（无机化学专业论文）环糊精包合物构建水解金属酶超分子模型及性质研究.pdf

摘要 为了构筑具有第一和第二配位环境的水解金属酶生物模型，本文拟设计由p 一 环糊精( b c d ) 与带疏水基团的金属多胺配合物组装成的一种超分子体系。在该 模型体系中，作为客体分子的金属离了及其配位原子单元用于模拟酶的第一配位 环境，而作为主体分子的环糊精的羟基基团用于模拟些水解酶的第二配位环 境。同时研究模型的结构与催化功能的关系，特别是第二配位环境对催化活性的 影响。为此，我们在多胺上二引入不同的疏水基团来构造客体分子配体，通过与金 属离子和仁环糊精的组装，获得超分子模型体系，表征其结构，研究它们的热力 学性质和催化活性。 本文首先合成和表征了4 一苄基- - z , 烯三胺( l 1 ) ，4 - ( 4 异丙基一苄基) 一一乙烯 三胺( l 2 ) 和4 - ( 4 一叔丁基苄基) 一二乙烯三胺( l 3 ) ，然后以它f f _ j 的铜( i i ) 、锌( i i ) 配合 物与坏糊精形成超分子体系。在环糊精存在下，配体l 2 和l 3 的金属配合物能与 环糊精形成1 ：1 单核包合物，并从溶液中成功分离出来；但对配体l 1 的金属配 合物而言，从环糊精的溶液中只能分离出它们的羟基桥联二聚物，未分离山其环 糊精包台物。其中l 2 c u ，l 3 z n 和l 3 c u 与环糊精的所形成的包合物， i l 2 c u ( h 2 0 ) 2 p - c d l ( c 1 0 4 ) 2 1 0 5 h z o 、i l 3 z n ( h 2 0 ) j 1 一c d l ( c 1 0 4 ) 2 7 5 h z o 和 l 3 c u ( h 2 0 ) 2 b ，c d i ( c 1 0 4 ) 2 1 0 5 h 2 0 已被结构表征t 它们的晶体结构显示与金属 配位的水分子，环糊精的羟基和溶剂水分子之间形成复杂的氢键网络，可能模拟 酶的第二配位环境，而且这些模型物都有很好的水溶性。没有环糊精存在时，l l ， l 2 和l 3 的铜锌配合物极易形成羟基侨连的双核配合物，其中l 1 的两个铜锌羟 摧桥联配合物 ， 【l 。z n ( h 2 0 ) 1 2 ( t o u ) ( 0 0 4 ) 3 和 【( l c u ) 2 h 2 0 ) 一o h ) i ( 0 0 4 b h 2 0 的结构已被表征。 u v - v i s 光谱滴定测定的稳定常数表明l 2 和p 的铜和锌配合物与环糊精构 成的l ：1 的单核包合物在水溶液巾也稳定存在。p h 电位滴定法对这些配合物和 包合物的热力学性质进行了研究，结果说明环糊精与配合物形成包合物有利f 降低金属离子上配位水分子的质子离解常数( p k 。) 的值，并目稳定的包合物的形 成能阻止滴定过程中高p h 值下因z n ( o h ) 2 和羟基桥联配合物的形成而乍成沉 淀，使滴定在高p h 下继续进行。 动力学研究表明以上超分子体系构成的模型物能快速水解醋酸酯f 对一硝基 苯酚醋酸酯，p - n a ) ，例如包合物i l 3 z n ( h 2 0 ) 2 p c d i ( c 1 0 4 ) 2 7 5 h 2 0 水解的 醋酸酯的二级速率常数。为0 5 4 m 。s 。；同等条件下，它比其它一些目前已报 道的简单单核锌配合物的水解醋酸酯的速度快，而且比母体二乙烯三胺锌的反应 速度快6 倍。并且超分子体系比相应客体金属配合物反应速度快，锌配合物超分 子体系比铜配合物超分子体系反应速度快，符合天然水解酶的特征。 用所得到的超分子模型物还研究其铜配合物对质粒d n a ( p b r 3 2 2d n a ) 的 切割。研究发现：超分子体系和客体金属配合物本身都能使超螺旋d n a 断裂成 缺刻型和线型d n a ，并且在有外加引发剂和无外加引发剂的情况下部可以断裂 d n a 。但是，有引发存在时，它们能迅速将d n a 断裂成线型和缺刻型，没何加 入氧化还原剂时，反应较慢。同样条件下，超分子体系与d n a 的反应比相应的 简单配合物反应馒，这正好与小分子反应的情况相反。因为这里包合物的形成阻 碍了疏水基团与d n a 的结合，从而减慢了反应速度，由此说明环期精在这里起 一缓释载体的作用，i f 如它常常在医药中作为缓释剂。另外，比较三个不同疏水 基团的与d n a 的作用，发现疏水基团的大小也影响反应的速度。 另外，为了扩展以卜超分子模型思想，住控制反应条件和步骤的情况下， 合成并结构表征一个咪唑桥联的双核铜配合物与环糊精形成的包合物， ( 【一c u ( h 2 0 ) l ( p 2 - i m ) 2 b c d ( c 1 0 4 ) 3 2 1 h 2 0 ，类似结构的环糊精包合物未见报 道。性质研究表明它的味哗桥可在接近生理p h 条件下断裂，类似于超氧化歧化 酶中咪唑桥的性质，而且在p h7 8 时此包合物能有效催化超氰离子0 2 的歧化。 除了以上主要工作，本文还对配体- - ( 2 氨乙基) 胺( t r e n ) 和l 1 的n i ，c u 和 z n 等羟基桥联配合物与c 0 2 的反应活性做了一些研究，得到两个新的碳酸根桥 联的配合物 ( 肋一c 0 3 ) n i ( t r e n ) 】3 ( h 2 0 ) 2 ( c 1 0 4 ) 3 和 【( z n l l ) 2 ( “2 一o h ) 2 ( ”4 一c 0 3 ) ( c 1 0 4 ) 4 和一个高氯酸根桥联的四核锌配合物 z n ( t r e n ) 4 ( p 4 一c t 0 4 ) ( c 1 0 4 ) 7 。 关键词：b 一环糊精，金属配合物，超分子模型，水解金属酶，催化活性 c o n s t r u c t i n gs u p r a m o l e c u l a r m o d e l so f h y d r o l y t i c m e t a l l o e n z y m et h o u g h m e t a li n c l u s i o n c o m p l e x e s o f i - c y c l o d e x t r i na n ds t u d y i n gt h er e l a t e dp r o p e r t i e so ft h em o d e l s n a m e ：h e n gf u m a j o r ：i n o r g a n i cc h e m i s t r y s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rz o n g w a nm a o a b s t r a c t 3 - c y c l o d e x t r i n a n ds o m em e t a l c o m p l e x e s w i t h p o l y a m i n e s ，w h i c h b e a r h y d r o p h o b i cp e n d a n t s ，w e r ee m p l o y e dt oa s s e m b l ei n t ot h es u p r a m o l e c u l a rs y s t e m si n o r d e rt ob i o - m i m i ct h ep r i m a r yc o o r d i n a t i o n s p h e r ea n dt h es e c o n dc o o r d i n a t i o n s p h e r e i n h y d r o l a t i cm e t a l l o e n z y m e s i nt h e s es u p r a m o l e c u l a rm o d e l s m e t a l c o m p l e x e s ( t h eg u e s t s ) i n c l u d e di n3 - c da c ta st h ep r i m a r yc o o r d i n a t i o ns p h e r ew h i l e t h eh y d r o x y lg r o u p so n3 - c d ( t h eh o s t ) m a yp r o v i d et h es e c o n dc o o r d i n a t i o ns p h e r e l b rt h em o d e l s ，s ot h a tw ec o u l du s et h o s em o d e l st o s t u d yw h e t h e rt h es e c o n d c o o r d i n a t i o ns p h e r ei n f l u e n c et h eb e h a v i o r so ft h ep r i m a r yc o o r d i n a t i o n s p h e r e f i r s t l y , s e v e r a ll i g a n d s ( l i - l 3 ) w e r es y n t h e s i z e db ys u b s t i t u t i n gt h es e c o n dn i t r o g e na s u b s t i t u t i n gt h es e c o n d a r yn i t r o g e na t o mo fd i e n t h y l e n e t r i a n f i n e o ) w i t hd i f f e r e n t h y d r o p h o b i eg r o u p s ( b e n z y l ，4 - i p r b e n z y l ，4 - t b u b e n z y l ) s e c o n d l y , t h e s el i g a n d s w e r eb o u n dt o j - c dt h o u g ht h e i rr e s p e c t i v eh y d r o p h o b i cp e n d a n t sa n dt h e nc h e l a t e d w i t hz n 2 + c u 2 t oa c c o m p l i s has u p r o m o l e c u l a rm o d e l f i n a l l y ，t h e s eo b t a i n e dm o d e l c o m p o u n d sw e r es t r u c t u r a l l yc h a r a c t e r i z e da n dt h e i rt h e r m o d y n a m i c sa n dk i n e t i c s w e r ei n v e s t i g a t e d f nt h ep r e s e n c eo f1 3 - c d ，t h er e s u l t so fs y n t h e s e sa n dx r a ys t r u c t u r a l a n a l y s e s r e v e a l e dt h a tt h e m e t a l ( c u ( i i ) ，z n ( i i ) ) c o m p l e x e s o f l 2a n d l 3 ， 【l 2 c u ( h 2 0 ) 2 1 3 - c d ( c 1 0 4 ) 2 1 0 5 h 2 0 、i l 3 z n ( h 2 0 ) 2 p c d ( c 1 0 4 ) 2 7 5 h 2 0 a n d i l c u ( h 2 0 ) 2 1 3 - c d i ( c 1 0 4 ) 2 1 0 5 h z ow e r em o n o n u c l e a ri n c l u s i o nc o m p o u n d sb y i n s e r t i n gt h e i rr e s p e c t i v eh y d r o p h o b i cg r o u p si n t ot h ec a v i t yo f3 - c d ，w h i l et h et w o c o m p l e x e s o f l 1 ，i ( z n l l h 2 0 ) 2 纽o h ) i ( c 1 0 4 ba n d ( c n l ) 2 m o t f ) 伪一h 2 0 ) 1 ( c 1 0 4 ) 3 h z ow e r eo n l ys i m p l eh y d r o x o b r i d g e dd i n u c l e a rc o m p l e x e s i nt h ea b s e n c e o f3 - c d ，t h ez n ( 1 i ) c o m p l e x e so ft h et h r e e l i g a n d sa l w a y s d i m e r i z e di n t o h y d r o x o b r i d g e dd i n u c l e a rw a t e r i n s o l u b l ec o m p l e x e s t h er e s u l t s h o w st h a tt h e i n t e r a c t i o no fl 2 l 3a n dm 2 + i o n sw i t h1 3 - c dc o u l df o r ms t a b l ei n c l u s i o nc o m p o u n d s a n de f f e c t i v e l yp r e v e n tt h ef o r m a t i o no fh y d r o x o - b r i d g e dd i m e r s t h eu vs p e c t r o s c o p i ct i t r a t i o nf u r t h e rs h o w e dt h a ta p p a r e n ts t a b i l i t yc o n s t a n t so f t h e s ei n c l u s i o nc o m p o u n d sa r ea l s om a i ns p e c i e si nt h e i ra q u e o u ss o l u t i o n s t h ep h t i t r a t i o ns t u d yo nt h ez n 2 + a n dc u 2 + c o m p l e x e so ft h et w ol i g a n d si nt h ea b s e n c eo f a n di nt h ep r e s e n c eo fb c ds u g g e s t e dt h a tt h ef l _ c dc a nl o w e rt h ep k av a l u e so ft h e c o m p l e x e sc a0 6 t h ee x p e r i m e n t so ft h ep h t i t r a t i o na l s os h o w e dt h a tt h e p a r t i c i p a t i o no f3 - c dc o u l dp r e v e n tt h ef o r m a t i o no ft h ep r e c i p i t a t e sd u et ot h e s p e c i e sz n o h so c c u r r e n c ea th i g hp h ak i n e t i cs t u d yo fp n i t r o p h e n y la c e t a t ep n a ) h y d r o l y s i sc a t a l y z e db yt h e i n c l u s i o nc o m p o u n d sw a sp e r f o r m e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e yc o u l de f f e c t i v e l y c a t a l y z e t h e h y d r o l y s i s o f p n a t h e s e c o n d o r d e rr a t ec o n s t a n t o f i l 3 z n ( h 2 0 ) 2 d c d i ( c 1 0 4 ) 2 7 5 h 2 0i s0 5 44 - 0 0 3m 一。s ，w h i c hi so b v i o u s l yh i g h e r t h a no t h e rr e p o r t e ds i m p l em o n o n u c l e a rz n 2 + c o m p l e x e sa tt h es a m ee x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n sa l t h o u g hi t sp k av a l u eo ft h ec o o r d i n a t e dw a t e rm o l e c u l ei sh i g h e r t h i s r e s u l ts u g g e s t st h a ts e c o n dc o o r d i n a t i o ns p h e r eo fa r c h i t e c t e ds u p r a m o l e c u l a rm o d e l c a nm a r k e d l ye n h a n c et h ec a t a l y t i ca c t i v i t y i ns u c ham o d e ls y s t e m ，o nt h eo t h e rh a n d ， t h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo ft h ez n ( i i ) i n c l u s i o nc o m p o u n d si sa l s oo b v i o u s l yh i g h e rt h a n t h a to ft h ec un 1 1i n c l u s i o nc o m p o u n d s t h i si si na g r e e m e n tw i t ht h eb e h a v i o ri n w i l dh y d r o l y t i cm e t a l l o e n z y m e s ，w h e r ez n 2 + i o ni sa l w a y ss e l e c t e da sa c t i v ec e n t e r m e t a i o n t h es u p r a m o l e c u l a rc u ( i t ) c o m p o u n d sa n dt h e i rg u e s tc o m p l e x e sw e r eu t i l i z e dt oc l e a v et h e m a c r o m o l e c u l e p l a s m i dd n ap b r 3 2 2 i nt h ep r e s e n c eo fa n di nt h ea b s e n c eo f e x t r a r e d o xa g e n t s ( h 2 0 2 s o d i u ma s c r o b a t e ) ，b o t hi n c l u s i o nc o m p o u n d sa n dt h eg u e s t c o m p l e x e sc a ne f f e c t i v e l yt r a n s f o r ms u p e r c o i l e dd n a i n t on i c k e da n dl i n e a rd n a 1 v b u tt h er e a c t i o nr a t eo fd n ac l e a v a g ei sm u c hh i g h e ri nt h ep r e s e n c eo fr e d o xa g e n t s t h a nt h a t i nt h ea b s e n c eo fr e d o xa g e n t s o nt h eo t h e rh a n d ，t h ec l e a v a g er a t e so f i n c l u s i o nc o m p o u n d sa r el o w e rt h a nt h e i rc o r r e s p o n d i n gg u e s tc o m p l e x e s ，t h i s i n d i c a t e st h a tt h ef o r m a t i o no fi n c l u s i o nc o m p o u n d sb l o c k st h eh y d r o p h o b i cg r o u p s i n t e r a c t i n gw i t hd n a s ot h a tt h er e a c t i o nr a t e sb e c o m es l o w e r , h e r ef t c dc a nb e r e g a r d e da sf l s l o w r e l i e fc a r r i e r t h e r e f o r e ，t h i sr e s u l ti l l u m i n a t e st h a tt h eb i n d i n g m o i e t i e s ( e g h y d r o p h o b i cg r o u p s ) o fa r t i f i c i a l n u c l e a s e si s i m p o r t a n tf o rd n a c l e a v a g e a l s ot h eh y d r o p h o b i c i t yo fd i f f e r e n th y d r o p h o b i cg r o u p si n f l u e n c e st h e c l e a v a g eo fd n a i n a d d i t i o n ，a ni m i d a z o l e - b r i d g e d d i n u c l e a rc u ( i i ) i n c l u s i o nc o m p o u n d ， “l j c u ( h 2 0 ) 1 2 姐2 - i m ) 2 1 一c d ( c 1 0 4 ) 3 2 1h z o ，w a so b t a i n e da sa l li n i t i a lm o d e lf o r d e v e l o p i n go t h e rm e t a l l o e n z y m e sb yc o n t r o l l i n g r e a c t i o nc o n d i t i o n sa n dw a s s t r u c t u r a l l yc h a r a c t e r i z e d ，s i m i l a rs t r u c t u r e h a sn o tb e e nf o u n di n l i t e r a t u r e s i t s i m i d o l eg r o u pc a nc l e a v ea tap h y s i o l o g i c a lp h ，w h i c hi ss i m i l a rt ot h en a t u r eo f i m i d o l e b r i d g ei ns o d ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) a l s ot h ei n c l u s i o nc o m p o u n dh a ss o d a c t i v i t yw i t hai c s 0v a l u e0 2g m e x c e p tf o rt h ea b o v em e n t i o n e dw o r k ，t h i st h e s i so f f e r e ds o m ei n f o r m a t i o na b o u t t h er e a c t i v i t yo fs o m eh y d r o x o b r i d g e dd i n u c l e a rp o l y a m i n e m e t a l ( z n ( i i ) ，c u ( i i ) a n dn i ( i i ) ) c o m p l e x e st o w a r dc 0 2 t w on o v e l c a r b o n a t o - b r i d g e dc o m p l e x e s ， 似3 c 0 3 ) n i ( t r e n ) 3 ( h 2 0 ) 2 ( c 1 0 4 ) 3a n d “( z n l ) 2 ( p 2 - o h ) 2 ( 阳c 0 3 ) ( c 1 0 4 ) 4 ，a n d a ni n t e r e s t i n gc 1 0 4 b r i d g i n gt e t r a - n u c l e a rz n ( i i ) c o m p l e x ， i z n ( t r e n ) h 似4 0 0 4 ) ( c 1 0 4 ) 7 w e r eo b t a i n e da n ds t r u c t u r a l l yc h a r a c t e r i z e d k e y w o r d s ：1 3 - c y c l o d e x t r i n ，m e t a lc o m p l e x e s ，s u p r a m o l e c u l a rm o d e l s ，h y d r o l y t i c m e t a l l o e n z y m e ，c a t a l y t i ca c t i v i t i e s 中山大学博士学位论文环糊精包合物构建水解金属酶超分子模型及性质研究 1 1 引言 第1 章前言 生命体内每时每刻都进行着复杂的生化反应，这些反应主要包括糖类、 脂类、蛋白质、核酸、维生素以及无机盐的合成与代谢，它们能在温和的 条件下快速进行，都得益下各种不同类型的酶的参与。因此，研究生命体 内各种酶的结构和功能一直为生物学家和化学家所关注，而其中的金属酶 类则成为生物无机化学和配位化学研究的热点之一。生物体内的酶一股来 说结构复杂而不稳定，要彻底阐明它们的作用机制非常困难，所以采用化 学方法构造酶模拟物来研究酶的活性位点的配位化学、结构与功能的关系、 酶的作用机理成为酶研究的主要方法之一 1 。事实上，早期对生物系统的 认识和理解许多与模型系统有密切的关系。通过模型研究我们可以了解各 种金属酶中金属离子的配位结构、电子结构、光磁性质作用、反应性能和 作用机制的阐明 2 。例如，蛋白质中不同p 丘值氨基酸侧链的作用，辅凼 子作用的详细机理 l ，氢键的强度和优先取向 3 ，蛋白结构中的芳香残 基“面一沿”堆积作用的认识 4 等都与模型研究有关。所以，模型研究为 研究生物分子识别和催化提供了一种比较有效的方法。我们知道模型研究 是对真实世界的一种简化和理想化的研究，在此基础上逐渐增加条件以最 大程度地接近真实情况，所以要复制出酶的生物功能则需要更为复杂的合 成体系。不过，在酶的模拟中，模型物的目的很多时候不是为了复制出天 然酶的所有性质，而是为了突出和理解复杂酶体系中某一方面的问题而设 汁的 2 。目前，生物无机化学的研究方法之一就是创造在不同程度和不同 方面再现生命现象的模拟体系，以加深对生命过程的认识。但是模拟方法 有一个前提，即支配酶促反应等生命现象的原则，不应超越物理学和化学 的范围，困此生命现象可以出某些模拟体系加以仿造 5 。 中人学博上学位论文环糊精包合物构建水解金属酶超分子模型及性质研究 虽然生命体内的酶多种多样，功能也各不相同，不过它们也有一些共性， 根据酶在生命体内反应的性质，它们被分为六犬类：水解酶、裂解酶、转移酶、 异构酶、连接酶和氧化还原酶。水解酶足六类酶中研究最多、应用最广的一类， 也是本文最感兴趣的一类酶，下面介绍它的一些特点和研究相关的工作。 1 , 2 水解金属酶的特点 随着生物和化学技术的发展，人们发现多数水解酶的活性与金属离子密切 相关，这一类水解酶一般称为水解余属酶。表1 1 列出了一些常见水解金属酶和 金属激活酶( 指必需加入金属离子才有活性的酶) 【6 】。 1 2 1 水解金属酶对金属离子的选择 水解金属酶在对金属离子的选择上表现出共同的特点，即不同的酶选择同样 的金属离子作为它们活性位点的中心配位离子，从表1 1 中，可以发现大多数水 表1 1 若干水解金属酶年金属离子激活酶 解酶选择z n h ，有些选择m 9 2 + 和c a 2 + ，它们都是非氧化还原型的离子，极少数 中山大学博十学位论文环糊精包台物构建水解金属酶超分子模型及性质研究 水解酶含有m n 2 + 、f e 2 + 等一些具有氧化还原性的金属离子。实际上，z n 2 + 和m 9 2 + 作为l e 晰s 酸普遍用于酶催化的水解反应中，这与它们本身的一些物理性质有 关，表l 一2 列出了一些生理相关的二价金属离子的物理、热力学和动力学参数。 其中离子半径为0 6 a 的m g z + 具有很高的电荷密度，是一个较硬的l e w i s 酸，它 容易与核酸中磷酸酯骨架上带负电荷的氧结合；而z n 2 + 的电荷密度虽然不及 m 9 2 + 高，但它的离子势较小，是一个较强的l e w i s 酸，这反应在结合水的相对 p 岛上： z n - o h 2 一z n o h + h + p = 8 8( 】一1 ) m g o h 2 一m g - o f f + h + p 岛= l1 4( 1 - 2 ) 因此，一个普遍的规律是，锌被用于反应物上带有一个羰基官能团的反应( 如酯、 表1 2 与生理有关的一些二价金属离子的物理参数、热力学和动力学参数 4 【8 】离子半径6 【9 】电荷密度。【l o 配位水分子被取代的速率常数 酰胺、c 0 2 ) ，而m 9 2 + 则存在于酶的辅基中，催化磷酸酯的水解( 或形成) 【7 。虽 然z n 2 + 的一些特别性质使得它为大多数水解酶所青睐，但研究发现酶中的z n 2 + 被c 0 2 + 、c u 2 + 、n i 2 + 、m n 2 + 或c d 2 + 取代后，也常常产生有活性的酶有时甚至取 代所得的酶活性还很高【1 1 】，其中c 0 2 + 是z n 2 + 的最佳替代者。 1 2 2 水解金属酶活性中心的组成和结构特点 虽然各种水解金属酶的功能各异，但它们在活性位点的构成安排上却有许多 相似点。这里以羧肽酶、嗜热菌蛋白酶、碱性磷酸酯酶和碳酸酐酶等几个研究较 多的金属酶为例，来看水解金属酶的组成和结构特点。 中山大学博十学位论文环糊精包合物构建水解金属酶超分子模型及性质研究 1 2 2 1 羧肽酶a 羧肽酶a ( c a r b o x y p e p t i d a s ea ，c p a ) 是1 9 5 5 年发现的含锌酶它存在于哺乳 动物的胰脏中，是由约3 0 0 个氨基酸残基组成的单一多肽链，m ，3 4 6k d a , 含一 个z n 2 + 作为辅基。研究较多的是牛羧肽酶a ，它是一种含锌肽链端解酶，催化肽 链c 一端氨基酸的水解，并显示优先选择c 一端芳香侧链为底物，它所催化的反 应可表示为： r - c o n h c h r 一c o z - + h 2 0 r c 0 2 - + n h 3 + - c h r - c 0 2 一 ( 1 3 ) o l f c c i u 2 7 0 70 。 s o r l g ；、 c 0 l h h t y r l 驰 图1 1 结合底物的羧肽酶a 的活性中心【1 3 】 迄今，已获得的牛羧肽酶a 有三种形式：氏、a d 和a t ，其中羧肽酶如高 分辨x 射线晶体结构已得到，它的活性中心如图1 1 所示，活性位点是一个z n ” 与三个氨基酸残基( h i s l 9 6 、h i s 6 9 、g l u 7 2 ) 和一个水分子配位构成的，其中组 氨酸h i s l 9 6 和h i s 6 9 的侧链眯唑氮与z n ”配位，而谷氨酸g l u 7 2 则以其羰基氧 与z n ”双齿配位，另外加上配位的水分子，因此z n 2 + 在这里是五配位的。在底 物和抑制剂存在下，g l u 7 2 就变成近于单齿配位的形式。这种g l u 或a s p 残基的 结构重排过程被称为羧基位移，它使金属离子上的配位数即使在结合了各种形式 中山大学博十学位论文环糊精包合物构建水解金属酶超分子模型及性质研究 的底物时也能够保持基本不变。活性位点的周围有个疏水口袋，是底物结合部 位，底物的c 末端芳香环可以伸入到酶的活性部位，由此也可以理解z n 2 + 的存 在是羧肽酶具有活性所必需的【7 ，1 2 】。 蛋白链化学修饰法确定的羧肽酶的活性部位，除了与z n 2 + 配位的h i s l 9 6 、 h i s 6 9 和g l u t 2 直接参与催化作用的活性位点外，还有在活性位点周围的氨基酸 残基精氨酸a r 9 1 4 5 、酪氨酸t y r 2 4 8 和谷氨酸g l u 2 7 0 也在催化过程中发挥重要 作用，它们的侧链基团也与底物或活性位点通过弱相互作用结合，当这些残基被 化学修饰成其它基团时，酶就失去活性【1 2 ，1 4 。 1 2 2 1 嗜热菌蛋白酶 嗜热菌蛋白酶( t h e n n o l y s i n ) 是一种肽链内切酶，其高分辨x 射线晶体结构也 已确定，它的活性部位如图1 2 。虽然它的结构在整体上与羧肽酶颇具差异，但 仔细考察其活性位点的结构，就发现它们惊人地相似。在无底物的状态下，z n ” 与h i s l 4 2 、h i s l 4 6 和g l u l 6 6 这三个氨基酸残基的侧链以及一个水分子配位。另 外，与羧肽酶相似，嗜热菌蛋白酶中也存在着不直接与z n 2 + 配位但与催化作用有 着密切关系、用来形成氢键的氨基酸残基g l u l 4 3 和h i s 2 3 1 。嗜热菌蛋白酶中的 g l u l 4 3 相当于c p a 中的g l u 2 7 0 ，h i s 2 3 1 对应于c p a 中的a r 9 1 2 7 。 删h 1 蜥h i s - l , 1 6 图1 2 嗜热菌蛋白酶的活性中一6 , 1 5 】 1 2 2 3 碱性磷酸酯酶 碱性磷酸酯酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，a p ) 也是结构已表征的含锌水解金属酶 之一，对它的研究颇多 1 6 ，1 7 。大肠杆菌的碱性磷酸酯酶是一种含9 4d a u 亚基的 中山大学博士学位论文环糊精包合物构建水解金属酶超分子模型及性质研究 二聚体，能催化磷酸酯的水解，但对磷酸二酯无催化作用，因为它在- p h8 时活 性最大而得名。碱性磷酸酯酶催化的反应可简单表示为1 - 4 式： r o p o c 0 3 2 - + h 2 0 手r o h + h p 0 4 2 。( 1 4 ) 图l 一3 结合有底物的碱性磷酸酯酶的活性中心 1 8 】 a p 结合有底物的活性中心结构如图1 3 所示，分子中含有一对z n ”( 相隔 4 a ) 和一个m g ”( 与双锌核相距5 7 a ) ，两个锌离子分别与三个氨基酸残基( z n l ： h i s 4 1 2 ，h i s 3 3 1 ，a s p 3 2 7 ；z n 2 ：h i s 3 7 0 ，a s p 5 l ，a s p 3 6 9 ) 和一个磷酸根的氧原子配位 并构成催化活性位点，与底物的末端磷酸根基团结合，底物通常是一个单酯如对 硝基苯基磷酸酯：m 9 2 + 与三个氨基酸残基( t h r l 5 5 ，a s p 5 1 ，g l u 3 2 2 ) 芹f l = 个水分子 配位，它的作用尚不清楚，似乎不直接参与催化作用，可能起稳定酶结构的作用。 1 2 2 4 碳酸酐酶 碳酸酐酶( c a r b o n i ca n h y d r a s e ，c a ) 是人类发现的首例含锌蛋白，它广泛分布 于各类生物体中，高效地( 它的转换数高达1 0 6s - i ) 可逆催化二氧化碳的水合反应 ( 式1 5 ) ，这个反应虽然简单，但对生命有着重要的意义。在人和动物体内，由 c a 催化c 0 2 水合生成h c 0 3 一，当h c 0 3 - 随血液循环到肺泡后，又由c a 催化使 它离解为c 0 2 而排出体外。大多数c a 是锌酶，但也有少数植物的c a 不含锌。 对于人体和动物体内c a ，人们作了广泛的研究，对它的结构和作用机制有较为 统一的看法。 6 中山大学博十学位论文环糊精包合物构建水解金属酶超分子模型及性质研究 c 0 2 + h 2 0hh c 0 3 一+ h +( 1 5 ) 来自人体和动物血液的碳酸酐酶的相对分子量m r s 3 0k d a ，由约2 6 0 氨基酸 组成的单肽链，几种c a 的晶体结构也已被表征。在生物体中，c a 能以几种稍 微不同的形式( 同功酶) 存在。图i - 4 是人体内碳酸酐酶i i ( h u m a nc a r b o n i c a n h y d r a s ei i ，h c a1 1 1 的活性中心的结构，它含有一个z 1 1 2 + ，这个z n 2 + 与三个氨 基酸残基h i s 9 4 、h i s 9 6 、h i m l 9 三个咪唑氮和个水分子( 或羟基) 配位，从而形 成畸变的四面体配位几何结构。如果除去酶中的z n ”则导致酶失去活性。这说明 z n 2 + 对酶发挥活性必不可少。另外，旋光色散研究表明天然c a 和脱锌的酶蛋白 具有相同的三级结构。因此，z n ”在c a 中不是起稳定空间构型的作用，而是起 活性中心的作用。 c a 的整个活性中心部位可分成两部分：亲水( h y d r o p h i l i c ) 部分和疏水 f h y d r o p h o b i c ) 部分，亲水部分包括质子接受基团h i s 6 4 和部分有序排列的水分子， 由氨基酸残基h i s 6 4 、h i s 6 7 、p h e 9 1 、g l u 9 2 和h i s 2 0 0 构成的环把内部水环境和 外部水环境分隔开来，h i s 6 4 起连接内外溶剂区域的桥梁作用，z n ”配位中心周 围的一些亲 h ”i m p h o b i ch a # 图1 4 碳酸酐酶的活性中心【1 9 】 水性残基( 如g l u l 0 6 和t h r l 9 9 ) 与水分子构成庞大的氢键网络【1 9 】。另外，v a l l 2 1 、 v 1 4 3 、t r p 2 0 9 和v a l 2 0 7 构成疏水部分结合底物c 0 2 分子，以便它与锌上配位的 中山大学博上学位论义环糊精包合物构建水解金属酶超分子模醴及性质研究 水分子作用。以上这些氨基酸残基虽然不与z n 2 + 配位，但仍然对酶催化活性有重 要影响，例如把t h r l 9 9 定点突变为其它氨基酸残基( s e t , a l a ，v a l 和p r o ) 会大大 降低酶的活性 2 0 1 。 由以上列举的几个水解金属酶的例子并结合其它类似的酶的结构资料【1 2 】， 我们可以发现它们活性中一t l , 的结构有以下一些共同点：( 1 1 都具有一个金属离子 配位核心，尽管核心中的金属离子数目会不同：( 2 ) 金属离子有较固定配位数， 对z n ”而言，一般为4 配位或5 配位，且其中一配体为水分子( 或羟基) ，与金属 配位的一般是氨基酸上的氮( h i s ) 、氧( g l u 、a s p ) 或硫( c y s ) 原子 2 l 】；( 3 ) 金属离 子配位中心常位于蛋白质一疏水腔底；( 4 ) 除了中心金属离子和与之直接配位的 氨基酸外，活性部位往往也包含其它一些不直接与金属配位的邻近的氨基酸残 基，而且它们也对酶的活性有重要的影响。 1 2 3 水解金属酶作用机理 物质的结构与性质往往有密切的联系，一般来说结构决定性质。水解金属酶 既然结构上有很多共同点，那么它们作用机制中也会存在一些相似处。仍然以上 面谈到的几个酶的水解机理为例来考察它们的一些催化机理的特点。 1 2 3 1 羧肽酶a 的作用机理 依照动力学和x 射线结构分析对羧肽酶a 与其抑制剂复合物研究的结果， 羧肽酶a 催化肽链水解的作用机理可以表