（农产品加工及贮藏工程专业论文）海南产木薯化学成分及其生物活性的研究.pdf

掣丫lj117l119ii18ihl7fllif2ih11ll 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 胡为飞 i 日期：加加年6 月严日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权海南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导 师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学和中国热带农业科学院。 保密论文在解密后遵守此规定。 导师签名： 日期：缈年月争日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人 的学位论文提交“c 规定享受相关权益 论文作者签名： 嘲为俘 日期：勿少年6 月乡日 导师签名： 程”中 日期：z 口力年月尹日 海南产木薯化学成分及其生物活性的研究 摘要 木薯是世界热带地区最重要的粮食作物之一，是供人类食用的的重要碳源。在我国， 木薯主要分布于海南、广东、广西、贵州、云南、福建和台湾等省。本论文中我们对海 南产木薯的化学成分及其生物活性进行研究。 采用气相色谱质谱( o c m s ) 联用方法对木薯茎和叶挥发油的化学成分进行分析， 鉴定了茎的挥发油中的2 5 个成分和叶的挥发油中的2 2 个成分，分别占总挥发油含量的 8 3 5 3 和8 3 4 6 。用滤纸片琼脂扩散法测定茎和叶的挥发油的抗金黄色葡萄球菌活性和 抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( m h s a ) 活性，结果表明茎的挥发油具有抗金黄色葡萄 球菌活性，叶的挥发油具有抗m a s a 活性。细胞毒活性试验表明茎的挥发油对人慢性髓 原白血病细胞k 5 6 2 有显著细胞毒活性，其i c 5 0 值为7 0 # g m l 。 对木薯茎的乙醇提取物的各组分进行了抗氧化活性测试，结果表明抗氧化成分主要 集中在乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中，其中乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性最强。 利用柱色谱技术对乙酸乙酯萃取物进行分离纯化，通过理化性质及现代波谱技术 ( n m r ，2 d - n m r 和m s 等) 鉴定化合物的结构。共有1 5 个化合物被鉴定，分别为： c o n i f e r a l d e h y d e ( 1 ) ，异香草醛( 2 ) ，6 - d e o x y j a c a r e u b i n ( 3 ) ，胆甾醇( 4 ) ，p 一谷甾醇( 5 ) ， 东莨菪亭( 6 ) ，丁香醛( 7 ) ，松脂醇( 8 ) ，3 , 6 - b i ( 4 h y d r o x y - 3 - m e t h o x y p h e n y l ) t e t r a - h y d r o f u r o 3 ，4 - c f u r a n - t ( 3 h ) - o n e ( 9 ) ，香豆酸( 1 0 ) ，f i c u s o l ( 1 1 ) ，y u c a l e x i np - 1 5 ( 1 2 ) ， b a l a n o p h o n i n ( 1 3 ) ，香草二乙胺( 1 4 ) 和伊胡萝卜苷( 1 5 ) 。其中化合物1 、2 、3 、7 、8 、9 、 1 0 、1 1 、1 3 和1 4 为首次从该植物中分离得到。 采用d p p h 和a b t s 法对这些化合物进行抗氧化活性测定，结果表明乙酸乙酯萃取物 中的酚类化合物有较好的抗氧化活性。运用m t t 法对这些化合物进行细胞毒活性筛选， 结果表明化合物1 、2 和1 3 有细胞毒活性；在采用滤纸片法所进行的抗菌活性表明，化合 物1 l 和1 2 对金黄色葡萄球菌有抑制作用，抑菌圈直径分别为2 2 0 和8 0 毫米，并且化合物 1 1 对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有抑制作用，抑菌圈直径为1 4 0 毫米。 关键词：木薯化学成分结构鉴定酚类成分细胞毒活性抗菌活性 海南大学2 0 1 0 届硕士学位论文 a b s t r a c t c a s s a v a ( m a n i h o te s c u l e n t ac r a n t z ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf o o dc r o p si nt r o p i c a l r e g i o n so ft h ew o r l d , b e i n gas t a p l es o u r c eo fe n e r g yc a r b o h y d r a t e sf o rh u m a nc o n s u m p t i o n i nc h i n a , c a s s a v aw a sd i s t r i b u t e di nh a i n a n , g u a n g d o n g ，o u a n g x i ，g u i z h o u , y u n n a n , f u j i a n , a n dt a i w a np r o v i n c e s ，e t e t h ep r e s e n tp a p e rd i s c u s st h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t sa n d b i o a c t i v i t i e so fc a s s a v ac o l l e c t e di nh a i n a n t h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t so f 也ev o l a t i l eo i i sf r o mt h es t e r n sa n dl e a v e so fo a s s a v aw e r e a n a l y z e db yg c - m s 2 5c o m p o n e n t s ，a c c o u n t i n gf o r8 3 5 3 o ft h eo i l sf r o ms t e m s ，a n d2 2 c o m p o n e n t s ，a c c o u n t i n gf o r8 3 5 3 f r o mt h eo i l so fl e a v e s ，w e r ei d e n t i f i e dr e s p e c t i v e l y b i o a s s a y o ft h o s et w oo i l s a g a i n s ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u $ a n dm e t h i c i l l i n - r e s i s t a n t s t a p h y l o c o c c u sa n r e u s ( m r s a ) w e r ec a r r i e d o u tb yp a p e rd i s c od i f f u s i o nm e t h o d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ev o l a t i l eo i lf r o ms t e m sp o s s e s s e d i n h i b i t o r ya c t i v i t yt o w a r d s s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，a n dt h ev o l a t i l eo i lf r o ml e a v e sp o s s e s s e di n h i b i t o r ya c t i v i t yt o w a r d s m r s , a _ c y t o t o x i c i t ya s s a yo ft h ev o l a t i l eo i lf r o ms t e m ss h o w e ds i g n i f i c a n tc y t o t o x i c i t y a g a i n s tt h ek 5 6 2c e l ll i n ew i t ht h ei c s 0v a l u e so f7 0p g m l a na c t i v i t y - d i r e c t e df r a c t i o n a t i o na n dp u r i f i c a t i o np r o c e s sw a su s e dt os c r e e na n t i o x i d a n t f r a c t i o n sf r o mt h ee t h a n o le x l t a c = to fc a s s a v as t e m s t h er e s u l ts u g g e s t e dt h a tt h ea n t i o x i d a n t s w e r em a i n l yc o n t a i n e di ne t h y la c e t a t ef r a c t i o na n dn - b u t a n o lf r a c t i o n a n dt h ee t h y la c e t a t e f r a c t i o ns h o w e dt h eg r e a t e s ta n t i o x i d a n ta c t i v i t y ，o nw h i c hf u 也e ri n v e s t i g a t i o nw a sf o c u s e d 1 1 1 ee t h y la c e t a t ef r a c t i o nw a ss u b j e c t e dt op u r i f i c a t i o nu s i n gc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y a n dt h e i rs t r b c t u r e sw e r ei d e n t i f i e db yp h y s i c o c h e m i c a la n ds p e c t r o s c o p i cm e t h o d s ( i n c l u d i n g n m r , 2 d - n m p , m s ，e ta 1 ) f i f t e e nc o m p o u n d sw e r ei s o l a t e df r o m 血es t e m so fc a s s a v ai n h a i n a n a n dt h e i rs t r u c t u r e sw e r ee l u c i d a t e da sc o n i f e r a l d e h y d e ( 1 ) ，i s o v a n i l l i n ( 2 ) ， 6 - d e o x y j a c a r e u b i n ( 3 ) ，c h o l e s t e r o l ( 4 ) ，f l - s i t o s t e r o l ( 5 ) ，s c o p o l e t i n ( 6 ) ，s y r i n g a l d e h y d e ( 7 ) ， p i n o r e s i n o l ( 8 ) ，3 , 6 - b i s ( 4 - h y d r o x y - 3 - m e t h o x y p h e n y l ) t e t r a h y d r o f u r o 3 ，4 - c l f u r a n - 1 ( 3 h ) - o n e ( 9 ) ，c o u r m a d ca c i d ( 1 0 ) ，f i c u s o l ( 1 1 ) ，y u c a l e x i np 1 5 ( 1 2 ) ，b a l a n o p h o n i n ( 1 3 ) ，e t h a m i v a n ( 1 4 ) a n df l - d a u c o s t e r o l ( 1 5 ) c o m p o u n d s1 ，2 ，3 ，7 ，8 ，9 ，1 0 ，i i ，1 3a n d1 4w e r ei s o l a t e df r o m t h i sp l a n tf o rt h ef i r s tt i m e a l lt h ec o m p o u n d sw e r ee x a m i n e df o rt h e i ra n t i o x i d a a ta c t i v i t i e sb yt h ed p p hm e t h o d a n da b t sm e t h o d , a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tp h e n o l i cc o m p o u n d sc o n t r i b u t e dt ot h e n i l l 海南大学2 0 10 届硕士学位论文 目录 摘要i i a b s t r a c t i i 第一章前言 1 1 木薯植物简介。1 1 1 1 木薯的生物学特性l 1 1 2 木薯综合利用一1 1 2 木薯化学成分及其药理活性研究进展2 1 2 1 化学成分研究2 1 2 2 药理活性研究6 1 3 本课题研究的目的和意义7 1 4 本课题的主要研究内容7 第二章实验材料与仪器 8 2 1 材料8 2 1 1 植物8 2 1 2 肿瘤细胞株8 2 1 3 人体病原菌8 2 1 4 培养基8 2 1 5 试剂8 2 1 6 常用耗材9 2 2 仪器设备10 第三章海南产木薯茎和叶挥发油的化学成分及其生物活性1 2 3 1 材料和方法1 2 i v 海南产木薯化学成分及其生物活性的研究 3 1 1 植物材料 3 1 2 挥发油的提取 3 1 3g - c m s 分析条件 3 1 4 生物活性测定 3 1 4 1 细胞毒活性测定方法 3 1 4 2 抗菌活性测定方法 3 2 实验结果： 3 2 1 木薯茎挥发油成分分析。 3 2 2 木薯叶挥发油成分分析。 3 2 3 细胞毒活性测定结果 3 2 4 抗菌活性测定结果 3 3 讨论 第四章木薯茎的化学成分研究 1 9 4 1 海南产木薯茎的化学成分的提取及抗氧化活性筛选1 9 4 1 1 海南产木薯茎的化学成分的提取1 9 4 1 2 海南产木薯茎提取物的抗氧化活性筛选19 4 1 2 1 实验原理和方法2 0 4 1 2 1 1 对d p p h 自由基清除测定一2 0 4 1 2 1 2 对a b t s 自由基清除测定2 1 4 1 2 2 实验结果与论论2 2 4 2 海南产木薯茎的化学成分的分离。2 3 4 3 化合物结构鉴定2 6 4 4 讨论3 0 第五章木薯茎的化学成分的活性筛选 3 2 5 1 材料和方法3 2 5 1 1 实验材料3 2 5 1 2 实验方法3 2 5 1 2 1 抗氧化活性测定方法3 2 5 1 2 2 细胞毒活性测定方法3 3 5 1 2 3 抗菌活性测定方法3 3 5 2 活性筛选结果3 3 v 海南大学2 0 1 0 届硕士学位论文 5 2 1 抗氧化活性筛选结果一3 3 5 2 2 细胞毒活性筛选结果3 6 5 2 3 抗菌活性筛选结果3 7 5 3 讨论3 7 第六章总结与讨论 参考文献 缩略语表 相关波谱分析谱图 个人简历 致谢 v i 3 9 4 5 6 2 6 3 海南产木薯化学成分及其生物活性的研究 1 1 木薯植物简介 第一章前言 木薯( m a n i h o te s c u l e n t ac r a n t z ) 又名树薯、树番薯、南洋薯、木番薯等，属大戟科 ( e u p h o r b i a ) 木薯属( m a n i h o tp m i l l ) 植物，具有高生物量、高淀粉、抗逆、耐旱等多 种特点，是世界3 大薯类作物之一，为全球超过6 亿人口提供基本的食物，是我国热带 亚热带地区的重要作物，在我国主要分布于海南、广西、广东、云南、福建等省【1 ，2 1 。 木薯在单位面积里，食物能量超过水稻、玉米和小麦，是人类食物、动物饲料和工业原 料的重要资源，在化工、医药、食品、纺织、造纸、能源酒精等方面有广泛用途【3 ，4 1 。 2 0 世纪9 0 年代以来，木薯的用途已经由以原来的粮食、饲料、工业原料为主，向以饲料、 工业原料为主转变，国际市场对木薯的需求量逐年增长【5 】。目前，木薯在我国主要利用 其块根生产淀粉和酒精【6 j ，而木薯酒精生产所剩的废渣和茎杆部分没有得到充分的利用， 若随意抛弃或焚烧，往往造成河床堵塞或空气污染【7 1 。另外，木薯的叶片也可食用，木 薯叶片中含有丰富的蛋白质和维生素，有良好的营养价值，但因其含有的固体物质较一 般蔬菜高多倍，煮熟后口感不佳，所以需在煮前将叶片捣烂或擦烂，然后作为煮汤或素 炒的原料。在亚马逊丛林地区生活的印第安人传统上把木薯叶作为一种草药使用【引。在 我国，随着经济的增长和能源缺口的不断加大，木薯主要作为一种能源作物，倍受关注。 1 1 1 木薯的生物学特性 木薯是直立灌木，有乳汁，茎粗壮，上部分枝；块根肉质、肥厚、圆柱状，富含淀 粉。木薯为异花授粉作物，雌雄同序异花，圆锥花序，同序的花雌花先开，相距约7 天； 蒴果椭圆状，表面粗糙，具6 条狭而波状纵翅；种皮硬壳质，具斑纹，光滑；种子扁长， 似肾状，褐色。木薯耐旱、耐贫痔和耐酸性土壤，故在干旱和半干旱地区得到较大发展。 木薯的根系稀疏，但深生穿透性强，有耐旱能力。木薯的块根是由吸收根的分化，出现 形成层，产生大量薄壁细胞，使根部不断增粗，并大量积累淀粉而形成，一般5 6 条， 多达1 0 条以上。木薯用种茎栽培，有否开花与生产关系不大，只是杂交育种时才需要其 开花结果。木薯喜阳性而不耐荫蔽，是短日照热带作物，对光照长度和温度的反应都比 较敏感，阳光充足对提高产量有重要的作用。木薯生长在阳光不足、荫蔽度大的地方， 茎叶徒长，叶序稀疏，节间伸长，茎干细弱，块根细小，且容易引起叶片脱落，造成低 产劣质。 1 1 2 木薯综合利用 国内外对木薯的利用主要集中在块根部分。木薯块根中含有大量的淀粉，且蛋白质、 果胶、油脂及灰份的含量很低。在非洲木薯是主要的粮食作物消耗，在拉美国家也加工 制成各种食品而食用。而在亚洲除印度和印尼作为粮食的补充外 主要做饲料和工业原料或供出口。木薯块根是生产优质淀粉的良 工生产淀粉糖系列产品，氧化还原产品，发酵产品，还可生产可 纺织、造纸、医药、食品、能源、饲料等行业【9 0 l 。木薯茎叶纤维素含量较低，可消化 率较高。木薯叶富含蛋白质，氨基酸的种类和大豆一样多，尤其是赖氨酸含量较高，对 改善缺乏赖氨酸的谷类作物的饲料很有价值。木薯是一种综合利用价值较高的作物，随 着科学技术的发展和进步，只要采取适当的技术措施，木薯的利用价值会变的越来越广 阔。 1 2 木薯化学成分及其药理活性研究进展 1 2 1 化学成分研究 s a k a i 等从受损后的木薯块根中分离出2 2 个二萜类化合物以及一些甾体类成分【1 1 1 2 1 ，其中二萜类化合物可分为贝叶烷型( b e y e r a n e ) 、右松脂烷型( p i m a r a n e ) 、阿替烷型 ( a t i s a n e ) 和贝壳杉烷型( k a u r a n e ) 四个类型。p o p o o l a 等【1 3 】对木薯种子油中的脂肪酸成 分作了研究。木薯在采收之后会产生大量的次生代谢产物如七叶内酯，七叶苷，东莨菪 亭，东莨菪苷和儿茶素【1 4 1 。k u b o 等人发现木薯的叶中含有很丰富的槲皮素和芦丁【8 】。陶 海腾等【6 】对木薯叶中的黄酮类化合物作了提取工艺方面的研究。木薯中这些酚类物质有 很好有抗菌、抗氧化、抗炎和降血脂等活性，木薯的保健功能可能与这些酚类物质的大 量存在有关。( 木薯中化学成分见图1 1 3 ) 二萜类化合物： 贝叶烷型二萜类化合物： h oo y u c a l e x i nb - l y u c a l e x i nb 一5y u c a l e x i nb 6 2 海南产木薯化学成分及其生物活性的研究 h o 、r y u c a l e x i nb 7y u c a l e x i nb 9y u c a l e x i nb 1l y u c a l e x i nb 1 4 o y u c a l e x i nb 2 2 右松脂烷型二萜类化合物： y u c a l e x i nb 18 o y u c a l e x i nb 2 0 o y u c a l e x i np 2y u c a l e x i np - 4 y u c a l e x i np 8 3 o h o h y u c a l e x i np - 10 y u c a l e x i np 12 o y u c a l e x i np 1 5 阿替烷型二萜类化合物： o h y u c a l e x i np - 1 7 海南产木薯化学成分及其生物活性的研究 甾体化合物： h o 酚类化合物： h o h o h o m e o h o c h o l e s t e r o l h o 图1 - 2 木薯中的甾体化合物 f i g 1 - 2s t e r o i d sf r o mm a n i h o t e s c u l e n t a e s c u l e t i n s c o p o l e t i n o h o h c a t e c h i n g l u o h o m e o g l u o o h h o e s c u l i n s c o p o l i n o h o ho q u e r c c t i n o h o h 图l - 3 木薯中的酚类化合物 f i g 1 - 3p h e n o l i c sf r o mm a n i h o te s c u l e n t a 5 r u t i n 1 2 2 药理活性研究 木薯受伤后，在外界环境的刺激下，会累积大量的次生代谢产物，来起保护自已的 作用，这些次生代谢产物有很好的生物活性，它们的累积可以防上氧化反应所带来的伤 害和微生物的侵害。陶海腾等对木薯叶中的总黄酮提取率进行研究，在乙醇浓度为5 0 、 提取温度7 0o c 、液料比为4 0m l g 、提取时间为2h 时，总黄酮提取率为干重的2 8 3 6 1 6 j 。 木薯叶可以用来冶疗膀胱炎，效果比较显著，而且没有副作用，木薯叶的这些保健功能 可能与叶中所含的黄酮类化合物有关。我们在本节介绍木薯中的主要化学成分的药理活 性。 东莨菪亭( s e o p o l e t i n ) 又称东莨菪内酯、莨菪酚，属香豆素类化合物。研究表明， 东莨菪亭具有很好的药理活性，如抗肿瘤、防治高尿酸血症、降血压、降血脂、解痉、 镇痛、及抗炎等作用，特别是抗肿瘤和防治高尿酸血症方面活性，引起了国内外广泛的 关注【l5 1 。随着化学、合成化学、分子生物学、分子药理学的发展，更多的东莨菪素衍生 物的生理和生物活性被人类所认识和发现，寻找更多高效低毒的东莨菪亭类药物已成为 药物研发工作的重要方向之一。 七叶内酯( e s c u l e t i n ) 又称七叶素，作为天然药物秦皮的有效活性成分，能明显的 抑制肝癌、乳腺癌、白血病等多种肿瘤细胞的增殖、起到诱导肿瘤细胞凋亡的作用。并 且七叶内酯对下肢深静脉血栓所导致的肢体肿胀不适安全有效【1 6 1 。戴榕等【l7 】发现七叶内 酯能有效抑制r v s m c s 的增殖。而且七叶苷具有抗菌抗炎，平喘，抗过敏及皮肤保护作 用，并且对人肺腺癌细胞株a 5 4 9 的有生长抑制作用i l 引。 儿茶素( c a t e c h i n ) 是很强的天然抗氧化剂，具有生物活性，具有抗病原体、增强机 体免疫力、防癌抗突变、抗炎抗心律失常、抗血栓、降低血糖、降血脂和胆固醇等药理 作用【1 9 1 。曾亮等1 2 0 1 对儿茶素的抗菌活性和机理作了研究，发现儿茶素对金黄色葡萄球菌 ( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 和大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 有抑制制用。刘珊丽等1 2 l j 研究了 儿茶素对大鼠脑缺血灌注损伤的保护作用及机制，表明儿茶素的抗炎和抗氧化作用可能 对脑部有保护作用。儿茶素能有效抑制前列腺癌发展过程中的关键酶类活性，而且有效 浓度很低，在一定程度上更有力地证明t j l 茶素抗前列腺癌的作用机制瞄j 。并且儿茶素 能抑制癌细胞转移，对肝癌细胞有抑制作用，能诱导肝癌细胞凋亡1 2 3 】。 槲皮素( q u e r c e t i n ) 具有很强的生物学活性及广泛的药理作用。槲皮素具有抗肿瘤、 抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、降压和调节免疫功能等多种生物活性 2 4 , 2 5 】。大量研究证 实：槲皮素对前列腺癌、白血病、鼻咽癌、肝癌、胃癌及视网膜母细胞瘤等多种肿瘤细 胞有抑制增殖的作用，是颇具应用前景的抗癌药物之一i 驯。 芦丁( r u t i n ) 又名芸香苷、紫槲皮苷，为一来源很广的黄酮类化合物，是一种具有 广阔开发前景的药用植物活性成分。芦丁有很好的抗氧化作用、抗病毒作用、抗急性胰 腺炎、对胃黏膜的保护作用和血管舒张作用【2 7 j 。 6 海南产木薯化学成分及其生物活性的研究 1 3 本课题研究的目的和意义 木薯广泛种植于全球热带地区，对光、热、水资源的利用率都非常高，单位面积的 生物能产量几乎高于其它所有栽培作物，在生物质能源的开发和利用中有非常重要的作 用。我国生产木薯主要是利用其块根部分，而对其它部分的利用较少。木薯的茎杆除少 量留作生产用种以外，人们大多将这些茎杆就地焚烧或抛弃，没有得到充分的利用。木 薯块根部分用于工业也会生产会产生大量的废渣。这些茎秆和废渣若直接丢弃，不仅造 成了资源的浪费，还造成了严重的环境污染。随着国内学者对木薯资源利用方面研究的 深入，对木薯茎杆和废渣的研究主要体现在粉碎还田、培养食用真菌和生物质能源利用 等方面。木薯所含的次生代谢产物也很丰富，并没有得到很好的利用。本研究对木薯次 生代谢产物进行研究，旨在木薯的工业生产生的废渣和茎杆的充分利用提供理论指导。 4 4 本课题的主要研究内容 本课题第一部分主要对木薯茎和叶的挥发油成分和生物活性进行研究，先采用 g c m s 对挥发油化学成分进行分析，再测定其抗菌活性和细胞毒活性。第二部分主要 研究茎中的化学成分，首先对茎的乙醇提取物的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水 相进行抗氧化活性筛选，发现乙酸乙酯相的抗氧化活性最强。通过各种色谱层析方法对 乙酸乙酯相进行分离纯化，共分离得到1 5 个纯化合物，再运用n m r 、2 d - n m r 、m s 等技术对这些纯化合物进行波谱分析，鉴定其结构。第三部分对分离得到的纯化合物进 行抗氧化、抗菌和细胞毒活性筛选。本课题旨在对木薯次生代谢产物进行研究，对木薯 资源的充分利用提供理论基础和科学依据。 7 2 1 材料 2 1 1 植物 第二章实验材料与仪器 木薯( m a n i h o te s c u l e n t ac r a n t z ) 茎杆( 7 5 0k g ) 于2 0 0 8 年1 1 月采自海南省文昌 市，由中国热带农业科学院生物技术研究所王文泉研究员鉴定，植物凭证标本 ( m e 0 8 11 1 2 ) 存放于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。 2 1 2 肿瘤细胞株 人肝癌细胞( s m m c - 7 7 2 1 ) 、肺腺癌细胞( s p c a 1 ) 、人胃癌细胞( s g c - 7 9 0 1 ) 和人 慢性髓原白血病细胞( k 5 6 2 ) 均购于中国科学院细胞库。 2 1 3 人体病原菌 金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) a t c c5 1 6 5 0 和耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌( m e t h i c i l l i n - r e s i s t a n ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，m r s a ) a t c c9 5 5 1 由中国热带农业科 海南产木薯化学成分及其生物活性的研究 a b i s d p p h 抗坏血酸 t r o l o x 四甲基偶氮唑蓝( m t t ) 和r m p i - 1 6 4 0 小牛血清、青霉素和链霉素 硫酸卡那霉素 硫酸链霉素( 批号：h 1 3 0 2 0 6 5 0 ) 香草醛 乙酸 浓硫酸 常用有机试剂为国产a r 级试剂 精碘 m e m 和平衡盐溶液p b s s i g m a - a l d r i c h 公司 s i g m a - a l d r i c h 公司 s i g m a - a l d r i c h 公司 s i g m a - a l d r i c h 公司 s i g m a - a l d r i c h 公司 h y c i o n e 公司 上海生工有限公司 深圳华药南方制药有限公司 广东光华化学厂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 淄博滨岭化工有限公司 天津大茂、天津福晨、广州化工等 s h a n g h a is u n h e a tc h e m i c a lc o ，l t d 北京欣经科公司 硫酸显色剂：1 0 的浓硫酸乙醇溶液，或1 0 浓硫酸香草醛乙醇溶液。喷洒后处 理：空气中干燥1 5r a i n ，再加热至1 1 0o c 直至出现颜色或荧光。 碘化铋钾( d r a g e n d o r f 0 显色剂：溶液：取0 8 5g 次硝酸铋，溶于1 0m l 冰醋酸 以及4 0m l 水中。溶液：取8g 碘化钾溶于2 0m l 水中。取、等体积混合液1m l 与2m l 乙酸，1 0m l 水混合即可。鉴别生物碱及含氮化合物的常用试剂。 碘：在密闭的玻璃缸内将少许碘结晶与适量的粗硅胶搅拌混匀，显色时，将薄层板 没入硅胶粉内一会儿后取出即可。 2 1 6 常用耗材 实验中常用的耗材见下表( 2 2 ) 。 表2 - 2 耗材 t a b l e2 2m a t e r i a l s 名称生产厂家 柱层析用硅胶( 6 0 8 0m e s h 、2 0 0 3 0 0m e s h ) 薄层层析硅胶h 薄层层析硅胶板( g f 2 5 4 ) 青岛海洋化工集团公司 青岛海洋化工集团公司 青岛海洋化工厂分厂 9 2 2 仪器设备 实验中所用的主要仪器见下表( 2 - 3 ) 。 表2 - 3 仪器设备 t a b l e2 - 3e q u i p m e n t s 1 0 海南产木薯化学成分及其生物活性的研究 第三章海南产木薯茎和叶挥发油 3 1 材料和方法 3 1 1 植物材料 木薯( m a n i h o te s c u l e n t ac r a n t z ) 茎和叶( 各1 0 0g ) 于2 0 0 8 年1 1 月采白海南省文昌 市，由中国热带农业科学院生物技术研究所王文泉研究员鉴定，植物凭证标本 ( m e 0 8 111 2 ) 存放于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。 3 1 2 挥发油的提取 木薯的茎和叶经粉碎后用乙醇超声提取三次，每次处理3 0m i n ，合并乙醇提取液， 回收乙醇后得到乙醇浸膏，将这些浸膏分散于水中，再用乙醚萃取，回收乙醚后即得木 薯茎和叶的挥发油。最终得到茎挥发油为0 3 3g ，得率为0 3 3 ；叶挥发油1 7 3g ，得率 为1 7 3 。 3 1 3g c m s 分析条件 仪器为美国惠普公司的h p 6 8 9 0 5 9 7 3g c m s 联用仪。气相色谱条件：色谱柱为 h p - i n n o w a xp o l y e t h y l e n eg l y c o l ( 3 0m x 0 2 5m m x 0 2 5g m ) 弹性石英毛细管柱，柱温5 0 o c ( 保留1m i n ) ，以4o c r a i n - 1 升温至2 3 0o c ，保持1 0m i n ；汽化室温度2 5 0o c ；载气为 高纯h e ( 9 9 9 9 9 ) ；载气流量2 0m l m i n 1 ；进样量1 l ；分流比5 0 ：1 。 质谱条件：离子源为e i 源；离子源温度2 3 0o c ；四极杆温度1 5 0o c ；电子能量7 0 “；发射电流3 4 6 a ；倍增器电压8 3 7 v ；接口温度2 8 0o c ；质量范围1 0 5 5 0 a i n u 。 数据处理及质谱检索：通过h p m s d 化学工作站，结合n i s t 2 0 0 5 标准质谱图库和 w i l e y 2 7 5 质谱图库进行鉴定，采用色谱峰面积归一化法计算相对含量。 3 1 4 生物活性测定 3 1 4 1 细胞毒活性测定方法 采用m t t 法【2 引，设阴性对照组、阳性对照组( 丝裂霉素o 和待测样品组，将每 个待测样品设5 个浓度梯度。选取对数生长期的细胞，用r p m l l 6 4 0 完全培养制成单细 胞悬浮液，用血球计数板计数，按5 0 0 0 0 个m l 接种9 0g l 于9 6 孔平底细胞培养板，其 中k 5 6 2 中直接加入样品1 0 【f l ，而s m m c 一7 7 2 1 和s g c 7 9 0 1 经培养2 4h 后，再加入样 1 2 海南产木薯化学成分及其生物活性的研究 品1 0 l ，培养条件为5 c 0 2 、湿度9 0 以上、3 7o c ，加入样品后继续培养7 2h ，之 后取出，置于显微镜下观察每孔细胞形态。然后加入5m g m l 的m t t 溶液1 5p l ，3 7o c 反应4h 后，吸弃上清，再向各孔加入1 0 0g ld m s o ，待充分溶解后，用e l x 8 0 0 酶标 仪测量各孔的o d 值( 测量波长为4 9 0r i m ) ，按公式3 1 计算抑制率。以样品浓度为横坐 标，以抑制率为纵坐标，作图并求出抑制率为5 0 时样品的浓度( i c 5 0 ) ，样品活性检测 结果以半数抑制浓度0 c 5 0 ) 表示。 抑制率= 型里塑号募墓麦斧- 。 ( 公式3 。) 3 1 4 2 抗茵活性测定方法 采用滤纸片琼脂扩散法啪颂0 定待测样品的抗菌活性。a u r e u s 和m r s a 采用n a 培养 基。将sa u r e u s 和m r s a 分别制成一定浓度的菌悬液( 1 0 5 1 0 7c f u m l ) ，用棉签将其均匀 涂布于供试无菌平板，制成含菌平板。然后将待测样品配成的浓度为5 0r a g m e 的样品 溶液，取5 0 l 分别滴加于灭菌滤纸片上( 0 = 6m m ) ，待溶剂挥干后将滤纸片贴于含菌 平板上。& a u r e u s 和m r s a 以硫酸卡那霉素作为阳性对照。& a u r e u s 和m r s a3 7o c 恒温 培养。2 4h 后观察结果，测量并记录抑菌圈直径。 3 2 实验结果 3 2 1 木薯茎挥发油成分分析 木薯茎挥发油成分的g c m s 分析结果见表3 1 ，共有2 5 个挥发油成分被鉴定，占总 挥发油的8 3 5 3 。其中棕榈酸( f a l m i t i ca c i d ) 3 1 3 9 、油酸( o l e i ca c i d ) 8 9 4 、亚油酸 ( l i n o l e i ca c i d ) 5 5 7 、十八烷酸( s t e a r i ca c i d ) 5 3 2 、植醇( p h y t 0 1 ) 4 8 2 、二十二烷酸 ( d o c o s a n o i ca c i d ) 4 5 7 、亚麻酸甲酯( m e t h y ll i n o l e n a t e ) 4 15 、二十一烷( h e n e i c o s a n e ) 4 1 和二十四烷( t e t r a c o s a n e ) 4 0 3 为木薯茎挥发油的主要成分，这些主要成分占总挥 发油的7 2 8 9 。 b u n d n c e 2 2 0 0 0 0 0 2000000 1800000 1 6 0 0 0 0 0 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 图3 - 1 木薯茎挥发油的g c m s 色谱图 f i g 3 - 1c h r o m a t o g r a mo fv o l a t i l ec o m p o u n d sf r o ms t e m so fm e s c u l e n t ac r a n t z 表3 - 1 木薯茎挥发油的g c m s 化学成分分析及相对含量 t a b l e3 1g c m si d e n t i f i c a t i o no fv o l a t i l ec o n s t i t u e n t sf r o ms t e m so fc a s s a v aa n d r e l a t i v ec o n t e n t s n o r e l a t i v e c o m p o u n d f o r m u l am o l e c u l a r r e l a t i v e s i m i l a r i t y ! i 堡! f 坐也! 型璺g 坠塑望堕坐i 丝!f 堑2 8 3 7 1 0 6 8 1 2 4 4 1 2 7 6 1 3 8 0 1 4 2 7 1 5 0 6 1 5 6 8 1 8 4 8 2 0 9 l 2 1 2 2