（果树学专业论文）柑橘转chit42和phyB基因的研究.pdf

摘要 柑橘是世界第一大水果，长期以来，常规育种手段受到珠心胚干扰、性器官 败育、育种周期长以及遗传上高度杂合等因素的影响，进程缓慢。近年来，不断 完善的转基因技术为我们提供了一条快速直接品种改良的途径。本研究以枳的实 生苗上躯轴为外植体，利用根癌农杆菌介导法转化p h y b 基因。成年态材料的转 化可以有效地解决遗传育种童期漫长的难题。本研究以c h i t 4 2 基因为目标基因， 以柑橘成年态节间茎段为外植体，研究了其再生和转化体系。主要研究结果如下： 1 优化了柑橘实生态上胚轴再生和转化体系，确定了m s 附加l i n g l 6 一b a 的培养基适合于枳壳的萌发；2 5 天茁龄的外植体转化再生频率最高；筛选抗性 芽的适宜卡那霉素浓度为7 5 m g l 。试验共得到了2 7 棵试管苗，经p c r 检测证 实，其中5 棵外源基因p h y b 和n p t 乃均有特异带扩增。 2 研究了成年态节间茎段的再生转化体系，以切割成l e n a 长的材料，经过 改良的消毒方法，灭菌效果最佳；以m s 附加3 m g l 的b a 作为纽荷尔和冰糖橙 不定芽的诱导培养基再生率最高：以m s 附加i m g l b a ，0 5 m g ln a a 作为桠 柑不定芽的诱导培养基再生率最高。初期选择培养以卡那霉素的选择压浓度为 3 0 m g l ，后期再转入卡那霉素5 0 m g l 的选择压下继续筛选。 3 通过茎尖嫁接来快速获得再生植株。纽荷尔、冰糖橙和碰柑均获得了转 化抗性芽，纽荷尔的抗性芽通过嫁接，得到了三棵试管苗，经过过p c r 检测证 实，其中一棵外源基因n p t 脯特异带扩增。 关键词：柑橘遗传转化实生苗上胚轴成年态节间茎段c h i t 4 2 基因p h y b 基因 a b s t r a c t c i t r u sr a n k st h en u m b c fo n ei nt h ew o r l df r u i tp r o d u c t i o n ，t h ec o n v e n t i o n a l b r e e d i n gp r o g r a m i nc i t r u sh a s l o n gb e e nh a m p e r e db ys u c hp r o b l e m s a s p o l y e m b r y o n y , a p o m i x i s , l o n gj u v e n i l i t y , h i g hh e t e r o z y g o s i t ya n da r t h e n o g e n e s i s f o r t u n a t e l y g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nt e c h n i q u ei sn o wp r o v i d i n gl l sa l l “n e w ，f a s t a n dd i r e c t ”s t r a t e g yt oc i t r u sg e n e t i ci m p r o v e m e n t i nt h i ss t u d y ，t h et r a n s f o r m a t i o no f p h y bg e n e i n t op t r i f o l i a t a e p i c o t y ls e g m e n t sm e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u mw a s c o n d u c t e d g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no fm a t u r et i s s u e sc a no v e r c o m e st h el o n gj u v e n i l e p e r i o d s i nt h i ss t u d y ，t h eg e n e c h i t 4 2w a si n t r o d u c e di n t oc i t r u s m a t u r ec i t r u ss t e i n s w 0 1 0u s e da se x p l a n t st or e s e a r c hi t sr e g e n e r a t i o na n da g r o b a c t e r i n m - m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o ns y s t e m t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ea g r o b a c t e r i n m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o no fe p i c o t y ls e g m e n t sw a s o p i t i m i z e d w ec o n f i r m e dt h a tm sm e d i u mc o n t a i n i n g1m g l6 - b aw a st h eb e s t c u l t u r em e d i u mf o rb u db u r s t i n g e x p l a n t sf r o m2 5 - d a y - o l ds e e d l i n g ss h o w e dh i g h e r t r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yt h a ny o u n g e ra n do l d e rp l a n tm a t e r i a l s t h es u i t a b l e c o n c e n t r a t i o no fk a n a m y c i nf o rs e l e c t i o nw a s7 5 m g l at o t a lo f2 7g r a f t i n gs h o o t w e r eg a i n e d p c ra n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h ep h y ba n dn p thg e n e sw e r ei n t e g r a t e d i n t op t r i f o l i a t a 2 r e g e n e r a t i o na n dt r a n s f o r m a t i o ns y s t e m sf r o mm a t u r ep l a n tm a t e r i a lw a s s t u d i e d t h er e s u rs h o w e dt h a tt h ec o n t a m i n a t i o nr a t eo ft h ep r e t r e a t m e n td i s i n f e c t i o n m e t h o dw a st h el o w e s ta n dt h ei n t e m o d es t e ms e g m e n t so fc i t r u sa b o u tl c ml o n gw a s b e s t ；t h eb e s tc u l t u r em e d i u mf o rn e w h a l ln a v e lo r a n g ea n db i n g t a n go r a n g e s a d v e n t i t i o u sb u d si n d u c t i o nw a sm s + b a3m e l ；m s + b a3r a g l + 0 5 m g ln a a i st h eb e s tc u l t u r em e d i u mf o rc i t r u sr e t i c u l a t eb l a n c u t h es u i t a b l ec o n c e n t r a t i o no f k a n a m y c i nf o rt h ei n i t i a ls t a g es e l e c t i o nw a s3 0 m g n 一 3 i nv i t r os h o o t - t i pg r a f t i n go ft h er e g e n e r a t e dm a t u r es h o o t so ns e e d l i n g r o o t s t o c k sp r o v i d e dar a p i da n de f f i c i e n ts y s t e mf o rp l a n tp r o d u c t i o n b i n g t a n gs w e e t o r a n g ea n dp o n k a no b t a i n e d r e s i s t a n ts h o o ta n dn e w h a l lo b t a i n e dg r a f t i n gs h o o t w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h en p t l ig e n ew a si n t e g r a t e di n t ob yp c ra n a l y s i s k e yw o r d s ：c i t r u s ；t r a n s f o r m a t i o n ；e p i c o t y l s ；m a t u r ei n t e r n o d a l s t e ms e g m e n t s ； c h i t 4 2g e u e ；p h y bg e n e ； b p b a s e p a i r c t a b c e t y l t r i m e t h y l a m o n i u mb r o m i d e 6 - b a n 6 一b e n z y la d e n i n e c e f k a n d e p c e 】d t a g u s g f p i a a n a a o d p c r t h s c e f o t a x i m e k a n a m y e i n d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e e t h y l e n e d i a m i n et c t r 蛆c e t i ca c i d i b - g l u e u r o n i d a s e l n d o l - 3 a c e t i ca c i d a - n a p h t h y la c e t i ca c i d o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 碱基对 十六烷基三甲基溴化胺 n 6 一苄基腺嘌呤 头孢霉素 卡那霉素 焦碳酸二乙脂 乙二胺四乙酸 1 3 葡萄醛酸糖苷酶 绿色荧光蛋自 吲哚乙酸 a 一萘乙酸 光密度 聚合酶链式反应 三羟甲基氨基甲烷 x - g l u c 5 b r o m o - 4 - c h l o r o 3 i n d o l y l b m u c u r o m d e 5 一溴4 氯一3 一吲哚一b - 葡萄糖苷酸酯 4 8 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究一：唿f 举 慨姗年0 4 月2 0 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 一躲五产求 帆舢年0 4 月2 0 日 导师签名：西孑r 勿- 乞r 时间：2 。0 7 年0 4 月2 0 日 第一章文献综述 l 柑橘新品种选育概况 柑橘( c i t r 瑚l ) 是全世界重要的经济作物之一。2 0 0 5 年，世界柑橘产量达 1 0 8 亿吨，居各种水果之首，柑橘及其产品的年贸易额近百亿美元，在国际农 产品贸易额中居第三位，仅次于小麦和玉米。我国是柑橘的重要起源中心，栽培 历史悠久，有文字记载的就有4 0 0 0 多年之久。近年来，我国柑橘业迅猛发展， 目前全国栽培面积超过1 6 0 万公顷，占世界柑橘总面积的2 3 ，居第一位。湖南 省是我国柑橘主要产区之一，全省现有柑橘面积3 9 0 万亩，居全国第一，产量 1 8 8 万吨，在全国排列前茅。柑橘产业已经成了我省及我国南方农村经济的支柱 产业，发展柑橘业对增加农民收入，改善人民生活水平和扩大对外贸易均有十分 重要的意义。 持续的品种改良是柑橘产业长期发展的根本，世界发达国家历来重视新品种 选育。自从上个世纪初开始，西班牙、日本、意大利等柑橘主产国均开展了系统 的品种改良计划，根据各自的特点形成了早、中、晚熟合理搭配，鲜食加工比例 合适的品种结构。并且根据市场需求的不断变化来选育新品种，以保持强劲的市 场竞争力，使柑橘产业得以稳健发展。 我国柑橘产业虽已有一定的基础，但与世界柑橘生产先进国家相比，差距还 很大，其根本原因是品种单一、老化；结构不合理、成熟期过于集中；病虫害危 害严重：优质高产的柑橘品种少，在国际柑橘贸易中一直是在低端市场上徘徊。 特别是加入w t o 后，面临国外鲜采和橙汁进口的巨大压力，能够抗衡进口产品 且具有我国特色的优良品种很少。 湖南做为我国的柑橘生产大省，有着丰富的野生资源和地方品种。但是到目 前为止，很多有价值的基因资源没能够得到很好的开发应用。湖南的柑橘产业也 同样面临着品种结构不合理的压力。目前全省正在投产的果园中有近8 0 的品种 都是几十年前的老品种，这些品种的选种、引种时间早，栽培时间长，普遍存在 品种退化、品质下降的现象。而且栽培品种单一，已成为柑橘产业的快速发展的 瓶颈，如中熟温州蜜柑占了整个柑橘产量的5 0 以上，已造成了强大的市场压力， 正在发展的脐橙也隐藏着新的品种单一问题，存在着潜在的市场压力，而目前可 以更新换代的品种很少。 因此，为应对国际水果市场的挑战，提高果品的竞争力，唯一的出路在于加 大品种改良。 长期以来，我国一直在开展柑橘新品种选育，但新育出的品种形成商品化栽 培的不多，目前主栽品种多是国外引进品种，品种的更新也主要依赖国外品种的 引进，使得更新速度较慢。因此加大育种研究力度，进一步调整优化我国柑橘品 种的结构，提高我国柑橘产业的国际竞争力已经成柑橘产业亟需解决的问题。 柑橘杂交育种受珠心胚干扰、性器官败育、童期长等因素的影响，进展较缓 慢，短期内难以满足整个产业和消费者对柑橘品种的需求；同时，柑橘在遗传上 高度杂合，因此，在育种实践中常常难以实现设计的育种目标。 随着基因工程研究的发展，转基因技术己被广泛应用于植物的遗传改良。与 传统育种方法相比，转基因育种不受基因型限制，目的基因来源广泛，可以定向 地改变目标性状。随着植物分子生物学和生物技术的快速发展，转基因技术也不 断改进，很多物种中得以应用。转基因育种为克服柑橘常规育种中难以避免的问 题，缩短育种周期，定向改良目标形状，提供了一条有效的途径。 2 柑橘转基因研究进展 果树转基因研究始于2 0 世纪8 0 年代，m c g r a n a h a n 等【1 1 于1 9 8 8 年获得转 基因核桃，是世界上果树转基因的首例报道。同其它作物相比，柑橘的遗传转化 研究起步较晚。直到1 9 8 9 年k o b a y a s h i 等【2 】才用p e g 法转化t r o v i t a 甜橙的胚性 愈伤组织，获得首例转基因柑橘抗性芽，但没有获得再生植株。柑橘首例转基因 植株诞生于1 9 9 0 年，v a r d i 等e 3 利用同样的方法转化粗柠檬原生质体，获得2 株 带有标记基因的再生植株。在此后的十几年间，柑橘遗传转化研究取得了长足的 发展。 2 1 遗传转化再生体系的研究 建立适于转化的高效再生体系是进行遗传转化的前提和基础。柑橘组织培 养已有3 0 多年的历史，再生系统较为成熟，但适于遗传转化的高效再生体系并 不完善。因此，近年来，高效再生体系的研究越来越得到重视【4 】。目前，柑橘受 体系统中，已报道转化成功的有上胚轴、子叶、珠心、胚性细胞、悬浮细胞、原 生质体、愈伤组织和节间茎段( 详见表1 2 ) 。 2 以原生质体为外植体，外源d n a 容易导入细胞，易于在相对均匀和稳定 的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定，克隆，可避免嵌合体的出现。有利于 简化后续筛选步骤圆。但所涉及的技术复杂，对操作技术要求高；原生质体比较 脆弱，在提高转化效率的实验设计时不得不考虑原生质体的活力和再生能力，而 且从原生质体到植株的再生流程长，培养所形成的无性系变异较强，遗传稳定性 差；很多材料会停留在愈伤组织阶段，植株再生频率低。 悬浮细胞来源于脱分化的愈伤组织，易接受外源d n a ，转化率高，多种外 植体均可经组织培养诱导产生愈伤组织，不受品种和季节限制；愈伤组织可继代 扩繁，转化愈伤组织可培养获得大量的转化植株。但它依然存在再生困难、嵌合 体及无性系变异问题。 用上胚轴、子叶、株心等作外植体，再生频率高，周期短，操作简便，成 本低。其中尤以利用实生苗上胚轴切段和节间茎段发生途径分化不定芽，体细胞 无性系变异小，简单易行，得到了普遍采用，柑橘中大部分的遗传转化都是采用 这种外植体。但是以上转化受体都是未经过童期的材料，所获碍的转基因植株还 需要经过一段漫长的时期才能对其进行结果特性和果实品质的鉴定，严重阻碍了 转基因品种的选育进程。况且对于目前普遍发展的无核品种，很难获得实生态受 体材料进行遗传转化。有些柑橘品种如多数柚类品种是单胚，由于亲本的商度遗 传杂合性，不管种子来自自交还是杂交，实生苗均会表现出基因型的分离，不能 与亲本保持遗传上的稳定性，使得转基因育种更为困难。 利用成年态材料作为遗传转化起始材料，可以避开童期问题，同时，选择 具有优良田间表现性状的植株茎段为外植体，可以不受品种限制，而且可以确保 后代的优良遗传性状，使柑橘转基因育种真正具有实用意义，因此受到了育种工 作者的欢迎。 但是，相对于实生态上胚轴和节间茎段，成年树枝条本身组织较难分化， 很难得到再生不定芽；而且田间材料在生长的过程中往往带有很多细菌和真菌， 以至消毒困难；再加上成年茎段对农杆菌的敏感性不如幼年材料，所以再生率和 转化率较低，转化成功的事例极少。c e r v e r a 等 6 1 用风梨甜橙成年树新抽出的枝 条做基因转化受体成功地将外源标记基因转入甜橙，且转化植株在1 4 个月后就 已开花结果。何永睿等p 】对成年态腋芽进行创伤处理，用根癌农杆菌感染后，将 3 抗菌肽基因转入脐橙中，得到了p c r 阳性芽，但没有进行转基因植株后续观测 试验以及嵌合体等问题报道。g e n t i l e 等嗍等用柠檬的成年树节闻茎段做转化受体 得到转c h i t 4 2 基因的柠檬植株，并表现出抗病性增强。w e l i t o n l 9 将g u s 基因转入 哈姆林甜橙成年态节间茎段和叶盘，结果表明成年态外植体器官发生能力因基因 型不同而存在较大差异，再生转化体系因品种而异。 2 2 转基因技术的研究 柑橘遗传转化技术通常采用d n a 直接导入法和农杆菌介导法。前者包括 p e g 法、电击法、显微注射法、基因枪法和花粉管通道法，而后者主要指的是 农杆菌介导法，考虑到操作的复杂性以及转化的工作效率，目前柑橘大部分转化 方法采用后者。 2 2 i 直接导入法 d n a 直接摄人法是将供体d n a 与外植体通过一定的化学处理或物理处理， 使d n a 进入植物细胞并得以表达，早期柑橘转基因研究大多采用这种方法。d n a 摄人法有多种方式，柑橘转基因中已运用过的方法有p e g 介导法【2 3 1 、电融合 【1 0 1 和基因枪法【l l l 。1 9 8 9 年，k o b a y a s h i 掣2 1 采用p e g 法，以t r o v i t a 甜橙为试材， 获得了转化的胚性愈伤组织，但并没有获得再生植株。1 9 9 0 年，v a r d i 等i j l 利用 p e g 法转化粗柠檬原生质体，获得2 株转基因植株。最近，f l e m i n g 掣1 2 j mp e g 法将绿色荧光蛋白基因导入甜橙，并获得了转化植株。p e g 介导法和电融合法 获得的转化子中嵌合现象少，易于筛选，但外植体一原生质体的培养周期长，再 生困难，转化频率较低，且容易产生体细胞变异，难以获得能稳定表达目标基因 的转基因植株。基因枪法获得的转化子拷贝数高，但遗传稳定性差，容易导致基 因沉默。直接导入法大多存在操作复杂、费用昂贵、转化工作效率较低等各种缺 点，在应用中受到限制。 2 2 2 农杆菌介导法 农杆菌介导法包括根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n a ) 介导法和发根农 杆菌( a g r o b a c t e r i u mr h l z o g i n e s ) 介导法，是通过农杆菌中的t i 或融质粒做为基因 转化载体，将外源基因导入植物细胞，切割整合到植物染色体上而完成转化。农 杆菌介导法转化机理清楚；相对于d n a 直接摄入法实验操作简单、成本低、转 4 化频率高、转化结果重复性好；外源基因一般以单拷贝或低拷贝插入、可导入较 大的外源基因片段、不易引起分子内或分子间重排；而且绝大多数柑橘品种都对 农杆菌比较敏感，所以利用这种方法转化受体不受材料限制。因此农杆菌介导法 在柑橘转基因中得到了广泛的应用，成为柑橘遗传转化的主要方法，转基因柑橘 植株几乎都是用这种方法得到的。b o n d 1 3 等比较了农杆菌不同菌株侵染华盛顿 脐橙的转化率，研究表明，c 5 8 的转化率最高，为2 9 ，其次是e h a l 0 5 ，为5 ， l b a 4 4 0 4 最低，为0 。由于农杆菌菌株的侵染能力在应用于不同类型的植株时存 在显著差异，因而不同的作物种类在实际的操作过程中其实存在着最合适或最为 敏感的农杆菌菌株【1 4 1 。对柑橘的载体系统而言，目前为止，以根癌农杆菌的 e h a l 0 5 和c 5 8 菌系对多数种类侵染性强，转化机率较高。 h i d a k a 等于1 9 9 0 年首次用农杆菌介导的转化法获得了一株华盛顿脐橙的 转基因植株【1 5 】。高峰1 6 1 等在国内首先利用根癌农杆菌感染桠柑、红橘的叶片和 胚轴，将激素合成酶基因和章鱼碱基因转入柑橘并得以表达。随后m o o r e 等【1 7 1 发展了一种更直接、简化的方法，采用农杆菌介导转化节间茎段，通过再生芽而 获得了转基因植株。 表1 1 柑橘主要转基因方法特点比较 三堂! ! ! ：! 里! ! 皇翌! 您2 1 曼竺塑! 塑! ! 垒罂业竺竺虫! 璺堡! 竺竺 评价条件 t h ee s t i m a t e c o n d i t i o n 基因转化方法 g e n e t i cw a n s f o r m a t i o nm e t h o do fc f 挑 农杆菌介导法p e g 法电融合法基因枪法 5 李卫等根据沙田柚一年四季不断抽芽的特性，用农杆菌感染附体的腋 芽，再离体扩繁鉴定的方法，成功地将g u s 基因转入沙田柚中，并认为这种方法 既不需要无菌操作，又免去了去除农杆菌的繁琐过程。且不需经过细胞或原生质 体再生途径，故可以克服柑橘漫长的童期，此外母体上腋芽生长远比外殖体再生 途径容易，所以转化效率高，因此是一种简单、快速、高效的转化新方法。 2 3 获得转基因的柑橘品种 到目前为止。利用不同方法在枳、甜橙、酸橙、柚、来檬、枳橙、橘柚、 葡萄柚、碰柑等多种柑橘中已获转基因苗( 详见表1 2 ) 。各种类之间，再生难 易程度不一，转化效果也参差不齐。其中，甜橙类的转化最为普遍，宽皮橘类品 种似乎转化难度最大，仅有一例桠柑的珠心例及胚性愈伤组织3 5 豫化成苗的报 道。利用实生幼苗节间茎段作为受体转化成功只有少数几个品种，主要有枳橙、 来檬、酸橙、柠檬等。成年态枝条节间茎段转化成功的则更少，目前只有甜橙【6 9 】和柠檬 8 1 。 2 4 已导入柑橘的外源基因 用于柑橘遗传转化的外源基因有两类，一类是标记基因和报告基因，另一 类是目的基因。 2 4 1 标记基园和报告基因 柑橘早期的遗传转化中，导入的外源基因多为筛选标记基因( n p t ) 或报 告基因( g u s ) 【2 3 1 1 7 1 。 对转化的材料进行筛选是获得转基因植株的一个关键步骤，通过选用选择 标记基因得到的转化体，会合成特定的代谢产物对选择剂产生抗性，从而使转化 细胞能正常生长、发育和分化而不受选择剂的影响，而未转化细胞的生长发育便 会受阻，甚至死亡。同其他植物一样，柑橘中常采用的标记基因主要有抗抗生素 类和抗除草剂类基因。抗抗生素类的选择标记基因主要有对卡那霉素、新霉素、 ( 3 4 1 8 等有抗性的新霉素磷酸转移酶基因( n p t i f ) ，对氯霉素有抗性的氯霉素乙 酰转移酶基因( c a t ) ，对链霉素有抗性的链霉素磷酸转移酶基因( s p t ) 等。卡 那霉素抗性基因是植物遗传转化中最常用的显性选择标记基因。抗除草剂类基因 主要有抗g l u f o s i n a t e 的b a r 和p a t 基因，抗f y p h o s a t e 的e p s p s 基因，抗磺酰类 除草剂的口厶基因，抗阿特拉津的p s b a 基因等。由于标记基因存在许多问题，如 6 对植物细胞的分化产生副作用，产物的安全性以及对环境的安全影响等，现在转 基因的研究重点将趋向于除目标基因以外不含其它成分的基因导入，降低转基因 的安全性风险。 表1 2 柑橘转基因植株一览表 t a b l e l 2 s u m m a r yo fs t u d i e sc o n d u c t e do n 廿a n s f o r m a t i o no fc t r u s 树种外植体转化方法 参考文献 璺墼! 嬖量翌! 型。! 堕! ! 墅型鲤墅堡! 鲤! 墨生壁翌鲤 枳p t r i f o l i a t e 上胚轴根癌农杆菌介导法 【1 9 、2 0 、 甜橙c s i n e n s i s悬浮细胞根癌农杆菌介导法 o s b e c k 胚性愈伤组织 原生质体 实生幼苗节间茎 段 上胚轴 子叶 成年态节问茎段 酸橙c a u r a n t i u ml实生幼苗节间茎 段 槿柑c r e t i c u l a t a珠心 b l a n c o 沙田柚cg r a n d i s 0 s b e c k 根癌农杆菌介导法 p e g 法 根癌农杆菌介导法 根癌农杆菌介导法 根癌农杆菌介导法 根癌农杆菌介导法 根癌农杆菌介导法 根癌农杆菌介导法 胚性愈伤组织根癌农杆菌介导法 上胚轴根癌农杆菌介导法 腋芽 来檬c a u r a n t i f o t i a实生幼苗节问茎 s w i n g 段 粗柠檬c j a m b h i r i 原生质体 枳橙c s i n e n s i s ( l )上胚轴 o s b c p t r i f o l i a t em ) r a f 橘柚c r e t i c u l a t a胚性细胞 b l a n c o xc p a r a d i s t m a c f 葡萄柚cp a r a d i s i上胚轴 m a c f 根癌农杆菌介导法 根癌农杆菌介导法 p e g 法 根癌农杼菌介导法 2 l 、2 2 、2 3 】 1 5 】 【2 4 、2 5 】 【2 6 】 【6 、2 7 2 8 、1 3 、 2 9 【2 8 】 f 6 、9 、3 0 3 1 、3 2 、 3 3 【3 4 】 【3 5 】 【2 8 】 【1 8 、3 6 】 【3 l 、3 2 、 3 7 】 【3 】 1 1 7 ，2 0 ， 3 1 、3 8 1 基因枪法【1 1 】 根癌农杆菌介导法 【3 9 、4 0 】 7 此外，利用非抗生素类筛选剂的转化也有成功的报道，如磷酸甘露糖异构 酶基因( p h o s p h o m a n n o s e i s o m e r a a e ，p m i ) f 剀和异戊烯基转移酶基因( i s o p e n t e n y l t r a n s f e r a s eg e n e ，i p t ) 1 4 ”，分别获得转基因植株。 尽管在筛选剂的选择压力下，可以在很大程度上将转化材料和未转化材料 区分出来，但仍然有部分逃逸体的存活。况且，筛选剂对外植体细胞有一定的毒 害作用，转化后得到的转基因植株因携带有抗生素抗性，存在生物安全的风险性， 妨碍了转基因产品的商品化生产。因此，很多转基因研究都转而选择用报告基因 来进行检测。报告基因的瞬间表达可以在短时问内研究外源基因的表达或基因转 化体系。一般报告基因要求有较低的活性，对植物代谢没有大的影响，检测简单、 易操作，并且敏感和直观。目前柑橘中转入的报告基因主要是b 一葡萄糖苷酸酶基 因( g u s ) 和绿色荧光蛋自基因( g 争) 1 1 2 蜘。g u s 基因是一种水解酶，能催化 许多b 一葡萄糖苷酯类物质的水解。由于绝大多数植物细胞、细菌及真菌均不存 在内源g u s 活性，因此，g u s 基因被广泛用作报告基因。葡糖苷酸酶催化一些荧 光和组织化学底物的水解反应，生成非常容易观察的兰色产物，便于检测。组织 化学染色法观察g u s 基因表达需要添加底物x - g l u c ( 5 一b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l 一1 5 - g l u c u r o n i d e ) ，该方法对细胞具有破坏性，经g u s 染色后的材料不能再接着培 养再生。绿色荧光蛋白是海洋生物水母体内的一种发光蛋白，经改造后其基因产 物在蓝光或紫外光下可激发出绿色荧光，可用于活体检测基因表达的研究。该基 因无物种特异性，适用于各种生物的转化，其表达也没有物种、细胞种类、位置 的限制；检测方法简便，无需底物，不需要辅助园子或其他蛋白质，不用做固定 处理，只需紫外光或蓝光照射，其表达产物就会发出绿色荧光可进行活细胞定时 定位观察；便于活体早期检测，及早抢救转基因组织，快速得到转基因植株；对 细胞无毒害作用，在细胞基因表达调控及蛋白定位研究中十分有效。 2 4 2 功能基因 柑橘中转入的功能基因主要是抗性基因，包括抗病虫基因和提高抗逆性的 基因。柑橘速衰病、溃疡病和黄龙病是柑橘生产的重要病害，在不同程度上危害 着柑橘产业的发展，培育抗病柑橘品种，对柑橘业的发展有很大的推动作用。根 据病原获得性抗性原理，g u t i e r r e z p l 】等首次将将柑橘衰退病毒的外壳蛋白基因 ( c t v - c p ) 转移入酸橙，随后d o m i n g u e z 等又将该基因导入墨西哥来檬，并获 8 得了转基因植株。y a n g 等 4 5 1 将c t v 株系s y 5 6 8 未翻译外壳蛋白基因( u n c p ) 和 g n a 基因转入r i or e d 葡萄柚。1 w a n a m i l 均等成功的将柑橘花叶病毒( c r a v ) 外壳 蛋白基因转入了积，转基因植株获得了相应的抗病毒能力。几丁质酶基因具有广 谱性的的抗真菌能力，g e n t i l e 等i s 报道将几丁质酶基因转入柠檬中可以提高其抗 真菌病害能力。 柞蚕抗菌肽基因具有广谱杀菌功能，对柑橘黄龙病病原菌及溃疡病病原菌 具有很强的抑菌效应。陈善春将柞蚕抗菌肽d 基因【捌转化锦橙、新会橙和沙田 柚获得了再生植株。郑启发等闲也成功地将该基因转入沙田柚。 提高柑橘的抗逆性一直是柑橘育种的一个重要目标，柑橘自身的抗逆性较 差，造成了栽培中的地域限制，并且由于各种逆境胁迫造成了巨大的产量损失。 目前，在抗逆基因的转化方面柑橘已经有了成功的先例，m o l i n a r i l “s l 等将p s c s 基因( ，1 - p y r r o l i n e - 5 一c a r b o x y l a t es y n t h e t a s em t l t a l l tg e n e ) 导入枳橙得到的转基因 植株在水分逆境下持续1 5 d ，会积累大量的脯氨酸，比对照表现出较高的渗透调 节能力及显著的光合效率。c e r v e r a l 4 刁等将j l n f 2 基因转入积橙以提高其耐盐性。 童期长是柑橘遗传育种效率低的最主要原因，有效地缩短童期，可以加速 柑橘的遗传改良进程。p e n a 等m 】报道将提早开花基因l e s f y 和a p e t a l a l 转入枳橙， 其转基因植株在移栽1 年内就可开花，且花正常可育，在随后的几年内连续开花 结果。e n d o 2 3 】等将f l o w e r i n gl o c u st ( f t ) 基因在柑橘中的同源基因c i f t 转入 枳和枳橙中，得到的转基因植株再3 个月左右就正常开花，1 0 个月左右正常结 果。 此外，到目前为止，报道过的转入柑橘的功能基因还有：几丁质酶基因【8 4 9 1 、 抗虫所基斟蚓、酵母h a l 2 基因【卿、人体表皮生长因子基因闭、发根农杆菌 r o l a b c 脚5 1 1 等近l o 个外源目的基因。但是，到目前为止还没有报道由转基因表 达而获得农艺性状改良的田间试验结果。 3 c h i t 4 2 基因及其在遗传转化中的应用 c h i t 4 2 基因是从哈茨木霉菌中分离出来的内切几丁质酶基因，几丁质酶 ( c h i t i n a s e 髓) 是一种以几丁质为底物的水解酶，而几丁质是除卵菌纲 ( o o m y c e t e s ) 外绝大多数病源真菌细胞壁的主要成分，但植物中还未发现几丁 9 质酶的底物 5 2 1 。所以，几丁质酶在防御病源真菌侵害中具有重要作用。病源真 菌细胞壁中几丁质的降解，不仅破坏细胞新生物质的沉积，造成病原体死亡，而 且产生的细胞壁碎片具有诱导物作用，从而刺激寄主植物产生抗病反应，因此将 几丁质酶转入到作物中表现出广谱的抗真菌特性。自1 9 9 1 年b r o g l i e 等田】首次报 道转几丁质酶基因的植物对真菌病害抗性提高以来，已有不少转几丁质酶基因植 物的报道嗍。在柑橘的遗传转化研究中，g e n t i l e 等 8 1 报道将几丁质酶基因转入柠 檬中可以提高其抗真菌病害能力。国内李耿光【4 9 】等人曾以上胚轴为外植体，通 过农杆菌介导法成功将几丁质酶基因转入枳橙。虽然几丁质酶基因在柑橘等木本 植物中的转化及抗病效果研究尚少，但是它的转化效果和抗病能力在其他植物中 的研究已有一定基础。如菜豆几丁质酶基因在转基因烟草植株中表达，表现出对 r h i z o c t o n i as o l a n i 的抗性【5 5 】；水稻几丁质酶基因转化玫瑰所获得转基因植株，可 以减轻黑斑病的发生i 5 6 ；t r i c h o d e r m a h a r a i a n m 几丁质酶基因转化苹果，增强了 对苹果疮痂病的抗性，但同时是转基因植株生长势减缓 5 7 1 。戴富明【5 明等通过根 癌农杆菌介导花期喷雾，将内切几丁质酶基因导入拟南芥哥伦比亚生态型的野生 型植株中，接种油菜菌核病菌( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) 后，t l 代植株对病菌 抗性显著提高，但当代植株表现出不育、矮化和生长发育正常等不同表型。 不同的几丁质酶有不同的抗菌谱，其机制有待进一步的研究。并不是所有 的转几丁质酶基因都能同时提高对多种病菌的抗性 5 9 删。一般说来转植物源几 丁质酶基因的植物对某些病原真菌的抗性增强，大多数转化植物的增强抗性与其 所表达的几丁质酶量呈正相关。但也有例外，如g a r c i a l 等m 】报道烟草表达 t h a r z u n u m 几丁质酶的量与植株的抗性不相关。微生物几丁质酶基因中尤以生防 菌转化植物为佳，有报道转t r t c h o d e r m a 几丁质酶基因的作物对很广范围的真菌 有增强抗性作用i 蛔。植物和细菌源的几丁质酶对昆虫的抗性不佳，但转昆虫源 和昆虫病原真菌源基因能增强对相应昆虫的抗性。 4 p h yb 基因及其在遗传转化中的应用 p h yb 基因是从拟南芥中分离出来的一类光敏色素基因，光敏色素 ( p h y t o c h r o m e ) 是一类红光远红光受体，它广泛存在于蓝细菌、低等植株和高 等植物体内。该分子是水溶性的色素蛋白同型二聚体，其单体由一个脱辅基蛋白 1 0 ( 1 2 0 _ 1 3 0 妨) n 端c y s 残基保守序列和个线性的四吡咯生色团p f b ( p h y t o c h r o m 搠n ) 在细胞质中共价结合而成。光敏色素b 为红光的主要受体，在抑制黄化幼苗或 其它细胞伸长生长、避阴反应以及根据日长控制开花时间等方面发挥着主要的作 用。 该基因参与对光合作用的调节，可使转化植物在不利生长条件下，仍能保 持较强的光合效率，保证植物的健壮生长 6 2 1 。d a v i d l 6 3 1 等通过从拟南芥不同光敏 色素基因缺失突变体的研究中发现，p h y b 是高光强红光反应的主要受体。p 缈b 基因能调控核基因和叶绿素基因的表达，调节植物的生长。利用p h y b 基因转化 柑橘以提高光合效能的研究报道极少，仅有一例利用农杆菌介导p h y b 基因转化 枳橙实生苗节间茎段的报道，国内尚未发现相关报道。d i s t e f a n o 6 4 1 等研究发现， 转化植株与未转化植株相比，生长速度快，但最终株高没有区别；叶片角度张大， 叶绿素含量增加；c 0 2 交换速率和量子产量增加；光合速率增加并认为p h y b 基 因的超表达加强了植株接受光和气体交换的能力，从而影响了转基因植株的生长 习性。此外，h o l e f o r s 6 5 1 等在利用p h y b 基因转化苹果砧木m 2 6 的研究中报道， 转化植株茎缩短，芽、根、植株等干重减轻。w a g n 水等将水稻的全长度p h y b 基因在拟南芥中超表达，所得的p f i y b 在光下稳定。这种基因的超标达会使转基 因的幼苗矮化。 5 本研究的目的和意义 根癌农杆菌介导的遗传转化技术作为一种改良植物性状的手段已经越来越 受到各国育种工作者的青睐。对于多年生木本植物柑橘来说，常规育种方法效率 较低，应用遗传转化技术来改良品种，是一种非常具有应用前景的途径。 枳( p t r i f o l i a m ( l ) r a f ) 是我国柑橘主导砧木之一，能增强接穗耐寒力及促 进矮化，早结丰产，提高品质及抵抗某些病虫害，但是枳光和效能低，属于需光 性强的植物。光敏色素基因参与对光合作用的调节，可使转化植物在不利生长条 件下，仍能保持较强的光合效率，保证植物的健壮生长。枳作为砧木，生产上通 常采用种子繁殖，不需要考虑其童期问题，因此，本研究将以枳实生态上胚轴为 外植体，通过农杆菌介导的方法将p h y b 基因转入枳壳，以期获得优良的砧木新 种质。目前国内还没有关于枳壳转p i v b 基因的研究报道。 良好的果树遗传转化体系是转基因工作的前提，一种再生转化体系的建立 往往能够促进转基因工作的突破性进展。在已报道的柑橘转基因研究中，9 0 以 上都是以实生苗上胚轴切段和节间茎段作外植体，成年态材料应用较少。进行成 年态外植体的遗传转化是解决柑橘遗传育种童期漫长难题的有效途径，使柑橘转 基因工作具有实际意义。国内开展的相关研究大部分以成年态腋芽进行创伤侵 染，这种方法虽然容易再生，但是容易得到较高比例的嵌合体转化材料，遗传性 状不稳定。用节间茎段作为转化的起始材料，通过诱导不定芽的生成，可以有效 的减少嵌合体的产生。但是成年态材料由于本身携带有较多的内生菌以至于消毒 困难，组培不易，所以转基因工作一直难以有效展开。本实验对成年态节间茎段 的灭菌和培养进行研究，以期初步建立成年态材料的再生体系，为以后的转基因 研究工作打下基础。 在柑橘生产中存在一个普遍的问题，就是真菌病害危害很广，几乎侵染所 有的栽培品种。病害种类主要有炭疽病、灰霉病、立枯病、疮痂病、脚腐病等， 而且直到目前为止，还没有发现一个抗真菌病害的柑橘品种。为防止病害每年都 要施用大量农药，不仅增加生产成本，更严重的是使得农药残留量增加，成为无 公害栽培的关键难题。因此，把抗病基因导入柑橘，获得广谱性抗真菌病害的优 质新品种是柑橘产业发展的需要。抗病基因的种类较多，其中较为重视并已广泛 应用是从木霉等微生物中鉴定分离出来的抗真菌病害的几丁质酶基因。 纽荷尔脐橙( cs i n e n s i so s b e s k “n e w h a l l ) 、冰糖橙、桠柑，冰糖橙( c s i n e n s i so s b e s k ) ，碰柑( cr e t i c u l a t eb l a n c o ) 是湖南省的优良栽培品种，综合农 艺性状优异但都不抗真菌病害，本实验拟将抗