会产生影响1 4 j 。 综上所述，由于硫化物多方面的危害性，近年来硫化物的处理问题受到越来越多的 关注，各种经济有效的处理方法也相继得到应用。 1 1 2 含硫化物废水的处理方法 1 1 2 1 物理化学方法 1 、直接气提法 这种方法就是用空气将废水中的硫化物吹脱出来。这个过程中存在两种作用：一是 由于空气的气提作用，水中h 2 s _ h + + h s _ 2 h + + s 2 。平衡向左进行，使废水中硫化物减 少；二是空气中的氧与h 2 s 发生化学反应，即h 2 s + o 5 0 2 一h 2 0 + s 但是，在没有催化 剂条件下硫化物的氧化很缓慢【5 1 。 2 第一章绪论 气提过程中以物理去除为主，所以会产生大量的硫化氢气体。虽然这样能改善废水 后续处理的条件，但是还是对环境造成很大的污染。因此被气提的h 2 s 还要进行处理， 工序更加复杂。 2 、化学沉淀法 化学沉淀处理废水中的硫化物就是把化学药剂加入到废水中，利用其金属离子与 s 2 。发生反应，在一定条件下，形成难溶盐沉淀，再加以分离。从而将硫化物去除，此时 h 2 s h + + h s 。_ 2 h + + s 2 的平衡向右移动。工业上常用f e s 0 4 和f e c l 2 作为沉淀剂来处 理含硫化物废水。在2 5 c 时，f e s 的溶度积为3 2 x 1 0 以8 ，因此极易发生沉淀。丁金贵【6 j 等曾分别用f e s 0 4 和f e c l 2 处理含硫化物的废水，效果良好。p e v r e z 7 1 等也有相似结论。 化学沉淀法虽然速度快效率高，但是它费用昂贵，而且易使水质变质，例如铁盐过量， 会产生铁锈，水中有黄色浑浊物。 3 、氧化法 主要包括：曝气氧化法和化学药剂氧化法两类。 曝气氧化法：这种方法是利用纯氧或在使用催化剂的条件下使用空气，将硫化物氧 化。采用的催化剂有k m n 0 4 ( 用量为1m g l ) t 8 j n n 性炭( 5 3 5 3 0m g l ) 9 1 。这种方法， 设备简单、操作简便，但运行费用较高，而且效率低，还会使一部分硫化氢进入空气， 造成污染。 药剂氧化法使用的药剂主要包括：氯气、臭氧、高锰酸钾、过氧化氢、萘醌等，其 原理是利用药剂的氧化性氧化s 2 。生成s o 或s 0 4 2 。，从而达到去除硫化物的目的。 氯气：其反应实质是： h s 。+ o c i 。s o + o h - + c l - h s + 4 0 c 1 。_ s 0 4 2 - + h + + c l - 从上式可以得出，每氧化1g 硫化物分别要用2 1g 或8 4g 氯气，用量很大，而且 当水中存在有机物时，氯气会与其发生反应而产生有毒有害物质，因此氯气的应用受到 限制。 臭氧：臭氧可以很快的将硫化物氧化成硫或硫酸盐。反应式如下： h s 。+ 0 3 s o + o h + 0 2 h s 。+ 4 0 3 _ 8 0 4 2 + h + + 40 2 但是臭氧在水溶液中不稳定，必须现场制备，且制备成本很高。 高锰酸钾：每克硫化氢需要的高锰酸钾量在3 3 1 3 2g 之间。而且高锰酸钾作为氧 化剂有两点不足：一是其价格相对较高，二是反应生成物二氧化锰必须进一步处理。 过氧化氢：过氧化氢与硫化物反应较以上氧化剂进行的缓慢。其反应式是： h s 。+ h 2 0 2 s ”+ o h - + h 2 0 h s 。+ 4 h 2 0 2 s o - + h + + 4 h 2 0 应用过氧化氢成本较高，而且易受水中微生物的影响，因为过氧化氢也与水中微生 江南大学硕士学位论文 物的过氧化氢酶起反应。 萘醌：利用萘醌氧化法可以去除生物气中的硫化物，并且实现单质硫回收，使资源 得到再利用，这是近几年发展起来的一种新的脱硫新技术【1 0 】。 萘醌是醌系物中的一种，它具有足够高的氧化还原电位，溶于水，常温下不升华， 不挥发，而且在作为氧化剂还原硫化氢的过程中不受二氧化碳的影响。利用萘醌回收硫 元素的化学反应式如下： 萘醌( 螯合物) + h 2 s = 萘酚( 螫合物) + s ( 除硫) 萘酚( 螯合物) + 0 2 = 萘醌螯合物+ h 2 0 2 h 2 0 2 ( 再生) + h 2 s _ 2 h 2 0 + s ( 再生产物参与除硫过程) 2 h 2 s + 0 2 = 2 h 2 0 + 2 s 萘醌氧化法的效率很高，在常温条件下就可以接近1 0 0 完成。另外该方法还适用 于气态硫化氢向单质硫的转化过程。因此，该方法可以广泛应用于化工厂，炼油厂，污 水的厌氧处理设施的去除硫化物过程。 1 1 3 微生物法去除水中的硫化物 从硫在自然界的循环中可以看到，微生物可以完全地完成整个循环。氧化硫化物的 微生物主要为：丝状硫细菌、光合硫细菌和无色硫细菌，大部分属于化能自养型。 1 1 3 1 丝状硫细菌 丝状硫细菌主要包括两个属【l l 】，即贝氏硫菌属( b e g g i a t o a ) 和发硫菌属( t h i o t h r i x ) ， 生活在含硫化物的水中，能在有氧环境中把水中h 2 s 氧化为单质硫，并从中获得生长和 活动所需的能量，生成的单质硫则以硫粒的形式沉积在细胞体内，单质硫还可以被进一 步氧化为硫酸盐。贝氏硫菌是一种可滑行的丝状细菌，发硫菌则固着生长。由于这类细 菌将产生的单质硫贮存在细胞体内，给分离和提纯带来困难，在实际生产中应用较少。 1 1 3 2 光合硫细菌 光合硫细菌是一类光能营养细菌1 1 ，1 2 1 ，它以硫化物或硫代硫酸盐作为电子供体，从 光源中获得能量，依靠体内特殊光合色素，同化c 0 2 进行光合作用。其反应式如下： c 0 2 + 2 h 2 s - - c h 2 0 + h 2 0 + 2 s 光合硫细菌主要分为两大类：( 1 ) 严格光能自养型，主要包括着色菌科 ( c h r o m a t i a c e a e ) 的着色菌属和绿菌科( c h l o r o b i a c e a e ) 的绿菌属；( 2 ) 兼性光能自养 型，它们能以有机物( 简单的有机酸类或醇类) 作为电子供体和碳源，主要包括红螺菌 科( r h o d o s p i r i l l a c e a e ) 的红螺菌属、红假单胞菌属、红微菌属以及绿丝菌科 ( c h l o r o f l e x a c e a e ) 。表1 1 列出了几种典型光合硫细菌的生理特性，可以看出大多数光 合硫细菌是体外排硫的。 4 第一章绪论 表卜3 光合硫细菌的分类及特征u 2 1 t a b l e1 3p h o t o s y n t h e t i cs u l f u rb a c t e r i ac l a s s i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i s t i c s 尽管如此，目前光合硫细菌应用生物脱硫工艺的例子却不多，其主要原因如下：( 1 ) 光合硫细菌生长和活动需要光照，给反应器设计带来困难，并增加了运行费；( 2 ) 有些 菌种也在体内贮硫；( 3 ) 光合硫细菌氧化硫化物的过程与c 0 2 的还原( 即固定) 和细胞 物质的生长相耦联，其氧化速率和能力受到细菌细胞物质的生长速率和总量的限制。此 外，研究表明，光合硫细菌每产生lg 细胞物质仅可将l 2g 硫化物氧化生成单质硫，这 个数值越低，去除同样多硫化物，产生的生物污泥就越多【1 3 1 。 1 1 3 3 无色硫细菌 无色硫细菌只是一个生理学惯用词，而不是分类学名词。实际上，有些无色硫细菌 的纯培养菌苔呈粉红或棕色，说明其体内含有细胞色烈1 4 】。 无色硫细菌种类繁多，且各自具有不同的生理学、形态学和生态学特征，对环境条 件的要求也有差异，如表1 2 所示。其中硫杆菌属( t h i o b a c i l l u s ) 是土壤和自然水体中 最常见的一种无色硫细菌l l 引，一般是无芽孢的短杆菌，革兰氏阴性，端生鞭毛，能将硫 化物氧化成单质硫或硫酸盐，或将硫代硫酸盐氧化为硫酸盐。大多数无色硫细菌都在p h 中性、中温条件下生活。但也有研究表明，无色硫细菌可生活的环境范围很广，在 p h l o 9 o 、温度4 9 5 的条件下都有无色硫细菌生长和活动，对d o 的要求很宽松， 在高至饱和浓度低至完全无氧状态下，都有无色硫细菌生存。 江南大学硕士学位论文 表1 - 4 几种无色硫细菌的培养条件 t a b l e1 4c u l t u r ec o n d i t i o n so fc o l o r l e s ss u l f u rb a c t e r i a 无色硫细菌包括严格化能自养菌及化能异养菌，也有一些过渡类型，土壤与水中最 重要的化能自养无色硫细菌是多种硫杆菌( t h i o b a c i l l u s ) ，能够氧化硫化氢、元素硫、 硫化硫酸盐和四硫酸盐等，而形成硫酸，并从此过程中获得能量。 2 h 2 s + 0 2 _ 2 h 2 0 + 2 s + 能量 5 n a 2 s 2 0 3 + h 2 0 + 4 0 2 _ n a 2 s 0 4 + h 2 s 0 4 + 4 s + 能量 2 s + 3 0 2 + 2 h 2 0 _ 2 h 2 s 0 4 + 能量 c 0 2 + h 2 0 + 能量_ ( c h 2 0 ) + 0 2 常见的化能自养无色硫细菌有氧化硫硫杆菌( t h i o b a c i l l u s t h i o o x i d a n s ) 、排硫硫杆 菌( t h i o b a c i l l u s t h i o p a r u s ) 、氧化亚铁硫杆菌( t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ) 、以及脱氮硫 杆菌( t h i o b a c i l l u s d e n i t r i f i c a n s ) 。在硫杆菌中，无机硫化合物的氧化途径如下： h s 。一膜附着硫【s o 】_ s o 膜附着硫 s o 】_ s 0 3 2 - - - 8 0 4 2 硫化物氧化成硫酸分两步进行，第一步快，硫化物失去两个电子，膜附着聚合硫形 成；第二步慢，单质硫被进一步氧化为亚硫酸、硫酸。 多数无色硫细菌是好氧菌，以0 2 作为电子受体。研究还表明，即使是严格好氧的 无色硫细菌，也可在厌氧状态中存活或生长。 多数无色硫细菌以0 2 ( 或n 0 3 。) 作为电子受体，且体外排硫，所以氧化速率和能 力不像光合硫细菌那样受细胞生长的限制。k u e n e n 等人【1 6 】经研究发现，无色硫细菌在 营养物质受限制而有足够硫化物时，可在几乎无明显生长的情况下，高效地将硫化物甚 至胞外的单质硫氧化。与光合硫细菌每增长1g 细菌细胞能产生1 - 2g 单质硫相比，无 色硫细菌的氧化能力很高，每增长1g 细菌细胞至少可产生2 0g 单质硫。 6 第一章绪论 1 1 4 含硫化物废水生物处理技术研究进展 国内外利用硫化物氧化细菌发展生物强化处理多处于小试阶段。根据终产物不同， 废水中生物脱硫工艺可分为两类：一类将硫化物最终氧化为硫酸盐；另一类仅将硫化物 氧化为单质硫形式回收利用，不仅消除了污染，还可回收资源，因此越来越引起研究者 的关注。 荷兰自8 0 年代末开始对无色硫细菌氧化硫化物工艺及理论进行研究。荷兰d e l f t 大 学和w a g e n i n g n e 大学在这个领域已取得了不少成果。s t e f e s s 等【1 7 j 人的研究表明，硫杆 菌生成单质硫的能力相当可观，且溶解氧浓度和硫化物浓度是影响无色硫细菌终产物形 式的关键因素，当溶解氧浓度较低和硫化物负荷较高时，终产物以单质硫为主。 b u i s m a n 等用带有p l j r 泡沫橡胶填料的三种反应器( c s t r 、生物回转反应器、上 流式生物反应器) 分别加以研究。通过研究发现，最佳p h 值在8 0 8 5 ，最佳温度在 2 5 3 5 ，并指出影响硫化物氧化最终产物的因素主要有三个：硫化物与氧的比例、 硫化物浓度及硫化物的污泥负荷。 荷兰农业大学的l e t t i n g a 等【l8 】对这种生成的单质硫进行了研究，指出这种附着在细 胞外的硫颗粒，并不像“l a - m e r 那种合成的硫颗粒一样，而是在微小的硫颗粒外面包裹 着一层类似蛋白质的多聚物，这些长链的多聚物对硫颗粒的聚集沉淀有明显的负作用。 为了达到更好的絮凝分离，要保持反应器内高负荷与尽量小的剪切力，而且，溶液内盐 的浓度越高越有利于硫的聚集。因此最近几年来，许多学者开始研究有利于沉淀分离的 处理工艺与高效反应器的模式，a d e k e i z e 与l e t t i n g a 等【l9 】研究开发了一种新型的反应 器( 分离式膨胀床) ，这种新型的反应器，将好氧曝气与产硫阶段分开，避免了高速气 体对硫颗粒的冲刷，同时也避免了刚刚生成的单质硫被氧气再次氧化，在维持适当的运 行参数情况下，能够形成直径达到3m n l 的硫颗粒，沉淀速度大大加快。 国内学者目前对生物脱硫技术也进行了较为深入的研究。左剑恶t 2 0 进行无色硫细菌 氧化废水中硫化物的研究发现，在不同的硫化物负荷下，反应器内都存在一个最佳的溶 解氧值，此时反应器对硫化物的去除率较高，绝大部分s 2 。转化为s o ，基本不生成8 0 4 2 。 李亚新等【2 l 】采用接触氧化脱硫工艺，研究了利用c s b 将硫化物转化为单质硫的可行性 及条件；姚传忠等【2 2 j 根据生物强化的原理筛选出一株高效脱硫的排硫硫杆菌，并利用上 流式填料床反应进行了挂膜试验，研究了特性菌种的筛选以及溶解氧、进水浓度、水力 负荷和进水p h 值等因素对于废水中硫化物去除的影响规律；张克强，黄文星等【2 3 采用 接种排硫硫杆菌种的升流式生物填料塔法，重点研究了含硫化物废水处理过程中溶解氧 以及容积负荷与单质硫生成的关系。 7 江南人学硕士学位论文 1 2 本课题的研究目的和研究内容 1 2 1 课题来源 本论文系实验室自选课题，烟气生物脱硫研究的后一处理阶段，即硫化物生物氧化 为单质硫的研究。 1 2 2 主要研究目的 本课题的研究目的是利用从土壤中分离出的一株具有硫化物氧化能力的细菌，通过 摇瓶实验摸索出最佳脱硫条件后，接种到气升式反应器中，在最佳条件下对该菌种的脱 硫特性进行研究，探讨硫化物生物氧化为单质硫的机理，为硫化物生物氧化为单质硫及 整个烟气生物脱硫的工艺组合提供一定的理论基础。 1 。2 3 主要研究内容 1 ) 一株具有硫化物氧化能力细菌的分离和鉴定； 2 ) 通过摇瓶实验，确定该菌株的最佳脱硫条件； 3 ) 接种纯菌种到气升式反应器中，研究该菌种不同o r p 条件下生成的单质硫的特 性。 8 第_ 二章硫化物氧化细菌的分离、观察及分子生物学鉴定 第二章硫化物氧化细菌的分离、观察及分子生物学鉴定 2 1 前言 菌种是生物脱硫技术的关键，获得脱硫效率高、环境条件适应性强的优质菌株是开 发高效生物脱硫工艺的基础，但已报道的脱硫菌株效率不高。国内关于硫化物氧化细菌 的研究，大多停留在细菌外部形态，脱硫条件的摸索，并未对细菌在系统分类学方面进 行深入的探讨，与高效脱硫反应器的开发和实际工业应用还存在着较大的距离。本部分 实验主要涉及生物脱硫菌株的选育工作，对筛选出的菌株形态进行了分析，并结合分子 生物学对该菌株进行了鉴定，确定了该菌株的种属。 2 2 材料与方法 2 2 1 主要仪器 仪器厂家 s w - c j 1 f d 超净台 d e l t a 3 2 0p h 计 电子天平 电热恒温鼓风干燥箱 生化培养箱 气浴恒温振荡器 苏卅l 净化设备有限公司 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 上海跃进医疗器械厂 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 常州实验仪器有限公司 2 2 2 菌株的分离 2 2 2 1 土样来源 无锡市硫酸厂地面下深1 0c m 左右，p h3 - - 4 的土壤。 2 2 2 2 培养基配方 培养基配方见表2 1 。 9 江南大学硕士学位论文 表2 - 1 培养基配方 t a b l e2 - 1c o m p o s i t i o no fm e d i u m 2 2 2 3 固体培养基 固体培养基在表2 1 培养基中添加1 8 琼脂。 2 2 2 4 细菌的富集和分离步骤 l 、按配方配置所需的培养基溶液，调节p h 为中性，包扎后高压湿热灭菌。 2 、称取5 9 土样于2 5 0m l 三角瓶中，加入5 0m l 培养基，初始p h 调节至中性， 于3 0 、17 0r m i n 条件下在恒温摇床上培养。 3 、长时间培养，直至培养液p h 明显下降至3 0 左右，取5m l 菌液于装有5 0m l 培养基的2 5 0m l 三角瓶中，按照上述方法重新培养。 4 、反复培养四次后，取培养液lm l 放入大试管中，注入无菌水9m l ，放入振荡 器使其充分震荡，再取1m l 稀释1 0 倍，按照上述方法依次制成1 0 、l o 之、1 0 a 、l o 4 、 1 0 一、1 0 。6 不同稀释度的菌悬液。 5 、平板涂布：无菌条件下分别吸取1 0 、1 0 一、1 0 4 、l o 一、1 0 石中的菌悬液各0 2m l 放入平板中，涂布后3 0 c 条件下，放入生化培养箱中培养2 , - - 一4 天。 6 、经过约2 天生化培养箱培养后，平板上生长出不同大小的菌落，挑取生长较好 的单菌落在平板上反复划线培养，获得纯菌。 2 2 3 菌株的形态观察 2 2 3 1 单染色法鉴定菌种形态 单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。次法操作简便，适用于菌体 一般形状和细菌排列的观察。染色步骤简述如下： 1 、涂片挑取待测菌菌液，均匀涂于滴有生理盐水的载玻片上，形成均匀薄片。 2 、干燥室温下自然干燥。 3 、固定涂面向上通过火焰2 - - 3 次稳定细胞形态。 1 0 第_ 二章硫化物氧化细菌的分离、观察及分子生物学鉴定 4 、染色齐氏石炭酸复红或吕氏碱性美蓝染色剂染色约1 2m i n 。 5 、水洗小水柱冲洗直到涂片上流下的水无色。 6 、镜检涂片干燥后用显微镜观察细胞形态，物镜放大倍数从d , n 大，最后用油镜 观察，镜检完毕后用二甲苯擦拭镜头。 2 2 3 2 革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，简单操作步骤如下： 1 、涂片取待测菌种培养物常规涂片，自然干燥后固定。 2 、初染滴加结晶紫( 以刚好覆盖菌膜为宜) 染色1 2m i n 后，水洗。 3 、媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1m i n ，水洗。 4 、脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜衬以白色背景，用滴管流加9 5 的 乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 5 、复染用番红液复染约2m i n ，水洗。 6 、镜检干燥后用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性，被染成红色的是 革兰氏阴性，镜检完毕后用二甲苯擦拭镜头。 2 2 3 3 鞭毛染色法 鞭毛是细菌的运动器官，细菌是否具有鞭毛以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一 项重要形态特征。鞭毛染色的基本原理是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上， 使鞭毛的直径加粗，然后进行染色。操作步骤简述如下： 1 、菌种的准备：要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。 2 、载玻片的准备：将载玻片( 玻片要求光滑洁净) 在含适量洗涤剂的水中煮沸约 2 0m i n ，取出用清水充分洗净，沥干后放入9 5 的乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精 以及可能残留的油迹。 3 、菌液的制备：取平板菌种培养物数环于盛有2m l 无菌水的试管中，制成轻度浑 浊的菌悬液用于制片。( 注意挑菌时尽可能不带培养基) 4 、制片：用记号笔在载玻片反面将玻片划分为4 个等分区，在每一小区的一端放 一小滴菌液。将玻片倾斜，让菌液流到小区的另一端，用滤纸吸去多余的菌液，室温下 自然干燥。 5 、染色：加l e i f s o n 染色液覆盖第一区的涂面，隔数m i n 后加染色液于第二区涂 面，如此继续染第三、四区( 间隔时间进行染色是为了确定最佳染色时间) 。染色过程 中仔细观察，当整个玻片都出现铁锈色沉淀、染料表面出现金色膜时，直接用水轻轻冲 洗，染色时间大约1 0m i n ，自然干燥。 6 、镜检：干燥后油镜观察。 2 2 3 4 芽孢染色法 芽孢是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。以 往的研究中并没有提及s r b 在生长中是否形成芽孢，实验利用芽孢染色对s r b 进行检 江南大学硕士学位论文 验。简单操作步骤如下： 1 、制备菌悬液：加1 2 滴水于小试管中，用接种环挑取2 3 环菌苔于试管中， 搅拌均匀，制成浓的菌悬液。 2 、染色：加2 - 3 滴孔雀绿染液于小试管中，混合均匀后将试管置于沸水浴的烧杯 中，加热染色1 5 2 0m i n 。 3 、涂片固定：用接种环挑取试管底部菌液数坏于洁净载玻片上，涂成薄膜，然后 将图片通过火焰3 次温热固定。 4 、脱色：水洗直至流出的水无绿色 5 、复染：用番红染液染色2 - - - , 3m i n ，倾去染液并用滤纸吸干残液。 6 、镜检：干燥后用油镜观察。 2 2 3 5 细胞大小的测定 1 、装入目镜，先用低倍镜校正，使某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重 合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数。再用同样的方法高倍镜和油镜校正。 2 、根据下列公式即可计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。 目镜测微尺每格长度( 1 u n ) = 毒雾誉羹窦冀簧瓣 3 、菌体大小测定：通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出细菌直径或宽和长所 占目镜测微尺的格数。最后将所测得格数乘以目镜测微尺每格所代表的长度，即为该菌 的实际大小。 4 、取出目镜测微尺；擦洗目镜测微尺和镜台测微尺。 2 2 3 6 生理生化实验 考察了菌株t l 1 的葡萄糖代谢、蛋白质代谢、淀粉水解、v - p 实验、甲基红实验、 硫化氢生成、明胶液化实验、吲哚实验、碳源发酵、毒性耐受等生理生化实验，实验方 法参照【硎。 2 2 3 7 分子生物学鉴定 l 、待鉴定菌株染色体d n a 提取： 划取数环菌体于蒸馏水中，振荡后离心并重悬与2m lt e 溶液。加入1m l1 0m g m l 的溶菌酶液，轻柔混匀。加入3 0 0l x l l 0 s d s ，混匀。再加入2 0 此1 0m g m l 的蛋白酶 k ，6 5 c 反应3 h 。酚仿抽提直至界面无蛋白出现，再加入2 倍体积的无水酒精，用无菌 牙签挑出染色体，晾干后溶于蒸馏水。 2 、待鉴定菌株1 6 sr d n a 的扩增： 以提取出的染色体d n a 为模板，使用细菌1 6 sr d n a 通用引物( 上游：5 a g a g t t t g a t c c t g g c t c a g 一3 下游：5 a c g g c l a c c r r g t t a c g a c t t - 3 ) 进行 扩增。在o 2m lp c r 薄壁管中加入染色体d n a 0 5l x l ，1 0 x p c r 缓冲液5i x l ，2 5m o l l d n t p s4l x l ，1 0l a m o l l 的上下游引物各0 5l x l ，t a q 酶1p l ，补水至5 0 “l 。 p c r 反应条件为：9 5 预变性4m i n ；9 4 变性3 0s ，5 2 退火6 0 s ，7 2 延伸9 0s ， 1 2 第= 章硫化物氧化细菌的分离、观察及分子生物学鉴定 经过3 0 个循环后，7 2 再延伸1 0r a i n 。 电泳p c r 产物后发现在约1 5k b 处出现一条目的条带。p c r 产物纯化按o m e g a 纯化试剂盒说明书进行。 3 、1 6 sf d n a 序列的测定： p c r 产物的核苷酸序列测定按b i g d y et e r m i n a t o rv 3l 试剂盒说明书进行。待酒精 挥发完全后每管加入1 0 i | t l h i d i f o r m a m i d e 溶解d n a 。随后在p c r 仪上变性：9 5 c4 r a i n ，9 4 4m i n 。上机电泳。 4 、b l a s t 比对； 将测序结果用a p p l i e db i o s y s t e m s 公司的s e q u e n c es c a n n e rv 1 0 软件进行分析后， 提交到n c b i - b l a s t 上进行比对。 23 结果与讨论 2 31 菌株的形态观察 采集得到的土样经反复平板划线分离后得到一株具有硫化物氧化能力并以c 0 2 为 碳源的自养菌株，命名为t l - 1 。在固体培养基上划线，恒温3 0 培养两天后长出针尖 大小浅黄色菌落，四天后菌落生长至直径1r a m 左右的圆形淡黄色菌落，中间稍有隆起， 边缘整齐，不透明，质地松软表面光滑有光泽，长期培养后菌落色泽逐渐变暗，呈浅黄 褐色。 黑 圈2 - i 苗落形态 f i g2 - lc o l o n ym o r p h o l o g y 江南大学硕士学位论文 图2 - 3 鞭毛染色形态 f i g 2 - 3b a c t e r i a l f l a g e l l u ms t a i n p a t t e r n s 在1 0 0 0 倍光学显微镜下观察可知t l 1 菌体为短杆状，两端钝圆，长o5 10u m 。 细菌革兰氏染色呈阳性，不产生芽孢，单极生鞭毛，能运动。菌落和菌体形态与伯杰 氏细菌鉴定手册描述的硫杆菌属( t h i o b a c i l l u s ) 相似【”i ，与王玮筛选的一株自养型脱 氮硫杆菌( t h i o b a c i l l u s d e n i t r i f i c a n s ) 菌落、菌体形态近似j 。 2 32 生理生化实验 对菌株t l l 按照2 236 方法进行生理生化实验，结果如表2 - 2 所示。 磐_鎏 第一章硫化物氧化细菌的分离、脱察厦分子生物学箍定 表2 - 2 菌株t l 1 生理生化鉴定结果 t a b l e 2 - 2p h y s i o l o g i c mc h a r 北i e “鲥c s o f t h es t r a i n t l 233 菌株t l 一1d n a 的提取和p c r 扩增 按照22 36 方法提取t l 1 菌株d n a ，然后采用细菌1 6 sr d n a 通用引物对d n a 进行扩增。将p c r 扩增产物电泳。紫外灯下观察约是15k b 的d n a 条带出现，如图 2 - 4 所示。 12 图2 - 41 6 sr d n a 扩增产物电泳图 f i g2 - 4e l e c t r o p h o r e s i s o f t h e a m p l i f i