（环境科学专业论文）海洋菌藻关系及对营养盐的吸收作用研究.pdf

藻的生长来促进微藻对营养盐的吸收，在藻生长前期对营养盐的吸收有较强的作 用，在稳定期后则对营养盐有一定的释放作用。 关键词：菌藻关系无机营养盐吸收相互作用影响因素 t h es t u d yo fa b s o r p t i o no fi n o r g a n i cn u t r i e n t si n f l u e n c e d b yt h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nm a r i n eb a c t e r i aa n dm i c r o a l g a e a b s t r a c t w i t ht h er a p i de c o n o m i cd e v e l o p m e n t sa n dt h ee x p a n d i n gp o p u l a t i o ni no m c o u n t r y ，w a t e rr e s o u r c ei si n f l u e n c e dd r a m a t i c a l l yb yt h es e w a g ei ni n d u s t r y ，l i v i n g ， a g r i c u l t u r e ，r e s u l t i n gi nt h ed e t e r i o r a t i o na n dd e c l i n ei nw a t e rq u a l i t ya n df u n c t i o n t h ee u t r o p h i c a t i o ni sb e c o m i n go n eo ft h em o s ta t t r a c t i v em a r i n ep r o b l e m s t h eb i o - r e m e d i a t i o no fa l g a ei np o l l u t e dw a t e ri sc a r r i e do u ta sah o tt e c h n o l o g y c a r i n gt h e e s p e c i a l l yi m p o r t a n tr e l a t i o n s h i pb e t w e e nb a c t e r i aa n da l g a e ，t h es t u d yo fa b s o r p t i o n i ni n o r g a n i cn u t r i e n t si n f l u e n c e db yt h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nm a r i n eb a c t e r i aa n d m i c r o a l g a ei sc a r r i e do u ti nt h i st h e s i s a x e n i cc u l t u r e so f6s p e c i e so fp l a n k t o n i cm i c r o a l g a e ，c h l o r e l l ae p ，l s o c h r y s i s g a l b a n aa n dp l a t y m o n a ss p a l eo b t a i n e db yt h et r e a t m e n to fp e n i c i l l i n ，g e n t a m i c i n ， k a n a m y c i n ，a n ds t r e p t o m y c i n t h e nt h ee n v i r o n m e n t a lb a c t e r i ai sn a t u r a l l ya e l e c t e d t h r o u g ht h em i x e dc u l t u r ew i t ht h em i c r o a l g u e ，t ol e a das y m b i o s i sb e t w e e n b a c t e r i a a n dm i c r o a l g a e , a n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fs y m b i o s i sa r ef o r m u l a t e db yt h ef i n g e r p r i n t o f d g g e s i xs t r a i n so fb a c t e r i ao fm i x e dc u l t u r em e d i u ma r ei s o l a t e d t h e nu s i n gt h e a x e n i cm i c r o a l g a ea sac o m p a r i s o n ，t h es t u d yo ft h ei n f l u e n c eo fm i c f o a l g a eg r o w t h m a d eb ys i n g l es t r a i ni sc a r r i e do u t r e s u l t ss h o wt h a to n eo ft h es i xs t r a i n sc a n a c c e l e r a t et h eg r o w t ho fc h l o r e t l aw h i l eo t h e r sh a v en os i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e a l s o ， t h em i x e db a c t e r i ao fs y m b i o s i si sa d d e di n t ot h em i c r o a l g ec u l t u r em e d i u mt of r e d o u tt h ei n f l u e n c eo nt h eg r o w t ho fm i c r o a l g a e ，a n df i n dt h a ti nt h ef 2c u l t u r em e d i u m ， t h eg r o w t hi sn o ti n f l u e n c e db ym i x e db a c t e r i ab u ti sa c c e l e r a t e di nt h ef 2c u l t u r e m e d i u ma d d e dw i t ha m m o m u m t h eb a l a n c eb e t w e e no fp h ，d i s s o l v e do x y g e na n d c o n c e n t r a t i o no fc 0 2a r ev e r yi m p o r t a n te n v i r o n m e n t a lf a c t o r sd u r i n gt h ei n t e r a c t i o n t h eb a c t e r i ad y n a m i cc h a n g e sa r eo b s e r v e dd u r i n gt h ec u l t u r e ，a n dt h ea m o u n to f b a c t e r i ai sf o u n dc h a n g i n gw i t ht h ep h y s i o l o g i c a ls i t u a t i o nm i c r o a l g a e d u r i n gt h e h i p e r i o do fp r o p h a s eo fe x p o n e n t i a lg r o w t h ，i tr e a c h e st h ef i s tp e a k ，t h e nd r o p ss t e e p l y , a n dr e s t a r t si n c r e a s i n gf r o mt h es t a b l ep e r i o d c u l t i v a t e di nt h ee x t r a e e l l u l a xm e d i u m ， t h eg r o w t ho fb a c t e r i ad i f f e r sb e t w e e ns i n g l es t r a i n sa n dm i x e dm e d i u m t h e e x t r a c e l l u l a lo r g a n i s ma n dt h ei n o r g a n i cn u t r i e n t sa l et h em a j o ri n f l u e n c i n gf a c t o r s c o m p a r e dw i t ht h ea x e n i cm i e r o a l g a e ，t h ea b s o r p t i o no fi n o r g a n i cn u t r i e n t si n m i x e dc u l t u r eo fb a c t e r i aa n dm i c r o a l g a ei so b s e r v e dd u r i n go n ec i r c l e r e s u l t ss h o w t h a tm i c r o a l g a et a k et h ea m m o n i u ma st h ep r i o rn i t r o g e n $ o u l e ea n db a c t e r i ac a n s p e e du pt h ea b s o r p t i o ni n t h ef 2m e d i u mw i t ht h ea d d i t i o no fa m m o n i u m c u l t i v a t i n gt h eb a c t e r i ai nt h ee x t r a c e u u l a lw a t e ri st a k e n t os t u d yt h ea b s o r p t i o no f i n o r g a n i cn u t r i e n t s r e s u l t ss h o wt h a tm i c r o a l g a et a k et h ea m m o n i u ma st h ep r i o r n i t r o g e ns o u r c ea n da m m o n i u mc a na c c e l e r a t et h ea b s o r p t i o no fp h o s p h o r g e n e r a l l y ，d u et ot h ea l g a ea n d t h ee n v i r o n m e n t ，t h ea b s o r p t i o no fi n o r g a n i c n u t r i e r l t si si n f l u e n c e db ya c c e l e r a t i n gt h eg r o w t ho fm i e r o a l g a e d u r i n gt h e p r o p h a s e ，t h eb a c t e r i ah a ss t r o n ga b s o r p t i o nw h i l et h ea n a p h a s e ，t h eb a c t e r i ar e l e a s e s s o m e w h a ti n o r g a n i cn u t r i e n t s k e y w o r d s ：t h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nb a c t e r i aa n dm i c r o a l g a e a b s o r p t i o no f i n o r g a n i cn f i t r l e n t s i n t e r a e t i o ni u f ! u e n e ef a c t o r s 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发表或撰写 过弱研究袋果，也不雹含来臻褥i 篷! 翅遗蠢基丝嚣噩篷黧壹强 鳆：壅拦堕童! 或其他教霄机构的学位或证书使用过的材料。与我同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了嘲确的说碉抨裘示谢意。 兰兰! 兰兰兰：邈! 堡竺! 竺! ! 竺! ! ! ! 学位论文版权使用授权攀 涔学位论文作者完全了解学校有关保留、捷尾学位论文豹魏定，毒投僳馨舞囊暖家有 关部门或机构送交论文的复印件和磁擞，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学 位论文的全帮或部分内容编入有关数描库进行检索，可以采用影印，缩印或扫描等复制手 段缳存、汇编学位论文。( 保密豹学位论文在解密詹适用本授权书) 学位论文作学毕业后去离；弋、真 、 主裟嘲摒通讯地址：l 导师签字：嗣下甏 签字日期0 卅磊石周，日 电话 郾编 蝌肌 箍 海洋茵- 藻关系及对营养盐的吸收作用研究 0 前言 随着我国现代经济的高速发展和人口剧增，工业废水、生活污水、农业用 水严重影响了我国的淡水和海水资源，致使水质恶化，水功能丧失。水体污染、 富营养化己成为我国最为关注的海洋环境问题之一。1 1 。 生物修复目前己成为一种新的可靠的环保技术，己由细菌修复拓展到真菌修 复、植物修复、动物修复，由有机污染物的生物修复衢展到无机污染物特别是无 机氮磷的生物修复，成为今后解决环境问题的重要研究方向“。 利用藻类进行富营养化水体的生物修复正在成为研究的热点，事实上，在菌 藻净化水质的体系中，同藻共生的细菌既有病原菌，又有益生菌，细菌在影响藻 的生长的同时，也影响着整个菌藻共生体系对无机营养盐吸收的效率。菌藻关系 的研究已经取得了一定的进展。1 ，不过主要集中在海洋赤潮的生消方面，而在净 化水质方面多集中于藻种的选取，关于菌藻关系对营养盐的吸收作用研究报道也 甚少，把二者结合起来研究有利于全面理解整个体系的结构和功能。本文就菌藻 关系及其对营养盐的吸收作用和影响因素作进一步的研究，为优化利用菌藻关系 修复富营养化水体提供参考。 海洋菌藻关系及对营养盐的吸收作用研究 1 文献综述 1 1 海水富营养化及其环境效应 水体富营养化是由于水体中氮、磷等营养物质大量积累而引起藻类过度增 殖，导致水质恶化，水体功能失调的现象。其本质问题是水生生物多样性的破坏， 由此造成系统丧失自我维持、自我调节的能力与系统平衡的稳定性，并最终导致 水生生态系统的破坏和环境问题的进一步加剧。 人类的活动严重影响着氮、磷的循环，当水体中氮、磷增多时，可导致藻类 等水生植物过量繁殖，造成水体富营养化，如湖泊“水华”和近海“赤潮”。我 国的水域环境富营养化近年来呈现出加速恶化的趋势”。 据统计，9 0 年代以来排入我国近海海域的污水量逐年增多，1 9 9 8 年沿海地 区企业排入近海海域的工业废水约3 9 8 亿吨。排放入海的各类污染物每年约 1 5 0 0 万吨，主要是化学物质、氨氮、油类物质和磷酸盐四类，富营养化加重， 导致赤潮频繁发生“1 。7 0 年代以前，我国近海海域赤潮发生的次数比较少，但是 从1 9 9 0 年到目前的1 0 年间，己累计发生赤潮2 0 0 余起，平均每年达2 0 起。1 9 9 7 年到1 9 9 9 年的三年间，共记录了较大规模的赤潮4 8 起，赤潮发生次数较多地区 为广州、山东、浙江、辽宁和上海近海。长江、珠海、辽东湾、杭州湾、莱洲湾、 大亚湾、汕头汕尾海域及天津近海海域等也是赤潮的多发地“1 。 徐宁，吕颂辉，段舜山等以国内外7 个典型海湾为例，分析了营养物质输入对 赤潮发生的影响，结果表明：陆源污染物排入及海水养殖业自身污染是近岸海域 营养物质输入的主要来源，水体富营养化的不断加剧是赤潮频发的重要原因，而 富营养化程度降低的海域发生赤潮的风险也会下降，营养盐比例的改变是浮游植 物种类的重要控制因子”1 。 从上面的资料可以看出，消除富营养化的关键在于减少营养物质向水体的输 入，利用水处理技术对生活，农业，工业污水进行治理，或是直接对受污染的水 体进行修复，从而达到消除富营养化的目的。 2 海洋菌藻关系及对营养盐的吸收作用研究 1 2 水体富营养化的生物修复及研究进展 对于污水的治理，常见的水处理技术主要是物理、化学方法以及生物法。 物理法是根据水的物理特性，通过机械、物理的方法除去水中悬浮物质或有害气 体，如沉淀、过滤、泡沫分离、吸附、换水、机械增氧等。化学法有氧化处理、 混凝和离子交换等方法，如传统的投撒石灰消毒，可起到杀菌、改良底质、提高 水体p h 值等f 1 ：用。生物处珲技术是利用生态系统中生物问互利、协作、萸生等 关系，通过培养或引进不同种生物直接或间接地调控水质。物理法和化学法虽然 处理效果比较显著，但是因为处理成本较高，而且存在不同程度的副作用，所以 不可能大规模的应用和推广抽生物法强调生态系统中分解者、生产者、消费者 之间的动态与合理的平衡，保持养殖水体水质的良性循环，被认为是经济可行、 副作用小的水处理方法，是水处理技术的发展方向盯】 根据净化生物的类别不同，生物法可分为微生物修复法和植物修复法，微 生物修复在环境污染治理方面研究的最多微生物净化水质的机理主要有三个 方面陬“；一是微生物的代谢具有氧化、氨化、硝化、反硝化、解磷、硫化及固 氮等作用，能将残余饵料，排泄废物、动植物残体以及有害气体( 如氨、硫化氢) 等分解为二氧化碳、硝酸盐、硫酸盐等；= 是为单细胞藻类的繁殖提供营养物质 促进藻类繁殖，这些藻类的光合作用又为养殖动物的呼吸、有机物的分解提供氧 气，从而形成一个良性的生态循环；三是有益微生物的大量繁殖，在水体内形成 优势种，可抑制病原微生物的繁殖，减少疾病发生。 植物修复是利用藻类、水生高等植物的吸收、吸附以及改善系统微环境的 功能来净化水体。其中藻类利用水体中c 如、营养盐以及太阳能进行光合作用， 释放出0 ：，从而减少水体中营养污染物，增加溶解氧。利用藻类净化水质在国内 外都作了大量的研究o 。 利用水生高等植物净化污水的研究已开展多年，国内外许多研究取得了很 好效果，结果表明水生高等植物对水体具有较好净化作用n 1 “城“1 。 不管是微生物修复还是藻类、水生植物修复，通常都不是孤立存在的，不同 的物种之间相互影响，协同作用，共同完成消除有机污染和富营养化的目标。利 用不同生物之间的关系，构建高效稳定的复合生态系统来进行水质治理成为研究 的热点和研究的方向。 晦洋菌藻关系及对营养盐的吸收作用研究 利用藻类处理污水的技术在许多年以前就被提出来了，把藻类应用于污水 处理己经有近5 0 年的历史。藻类在水体净化中起重要作用，因为藻类既可以利 用太阳能生成氧气，供微生物对营养物质的需氧降解，又可使产生富营养化的营 养物质转化成可能有价值的生物量。同时由于光合作用增加了p h 值，也可以对 污水起到消毒作用，减少大肠杆菌及有毒细菌数量，并且藻类还可以络合外源 物质，如重金属等，同时可以有效地富集和降解多种有机化合物，如碳氢化合物、 有机氯、农药、烷烃、偶氮染料、淀粉、酚类、邻苯二甲酸酯等有机污染物“”“。 在净化水质的过程中，藻类和细菌形成复杂的共生系统( 见图1 ) ，促进了水 质的净化：藻类光合作用释放出氧，增加了水中的溶解氧，促进了好氧菌的代谢 活动，好氧菌将含碳有机物降解为二氧化碳和水，对含氮有机物进行氨化，继而 进行硝化，生成氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐，将含磷有机物最后降解为正磷酸盐， 而细菌降解有机质产生的c 0 ：又成为藻类的主要碳源，促进了藻类的光合作用。 图l - 1 菌藻共生关系示意图”1 利用藻类净化水质，出水可以作为中水回用、农田灌溉的水源等，很好地 实现了污水的良性生态循环，同时可以回收藻类生物量作为动物饲料等，体现了 环境效益、经济效益与社会效益的协调统一。利用藻类净化水质的应用主要经历 了以下几个阶段，取得了如下的进展。 ( 1 ) 在污水处理方面的应用 生物稳定塘：藻类作为一种分布广，适应性强的自养生物，很早就被应用 于污水的处理。而真正利用光合作用产氧稳定有机物的工程是在污水稳定塘中才 得以真正实现。迄今为止，菌藻共生的生物稳定塘( w s p 。w a s t es t a b i l i z a t i o n 4 l 海洋鹾卜藻关系及对营养盐的吸收作用研究 i p o n d ) 在世界范围内已经得到了广泛应用“ 。 高效藻类塘( h r a p ，h i g hr a t ea l g a lp o n d s ) ：是近年来受到普遍关注的新 工艺。高效藻类塘不同于传统的稳定塘，主要表现在4 个方面：( 1 ) 较浅的塘深， 一般为0 3 - 0 6 m ：( 2 ) 有一个垂直于塘内廊道的、连续搅拌的装置：( 3 ) 较短的停 留时间，比一般的稳定塘短7 1 0 倍：( 4 ) 一般设有搅拌装置可以促进污水的完全 混合、调节塘内的氧和c o 。的浓度、均衡池内水温以及促进氨氮的吹脱作用。高 效藻类塘能够强化细菌和藻类之间的相互作用，具有比普通氧化塘更加丰富的生 物相，因此可以大大提高处理污水的有机负荷1 。 藻类固定化技术：对固定化藻类细胞的研究已经引起了人们广泛的兴趣， 而利用固定化藻类细胞进行污水处理的研究刚刚起步，目前研究较多的是对污水 中n ，p 的去除、对重金属的去除以及对污水中烃类化合物的去除等。藻类固定 化技术在污水处理方面的应用，使藻类反应器具有藻类密度高、反应速度快、耐 毒害能力强、运行稳定可靠、微藻细胞流失少、产物易分离、能纯化和保存高效、 藻种等优点，因此成为研究的热点”1 。 ( 2 ) 藻类在环境生物修复中的应用 利用藻类直接进行生物原位修复正在成为新的研究的热点，在海洋中利用 藻类进行生物修复主要在大型海藻的研究方面。 作为重要自然资源的大型海藻可食用，作为饲料，工业原料和有机肥料， 是具有较高价值的商品。当前，近海水域营养超负荷是世界上普遍存在的环境问 题。一些栽培的大型海藻，生产力很高，在生长过程中可大量吸收n 、p 营养物 质，是海洋环境中重要的生物过滤器。此外，大型海藻在碳循环研究、赤潮控制 和维持健康的复合养殖系统方面也有很重要的作用，是非常重要的生态环境材 料。为保障近海水安全和生态系统健康，大规模栽培大型海藻是重要的生态对策 【0 1 丑】 口 9 0 年代以来，欧盟启动了有关富营养化和大型海藻的e 眦研究计划，研究 水域跨越波罗的海到地中海的欧洲沿岸海区，以研究海藻在海区富营养化过程中 的响应和作用1 。t r o e l l 等矧通过在鱼类养殖区栽培江蓠，利用鱼类养殖过程 中产生的废物作为海藻生长的营养源，从而降低养殖水域中n 和p 的浓度，同时提 高了单位水体综合养殖的经济效益，江蓠与大麻哈鱼共养，可去除鱼类养殖过程 5 海洋菌- 藻关系及对营养盐的吸收作用研究 中排放到环境中可溶性铵的5 0 - 9 5 ，大型海藻是海洋环境中非常有效的生物过滤 器。韩国从2 0 0 2 年开始也启动了以大型海藻作为近海水域生物过滤器和生产力系 统的计划，以修复韩国近海由于鱼类养殖等人类活动所带来的富营养化问题 f 2 屯捌 。 黄道建蕾1 等研究了广东省珠海桂山岛附近海域网箱养殖区生长的细基江 蓠、石莼、海带、羽藻和草叶马尾藻j 种典型大型海藻在不同月份体内总氮，总 磷的含量，并分析了其对近海环境修复的意义，研究结果的分析表明，石莼、羽 藻体内t n 、t p 含量较高，可作为近海富营养化水环境修复的优选海藻。 事实上，在利用藻类进行环境生物修复的过程中，藻微生物的生存提供了 良好的生存环境，这些微生物通过对氮、磷、硫和有机物等的代谢与水生植物发 生直接或间接的相互作用。1 ，从而共同完成对水质的净化，因而结合藻类和微生 物共同净化水质成为研究的方向。吴永红等将一种由改性高分子材料制成的人 工水草作藻一菌生物膜的载体，来改善富营养化水体水质，发现人工水草藻一菌生 物膜技术处理的水质明显比没有处理的水质要好，透明度提高幅度大，叶绿素浓 度急剧下降，c o d 明显降低，t n 、t p 和氨氮都有一定程度下降，d o 也能维持在 合适范围。 ( 3 ) 环境因子对藻类生物修复的影响 利用菌藻系统进行生物修复与许多环境因子密切相关，如温度、p h 、可溶性 氧、氧化还原电位和营养状况等，选择最佳的环境条件将有助于提高生物修复的 效率。 吴永红1 发现在高温季节经过人工水草藻一菌生物膜技术处理的水质明显 比没有处理的水质要好，而在低温季节，处理组与对照组中的比较，除了透明度之 间的差异很大外，其它指标差异并不明显，说明温度对藻一菌生物膜技术的影响很 大。 强酸、强碱会抑制大多数微生物的活性，藻类生长最适宜的p h 值范围是4 - 9 。 s o f i a c ”研究单种藻s e l e n a t r u 皿去除氮磷时发现，当p h 由7 变化到4 时将对 藻细胞的活性产生很明显的影响，平均单个细胞对氮磷的去除在p h = 4 时比p h = 7 时要少的多，也即酸性的环境使细胞对氮磷的吸收受到影响。 同时营养结构的改变也会显著的影响生物修复的效果的提高。氮磷是藻类 6 海洋菇卜藻关系及对营养盐的吸收作用研究 生长不可或缺的营养元素，氮磷营养盐是影响开放体系内藻类生长的主要因素。 藻类可以吸收不同形态的营养盐，而营养盐的改变又会影响藻类群落结构组成， 不仅表现为影响藻类生长及繁殖的快慢，还表现在影响藻类细胞光合作用和生化 组成的差别恤3 。余若黔等1 的研究表明，低氮异养小球藻在经过一定时间的适应 后可快速去除味精废水中的n i l + - n ，单位藻体去除n i l , - n 比例为4 7 5m g g ， 小球藻去除的n i l _ n 全部转化为蛋白质、叶绿素等细胞含氮物质。 同藻共生细菌也由于其具有二物量大，比表面积大，对营养物质的亲和性 高及拥有多种运输系统等特点，在利用溶解有机物的同时，同时可改变无机营养 盐的含量和结构m 1 。邹迪”以铜绿微囊藻及其附生假单胞菌为研究对象，研究了 不同氮磷比对铜绿微囊藻和假单胞菌之间磷代谢的影响。结果发现，无论有无附 生菌存在，铜绿微囊藻在氮磷比为1 6 ：l 时，生长情况最好，此时微囊藻能迅速 有效地吸收水中的磷，而且附生菌的存在能促进藻的生长，而在氮磷比为4 ：1 时， 藻的生长情况最差，在实验后期，藻细胞死亡分解后把一些含磷化合物释放到了 水中，附生菌的存在能够加速藻细胞的衰亡和藻体内磷的释放。 因此根据生物的需要，合理地改善环境因子，使生物的代谢处于最佳状态， 以期更好地发挥生物修复的功能是关键。 总之，与其它生物技术相比，藻类技术是利用太阳能的生物过程，具有以 下优点：符合自然生态原则、具有环境合理性，生物量收获不会引起二次污染； 可以导致有效的营养物质的良胜循环。然而，这种技术的推广一直受到限制，主 要是因为它同样存在着一些弊端：需要较大的占地面积，有光照，温暖的气候条 件；生物量收获困难：藻类世代时间长，不同藻类的世代时间从几小时到几天不 等渊。 1 3 菌藻关系及在富营养化水体净化中的作用 综上所述，在利用藻进化水质的过程中，实际上是细菌和藻的共同作用， 因此对菌藻关系对于我们深刻了解整个系统的运行有着重要的意义。 藻细胞在新陈代谢过程中会向周围环境释放许多有机物质，如脂、肽、碳 水化合物、有机磷酸盐、维生素和毒素，以及生长抑制和促进因子等“”。这些 有机物质，可以被周围细菌有效地摄取利用，一部分同化成为数量巨大、营养丰 7 海洋菌藻关秉及对营养盐的吸收作用研究 富的颗粒有机碳( p o c ，即细菌本身) ，另一部分经细菌代谢后又以矿物或其他形 式释放回水体中，为藻类生长提供营养盐及必需的生长因子，调节着藻类的生长 环境。目前，人们对菌一藻间相互关系的认识正在逐渐深入。 一方面，作为重要的分解者，细菌以多样化的代谢活动参与水体物质转化 和分解过程，是生物地球化学循环的一个重要环节。氨化细菌能够将含氮有机物 质分解为n i l , - n ，再进一步通过细菌的硝化作用把n l + - n 转化成n 昕- n ，为藻 类提供无机氮；细菌还可以将三价铁还原为溶解度较高的二价铁，为藻类提供生 长所需的铁元素：有些细菌具有高水平的5 一核苷酶，它们可以迅速地水解a ? p 类的5 - 核苷酸，还原产生无机磷供给藻类；某些细菌因能产生特定的有机物质， 如胞内磷脂或胞外糖肽，可以促进微藻的生长懦1 ；海洋中存在着大量的维生素( 如 b ，。) 产生菌，它们对海洋藻类的生长也是非常重要的。另外，过量的溶解氧会抑 制藻细胞的光合作用，使其转向光呼吸，从而阻碍藻的生长，细菌对藻细胞周围 环境中高浓度溶解氧的利用，也为藻的生长提供了一个还原性较强的生长环境 【3 3 6 抽】 o 另一方面，细菌也可以通过直接或间接方式的抑制藻类生长，或杀死藻细 胞，从而导致藻细胞裂解，此类细菌可统称为溶藻细菌。i m a i 等”发现一株可 滑行的噬胞菌具有广谱的杀藻功能，它可以裂解硅藻、甲藻以及针胞藻等多种藻 细胞。在作用过程中，这株细菌的数量可以在2 4 小时内升至lx1 0 6 c e l l m l ， 而藻细胞则在2 4 天内被杀光。这种细菌可以在营养贫乏的培养基，甚至海水 中生长，因此，很可能在赤潮的动态变化中起重要作用。细菌溶藻可采用多种机 制。上述的噬胞菌须直接接触藻细胞来行使杀藻功能，而另一些属于y - p r o t e o b a c t e r y a 的则产生杀藻物质。l e e 等。和报道他们分离获得了两株假 交替单胞茵a 2 8 和a 2 5 ，其培养液能有效地杀死中肋骨条藻，研究发现它们所分 泌溶藻活性物质为蛋白类。 除了前面所述的细菌对藻生长有利和有弊方面，同藻共生的细菌具有结构 上的稳定性，和功能上的独特性，这种生态上的关系在利用藻类净化水质中具有 重要的意义3 ，因此，通过研究弄清微藻及其共栖细菌菌群组成和功能的特异性， 掌握藻、菌间相互依存条件和相互作用特点，就可以为今后应用人工控制技术， 强化相关细菌的净化水质功能，改进优化菌藻共生系统，增强其调控水质的功效， 海洋菌藻关系及对营养盐的吸收作用研究 从而为消除有机污染和富营养化，为经济的健康可持续发展作出贡献“一。 k e i j iw a t a n a b e m l 等研究发现，细菌在藻液中可以直接附生在微藻的细胞 表面或是藻分泌形成的鞘上，并研究了细菌，真菌和小球藻之间的相互作用，见 图1 2 。 图1 2o b s e r v a t i o no fs y m b i o t i cc o n f o r m a t i o nb ys 酬“” 林伟。分析了海洋浮游性微藻共栖异养细菌群落的组成特点。结果表明，与 藻共栖异养细菌群落主要由假单胞菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属的细菌组成，经 底栖微藻自主选择后形成的与藻共栖细菌群落主要由假单胞菌属、黄杆菌属和产 碱菌属组成，与4 种自然未除菌的浮游性海洋微藻共栖异养细菌群落的组成特点 基本一致，发现了实验所用的海洋微藻同不具有葡萄糖发酵能力的细菌间具有亲 和性的现象。同时，海洋微藻一共栖细菌系统海洋与弧菌间亲和性很差，与藻共 栖的细菌群落因优先占有生态空间从而使系统对弧菌菌群具有排它性。，从而抵 御病弧菌对海洋微藻的侵袭。 郑耀通1 等在室内模拟的条件下，研究了一些生态因子对由螺旋藻、小球藻、 硝化细菌和光合细菌组成的菌藻系统代谢有机碳、氨态氮的影响。试验结果显示： 4 种微生物的最初数量比影响其代谢功能，当螺旋藻：小球藻：硝化细菌：光合细菌 比例为l ：2 1 1 ：3 4 2 ：4 7 1 时，组成的混合微生物系统具有最高的氢态氮 去除能力。在光照与黑暗两种环境条件下，混合菌藻系统代谢有机质、氨态氮的 速率有一定的差异，光照环境利于氨态氮的去除而黑暗条件则利于有机质的降 解。 9 海洋菌藻关系及对营养盐的吸收作用研究 邹迪“3 实验研究了磷酸二氢钠、p 一甘油磷酸钠、磷酸钙和卵磷脂4 种不同形 态的磷源对铜绿微囊藻的生长代谢及其与附生假单胞菌磷代谢关系的影响，测定 了微囊藻的生长，水中磷浓度的变化，碱性磷酸酶活性和微囊藻中总磷含量的变 化。结果表明，附生假单胞菌的存在能促进铜绿微囊藻的生长，并可以将微囊藻 不易直接吸收的磷形态转化为磷酸盐等物质供微囊藻利用，碱性磷酸酶在微囊藻 和附生菌利用大分子有机磷的过程中起重要作用。 1 4 本文的研究内容 1 4 1 研究意义 随着我国现代经济的高速发展和人口剧增，工业废水、生活污水、农业用 水严重影响了我国的淡水和海水资源，致使水质恶化，水功能丧失。水体污染， 富营养化己成为我国最为关注的海洋环境问题之一“”。 生物修复目前已成为一种新的可靠的环保技术，已由细菌修复拓展到真菌 修复、植物修复、动物修复，由有机污染物的生物修复拓展到无机污染物特别是 无机氮磷的生物修复，成为今后解决环境问题的重要研究方向。1 。 利用藻类净化水质，经历了稳定塘，高效藻塘，水力藻床( 事实上也是一 种固定化生物技术，包括生物膜的形成) ，再到固定化技术，主要应用于城市的 污水的深度处理，取得了很好的效果，在滨海湿地中，特别是养殖环境中，存在 着大量的藻类和微生物，这为我们利用藻类净化水质提供了很好的条件，关于利 用藻类和细菌进行富营养化水体的生物修复已经有所报道”“。 人们在利用藻类去除氮磷的研究中，主要集中于藻种的筛选及其去除效果 的比较上1 。一般认为，藻类主要吸收无机氮磷，光合作用释放氧气供好氧微生 物进行代谢活动，消除有机污染，同时又产生营养盐供藻类进行光合作用，协同 作用，从而消除有机污染和富营养化。在藻类净化水体体系中，同藻共生的细菌 既有病原菌，又有益生菌，细菌在影响藻的生长的同时，也影响着整个菌藻共生 体系对无机营养盐吸收，菌藻关系的研究已经取得了一定的进展”1 ，但是在水质 净化体系中，关于菌藻关系对整个体系无机营养盐的吸收的影响报道甚少汹，本 文旨在探索研究藻类和细菌相互作用及其对无机营养盐吸收的影响，为优化菌藻 i o 海洋菌藻关系及对营养盐的吸收作用研究 共生体系消除富营养化提供基础。 1 4 2 研究内容 研究菌藻共生体系中细菌对海洋微藻生长的影响，海洋微藻对细菌的 影响，充分了解菌藻相互作用和影响的规律，为构建稳定高效的菌藻 修复系统提供参考。 彬f 究菌藻芡生体系中细菌对悭个体系无饥营养盐吸收的影响和员献， 充分了解无机营养盐吸收的舰律，以提高整个体系无机营养款的吸收 效率。 研究菌藻共生体系中重要环境因子对无机营养盐吸收的影响，以调控 生物修复的环境因子，提高生物修复效率。 ) ) ) n 旺 海洋菌一藻关系及肘营养盐的吸收作用研究 2 材料和方法 2 1 实验材料 ( 1 ) 藻种和培养基 实验用小球藻c h l o r e l l as p 、i s o c h r y s i sg a l b a n ap l a t y m o n a ss p 、等鞭金藻 l s o c h r y s i sg a l b a n a 、和青岛大扁藻p l a r y m o n a ss p ，来自于中科院海洋研究所， 藻培养基采用f 2 培养液配方。 ( 2 ) 细菌的来源和培养基 细菌样取自于青岛近海，按微生物采样要求带回实验室备用，培养基根据 需要选用2 2 1 6 e 固体和液体培养基。 ( 3 ) 无机营养盐的配制 无机营养盐主要在f 2 培养基的基础上，添加n 1 4 c 1 配制。 表2 1 不同实验组微藻培养液中的无机营养盐浓度 f i g2 i t h ec o n c e n t r a t i o no f i n o r g a n i cn u t r i e n 协i n a l g a ec u l t u r e n 0 3 - - n ( m g l ) p 0 4 3 - _ p ( m g l )n i l , + 一n ( m g l ) f 2 培养液组1 20 7 o 加n | 4 + _ n 组1 2o 7 7 表2 2 不同实验组细菌培养液中的无机营养盐浓度 f i g2 2t h ec o n c e n t r a t i o no f i n o r g a n i cn u t r i e n t si nb a c t e r i ac a i t u r e n o ，一一n ( m g l ) p o , - p ( r a g l )舭 - n ( m g l ) f 2 培养液组 8o 7o 加n 心_ n 组8o 77 2 2 实验方法 一 ( 1 ) 海洋微藻的除菌和计数 三种藻的培养温度均为2 5 士l o c ，光暗周期比为1 4 h ：1 0 h 。根据已有的文献 资料。枷，选取青霉素，链霉素，庆大霉素，卡那霉素等四种抗生素作为海洋微 1 2 海泮菌藻关系及对营养盐的吸收作用研究 藻培养体系的除菌药物，使其在藻培养液中的终浓度达到1 0 0 0 u 1 ，对三种海 洋藻进行除菌，以获得无菌藻，传代培养以消除残留抗生素的影响。在培养的过 程中始终用2 2 1 6 e 固体培养基检测是否有细菌的存在。藻的计数采用血球计数 板，在显微镜下( d 儿a ，l e i c a ) 进行观察计数。 ( 2 ) 细菌的培养和计数 细菌的培养主要在2 2 1 6 e 固体和液体堵养基上培养，培养温度为2 5 ，藻液 中的细【翁取适当的稀释液用荧光显微镜泣计数。具体方法为：用试管量取一定量 的固定水样，加入d a p i ( 终浓度0 0 0 4 m g l ) 染色卜2 m i n ，真空抽滤到黑色微孔 滤膜( m i l l i p o r e ，0 2 “m ，2 5 m m d i a m e t e r ) 上，将抽滤后滤膜置入载玻片上，盖上 盖玻片，用荧光显微镜( d m l a ，l e i c a ) 在放大倍数为1 0 i 0 0 下观测计数，随机 观测1 0 一2 0 个视野，每个视野不少于2 0 个细菌个体。按式；细菌数量= a x s l ( s 2 x v ) 其中a 为视野中细菌的平均数，s 1 为虑膜的有效过滤面积，s 2 为视野面积， v 为过滤水样的体积。 ( 3 ) 菌藻混合培养及细菌的分离纯化 。 把混合细菌样分别接入除菌的海洋微藻培养液中，共培养数代( 大概1 个 月) ，使其形成稳定的菌藻共生体系。将堵养液的接种到2 2 1 6 e 固体培养基上培 养，待菌落形成后，挑取形态特征差异较大的菌落进行分离纯化，以得到培养体 系中单菌株。 - ( 4 ) 藻液中共生细菌d o g e 分析 细菌总d n a 的提取：采用冷冻一融解法( f r e e z e - - t h a wm e t h o d ) “8 1 分别提 取纯化后的异养细菌及菌藻培养体系中细菌的总d n a ，然后保存于一2 矿c 至下一 步p c r 实验。 ， 1 6 sr d n a 的p c r - d g g e 分析：1 6 sr d n a 片段的扩增，前向引物采用哪3 4 l f ( 5 - c c t a c g g g a g g c a g c a g 一3 ) ， 5 端带 g c 环 ( 5 - c g c c c g c c g c g c g g c g g c g g g c g g g g c g g c a c g g g g g g - 3 ) ；反向引物采用t i n i v 9 0 7 r ( 5 _ c c c c g t c a a t t c c 兀t g a g t t t 一3 ) 旧p c r 扩增用自动热循环仪 ( b i o - r a d ，u s a ) ，使用文献1 提供的方法进行p c r 扩增。 d g g e 分析：2 5 p 1p c r 产物在6 的聚丙烯酰胺凝胶上电泳( c o d et m s y s t e m b i o r a d ) ，条件为0 5 t a eb u f f e r ，6 0 ，1 0 0 v ，1 6 h 。染色，紫外 鹰洋菌藻关系及时营养盐的吸收作用研究 凝胶成像( u n i v e r s a lh o o d0 ，b i o - r a d ) ”。 ( 5 ) 环境因子的测定 d o e 和无机营养盐分别用事先经4 5 0 。c 烧灼的g f f 玻璃纤维滤膜和经酸浸 泡的0 4 5p 的醋酸纤维膜过滤，d o c 分析采用总有机碳分析仪( t 0 c w 岛津公 司) ，无机营养盐的分析采用a a 3 营养盐自动分析仪( a a 3 ，b u r r a n + l u b b e 公司) 进行分析。 p h 用精密p h 计( p h s - 2 c ，上海大普仪器有限公司公司) 进行测定，溶解氧 用溶氧仪( y s l 6 0 0 0 s ，美国y s 公司) 进行测定。 ( 6 ) 统计分析 各实验组之间的显著性差异用s p s s l 2 o 统计软件中的单因素方差分析 ( o n e - w a ya n o v a ) 完成，均值用t u k e y 显著性检验( t u k e y sh o n e s t l y s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ) ，在a = o 0 5 时进行多重比较。 2 3 实验分组 2 3 1 菌藻关系实验 ( 1 ) 单菌株对微藻生长影响实验 各对取一定量分离纯化后6 株细菌的2 21 6