（蔬菜学专业论文）玉米和芦笋中腐马素产毒菌株复合PCR检测方法及其毒力研究.pdf

摘要 摘要 腐马素是一组主要由串珠镰刀菌( f u s a r i u mv e r t i c i l l i o i d e s 或f u s a r i “，l m o n i l i f o r m e ) 和再育镰刀菌( f u s a r i u mp r o l i f e r a t u m ) 产生的真菌毒素。腐马素 对某些姓畜有急性毒性及潜在的致痉性，如引起马脑炎、猪肺水肿或大鼠肝癌， 还能引起人类食道癌和神经管缺陷，严重威胁食品安全及人类和动物的健康。 串珠镰刀菌和再育镰刀菌是世界范围内常见的作物和食品的污染菌，在玉米和 芦笋上也有着广泛的侵染。本研究建立了一种经济、快速、简便、准确的腐马 素产毒株的复合p c r 鉴定方法和快速测定玉米产品中b 族腐马素的h p l c e l s d 法，并分析了我国各地收集玉米样品上，浙江省内芦笋样品上腐马素产毒 株的侵染状况，对样品上分离菌株的腐马素产毒力也进行了测定。研究结果如 下： 以串珠镰刀菌野生型的聚酮化合物合成酶( p k s ) 基因r 强z ，丝氨酸一十六 酰基转移酶基因f m 招，长寿保证因子基因f u m l 7 核苷酸序列为基础，检索 g e n b a n k 数据库，采用d n a m a n 软件，分别设计了多对引物。以串珠镰刀菌野 生型菌株( a 0 1 4 9 ) ( f g s c 号7 6 0 0 ) 为阳性对照，以p k s 被敲除的串珠镰刀菌 野生型菌株和桔青霉等菌株为阴性对照。以特异性高的引物对f u m l 2 l f u m t 一2 r ，f u m 8 3 n ，凡m - 8 4 e ，f u m t 7 - p f 2 m 强1 7 - p r 2 与镰刀菌属特异的引物对 核糖体r d n a 及其内转录间隔区( i t s ) 序列引物i t s r i t s f ( b l u h me ta 1 ，2 0 0 2 ) 结合。建立了串珠镰刀菌腐马素产毒菌株复合p c r 检测方法，检出限为l n g 。 使用分别基于f u m i ，f u m 8 的引物r p 3 2 r p 3 3 ，r p 6 7 9 r p 6 8 0 ( p r o c t o r c ta 1 ，2 0 0 4 ) 及i t s r i t s f 引物，建立了腐马素产毒菌株的复合p c r 检测方法，检出限为1 0 0 p g 。 在4 4 份未加工玉米样品的2 1 份上分离菌株2 5 个，在1 6 个芦笋样品上分离 菌株1 6 个，对此4 1 个菌株用上述方法进行了分析，得到的2 5 个p c r 检测阳性 菌株( 玉米上1 5 株，芦笋上l o 株) 。经形态学鉴定及蛋白质翻译延伸因子( t e f ) 基因p c r 产物测序鉴定后，确定玉米上分离的菌株均为串珠镰刀菌，芦笋上分 离的菌株均为再育镰刀菌。 同时，建立了快速测定玉米培养物中b 系列腐马素的h p l c e l s d 法，无需 衍生，快速、准确地测定b 族腐马素含量和组成，检出限为6 n g 。具有较好的定 摘要 量灵敏度。并应用该法对玉米及芦笋样品上分离菌株的腐马素产毒能力进行了 测定。结果显示。所有样品上分离的产毒基因p c r 检测阳性镰刀菌菌株在玉米 培养基上均能产生f b i ( 1 2 5 - 4 0 3 2 1p g g ) ，芦笋上分离的再育镰刀菌中，除了一 个菌株为中等产毒菌株( 5 0l _ t g g 至5 0 0i _ t g g ) 外，其余全部为高产毒株( 2 5 0 0 r t g g ) 。不同菌株产毒能力差异也比较大，串珠镰刀菌不同菌株产生f b 。浓度范 围约为1 3 3 1 至4 0 3 2 1i _ t g g ，再育镰刀菌产生f b l 浓度范围为1 2 5 1 9 2 5 1 斗g 幢。另 外，六部分菌株还能产生f b 2 及f b 4 ，部分菌株能产生f b 3 ，且所有菌株产生f b 。 的量都高于f b 2 ，f b 3 及f b 4 的量。 关键词：玉米芦笋腐马素串珠镰刀菌再育镰刀菌复合p c r i l a b s t r a e t a b s t r a c t f u m o n i s i n sa r eag r o u po fm y c o t o x i n sm a i n l yp r o d u c e db yf u s a r i u mv e r t i c i - l l i o i d e s ( f o r m e r l yem o n i l i f o r m e ) a n df u s a r i u mp r o l i f e r a t u m f u m o n s i n sh a v eb e e n d e m o n s t r a t e dt oc a u s es e v e r a lf a t a ld i s e a s e si na n i m a l s ，s u c ha sl e u k o e n c e p h a l o m a l a - c i ai nh o r s e s ，p u l m o n a r yo e d e m aa n dh y d r o t h o r a xi n $ w a l l ea n dh e p a t i cc a n c e ri nr a t s i nh u m a n s , f u m o n i s i n sa r ea s s o c i a t e dw j t l lo e s o p h a g e a lc a n c a a n db i r t hn e u r a lt u b e d e f e c t s ev e r t i c i l l i o i d e sa n dfp r o l i f e r a t u ma r ef o u n dw o r l d w i d ea n dh a v eb e e n r e p o r t e di nm a i z e ，a s p a r a g u s ，a n dm a n yo t h e ra g r i c u l t u r ep r o d u c t s w eh a v ed e v e l o p e da ne c o n o m i c a l ，r a p i d ，s i m p l e ，a n dp r e c i s em u l t i p l e xp c r m e t h o df o ri d e n t i f y i n gf u m o n s i n p r o d u c i n gf u n g a ls t r a i n si nc , m na n da s p a r a g u s w e h a v ea l s od e v e l o p e dam e t h o df o rd i r e c tq u a n t i f i c a t i o no f b - s e r i e sf u m o n s i n s ( f b s ) i n c o r np r o d u c t s t h i sm e t h o di sb a s e do nh i g h - p e f f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y c o u p l e dw i t ha l le v a p o r a t i v el a s e rs c a t t e r i n gd e t e c t o r ( h p l c e l s d ) ，w h i c ha l l o w s d i r e c td e t e c t i n gt h en o n u v - a b s o r b i n gf u m o n i s i n sw i t h o u ta n yp r i o rd e r i v a t i z a t i o no f t h es a m p l e s t h em e t h o de n s u r e sa c c u r a t eq u a n t i f i c a t i o no ff b s 、i t l lal i m i to f6 n g l u l u s i n gt h em e t h o d s ，w eh a v es t u d i e dt h eo c c u r r e n c eo ff u m o n s i n p r o d u c i n g s t r a i n si nm a i z eg r a i ns a m p l e sf r o mh o u s e h o l da n ds u p e r m a r k e to fl i m i t e da r e a si n c h i n aa n di ne d i b l ea s p a r a g u sf r o mz h e j i a n gp r o v i n c e f u r t h e r m o r e ，t h ea b i l i t yo f t h e i s o l a t e ds r a i n st op r o d u c ef b so ns t e r i l em a i z eg r a i nh a sb e e nd e t e r m i n e d t h er e s u l t s o f t h es t u d i e sa r ea sf o l l o w s ： s e v e r a lp a i r so fp r i m e r st h a ta r es p e c i f i cf o rf u m o n s i n p r o d u c i n gs t r a i n sw e r e d e s i g n e d t h e s ep r i m e r s ，i n c l u d i n gf u m l - 2 l f u m i 一2 r , f m n 8 3 n f i n n - 8 4 e ，f u m l 7 p f 2 f a m l 7 p r 2 ，r p 3 2 叩3 3 ，a n dr p 6 7 9 r p 6 8 0 ( p r o c t o re ta 1 ，2 0 0 4 ) ，w e r eb a s e do nt h e p o l y k e f i d es y n t h a s e ( p k s ) g e n e ( f u m i ) ，s e r i n e - p a l m i t o y l t r a n s f e r a s eg e n e ( f u m 8 ) ， a n dl o n g e v i t ya s s u r a n c ef a c t o r ( a l s ok n o w na sc e m m i d es y n t h a s e ) g e n e ( f u m j7 ) t h a t a r ei n v o l v e di nf u m o m s i nb i o s y n t h e s i s i na d d i t i o n , f u s a r i u mg e n u s - s p e c i f i cp r i m e r s ， i t s r i t s f ( b t u h me ta 1 ，2 0 0 2 ) ，w e r ea l s op r e p a r e d w i t hb o t hf u m o n i s i n s p e c i f i c p r i m e r sa n dg e n u s s p e c i f i cp r i m e r s , m u l t i p l e xp c rw e r ec a r r i e d o u tt od e t e c t i i i a b s t r a c t f u m o n s i n - p r o d u c i n gs t r a i n sa n d f u s a r i u mv e r t i c l l i o i d e si nt h ef o o dp r o d u c t sc o l l e c t e d f r o mv a r i o u sa r e a si nc h i n a a sc o n t r o le x p e r i m e n t s , t h ew i l d - t y p ef u r n o n i s i n - p r o d u c i n gs t r a i na 0 1 4 9 ( f g s cn o 7 6 0 0 ) o fev e r t i c i l l i o i d e s , t h ep k s d e l e t e d n o n - f u m o n i s i n - p r o d u e i n gm u t a n t ，a n dp e n i c i l l i u r ac i t r i n u mw e r ei n c l u d e di nt h e m u l t i p l e xp c r t h ed e t e c t i o nl i m i t so ft h em u l t i p l e xp c rd e t e c t i n gf u m o n i s i n p r o d u c i n g f u s a r i u mv e r t i c i l l i o i d e s 、i t l l p r i m e r sf u m l 一2 r ，r u m 8 3 n r u m - 8 - 4 e ， f i m a l 7 p f 2 f u m l 7 - p r 2a n di t s r i t s fa n dt h em u l t i p l e xp c r d e t e c t i n gf u m o n i s i n - p r o d u c i n gs t r a i n sw i t hm i n e r sr p 3 2 r p 3 3 r p 6 7 9 r p 6 8 0a n di t s r i t s fw e r e1n ga n d 1 0 0p gt e m p l a t ed n a p e rp c ra s s a yr e s p e c t i v e l y a m o n g5 8c o i t is a m p l e s ，2 1s a m p l e sc o n t a i n e df u n g a ls t r a i n s ( t o t a l2 5i s o l a t e s ) ； f r o m1 6e d i b l ea s p a r a g u ss a m p l e s ，1 6i s o l a t e sw e r ei d e n t i f i e d t h e4 1i s o l a t e sw e r e a n a l y z e dw i t ht h em u l t i p l e xp c r , a n d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t2 5w e r ef u m o n i s i n p r o d u c i n gf u s a r i u ms t r a i n s ( 1 5f r o mc o i t ia n d1 0f r o ma s p a r a g u s ) t h ep o s i t i v e s t r a i n sw e r es u b j e c t e dt of l l r t h e rm o r p h o l o g i c a li d e n t i f i c a t i o n , a sw e l la sm o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o nb ya n a l y z i n gt h es e q u e n c eo fp c ra m p l i f i e dt r a n s l a t i o ne l o n g a t i o n f a c t o r - 1 a ( t e f ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta l lt h ei s o l a t e sf r o mc o ma r ee v e r t i c i l l i o i d - e sa n da l lt h ei s o l a t e sf r o ma s p a r a g u sw e r ee p r o l i f e r a t u m ， t h ea b i l i t yo ft h ep o s i t i v ei s o l a t e si d e n t i f i e db yp c rt op r o d u c ef u m o n i s i n sw a s e x a m i n e db yh p l c e l s d a l l2 5i s o l a t e sp r o d u c e df b i ( 1 2 5 - 4 0 3 2 1i l g ，g ) o n a u t o c l a v e dm a i z ek e r n e l s t h e10a s p a r a g u si s o l a t e sw e r ea l lh i g hp r o d u c e r ( 5 0 0 g g g ) e x c e p to n ei s o l a t ew i t ham o d e s ty i e l d ( 5 0i t g g - 5 0 0i t g ) t h ea b i l i t y t o p r o d u c ef b sd i f f e r e da m o n gd i f f e r e n ti s o l a t e s o ft h es a m es p e c i e s f o rt h ee v e r t i c i l l i o i d e si s o l a t e s ，t h ey i e l do f f b iv a r i e df r o m1 3 3 1t o4 0 3 2 1r t g g ，w h i l ef o re p r o l i f e r a t u m 。i s o l a t e st h ey i e l do ff b if r o m1 2 5t o 1 9 2 5 1p - g g m o s ti s o l a t e s a l s o p r o d u c e df b 2 a n df b 4 ，w h i l es o m ea l s op r o d u c e df b 3 i na l li s o l a t e s ，t h ey i e l do ff b l w a sa l w a y st h eh i g h e s ta m o n ga l lf u m o n i s i n s k e yw o r d s ：c o ma s p a r a g u sf u m o n i s i nf u s a r i u m v e r t i c i l l i o i d e s f u s a r i u mp r o l i f e r a t u mm u l t i p l e xp c r i v 英文缩略语 a a v l d t c c b e a b d c l a c t c z e d c e l i s a 方法 英文缩略语 a m e r i c a na s s o c i a t i o no f v e l e r i n a r yl a b o r a t o r yd i a g n o s i s a m e r i c a nt y p cc u l t u r ec o l l e c t i o n b e a u v e r i c i n b a s ep a i r c a r n a t i o nl e a f a g a r c h o l e r at o x i n c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s d i r e c tc o m p e t i t i v ei n h i b i t i o n 美国兽医实验室诊断协会 美国典型菌种保藏中心 白僵菌素 碱基对 石竹叶培养基 霍乱毒素 毛细管区带电泳 直接竞争性酶联免疫吸附测定 d dh 2 0 d i s t i l l e dh 2 0重蒸水 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 d n t p d e o x yn u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 脱氧三磷酸核营酸 e be t h i d u mb r o m i d e 澳化乙啶 e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a e e t i c a c i d 乙二胺四乙酸 e l i s a e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 酶联免疫吸附剂测定 e l s d e v a p o r a t i v el i g h t - s c a t t e r i n gd e t e c t o r 蒸发光散射器 f a 0f o o da n da g r i c u l t u r eo r g a n i z a t i o no f t h eu n i t e dn a t i o n s 联合国粮食及农业组织 f bf u m o n i s i nbs e r i e sb 系列腐马素 f cf u s a r i n c 镰刀菌素c f g s c f u n g a lg e n e t i cs t o r ec e n t e r 美国真菌遗传保存中心 f u p f u s a p r o l i f e r i n 镰孢增殖素 g c m s g a se h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y 气相色谱- 质谱联用分析仪 g y pg l u c o s ey e a s te x t r a c tp e p t o n e酵母培养基 h p l c h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 i a r ci n t e r n a t i o n a l ag e o c y of re s e a r c h c c c f国际癌症研究院 i g s i n t e r g e n i cs p a c e r 基因问隔区 i t si n t e m a l t r an s c r i b e d s pa r内转录同隔区 j e c f a t h ej o i mp 丸。嗣e x p e r tc o m m i t t e eo nf o o da d d i t i v e s f a o w h o 食品添加剂联合专 家委员会 m o n m o n i l i f c i r m i n o p a o p h t h a l d i a ld e h y d e 串珠镰刀苗素 苯二甲醛 英文缩略语 p c r p d a p k s p m t d i p s a r a p d t i ) n a r f l p r n a r n a s e s a x s n a s d s s p e t a e t e f t l c a d s u s d u s f d a w h 0 p o l y m e 艘c h a i nr e a c t i o n p o t a t od e x t r o s ea g a r p o l y k e t i d es y n t h a s e p r o v i s i o n a lm a x i m u mt o l e r a b l ed a i l yi m a k e p o t a t os u g f o a g a r r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a r i b o s o m ed n a r i s t r i c t i o n f ra g m e m l e ng t h p ol y m o r p h i s m r i b o n u c l e i ca c i d r i b o n u c l e i ca c i d a s e s t r o n ga n i o ne x c h a j l g e s p e c i a ln u t r i e n tp o o r - a g a r s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n t t i s - a c e t a l eb u f f e r t r a n s l a t i o ne l o n g a t i o nf a c t o r1 咀 t h i n - l a y e rl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t r i s ( h y d r o x y m e t h y ) x a m i n o m c t h a n e u n i t e ds t a t e sd e p a r t m e n to f a g r i c u l t u r e u s f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o n w o r l d h e a l t h - o r g a n i z a t i o n 聚合酶链式反应 马铃薯葡萄糖琼脂 聚酮化合物合成酶 最日最大耐受摄入量 马铃薯蔗糖琼脂 随机扩增多态性d n a 编码核糖体的基因 限制片段长度多态性 核糖核酸 核糖核酸酶 强阴离子交换柱 营养贫瘠培养基 十二烷基磺酸钠 固相摹取柱 t r is 醋酸盐缓冲液 翻译转录因子 薄层色谱法 三梭甲基氨基甲烷 美国农业部 美国食品药品管理局 世界卫生组织 前言 第一章前言 镰刀菌( f u s a r i u ms p p 属于真菌中的半知菌类，归属于丛梗孢目，瘤座孢 科，由于该属真菌的大型分生孢子多呈镰刀形状，故得名。镰刀菌是真菌中一 个庞大的家族，普遍存在于土壤及动植物有机体内，地域分布也极为广泛，是 一种世界性分布的真菌。其中的一些种、变种及生理专化型可引起许多重要作 物如玉米、高粱、水稻、小米、芦笋等的病害。另外，镰刀菌的某些种还可产 生许多次生代谢物，这些物质可以引起动物、植物明显的生理和植物病理方面 的反应。镰刀菌产生的化合物有真菌毒素、毒植物素、抗生素和色素等，对于 被侵染作物的生长和产品质量具有较大影响。 镰刀菌又分为许多组，李瑟组镰刀菌( f u s a r i u ms e c t i o nl i s e o l a ) 就是其中 很重要的一组。它对作物的侵染不仅造成作物产量的下降，还严重影响其产品 的质量，从而对人畜健康造成危害。李瑟组镰刀菌主要包括串珠镰刀菌( f u s a r i u m m o n i l i f o r m e 或f u s a r i u mv e r t i c i l l i o i d e s ) ，再育镰刀菌( f u s a r i u m p r o l i f e r a t u m ) 和 胶孢镰刀菌( f u s a r i u ms u b g l u t i n a n s ) 。其中串珠镰刀菌和再育镰刀菌是李瑟组中 主要的产毒菌种，它们的许多菌株在侵染作物的同时，还产生大量的真菌毒素， 如腐马素( f a m o n i s i n s ) ( l e s l i ee t a l ，1 9 9 2 ) 、串珠镰刀菌素( m o n i l i f o r m i n ，m o n ) ( l e s l i ee t a l ，1 9 9 2 ) 和白僵菌素( b e a u v e r i c i n ，b e a ) ( s h e p h a r de t a l ，1 9 9 2 ) 。 1 镰刀菌在作物上的侵染及产毒研究 1 1 串珠镰刀菌在作物上的侵染 串珠镰刀菌是李瑟组镰刀菌中最重要的两个种之一，由s a c c a r d o 和c u b o n 于1 8 8 1 年首次发现。串珠镰刀菌是一种世界性分布的真菌，常见于北温带地区。 它易产生于生长期、储存期的农作物及产品中，在美洲、欧洲、亚洲等温带区 域种植的谷物中被广泛发现。只在寒冷地带中极少发现，但k o m m e d a h l 与 s i g g e r i r s s o n ( 1 9 7 5 ) 在冰岛的草原植物根系和土壤中也分离到了串珠镰刀菌。 串珠镰刀菌是世界上许多重要经济作物的病原体，它主要污染玉米以及大 l 前言 米、小麦、水稻、高粱、芦笋等多种作物及其制品其中，玉米上串珠镰刀菌 的污染几乎占各类谷物污染的9 0 ，几乎在所有玉米产区( m a r a s a se ta 1 ，1 9 8 4 ) ， 所有种类的玉米籽粒上( m i l l e r , 2 0 0 1 ) 都发现了串珠镰刀菌的侵染。宰珠镰刀菌 在玉米中的生活周期分为腐生阶段和寄生阶段。在腐生阶段，串珠镰刀菌从死 亡组织( 如干燥组织) 中获取营养，形成感染性而感染玉米，引起植物病害。 在寄生阶段，串珠镰刀菌定位于细胞内，从活体组织中获取营养。通常情况下， 多数非专性病原菌先将宿主细胞杀死，从死亡组织中获取营养，然后感染其他 组织。串珠镰刀菌的寄生阶段并不导致玉米植物死亡，主要是引起秧苗枯萎、 茎腐烂、穗腐烂、根腐烂及种子腐烂( m i l l e r , 2 0 0 1 ) ，造成经济损失。 芦笋也是串珠镰刀菌主要的寄主，己有许多研究报导了串珠镰刀菌在世界 各地芦笋上的侵染( j o h n s t o r l , 1 9 7 9 ；d a m i c o n ea n dm a n n i n g ，1 9 8 5 ；e l m e r , 1 9 9 0 ) 串珠镰刀菌还侵染其他一些植物和非食用商品，如豆子，棉花，香蕉，烟草， 花生，山核桃。甜菜，绿胡椒，亚麻，大豆和藤( v e n k a t ae ta 1 ，1 9 5 1 ；j o f f e ，1 9 7 2 ； j o f f ee ta 1 ，1 9 7 3 ；w i n t e re ta 1 ，1 9 7 4 ；f l o o de ta 1 ，1 9 9 0 ；l e s l i ee ta 1 ，1 9 9 2 ；s u b b a r a o e ta 1 ，t 9 9 2 ；y a n ，1 9 9 3 ) 另外，在一些饲料和作为饲料的草料上也发现有这种真 菌，如杂色黍( p a n m u m c o l o r a t u r a ) ( e i k e r , 1 9 7 6 ) ，紫花苜蓿，红三叶( r e d c l o v e r c a r r o l l ) 和珍珠粟( p e a r lm i l l e e t ) ( m a t h u r , 1 9 7 3 ) 。 1 2 再育镰刀菌在作物上的侵染 再育镰刀菌是李瑟组镰刀菌中另外一个非常重要的菌种。因为直至1 9 7 6 年， 再育镰刀菌才从李瑟组镰刀菌中被区分开来( n i r e n b e r g ，1 9 7 6 ) ，所以有关再育 镰刀菌的地理分布、病原与植物的互作关系尚未形成完整、系统的研究结果。 但已有研究表明，再育镰刀菌和串珠镰刀菌具有很多相同的寄主，如玉米、小 麦、高粱、水稻和芦笋等( t h i e le ta 1 ，1 9 9 1 ；l e s l i ec ta 1 ，1 9 9 3 ；c h u l z ee ta 1 ，1 9 9 6 ； d e s j a r d i n se ta 1 1 9 9 7 ) 。随着菌种鉴定水平的提高和发展，以前许多被认为是串 珠镰刀菌的菌种，现在重新鉴定为再育镰刀菌( l a m o n d i aa n de l m e r , 1 9 8 9 ；e l m e r , 1 9 9 1 ) 。因此有关再育镰刀菌的地理分布、与植物的相互作用和生长条件等将随 着研究的深入而进一步褥到明确。 再育镰刀菌也是一种世界性分布的真菌，它能够频繁侵染玉米等许多禾谷 类作物。特别是热带或温热地区的温室中( m a r a s a s ，1 9 8 6 ；t h i e le ta 1 ，1 9 9 1 ； 2 m u n k v o l da n ds t a h r , 1 9 9 4 ；s h e p h a r de ta 1 。1 9 9 6 ) 此外，再育镰刀菌在世界各地 的芦笋上也有广泛的侵染，是引起芦笋根腐病和冠腐病的主要病原菌之一如 在德国、美国、秘鲁、南非、只本、墨西哥、法国、德国、西班牙等各国的芦 笋产区都有相关报导( c o h e nc ta 1 ，1 9 4 1 ：e l m e rc ta 1 ，1 9 9 0 ，1 9 9 1 ，1 9 9 6 ；l o g r i e e o c ta 1 ，1 9 9 8 ；g u e r r e r oe ta 1 ，1 9 9 9 ；s e e f e l d e re ta 1 ，2 0 0 2 ) 我国芦笋的种植区主要分 布在山东、江苏、浙江、山西、福建、河北等省。在我国，芦笋上的主要病原 菌有拟茎点霉属( p h o m aa s p a r a g i ) 、镰刀菌属( fo x y s p o r u m ，em o n i l i f o l - m e ，e p r o l i f e r a t u m ) 等，引起茎枯病，立枯病和根腐病( 何祖法等，2 0 0 0 ；丁志宽等， 2 0 0 1 ) 。再育镰刀菌对其他作物的侵染也会引起寄主组织的腐烂，如造成水稻地 下部分根的腐烂( d e s j a r d i n s e ta 1 ，1 9 9 7 ) ，苹果和梨的腐烂等等。， 1 3 串珠镰刀菌和再育镰刀菌的产毒性 镰刀菌自然产生的毒素包括单端孢霉烯族化合物、烟曲霉菌毒素、玉米赤 霉烯酮等，其产生的毒素危害为全球之最。其中，串珠镰刀菌在侵染植物时产 生的真菌毒素有腐马素b l 、b 2 、b 3 ( f b l 、f b 2 、f b 3 ) ( g e l d e r b o l r n , 1 9 8 8 ；l e s l i e ， 1 9 9 2 ；n e l s o n ，1 9 9 1 ，1 9 9 2 ) ，串珠镰刀菌素和镰刀菌素c ( f u s a r i nc ) 。再育镰刀 菌在作物上产生的真菌毒素有f b i 、f b 2 、f b 3 ( l e s l i e ，1 9 9 2 ；n e l s o n , 1 9 9 2 ； l o g r i e c o ，1 9 9 8 ) ，串珠镰刀菌素( m a r a s a s ，1 9 8 4 ；l e s l i e ，1 9 9 2 ) 自僵菌素( k g i e 圮o ， 1 9 9 5 ) 和镰孢增殖素( f u s a p r 0 1 i f e d n , f u p ) ( m u n k v o l d ，1 9 9 8 ) 。此外，这两种菌 种还能产生一些其他的次生代谢物如镰刀菌酸( f u s a r i ca c i d ) ( b a c o n ，1 9 9 6 ) ，镰 刀菌素( f u s a r i n s ) ( w i e b ea n db j e l d a n e s 。1 9 8 1 ) 这些真菌毒素在自然界中大部分 存在于玉米及其制品中，并对人和动物的健康造成不同程度的危害。 2 腐马素的研究 1 9 8 8 年，g e l d e r b l o m 等首次从串珠镰刀菌( m r c 8 2 6 ，a t c c5 2 5 3 9 ) 培养液 中分离出腐马素目前，对串珠镰刀菌及腐马素的研究已成为国际社会关注的 热点。现已鉴定到2 8 种腐马素类似物( h l y w k a a n d b u l l e r m a n ，1 9 9 9 ) ，它们被分 为4 组，即a 、b 、c 和p 组。其中，b 组腐马素是野生型菌株中产生量最为丰 富的一组。目前已发现的腐马素有f a 卜f a 2 、f b i 、f b 2 、f b 3 、f b 4 、f c l 、f c 2 、 3 f c 3 、f c 4 和f p i 共1 1 种，其中f b l 是其主要组分，占7 5 以上，而且毒性最强。 f b l 为水溶性真菌毒素，对热稳定，不易被蒸煮破坏，所以，它同黄曲霉素一样， 需在农作物生长、收获和储存过程中积极加以控制，防止霉菌污染。 b 组腐马素的化学结构是一个线型的2 0 个碳原子的主链，羟基、甲基和丙 三羧酸基等配基连接在主链的不同位置上。这些代谢产物的化学结构非常多变， 因为它们有l o 种以上的手性中心，能构成1 0 2 4 种不同的立体异构体。但是， 这1 0 2 4 种异构体中只有一种被真菌合成，表明了这一途径中的生物合成酶具有 极高的立体专一性。并且在碳主链的修饰过程中，只有2 0 个碳主链碳原子中的 c 5 ，c 1 0 ，c 1 4 和c 1 5 被特异性地氧化( 图1 1 中的f b l ) ，表明这些酶也具 有几何异构专一性。 f n 一| l 巩b ，b i 1 l 吼 0 1 4 h 0 1 4 h l 【r 2 o ho i lh “j 图1 1b 族腐马素的化学结构( 汪俏梅等。2 0 0 6 ) f i g 1 i s t r u c t r u e so f b - s e r i e s f u m o n i s i n s ( w a n g e ta l ，2 0 0 6 ) 2 1 腐马素的污染状况 腐马素产毒菌株是几种重要的农业真菌，其中包括串珠镰刀菌和再育镰刀 菌这两种世界范围内常见的作物和食品的污染菌( l e s l i ea n dp l a t t n e r , 1 9 9 2 ； n e l s o n , e ta 1 ，1 9 9 2 ) ，以及en y g a m a i 、芜菁状镰刀菌( fn a p i f o r m e ) 、花腐镰孢 菌( fa n t h o p h i l u m ) 、尖孢镰刀菌( fo x y s p o r u m ) 和fd l a m i n i ( m a r t i n ，2 0 0 1 ) 但是这些产生腐马素的真菌对食品和饲料的污染相对较少。目前，除了镰刀菌 属以外。交链孢属( a l t e r n a r i aa l t e r n a t a s p l y c o p e r s i c i ) 也是f b i 、f b 2 、f b 3 的重要产生菌。而另外一些镰刀菌，如fs u b g l u t i n a n a ，fa n n u l a t u m ，fs u e c 括a e 和fb e o m i f o r m e 则不产生腐马素( n e l s o ne ta 1 1 9 9 2 ) 。 4 研究表明，世界各地的玉米及其制品上广泛存在着腐马素污染，且大部分 为f b 。如意大利、法国、德国、南非，埃及、阿根廷，巴西，美国、加纳、加 拿大、日本、澳大利亚、韩国、中国、英国、匈牙乖j 等( d o k o 昏a 1 ，1 9 9 5 ；p a t e l ， 1 9 9 7 ；g r o v e se ta 1 ，1 9 9 9 ；h e f l d r i c k s , 1 9 9 9 ；m a c h i n s k i ，c ta 1 ，2 0 0 0 ；w h o ，2 0 0 0 ； p e t e r s e ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 另外，在大米、小麦、大麦、高梁、芦笋、啤酒、牛奶等 食品和饮料中也有一定浓度的腐马素存在( t o m e se ta 1 ，1 9 9 8 ；m a t i ne ta l ，1 9 9 9 ； j a s o ne ta 1 ，1 9 9 9 ；s e e f e l d e re ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 关于腐马素对粮食污染的状况，国内外学者研究最多的是玉米及其制品。c h u 和l i ( 1 9 9 4 ) 对河北磁县和河南林县农户收集的玉米样品进行研究，在所有发 霉玉米上都检测n - f 高水平的f b t ，浓度为1 8 至5 5g g g ( 平均值为7 4i j t g g ) ，在 外观正常的样品上检测到了相对较低水平的f b l ，浓度为2 0 至6 0p g ( 平均值为 3 5