（制糖工程专业论文）整合子—耐药基因盒系统介导食源微生物耐药机制的研究.pdf

摘 要 摘 要 食品的质量和安全问题是全球普遍关心的焦点。食源性疾病作为威胁人类健康的一类疾病已经引起相关研究人员的注意。 沙门氏菌是引起食物中毒的一类重要的病原微生物，由于人类在临床上和畜牧养殖业中滥用抗生素，在过去的 1 0年中，沙门氏菌的耐药性也呈现越来越严重的趋势。细菌的耐药机制，传播耐药性质粒和转座子的研究比较多。近年，整合子一 耐药基因盒系统成为研究人员关注的热点，其对细菌耐药性的介导作用已经得到逐步的确认，其中，第一类整合子对介导细菌的耐药性具有更重要的的意义。 为了探讨第一类整合子在食源性细菌耐药机制中的介导作用，对来自广州市健康食品从业人员分离到的 2 3株沙门氏菌做第一类整合子的筛选。首先研究了它们对 1 0种常用抗生素耐药性情况。结果表明所有的菌株对其中至少一种抗生素产生耐药。应用p c r 法和菌落杂交方法检测第一类整合子，发现 4 株第一类整合子阳性菌株，以工 n - f 和 工 n - b 对其整合的耐药基因盒进行扩增，并对扩增片段进行序列分析。结果表明，在 4株第一类整合子阳性菌株中，2株各产生一个1 0 0 9 b p 片段，1 株产生一个 1 6 6 4 b p片段，1 株产生 1 0 0 9 6 p 和 1 6 6 4 b p两个片段。序列分析结果表明， 1 0 0 9 b p 为 a a d a 2 耐药基因盒， 对链霉素和壮观霉素产生耐药。1 6 6 4 b p 含有a a d a 5 和 d f r 1 7 两个耐药基因盒， 分别对链霉素、 壮观霉素和甲氧氨节嚓 uq耐药。 为了研究第一类整合子的基因定位及其拷贝数， 进行了s o u t h e r n 杂交实验和质粒接合实验。选择在第一类整合酶基因 i n t n 无酶切位点的 e c o r i 和 e c o r v对染色体 d n a 进行限制性酶切，酶切后的染色体 d n a 和质粒d n a分别与p c r 产生的并由地高辛标记的 i n t o 探针进行杂交，在质粒 d n a上无杂交信号。同时在质粒的接合转移实验中无接合子产生，说明了第一类整合子不存在于质粒d n a 上。而染色体d n a 的杂交实验表明了第一类整合子的位置和拷贝数， s . t s h i o n g w e s 1 4和 s . t s h i o n g w e s 1 2 6 为2 个拷贝，s . t s h i o n g w e s 1 9 1和 s . h a d a r s 8 7 为单拷贝。 以 4株第一类整合子阳性菌株和 4株整合子阴性菌株为研究对象，用任意引物 p c r ( a p - p c r )和肠杆菌间间隔重复序列 p c r ( e r i c - p c r )两种方法测定 d n a指纹图谱，来分析菌株第一类整合子的特性与基因分型之间的关系。两种方法对实验菌株确定出统一并与第一类整合子特性相关的基因型，而 a p - p c r方法较e r i c - p c r 方法比较，在区分菌体基因型方面能力更强。 为研究第一类整合酶基因对耐药基因盒捕获和表达的调控因子和调控过程，采用了反向 p c r方法扩增第一类整合酶基因上游未知的 d n a片段。用 h i n d i i i 对 t s h i o n g w e s 1 9 1 染色体 d n a 进行限制性酶切，酶切产物自身环化。设计第一华南理工大学工学博士学位论文类整合酶基因的反向引物，扩增第一类整合酶上游未知 d n a片段，产生 1 5 0 2 b p大小的d n a片段，将该片段克隆到 p g e m上，转化大肠杆菌，筛选转化子，提取质粒后对其测序。序列分析的结果表明，在第一类整合酶上游未知 d n a序列的1 0 5 2 b p 大小的片段中， 含有两个解离酶结合位点和一个开放阅读框， 推测该开放阅读框可能为第一类整合酶基因的调控因子。 本论文研究了第一类整合子介导的食源性微生物的耐药特性， 提示我们应该全面对细菌的耐药性进行监测。同时，本论文的数据对细菌耐药基因的控制和表达的研究奠定了基础，也为控制致病菌的耐药性传播提供了研究思路。关键词:整合子 耐药基因盒 整合酶 沙门氏菌a b s t r a c ta b s t r a c t t h r o u g h o u t t h e w o r l d f o o d s a f e t y a n d q u a l i t y i s a t o p i c o f p u b l i cc o n c e r n a n d w e l l p u b l i c i z e d . w i d e s p r e a d f o o d b o r n e d i s e a s e o u t b r e a k s h a v ec r e a t e d a n a w a r e n e s s o f p o t e n t i a l t h r e a t s t o h u m a n h e a l t h . s a l m o n e l l as p e c i e s a r e a n i m p o r t a n t g r o u p o f b a c t e r i a l p a t h o g e n i n h u m a n . m o r e a n dm o r e m u l t i d r u g - r e s i s t a n c e s a l m o n e l l a i s o l a t e s h a v e a t t r a c t e d a t t e n t i o nw i t h i n p a s t o n e d e c a d e s , p r e s u m a b l y d u e t o t h e e x t e n s i v e u s e o fa n t i m i c r o b i a l a g e n t s i n h u m a n a n d v e t e r i n a r y m e d i c i n e s . s e v e r a lm e c h a n i s m s i n v o l v i n g m o b i l e g e n e t i c e l e m e n t s , s u c h a s p l a s m i d s a n dt r a n s p o s o n s h a v e b e e n s h o w n t o c o n t r i b u t e t o t h e s p r e a d o f t h i s r e s i s t a n c e .i n r e s e n t y e a r s , t h e r o l e o f i n t e g r o n s a n d g e n e c a s s e t t e s i n t h e s p r e a do f a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e i s w e l l e s t a b l i s h e d . c l a s s 1 i n t e g r o n s i s t h em o s t s t u d i e d a n d i s l a r g e l y i m p l i c a t e d i n t h e d i s s e m i n a t i o n o f a n t i b i o t i cr e s i s t a n c e . t w e n t y - t h r e e s t r a i n s o f s a l m o n e l l a s p p . i s o l a t e d f r o m h e a l t h y h u m a n si n g u a n g d o n g , c h i n a , w e r e e x a m i n e d f o r t h e i r s u s c e p t i b i l i t y t o t e n c o m m o na n t i b i o t i c s a n d t h e p r e s e n c e o f a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e i n t e g r o n s . a l l t h es t r a i n s w e r e r e s i s t a n t t o a t l e a s t o n e a n t i b i o t i c , a n d 4 s t r a i n s w e r ep o s i t i v e f o r i n t l l g e n e . p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n u s i n g i n - f a n d i n - bp r i m e r s s h o w e d e x i s t e n c e o f a m p l i c o n s o f 1 , 0 0 9 i n l , a n d 1 , 6 6 4 b y i n 1 ,a n d 1 , 0 0 9 b y a n d 1 , 6 6 4 b y i n 1 o f t h e初t l l - p o s i t i v e i s o l a t e s , r e s p e c t i v e l y .s e q u e n c e a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t 1 , 0 0 9 6 p a m p l i c o n h a r b o r e d g e n e c a s s e t t ea a d a 2 c o n f e r r i n g r e s i s t a n c e t o s p e c t i m o m y c i n , a n d 1 , 6 6 4 a m p l i c o n h a r b o r e dg e n e s a a d a 5 a n d d f r 1 7 c o n f e r r i n g r e s i s t a n c e t o s p e c t i m o m y c i n ,s t r e p t o m y c i n a n d t r i m e t h o p r i m . c h r o m o s o m a l d n a w a s d i g e s t e d w i t h r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e凡叔 t a n de c o r v , w h i c h h a s n o c u t p o s i t i o n i n i n t l l g e n e . h y b r i d i z a t i o n w a sp e r f o r m e d w i t h p c r g e n e r a t e d d n a p r o b e s p e c i f i c f o r i n t l l . t h e r e w a s n os i g n a l o n p l a s m i d d n a . m e a n w h i l e t h e e x p e r i m e n t o f p l a s m i d c o n j u g a t i o nw a s f a i l e d . t h e p r o b e h y b r i d i z e d t o g e n o m i c d n a f r o m a l l t h e f o u r i s o l a t e s ,s u g g e s t i n g t h e p r e s e n t s o f t h e l o c a t i o n s a n d t h e c o p y n u m b e r s o f c l a s s1 i n t e g r o n s i n t h e s e s t r a i n s . s . t s h i o n g w e s 1 4 a n d s . t s h i o n g w e 5 1 2 6 w e r et w o c o p i e s , w h i l e s . t s h i o n g w e 5 1 9 1 a n d s . h a d a r s 8 7 w e r e o n e c o p y . f o u r i n t e g r o n - p o s i t i v e i s o l a t e s a n d f o u r i n t e g r o n - n e g a t i v e i s o l a t e sm华南理工大学工学博士学位论文w e r e t e s t e d d n a f i n g e r p r i n t f o r d e t e c t i o n t h e i r g e n e t y p i n g b y a r b i t r a r i l yp r i m e d p c r ( a p - p c r ) a n d e n t e r o b a c t e r i a l r e p e t i t i v e i n t e r g e n i cc o n s e n s u s ( e r i c ) p c r . t w o m e t h o d s y i e l d e d u n i q u e f i n g e r p r i n t f o ri n d i v i d u a l s e r o v a r s a n d i n t e g r o n s , a n d a p - p c r w a s s e n s i t i v e t h a ne r i c - p c r i n d i s c r i m i n a t i o n o f 8 i s o l a t e s . i n o r d e r t o e s t a b l i s h t h e r e g u l a t i o n f a c t o r a n d f u r t h e r c o n t r o l l i n gt h e e x p r e s s i o n o f c l a s s 1 i n t e g r a s e . i n v e r s e p c r w a s u s e d f o ra m p l i f i c a t i o n o f u p s t r e a m d n a s e q u e n c e o f i n t 1 1 . c h r o m o s o m a l d n a o f s .t s h i o n g w e s 1 9 1 w a s d i g e s t e d b y h i n a i l l a n d w a s r o t a t e d i t s e l f . i n v e r s ep r i m e r s w e r e d e s i g n e d f o r a m p l i f i c a t i o n o f c l a s s 1 i n t e g r a s e . a m p l i c o n so f 1 , 5 0 2 b p w a s p r o d u c e d . t h e s e q u e n c e w a s c l o n e d i n p g e m - t a n d s e q u e n c e d .s e q u e n c e a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t a n o r f , w h i c h m a y b e a c t a s t h e r e g u l a t i o nf a c t o r a n d c o n t r o l t h e e x p r e s s i o n o f c l a s s 1 i n t e g r a s e . i n t h i s s t u d y , s i t u a t i o n o f a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e i n t e g r o n - m e d i a t e da m o n g s a l m o n e l l a s t r a i n s f r o m h e a l t h y h u m a n s w a s d e m o n s t r a t e d w i t he x p e r i m e n t a l d a t a . t h i s s t r e s s e s t h e n e e d f o r a l l r o u n d s u r v e i l l a n c e o ft h e a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e o f p a t h o g e n s . f u r t h e r m o r e , t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t s a l s o l a y a f o u n d a t i o n f o r c o n t r o l l i n g t h e e x p r e s s i o n o f a n t i b i o t i cr e s i s t a n c e a m o n g b a c t e r i a , a n d s h e d l i g h t o n e x p l o r a t i o n o f n e w d r u g s a n dn e w m e t h o d f o r k i l l i n g t h e p a t h o g e n s .k e y w o r d s : i n t e g r o n s , a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e g e n e c a s s e t t e s , i n t e g r a s e ,s a l m o n e l l a s t r a i n si v 华南理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作 者 签 名 : y v i 6日期: 2 0 0 4年 0 6月 才 日学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在_年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密mo ( 请在以上相应方框内打 “v v)作 者 签 名 : 今 衣 ? 穗日期:2 0 0 4 年 0 6月 x 日导师签名: 4 -0 9 -4 -0 9 - 010 4-日 期:2 0 0 4 年0 6 月 万日英文所写词表英文缩写词表英文缩写a m pa p - p c r英文全称中文全称cefchldnaebe d t aga m p i c i l l i na r b i t r a r i l y p r i m e r d p c rc e f o t a x i mec h l o r a m p h e n ic o ld i t h y l r i b o n u c l e i c a c i de t h i d u m b r o m i d ee t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i dg r a mg e n g e n t a m i c i nh r h o u rk a n k a n a m y c i nk b k i l o b a s e sl l i t e rl b l u r i a - b e r t a n i m e d i u mm g m i l l i g r a mm i n m i n u t em l m i l l i l i t e rm v m o l e c u l a r w e i g h n i t r o b l u e t e t r a z o l i u m / 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o -n b t / b c l p p h o s p h a t e n a t i o n a l c o m m i t t e e f o rn c c l s c l i n i c a l l a b o r a t o r y s t a n d a r d so d o p t i c a l d e n s i t yp c r p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o np h p o w e r o f h y d r o g e nr p m r o t o r p e r m i n u t es d s s a i u m d a e c y l s u l p h a t es e c s e c o n d 氨节青霉素 任意引物p c r 头抱嚎肪 氯霉素 脱氧核糖核酸 漠化乙锭 乙二胺四乙酸 克 庆大霉素 小时 卡那霉素 碱基数 升 l b 培养基 毫克 分钟 毫升 分子量 氯化氮蓝四51/ 5 - 澳- 4 - 氯- 3 - v i a; k -l y l 磷酸 二钠盆美国临床实验室标准化委员会光密度值聚合酶链反应酸度值转速/ 每分钟十二烷基磺酸钠秒华南理工大学工学博士学位论文s m xs p ts t rs u ls x tt a et e tt r i svs u l f a m e t h o x a z o l es p e c t i n o m y c i ns t r e p t o m y c i ns u l f a me t h o x a z o l es u l f a m e t h o x a z o l e - t r i m e t h o p r i mt r i s a c e t i c a c i d e d t at e t r a c y c l i n et r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i m o m e t h a nv o l t复方新诺明壮观霉素链霉素磺胺复方新诺明t r i s乙酸缓冲液四环素三轻甲基氨基甲烷电压vi第一章 绪论 第一章 绪 论 二十一世纪，食品安全问题已经成为人类健康和发展的主题。由微生物引起的食源性疾病不断产生。这其中由于抗生素的滥用，导致食品中耐药菌产生并对食品原料污染起重要的作用。明确食源性细菌耐药的基因机制，控制细菌耐药性的传播，开发出能够抑制细菌耐药性产生的活性物质己成为当今营养、疾病预防学和生物科学领域研究的重要使命，整合子一耐药基因盒系统 已成为微生物学和生物医学领域里的热门研究课题之一，为揭开细菌耐药性机制和控制细菌耐药性的表达提出了一个全新的生物遗传概念和研究方向。1 . 1 抗生素应用与食品安全1 . 1 . 1抗生素应用现状 历史上，细菌感染曾严重威胁着人类的生存与发展。以弗莱明发现青霉素为开端，人们不断从微生物次级代谢产物中找到众多有效的抗生素并由此开发出半合成抗生素，青霉素作为第一种应用于临床的抗生素，成功解决了临床上金葡菌感染这一难题。随后以红霉素为典型代表的大环内醋类抗生素药物的问世义使肺炎、 肺结核的死亡率降低了8 0 %. 氨基糖贰类抗生素2 0 世纪 7 0 年代曾广泛用于下呼吸道感染，作为抵御细菌感染的广谱抗菌药物，给器官功能不全患者第二次生命器官移植，以及癌症、艾滋病患者治疗过程中不断出现严重的真菌感染和延续患者生命的各种导管及假体的组织拼接中提供了极大的治愈儿率等等 l . 2 。半个世纪来，抗生素为人类健康做出了卓越贡献，并推动了以生产抗生素为目的的微生物工程技术的快速发展，同时，对于生物学、化学、分子生物学等基础科学进展亦有重要反馈影响。 抗生素类药物的作用不仅发挥在临床医学上，在农业生产中也发挥重要的作用，如粮食储藏、动物饲养、农业增产等方面。自 1 9 6 3年日本生产的杀稻瘟菌素 s ( b l a s t i c i d i n s ) 替代了毒性很大的有机汞农药防治稻瘟病以来， 农用抗生素的研究开发受到很大关注，之后又发现了高杀虫活性的微生物代谢产物，如抗霉素a 、 杀粉蝶素、 金链菌素等具有相当强的农业害虫的触杀作用【 . 1 9 5 0 年美国食品与药物管理局 ( f d a )首次批准抗生素用作饲料添加剂后，世界各国相继进行抗生素的饲喂实验，并用于畜牧生产。抗生素的应用给畜牧生产的发展做出了巨大的贡献，饲用抗生素可抑制畜禽消化道内有害微生物的生长和繁殖，减少体内营养消耗，节省维生素和蛋白质等，促进消化道内合成动物必需营养物质的有益菌群的生长、繁殖，使营养物质的合成增加，抑制或杀灭某些病原微生物，增强畜禽的抗病能力， 防止疾病， 使肠壁变薄， 从而有利于营养成份的渗透与吸收，华南理工大学工学博士论文增进食欲，同时可刺激脑下垂体分泌激素，促进发育 5 ,6 1 正是由于抗生素在临床上和农产品原料生产中的重要作用，使人类对抗生素的认识也时常陷入误区，除了在医疗上抗生素的大量滥用之外，在食品原料的生产和加工中也出现更另人担忧的抗生素滥用局面。在临床住院患者中，抗生素应用率为7 9 %， 这一数字远远高于英国的2 2 %和各国平均水平3 0 0/ % 7 , 9 1 。 人类滥用抗生素问题己引起有关方面的高度重视，但对于使用抗生素的另一歧途- 一牲畜大量使用并进而危害环境，却缺乏足够的认识。在畜牧养殖上，目前国外用于饲料的抗生素有6 0 余种，国内应用的有 3 0 余种，如青霉素、链霉素、四环素、土霉素 等 s 1 。 现代养殖业日 益 趋向 干 规模化、 集约化， 使用抗生素、 维生 素、 激素、金属微量元素等，更成为保障畜牧业发展必不可少的一环。由于科学知识的缺乏和经济利益的驱使，在养殖业中滥用药物的现象更加普遍1 9 1 。在我国情况尤为严重，据有关部门调查，我国合理使用抗生素的比例只占5 0 - 6 0 % ，可见，抗生素在农副产品生产中的滥用情况十分严重。1 . 1 . 2抗生素对致病菌的作用机理 抗生素的作用机制，现多以干扰细菌的生化代谢过程来解释。有的抗生素能阻断能量供应系统， 有的能干扰微生物代谢中间物的合成或聚合过程，引起微生物形态结构的变化，改变遗传信息， 从而产生抑制作用 l o , 。抗生素对致病菌的作用主要包括以下几个方面: ( i ) 抑制细菌细胞壁的合成 细菌与人类细胞间的根本区别是细菌细胞具有细胞壁。细胞壁的主要作用是保护微生物免受周围环境的机械损伤和渗透压改变的影响。其主要成分是胞壁粘肤。胞壁粘肤的生物合成可分为胞浆内、胞浆膜及胞浆外 3 个阶段。当细胞壁受损，由于菌体内高渗透压，如在等渗环境中水分不断渗入， 致使细菌膨胀、 变形，在 自溶酶影响下破坏溶解而死亡。 抗生素能抑制微生物细胞壁的合成，使细胞壁变薄或失去完整性，造成细胞膜暴露，最后由于渗透压差导致原生质渗漏。某些抗菌药可干扰粘肤合成，从而使细菌细胞壁缺损。青霉素 ( p e n i i l l i n )、多氧霉素 ( p o l y o x i n )和尼可霉素 ( n i k k o m y c i n ) 等是作用于细胞壁的抗生素，这类抗生素主要引起细菌溶菌及真菌菌丝芽管和菌丝尖端出现膨大， 都能抑制细胞壁的合成 。 。 例如青霉素类和头抱霉素类能阻碍胞浆外阶段的粘肤交叉联接过程，革兰阳性球菌及杆菌细胞壁的粘肤成分较高，所以对这类细菌敏感。由于革兰阴性菌的细胞壁不但粘肤含量较少及粘肤被脂蛋白一多糖包裹，且菌内渗透压不太高，所以天然青霉素对革兰阴性菌不敏感。 此类机制的抗菌药物对繁殖期细菌作用明显， 对静止期细菌影响小，均为 “ 细菌繁殖期”杀菌抗生素。在这些抗生素使用治疗的过程中，高渗环境中第一章 绪论( 如肾髓质、脓液中)细菌细胞壁容易损伤或缺损，但是仍能继续生存，潜伏在生物体内，但无致病力，称 l型细菌。药物停止作用后，可迅速修补与合成细胞壁，恢复致病力，可引起疾病复发。如果联用其他机制的抗菌药物如氨基糖普类等，可协同杀灭静止期 l型细菌。 ( 2 )影响细胞膜的通透性 细菌细胞膜主要是由类脂质和蛋白分子构成的一种半透膜，是细胞的选择性屏障，具有渗透屏障和运输物质的功能，主要生理功能是控制细胞内与外界环境中各种物质的交换。多粘菌素类、多烯类抗生素、噢类等抗菌药物均能使细菌细胞膜通透性增加，可导致菌体内的蛋白质、核昔酸、氨基酸、糖和盐类等外漏，从而使细菌死亡。此外，有些酶和酶系统及核糖体也都定位在细胞膜上。细胞膜受某些抗生素的影响而遭到破坏时，就会丧失半透性的作用，从而使细胞内的重要代谢物质外渗，多粘菌素类能选择性地与细菌细胞膜中磷脂结合，使类脂质膜分子定向排列发生变更，细菌膜通透性增加，多烯类抗生素能与真菌细胞膜中固醇类物质结合形成胶粒性聚合物，在细胞膜上形成小孔，使细胞内容物泄漏，引起真菌死亡。哇类抗菌药物能抑制真菌细胞脂质的生物合成，使细胞膜结构和成分 发 生 改 变 11 。 ( 3 )抑制蛋白质合成 蛋白质的合成是细胞生长最基本的活动，它的合成受到抑制，势必抑制微生物的生长。蛋白质的合成分为 2 个过程 : 氨基酸结合在 t r n a上;核糖体上的氨基酸聚合反应。链霉素 ( s t r e p t o m y c i n ) 、春日霉素 ( k a s u g a m y c i n ) 、杀稻瘟菌素s ( b l a s t i c i d i n ) ,嗓吟霉素 ( p u r o m y c i n )等抗生素类药物主要作用于细菌核糖体，干扰细菌蛋白质的合成。细菌为原核细胞，其核蛋白体为 7 0 s , ，由 3 0 s与5 0 s亚基组成， 哺乳动物是真核细胞， 其核蛋白体为8 0 s由4 0 s 和6 0 s亚基构成，因而它们的生理、生化与功能不同仁 ， 2 。该类抗菌药物对细菌的核蛋白体具有高度的选择性毒性，但是不影响哺乳动物的核蛋白体和蛋白质合成。抑菌抗生素可与5 0 s亚基结合，使蛋白质合成呈可逆性抑制，使细菌难于生长，最终被宿主的免疫系统杀伤。 ( 4 )抑制核酸代谢 哇诺酮类抗生素可以抑制细菌 d n a旋转酶、干扰 d n a 及螺旋的形成，高浓度时尚有干扰 r n a及蛋白质合成的作用;利福霉素类能与d n a 依赖的r n a 聚合酶结合，抑制 r n a的合成，对结核分支杆菌有杀菌作用;硝基吠喃类进入菌体经还原产生的衍生物可使 d n a双链或单链破裂而具杀菌作用;在抑制真菌方面，灰黄霉素 ( g r i s e o f u l v i n )能够抑制表皮癣菌等真菌，在低浓度下就能抑制菌丝螺旋生长。 灰黄霉素通过抑制 1 4 c 尿啼咤和胸腺啼陡掺入核酸， 干扰真菌细胞 d n a合成，华南理工大学工学博士论文从而抑制真菌生长。此外，博莱霉素 ( b l e o m y c i n )能引起肿瘤细胞和细菌d n a的断裂，选择性地抑制d n a的合成。从而抑制肿瘤细胞的生长和繁殖 1 3 1 ( 5 )抗叶酸代谢 磺胺类与甲氧节叮分别可以抑制二氢叶酸的合成和二氢叶酸还原酶的作用。妨碍叶酸代谢，最终影响核酸的合成，从而抑制细菌的生长和繁殖。1 . 1 . 3抗生素滥用产生的食品安全问题 随抗生素发展和广泛使用尤其是不合理的使用， 同时产生一些问题， 其中主要是抗生素的毒副作用和日 益广泛的细菌耐药性问题u 4 . 15 。中国已成为世界上滥用抗生素最为严重的国家之一。据统计，中国每年有 8 万人死于抗生素滥用! 近来，在世界范围内发生的非典疫情，专家指出，滥用抗生素可能导致冠状病毒变异，也再次敲响了人类滥用抗生素的警钟。抗生素的滥用可能形成以下两个方面的负面效应: ( 1 )药物残留 药物残留是指在动物饲料中使用抗生素后，饲用抗生素以原形或中间代谢产物在动物的细胞、组织或器官中蓄积的现象。随着抗生素在农副产品加工中的大量应用，药物残留在食品原料中的现象越发常见，带来了产生食品安全问题。药物残留的危害主要表现有对动物本身产生的危害和由于饲用抗生素在动物产品中的残留对人体产生的危害。第一，大量抗生素被动物机体摄入后，随血液循环分布到各组织器官，一方面动物机体的免疫能力被逐渐削弱，另一方面还会影响免疫过程，对疫苗的接种产生不良影响。第二，药物残留对人体的危害通常不表现为急性中毒，而是呈现慢性作用，因而常被人们所忽视，当摄入药物残留一段时间，药物在体内蓄积达到一定量后，会对人体造成一定的危害。主要包括各种过敏反应、细菌耐药性、二重感染、致畸作用、致突变作用、致癌作用和激素样作 用 等 16 j ( 2 )细菌耐药性的产生 细菌耐药性是指原本对抗生素敏感的细菌由于自发性突变或获得外源基因引起遗传性状改变而对抗生素不再敏感的现象。早期细菌耐药的表现主要为某种细菌对某类药物耐药， 3 0 年代末磺胺药上市， 4 0 年代临床广泛使用磺胺药后， 1 9 5 0年日本报道 8 0 % - 9 0 % 的志贺氏痢疾杆菌对磺胺药耐药了。1 9 4 0 年青霉素问世后，1 9 5 1 年就发现金黄色葡萄球菌能产生 0 一 内酞胺酶灭活青霉素而对青霉素产生了耐药性，此后 6 0 年代、7 0 年代，细菌耐药性主要表现于金黄色葡萄球菌和一般肠道阴性杆菌中，由于它们能产生 日 一 内酞胺酶，使青霉素类和一代头抱菌素抗菌对其作用下降， 这样这些菌株对抗生素产生不同程度耐药性仁 ， 7 。 1 8 . 1 9 。 但当时这些耐药菌大多可被其后开发的一些抗生素与抗菌药所控制。 8 0 年代以后细菌耐药第 一章 绪论性逐步升级，自8 0 年代后期至9 0 年代， 人们对阴性杆菌产生的超广谱酶( e s b l s )和染色体介导的i 类酶引起了注意，并对由于广泛使用三代头抱菌素引起的对包括三代头饱菌素在内的多种抗生素耐药的多重耐药阴性杆菌的增加所有警惕。另外一个严重的问题是阳性球菌中出现了非常难治的多重耐药菌感染，这种高度耐药的多重耐药阳性球菌除个别抗生素外几乎对所有抗菌药物都耐药，对临床形成了很大的威胁，已引起全球的震惊和高度的重视。 在抗生素治疗过程中，细菌的耐药性可以遗传给下一代，也可以经转导、结合、转化等方式自耐药菌转移给敏感菌，敏感菌变为耐药菌，即获得性耐药。一般的规律是抗生素在开始应用时疗效好， 渐渐出现耐药， 最后大大丧失治疗价值，人类似乎陷入了“ 感染一 用抗生素一 培养出耐药菌株一 造成新的感染一 再用抗生素” 恶性循环的怪圈。这其中的原因主要有医生对使用抗生素适应症掌握不严，在临床上不重视病原学检查，患者对抗生素的认识局限在药物越贵越好，社会上的大量刊播抗生素广告，夸大其治疗作用，极大地误导了消费者。同时，最重要的，养殖业大量的应用抗生素，这些抗生素不仅会通过肉类食品进入人类食物链，还会随家畜的排泄物大量进入农田、农作物中，这将使大肠杆菌等 自然界广泛存在的微生物也产生耐药性。1 . 2细菌耐药产生机制1 . 2 . 1 细菌耐药性的生化机制 在抗生素的选择压力下， 微生物在维护其生存上会竭力从适应本能方面改变其代谢途径，并全力发挥防御功能而形成耐药机制。细菌对抗生素耐药的生化机制，就目前的研究结果主要有以下两种: ( l )细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌细胞内的抗生素使之失去活性， 如 日一内酞胺酶、氨基昔类钝化酶和氯霉素乙酞转移酶，目前在g - 杆菌中最引人注目的是细菌产超广谱p一内酞胺酶( e s b l s ) 和b u s h i 组d一内酞胺酶2 0 , 2 k o e s b l s可水解头抱咪肪、头袍他定等第三代头饱菌素而使之失活a b u s h i 组0一内酸胺酶为一种诱导酶， 在无抗生素的情况下， 只产生极微量的0 一 内酞胺酶， 当接触抗生素后， 可被诱导产生大量的酶， 而去除抗生素后产酶水平又可恢复正常。 另外，抗生素作用的靶位 ( 如核糖体和核蛋白)由于发生突变或被细菌产生的某种酶修饰而使抗菌药物无法发挥作用，以及抗生素作用的靶酶 ( 如青霉素结合蛋白和 d n a 促旋酶)的结构发生改变使之与抗生素的亲和力下降或靶酶过度表达，都可能使细菌产生耐药现象。 ( 2 ) 细菌壁屏障功能的改变，是指细菌细胞膜渗透性的改变或其他有关特性的改变，如细菌菌膜 ( b i o f i l m )的形成而使抗生素难以进入胞内。其中包括降华南理工大学工学博士论文低细菌细胞壁通透性和主动外排两种机制，以阻止抗生素进入细菌或将抗生素快速泵出， 泵出速度往往比流入速度更快2 2 , 2 a , 2 4 1 。 使得抗生素无法在细胞体内存在，不能发挥作用。 在不少耐药菌中耐药不仅只是存在一种机制， 常可由二种或多种机制形成。一般说，耐药菌只发生在少数细菌中，难于与占优势的敏感菌竞争，只有当敏感菌因抗菌药物的选择性作用而被大量杀灭后，耐药菌才得以大量繁殖而继发各种感染 。1 . 2 . 2 细菌耐药产生的基因机制 细菌耐药的生化机制，归根结底由细菌的基因机制控制， 对细菌耐药的基因机制，主要包括天然或基因突变产生的耐药性和从外界捕获耐药基因两个方面。 天然或基因突变产生的耐药性又称固有耐药，是细菌染色体基因决定的代代相传的天然耐药性。亦称突变耐药，通过染色体遗传基因d n a发生突变，细菌经突变后的变异株对抗生素耐药，细菌基因突变是一种自发性随机事件，无论抗生素是否存在。 但如果有抗生素选择压力的存在， 敏感细菌繁殖受到抑制甚至杀死，而携带有耐药基因的突变菌株却具有生存优势， 最终留下耐药亚群2 5 。 细菌的自发突变率约 1 0 -1 -1 0 - 1 ， 机率小，且不稳定，因此在无持续选择压力的环境下，细菌不可能形成稳定的耐药菌株，因此突变造成的耐药菌在自然界中仅居次要地位。而且，细菌要对结构无关的药物呈现多重耐药，则需多步突变才能形成，其出现机率是两次突变率的乘积，机会更小。因此，细菌通过自身遗传物质突变形成的耐药性不是造成今天如此严峻耐药局面的主要原因。 细菌在接触抗生素后产生的耐药性，可通过突变产生，但更主要的是通过获得新 d n a而产生的，发生的遗传基础大多是可移动遗传基因片段，如耐药质粒、转座子、和整合子等。这些 d n a片段常带有耐药基因，可从一个菌体转移到另一个菌体，可以是同种属的，也可以是异菌属的，这种转移使耐药菌增多，并易于传递散播。本文研究的整合子一耐药基因盒系统属于菌体从外界获得耐药性方面的研究。1 . 2 . 3环境中细菌耐药的诱导因素 细菌耐药性发展的如此迅速的主要原因除了其自身因素之外，还有环境因素作用。从自身因素来讲，细菌增殖非常迅速，并且细菌在人、动物体内以及环境中广泛存在。这为极端环境条件下细菌发生突变所获得的耐药基因，各种可动遗传因子以适当方式转移给其它环境中的细菌而表现耐药提供了前提。 而在环境因素中，最重要的是来 自抗生素的选择压力。 药物选择压力是诱导耐药菌及造成耐药基因转移的主要动力。所谓耐药性选第一章 绪论择压力是指可促使耐药细菌繁殖的环境条件。有人假设，产生突变或带有新基因的微生物如果得不到促使其存在的选择压力可能就不能存活。广泛使用抗生素所造成的选择压力是细菌耐药性产生和维持的主要驱动力。 抗生素选择压力对细菌耐药性的形成很重要，研究表明实验室内低浓度抗生素胁迫连续培养可诱导出稳定的耐药菌，另外，动物长时间饲喂或人长时间服用低水平四环素， 其肠道菌群会从敏感转为四环素耐药及多重耐药2 6 。 万古霉素耐药肠球菌 ( v r e )医院内感染率在欧洲及美国都很高，但欧洲社区的 v r e粪便携带率高达 2 % -2 8 % ，而美国社区内几乎无 v r e ，动物亦分离不到 v r e ，这些有差异的调查结果合理的解释应该是美国从来没有批准将糖肤类抗生素用作动物生长促进剂， 从而未对环境及动物体内的细菌形成广泛的选择压力 2 7 。曾对冰岛5 个不同社区7 岁以下儿童鼻咽内青霉素耐药和多重耐药肺炎球菌携带率与抗菌药消费相关性进行研究，结果发现，不管是个人还是社区，近期内 ( 2 -7周)抗菌药物的消费量与耐药菌的携带率显著相关。在芬兰，2 0 世纪 9 0年代耐红霉素链球菌在不断上升，从 1 9 8 8 - 1 9 8 9年的 5 % 上升到 1 9 9 0年的 1 3 % ，于是在全国倡导上呼吸道及皮肤感染的门诊病人中减少红霉素及其它大环内酷类药物的使用，结果发现，链球菌的红霉素耐药性稳定且显著下降，从 1 9 9 2 年的 1 6 . 5 % 降到 1 9 9 6 年的8 . 6 % r2 6 , 2 9 5 。 有人 3 6 1 检测了4 个月内未使用过抗菌药物和最近2 周内使用过抗菌药物的成人肠道大肠杆菌对 1 2种抗菌药物的敏感性，结果用药人群的肠道大肠杆菌耐药程度明显高于未用药人群，这个结果亦支持抗菌药物选择压力是细菌耐药性上升的重要原因的观点。 农业生产上使用抗生素亦可从多方面影响细菌耐药性。首先，畜禽、水产养殖中使用亚治疗水平的抗生素作为生长促进剂可给动物肠道细菌带来选择压力，诱导出抗生素耐药性;其次，农业上使用不纯抗生素制剂或抗生素产生菌发酵下脚料亦会带来耐药性，因为它们有抗生素生产菌的d n a 污染，这些d n a 可能携带有针对该抗生素的耐药基因，使用后，动物肠道菌可通过转化作用获得不纯抗生素中污染d n a的耐药基因，进而再经肠道菌散播到土壤、水源、植物甚至人体;另外， 农业上使用特定细菌作为生物杀虫剂可引起耐药因子的散播。 据p a t e l r 等报道，用作生物杀虫剂的日本甲虫芽胞杆菌含有的基因，在 d n a 水