（化学工程与技术专业论文）石莼光合膜蛋白复合体的提取及光合特性研究.pdf

单位代码： 学 号： 寸阂石油六学 硕士学位论文 1 0 4 2 5 s 0 7 0 3 0 4 3 2 c h i n au n i v e r s i t yo fp e t r o l e u mm a s t e rd e g r e et h e s i s 石莼光合膜蛋白复合体的提取及光合特性研究 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f p h o t o s y n t h e t i c m e m b r a n e p r o t e i nc o m p l e x e sf r o mu l v al a c t u c a 学科专业：化学工程与技术 研究方向：新能源与可再生能源 作者姓名：邱宇 指导教师：张曙光教授 于道永副教授 刘双讲师 二。一。年五月 帅1 1 1 l l l l l i l l l l l i n 1 1 1 1 1 m i 17 7 7 8 7 5 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f p h o t o s y n t h e t i c m e m b r a n ep r o t e i nc o m p l e x e sf r o mu l v al a c t u c a at h e s i ss u b m i t t e df o rt h ed e g r e eo fm a s t e r c a n d i d a t e ：q i uy u s u p e r v i s o r ：p r o f z h a n gs h u g u a n g a s s o c p r o f y ud a o y o n g l e c t ur e rl i us h u a n g c o l l e g eo fc h e m i s t r y & c h e m i c a le n g i n e e r i n g c h i n au n i v e r s i t yo f p e t r o l e u m ( e a s tc h i n a ) 独创性声明 指导教师指导下独立进行研究工作所 取得的成果，论文中有关资料和数据是实事求是的。尽我所知，除文中已经加以 标注和致谢外，本论文不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人 或他人为获得中国石油大学( 华东) 或其它教育机构的学位或学历证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对研究所做的任何贡献均己在论文中作出了明确的 说明。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名：j 啦 日期：力加年岁莎月，2 日 学位论文使用授权书 本人完全同意中国石油大学( 华东) 有权使用本学位论文( 包括但不限于 其印刷版和电子版) ，使用方式包括但不限于：保留学位论文，按规定向国家有 关部门( 机构) 送交学位论文，以学术交流为目的赠送和交换学位论文，允许学 位论文被查阅、借阅和复印，将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，采用影印、缩印或其他复制手段保存学位论文。 保密学位论文在解密后的使用授权同上。 学位论文作者签名： 王碧 指导教师签名：丝噬坠 奇连南 多、j 双 日期：矽伽年彩月吧目 日期：如矽年形月缈日 摘要 合膜蛋白结构与功能研究表明，绿藻在色素蛋白复合物的组成上具有 多样性，是绿藻适应海洋中特定生存环境的结果，暗示了海洋绿藻的光合膜蛋白在结构 和能量传递等方面具有特异性，但这些特异的色素组成及荧光特性有何重要的生理功 能，尚缺乏深入、系统的研究，本论文针对这些基础问题对绿藻石莼进行了研究。 首先，成功用差速离心法提取出石莼类囊体膜，石莼的捕光系统较大。首次采用冻 融连续蔗糖梯度离心方法成功提取出石莼捕光色素天线蛋白复合物i i ( l h c i i ) ， s d s p a g e 凝胶电泳分析表明，石莼l h c l l 只有2 7k d a 一条带，表明得到的是纯度较 高的l h c i i 样品。与菠菜l h c i i 相比，石莼l h c i i 缺少2 5k d a 的条带，表明在蛋白组 成亚型上二者可能存在差异。石莼l h c i i 与菠菜l h c i i 的色素组成大致相同，但石莼 l h c i i 含有独特的色素c h la 。将l h c i i 进一步蔗糖梯度分离，可以看到石莼和菠菜的 l h c i i 都主要以三聚体形式存在。石莼l h c i i 和菠菜l h c i i 相比，在圆二色光谱的蓝区 有更为明显的差异，表明石莼的类胡萝b 素分子与蛋白结合的构象上与高等植物不同。 其次，对石莼和菠菜类囊体膜热稳定性进行对比研究表明，石莼类囊体膜的变性温 度t m 值比菠菜类囊体膜的t m 值高5 。c ，在菠菜类囊体膜内，温度首先影响膜蛋白内 的能量传递，然后是色素之间的相互作用力和色素自身的变化。 最后，用水热合成法在f t o 玻璃上生成的纳米z n o 晶核分布比较均匀、粒径一般 在2 0 - - - 4 0r l n l ；用l b 膜仪把类囊体膜吸附在纳米z n o 上，形成的z 型l b 膜具有良好 的导电性能，而且随着l b 膜层数的增加短路电流不断增大，用菠菜类囊体膜制成的导 电膜开路电压和短路电流比相同层数石莼类囊体导电膜小。 关键词：膜蛋白；捕光色素天线蛋白复合物i i ；热稳定性；类囊体膜 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f p h o t o s y n t h e t i cm e m b r a n e p r o t e i nc o m p l e x e sf r o mu l v al a c t u c a q i uy u ( c h e m i c a le n g i n e e r i n ga n d t e c h n o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f z h a n gs h u g u a n g ，a s s o c p r o f y ud a o y o n g ，a n dl e c t u r e rl i u s h u a n g a b s t r a c t m a r i n ea l g a ep h o t o s y n t h e t i cm e m b r a n ep r o t e i ns n u c t l 玳a n df u n c t i o ns h o w e dt h a tt h e p i g m e n t 。p r o t e i nc o m p l e x e so fg r e e na l g a ea r ed i v e r s i t y , t h i si st oa d a p tt ot h em a r i n el i v i n g e n v i r on m e n t i ti sa l s of o u n dt h a tm a r i n ea l g a eh a v e s p e c i a lc h a r a c t e r i s t i c si nt h es t r u c t u r eo f p h o t o s y n t h e t i cm e m b r a n ep r o t e i nc o m p l e x e s ，e n e r g yt r a n s f e ra n ds p e c t r a s h o w e v e rt h e c o m p o s i t i o n so fp i g m e n t sa n df l u o r e s c e n c ec h a r a c t e r i s t i c sh a v en o tb e e nw e l li n v e s t i g a t e d t h e s ef o u n d a t i o n a li s s u e sw e r es t u d i e di nt h i sp a p e r f i r s to fa l l ，t h y l a k o i dm e m b r a n ef r o mu l v ab yw a ss u c c e s s f u l l ye x t r a c t e db yu s i n g d i f f e r e n t i a lc e n t r i f u g a t i o n ，t h el i g h t h a r v e s t i n gs y s t e mo fu l v aw a sl a r g e r l h c i if r o mu l v a w a ss u c c e s s f u l l ye x t r a c t e db yu s i n gac o n t i n u o u sf r e e z e - t h a ws u c r o s eg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n f o rt h ef i r s tt i m e t h ee x t r a c t e d p r o t e i ns h o w e do n l ya2 7k d ab a n do ns d s p a g e c o m p a r e dw i t hs p i n a c hl h c i i ，t h el a c ko f2 5k d ab a n d si n d i c a t e dt h a tt w os u b t y p e sm i g h t b ed i f f e r e n c e u l v al h c i ia n ds p i n a c hl h c i ii nt h ep i g m e n tc o m p o s i t i o nw e r er o u g h l yt h e s a m e ，b u tu l v al h c i ih a dap i g m e n tc h la w h i c hw a sn o tf o u n di ns p i n a c hl h c i i f u r t h e r , t h r o u g ht h es e p a r a t i o no fs u c r o s eg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n ，u l v al h c i ia n ds p i n a c hl h c l l w e r eb o t hm a i n l yi nt r i m e r u l v al h c i ia n ds p i n a c hl h c i id i f f e r e dm o r ei nt h eb l u ez o n ei n c d s p e c t r a , s u g g e s t i n gt h a tu l v ac a r o t e n o i dm o l e c u l e sa n dp r o t e i nb i n d i n gc o n f o r m a t i o na r e d i f f e r e n tf r o mt h eh i g h e rp l a n t s t h e r ew a sa l s oo b v i o u sd i f f e r e n c eb e t w e e nu l v aa n ds p i n a c ht h y l a k o i dm e m b r a n ei n t h e r m a ls t a b i l i t y t h et mo fu l v at h y l a k o i dm e m b r a n e sw a s5 。ch i g h e rt h a nt h a to ft h e s p i n a c ht h y l a k o i dm e m b r a n e i nt h es p i n a c ht h y l a k o i dm e m b r a n e ，t h et e m p e r a t u r ef i r s t l y a f f e c t st h ee n e r g yt r a n s f e ri nm e m b r a n ep r o t e i n ，t h e nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np i g m e n ta n d p i g m e n ti t s e l f t h i r d l y , h y d r o t h e r m a ls y n t h e s i so fn a n o - z n os e e d si nt h ef t og l a s sg e n e r a t e du n i f o r m d i s t r i b u t i o nw i t hp a r t i c l es i z e2 0 4 0n m ；l bf i l mi n s t r u m e n tw a su s e dt ot r a n s f e rt h y l a k o i d m e m b r a n e st on a n o - z n og l a s s t h y l a k o i dm e m b r a n ea n dt h ef o r m a t i o no fn a n o z n o a d s o r p t i o nw a sz t y p el bf i l m s t h y l a k o i dm e m b r a n e so nn a n o z n og l a s sc o n d u c t i v ef i l m h a sg e n e r a t e dag o o de l e c t r i c a lc o n d u c t i v i t yp r o p e r t i e ，a n dw i t ht h ei n c r e a s ei nt h en u m b e ro f l bf i l mc u r r e n ti si n c r e a s i n g ，w i t ht h es p i n a c ht h y l a k o i dm e m b r a n em a d eo fo p e n c i r c u i t v o l t a g ea n dt h ec o n d u c t i v ef i l ms h o r t - c i r c u i tc u r r e n tt h a nt h es a m el a y e r su l v at h y l a k o i d c o n d l 】c t i v ef i l ms m a l l k e y w o r d s ：m e m b r a n ep r o t e i n ；l h c i i ；t h e r m a ls t a b i l i t y ；t h y l a k o i dm e m b r a n e 目录 第一章前言。1 1 1 类囊体膜的结构组成及其功能l 1 1 1 光系统i i ( p s i i ) 1 1 2 细胞色素b 6 f 蛋白 1 1 3 光系统i ( p s i ) 1 1 4 腺苷三磷酸合成 复合体( c y t b 6 f ) 3 酶( a t p 合成酶) 4 1 2l h c i i 的结构与功能4 1 2 1l h c i i 的结构4 1 2 2l h c i i 的功能5 1 3 海洋绿藻光合膜蛋白的研究进展。7 1 4 光合膜蛋白热稳定性研究8 1 5 光合膜蛋白的固定及光电性质的研究9 1 6 课题研究的目的及内容1 1 1 6 1 i ；if 臼11 1 6 2 研究内容11 1 7 实验仪器及药品1 2 1 7 1 实验仪器。1 2 1 7 2 实验药品。1 2 第二章石莼类囊体膜的提取及光合特性研究1 3 2 1 材料与方法。1 3 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 1 4 2 1 5 2 1 6 2 1 7 类囊体膜的制备 吸收光谱的测定 荧光光谱的测定 s d s p a g e 哆子析 叶绿素含量和c h la f o 比值的测定 高效液相色谱( h p l c ) 检测和色素分析。 圆二色光谱的测定1 4 2 2 实验结果与分析15 2 2 1 石莼类囊体膜的分离 2 2 2 石莼类囊体膜的多肽组成 2 2 3 石莼类囊体膜的吸收光谱分析 2 2 4 石莼类囊体膜的室温荧光光谱分析 b m m m h m 5 5 5 6 r _ 一 、 2 2 5 石莼类囊体膜的低温荧光光谱分析1 7 2 3 2 4 第三章 3 1 3 2 3 3 3 4 第四章 4 1 4 2 4 3 2 2 6 石莼类囊体膜的色素组成分析18 2 2 7 石莼类囊体膜的圆二色谱图分析2 2 讨论2 ：! 小结2 3 石莼l h c i i 的提纯及光合特性研究2 5 材料与方法2 5 3 1 1 类囊体膜的增溶2 5 3 1 2 吸收光谱的测定2 5 3 1 3 荧光光谱的测定2 5 3 1 4s d s p a g e 分析2 5 3 1 5 叶绿素含量和c h la b 比值的测定2 6 3 1 6 高效液相色谱( h p l c ) 检测和色素分析2 6 3 1 7 圆二色光谱的测定2 6 实验结果与分析2 6 3 2 1 石莼l h c i i 的分离纯化2 6 3 2 2 石莼l c h i i 的s d s p a g e 凝胶电泳图分析2 9 3 2 3 石莼l h c i i 高效液相分析3 0 3 2 4 石莼l h c i i 吸收光谱分析3 2 3 2 5 石莼l h c i i 荧光光谱分析3 3 3 2 6 石莼l h c i i 的圆二色谱分析3 4 3 2 7 石莼l h c i i 单体与三聚体的分离3 5 讨论3 7 小结3 8 石莼类囊体膜和l h c i i 的热稳定性研究3 9 实验材料和方法3 9 4 1 1 类囊体膜的热处理及光谱表征一3 9 实验结果与分析3 9 4 2 1 热处理对类囊体膜吸收光谱的影响3 9 4 2 2 热处理对类囊体膜荧光发射光谱的影晌4 2 4 2 3 热处理对类囊体膜低温荧光发射光谱的影响4 4 4 2 4 热处理对类囊体膜圆二色光谱的影响4 5 4 2 5 热处理对类囊体膜高效液相色谱的影响5 l 讨论5 3 5 4 的组装和光电性质研究一5 5 ! ；! ； 5 1 1 纳米z n o 的制备5 5 5 1 2 类囊体膜单层及多层膜的制备一5 5 5 1 3 类囊体膜在纳米z n o 上电学性质5 5 5 2 实验部分与分析5 6 5 2 1 纳米z n o 制备分析5 6 5 2 2 类囊体膜在纳米z n o 上的吸附及光电性质5 7 5 3 讨论6 0 5 3 小结6 l 结论6 2 参考文献6 3 攻读硕士学位期间的学术成果一7 1 致谢7 2 缩写词 l u t 黄体素l h c i ip s i i 捕光天线复合物 x a n 叶黄素 n p q 非光化学淬灭 n e o 新黄质 c a r 胡萝卜素 v i o 紫黄质c h l 叶绿素 z e a 玉米黄质e d t a 乙二胺四乙酸 c h la 叶绿素a c h l a f o 叶绿素a b 比值 c h l b 叶绿素bd m十二烷基麦芽糖苷 s d s十二烷基硫酸钠t r i t i o nx 1 0 0 曲拉通x 1 0 0 p s i i 光系统i i q e能量依赖型淬灭 p s i 光系统i p s 皮秒 f s 飞秒pq 质体醌 c d 圆二色光谱 p s i 聚合物和盐形成的超分子结构 h p l c 高效液相色谱 a t p 三磷酸腺苷 p c 质体兰素f d 铁氧还蛋白 h t m 变性温度时的焓值 c p 等压热容 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 第一章前言弟一早月l j 百 光合作用是地球上一切生物直接或间接的能量来源，也是人类生存的重要条件，它 能把光能转化成化学能，把无机物合成有机物，并释放出氧气，是生物圈中几乎所有生 物体的能量和氧气的源泉。 在高等植物和藻类中，光合作用的光能吸收、传递和转化过程是在具有一定分子排 列及空间构象的色素蛋白复合体及相关的电子载体中完成的。这些复合体大都镶嵌在类 囊体膜中，又被称为光合膜蛋白。其中最主要的光合膜蛋白复合体有四种：光系统 ( p s i i ) 复合体、细胞色素b 6 f ( c y t b 6 f ) 复合体、光系统i ( p s i ) 复合体和a t p 合成酶 复合体( 图1 1 ) 。p s i 和p s i i 都有各自的捕光天线色素蛋白复合体，分别是l h c i 和 l h c i i ，能够吸收光能并将激发能传递至各自的反应中心，发生电荷分离，引起一系列 光化学反应1 1 ，2 1 。 海藻中的绿藻作为海洋中的重要初级生产者，在整个藻类中具有其特殊的地位，藻 类学家认为，在整个植物进化系统中，绿藻比其他门类藻类与高等植物的亲缘关系更接 近。由于对复杂海洋生境的适应，海洋绿藻的光合器官在色素组成、细胞壁结构、类囊 体膜的垛叠方式以及荧光特性等许多方面都有别于淡水绿藻和高等植物，在色素蛋白 复合物的组成上具有多样性和特异性。最近二三十年对光合作用的研究主要集中在光合 细菌、蓝藻、淡水衣藻和高等植物，而关于海洋绿藻的研究要少得多，对于绿藻光合膜 蛋白结构和功能的研究更少。 1 1 类囊体膜的结构组成及其功能 叶绿体作为绿色植物和藻类进行光合作用的主要场所，是由双层膜围成的细胞器， 两层膜之间的空隙平均约为2 0n m 。叶绿体的形状随物种的不同具有较大的差异，尤其 是藻类的叶绿体，能够呈现出板状、星状、囊状等不同形状。叶绿体主要由类囊体和基 质组成，是光合反应中光反应和暗反应的场所，而光反应主要在类囊体上进行，因此光 合作用的色素大都位于类囊体中。类囊体是叶绿体内的磷脂双分子层膜弯曲形成的结 构，是由单位膜封闭形成的小囊，其主要分为两部分：基粒类囊体和基质类囊体。基粒 类囊体是圆盘一样叠在一起的类囊体，其片成结构成为基粒片层；基质类囊体是贯穿在 两个或两个以上基粒之间的没有发生垛叠的类囊体，其片层结构称为基质片层。 类囊体膜的主要物质组成包括蛋白质、色素和脂类，其中的蛋白质在类囊体膜的功 第一章前言 中含量相对较多的蛋白包括四种，分别是光系统i i ( p s i i ) 复合物、 物、细胞色素b 6 f ( c y t b 6 f ) 复合体、a t p 合成酶复合体。类囊体膜 之间相互协调作用，利用太阳光能激发电子，并使其沿电子传递链 进行跨膜传递。在光合作用过程中水分解为氧和质子，质体醌将p s i i 、c y t b 6 f 复合物和 p s i 连成一体，最终完成电子从n 2 0 到n a d p 的传递同时产生a t p ，释放氧气闭。 p ”m 蝴e _ i 慧慧筠擎、， 惫蘸嗜、 图1 - 1 类囊体膜示意图 f i g l - i s c h e m a t i cd i a g r a mo ft h y l a k o i dm e m b r a n e 1 1 1 光系统i i ( p s i i ) p s i i 复合体是类囊体膜上进行光合原初反应的重要场所，它的主要功能是吸收光 能，进行光诱导的电荷分离，产生电子传递并催化水的光解，它主要集中在垛叠的基粒 类囊体膜上。p s i i 由内周捕光天线色素蛋白复合体( c p 4 3 和c p 4 7 等) ；外周捕光天线 色素蛋白复合体( l h c i i ) ；反应中心色素蛋白复合体( p s i i r c ) 和m n 簇合物和放氧 复合体外周蛋白3 3k d a ，2 4k d a 和1 7k d a 等部分组成。 通常将去除l h c i i 的p s i i 剩余部分称为p s i i 核心复合物，分离纯化的p s i i 反应中 心色素蛋白复合体由d 1 蛋白( 3 2k d a ) 、d 2 蛋白( 3 4k d a ) 、细胞色素b 5 5 9 ( c t yb 5 9 9 ) 的伐和p 亚基和p s b i 基因产物等5 种蛋白及其结合的c h la 、脱镁叶绿素( p h e o ) 和1 3 - c a r 组成。d 1 蛋白、d 2 蛋白分别由叶绿体基因p s b a 和p s b d 编码【4 1 。细胞色素b 5 5 9 是含有 双亚基的血红素蛋白，有分子量为9k d a 的a 亚基和分子量为4k d a 的b 亚基组成，它 们分别由叶绿体基因p s b e 和p s b f 亚基和分子量为4k d a 的p 亚基组成。细胞色素b 5 5 9 瓣 l 叶绿素p h e o 。由于这一特殊的c h la “分子对”，在其氧化还原吸收光谱的6 8 0n m 有一 明显的吸收高峰称其为p 6 8 0 【5 1 。 光合作用中水的氧化和氧气的释放在锰簇中进行，由外周蛋白3 3k d a ，2 4k d a 和 1 7k d a 组成的放氧复合体和p s i i 的锰电子簇紧密结合，起到维持放氧反应的辅助作用。 p s i i 内周天线c p 4 3 及c p 4 7 是结合在c h la 上的蛋白，分别由叶绿体基因p s b b 和 p s b c 编码，表观分子量为4 7 和4 3k d a ，它们与反应中心紧密相连，不仅可以将外周天 线( l h c i i ) 捕获的激发能汇集给p s i i 反应中心，还具有维持p s i i 放氧复合体的结构， 支持水分子裂解放氧的功能【5 1 。 1 1 2 细胞色素b 6 f 蛋白复合体( c y t b 6 f ) c y t b 6 f 作为质体醌质体蓝素氧化还原酶，在光合作用过程中的电子传递及能量转化 方面扮演着重要的角色【6 】。c y t b 6 f 是一个膜蛋白复合体，以二聚体形式存在于类囊体膜 中，含有3 个电子载体，一个高电势的c 型细胞色素、一个高电势的2 f e 2 s 蛋白和一 个b 型细胞色素【7 1 。它一方面位于p s i i 和p s i 之间，负责传导两者之间的线性电子，另 一方面利用电子传递过程中释放出来的自由能将质子从类囊体的外侧传递到类囊体膜 的内侧，形成跨膜质子电化学的p h 梯度，为a t p 的生成提供能量 6 1 。此外，c y t b 6 f 还 可以通过调控l h c i i 激酶的磷酸化，在调节p s i i 和p s i 之间激发能分配中起作用【8 】。 1 1 3 光系统i ( p s i ) p s i 和p s i i 相似，也是由捕光天线色素蛋白复合体( l h c i ) 和反应中心色素蛋白 复合体( p s i r c ) 组成。它作为光驱动的质体蓝素和铁硫蛋白氧化还原酶，催化产生电 子的同时把它从p c 经过一系列电子传递到f d 。p s i 由光能吸收、传递和转化所需要的 一系列蛋白质和结合在这些蛋白上的色索分子及电子传递链成分组成。p s i 吸收光能通 过诱导共振传递到p 7 0 0 ，然后按顺序将电子传给原初电子受体a o 、次级电子受体a 1 ， 再通过f e s 最后传给f d ，在f d ：n a d p + 氧化酶( f n r ) 的作用下，电子最终被传递给 n a d p + ，同时，氧化态的p 7 0 0 + 经过细胞色素b 6 f 复合体和类囊体囊腔侧的水溶性电子 供体质体兰素( p c ) 从p s i i 获得电子，还原态的n a d p h 以及a t p 为后面c 0 2 的固定 储存能量，最后使水和c 0 2 生成有机物。p s i r c 中组成特殊二聚体结构的c h la “分子 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。_ _ _ _ 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。_ _ _ _ _ _ _ 。- _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 对，在原初刈，仕j 尿例 第一章前言 光化学反应中起原初电子供体功能的是p 7 0 0 。高等植物、绿藻和蓝细菌的 p s i 复合物还包括3 个外周蛋白及5 个膜内周蛋白，目前l h c i 已经从豌豆、菠菜、大 麦等植物中被分离出来，其分子量约在2 0 2 5 k d a 之间，l h c i 6 8 0 和l h c i 7 3 0 、l h c i i 三体和l h c i 6 8 0 互相结合，能量从l h c i i 或l h c i 7 3 0 经过l h c i 6 8 0 传递至反应中心 【9 1 o 1 1 4 腺苷三磷酸合成酶( a r p 合成酶) a t p 合成酶是一个大的多亚基单位的复合物，它的功能是把a d p 和p i 合成为a t p ， 广泛分布于线粒体内膜，叶绿体类囊体，异养菌和光合菌的质膜上，在光合作用电子传 递过程中具有重要作用，参与氧化磷酸化和光合磷酸化。镶嵌在类囊体膜上的a t p 合酶 由c f l 和c f o 两部分组成。其中c f o 的分子量约为1 7 0k d a ，是一种嵌合在内膜上的疏 水蛋白复合体，能形成一个跨膜质子通道，由i 、i i 、i i i 和i v4 个亚基组成，其各亚基 的分子量约分别为1 8k d a 、1 6k d a 、8k d a 和2 0k d a 。而c f l 的分子量约为4 0 0k d a ， 是一种水溶性蛋白，由5 个亚基组成，其分子量分别为a ( 5 5k d a ) 、p ( 5 3k d a ) 、丫( 3 5 k d a ) 、6 ( 2 0k d a ) 和亚基( 1 4k d a ) ，0 【和1 3 亚基结合a d p 和磷酸，催化a d p 的磷 酸化；6 亚基位于柄部，起着连接c f o 和c f l 的作用；6 亚基对a t p 酶的活性几乎没有 影响，因为它主要起阻止质子“泄露”的作用，还有可能与丫亚基相互作用，控制质子的 转运。 1 2l h c i i 的结构与功能 1 2 1l h c i i 的结构 在高等植物和绿藻体内，捕光色素蛋白复合体( l h c ) 是一类捕获光能，并把能量 迅速传至反应中心引起光化学反应的色素蛋白复合体，它是地球上最多的一种膜蛋白， 主要由c h la b 结合蛋白和有关的光合色素分子组成。虽然高等植物体内的p s i 和p s i i 都含有各自的捕光色素蛋白复合体l h c ( l h c i 和l h c ) ，但在高等植物的诸多膜蛋白 复合体中，l h c i i 是第一个认识比较清楚的一类膜蛋白。自1 9 7 5 年l h c i i 被发现以来， 随着色素蛋白复合体分离、提纯技术的不断改善，人们对蛋白结构和功能的研究已取得 了较大的进展。膜蛋白l h c i i 在类囊体膜中除了进行光能的吸收和传递之外，还在维持 类囊体膜的结构，调节激发能在两个光系统之间的分配，光保护以及保障物种对各种环 境的适应等过程中都起着重要的作用。长期以来人们对l h c i i 蛋白结构的认识都不是很 4 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 清楚，但自从蛋白晶体技术的出现，通过x 射线晶体衍射人们清晰的知道蛋白的立体 结构【1 1 1 。近年来随着蛋白质分子空间结构的解析，分子生物学及超快光谱技术的迅速发 展和有效地结合应用，膜蛋白结构的研究更是成为蛋白质化学研究领域中新热点【l o 】。特 别是日本科学家k i i h l b r a n d t 等对l h c b l ( l h c i i 单体) 在3 4 a 级的结构解析，进一步 加深了人们对l h c i i 结构和功能的认识【1 1 】。2 0 0 4 年中国科学院生物物理所的常文瑞研 究组和植物所的匡廷云院士研究组合作，选取菠菜光合膜蛋白作为研究对象，经过多年 艰苦努力，在世界上率先成功分离和测定了光系统i i 捕光色素蛋白复合体( l h c i i ) 在 2 7 2a 级的晶体结构【1 2 1 ，首次报道了每个复合体有三个l h c i i 单体组成，每个单体的 l h c i i 包含8 个c h la 分子和6 个c h lb 分子，4 个类胡萝b 素分子。 作为位于p s i i 最外周、含量最丰富的天线系统，l h c i i 结合了叶绿体中近5 0 的叶 绿素分子和几乎所有的辅助色素分子【l 引。l h c i i 包括主外周天线l h c i i b 和辅助外周天 线l h c i i a ( c p 2 9 ) 、l h c i i c ( c p 2 6 ) 、l h c i i d ( c p 2 4 ) ，l h c i i b 是主要的三聚体复合物， c p 2 9 、c p 2 6 、c p 2 4 则以单体形式存在1 1 4 】。目前普遍认为三聚体形式是l h c i i 在叶绿体 中的功能组成单位，而且三聚体和单体之间可以相互转化。k i i h l b r a n d t 等【l5 】用电子衍射 法推导出分辨率为o 3 4n n l 的l h c i i 三聚体和单体结构单元的模型。陈辉等【1 6 】证实假根 羽藻l h c i i 中有3 个跨膜6 t 一螺旋与亲水环相连、一个两性短螺旋位于类囊体膜内表面。 一个单体l h c i i 中含有8 个叶绿素a 、6 个叶绿素b 、2 个叶黄素和1 个新叶黄素。 1 2 2l h c i i 的功能 1 2 2 1 光能的捕获及其传递 捕光天线复合物的主要功能是促进p s i i 更多的吸收光能，并把它迅速地传递到光合 反应中心引起光化学反应。在l h c i i 中，不同的c h la 、c h lb 和类胡萝b 素分子之间存 在着非常复杂的激子相互作用，所以能量传递的途径主要由类胡萝b 素到c h lb 、c h lb 到c h la 和c h la 到c h la 【1 7 1 。能量从胡萝卜素到c h lb 的传递时间为几百f s 【1 引，由于c h l 和类胡萝b 素的光谱大量重叠，研究两者之间能量传递问题上仍存在争议；c h lb 到c h l a 及c h la 到c h la 的能量传递时间常数分别为6 和2 0 皮秒c o s ) t 1 9 】。近年来皮秒或飞秒差 异吸收光谱研究技术的应用，相邻色素分子之间能量传递的时间更加清晰，约为0 1 - 5 p s ，而从能量的吸收到原初光化学反应的时间为1 0 0 - - - 5 0 0p s ，二者的时间差表明能量的 传递有许多过程，并且能量在外周天线、内周天线以及反应中心的传递是可逆的。 1 2 2 2 能量的耗散与光保护功能 第一章前言 常变化的气候条件下，植物和藻类的光合结构经常面临着既需要光能又 需要避免光胁迫的矛盾，所以对于光热变化很敏感。处于较强的光照条件下它们只有耗 散掉过剩能量才能保护光合器官，但是有时吸收的光量子不足以完全利用时就会产生光 抑制，甚至光破坏，光破坏防御机制可以防止强光对光合器官的损伤，这对于植物和藻 类的生存和生长是非常必要的。对过多能量的非辐射耗散州i d ) 则是通过l h c i i 蛋白参 与的复杂机制来实现的，这些机制包含热耗散机制，以热的形式来耗散过剩光能的形式 称为非光化学淬灭( n p q ) 。n p q 中最主要的一种是依赖质子梯度的非光化学淬灭( q e ) 2 0 1 ， q e 经常伴随着l h c i i 的聚集态改变，因此l h c i i 是q e 的主要位点。光诱导q e 后产生 的质子梯度变化激活了叶黄素循环，而质子和玉米黄素结合在捕光天线上导致蛋白构象 的变化继而引起了激发能的淬灭【2 1 1 。 叶黄素循环是指在植物和藻类体内，三个组分( 紫黄质、单环氧玉米黄质和玉米黄 质) 根据光照条件的改变而相互转化的过程。当光能过剩、跨膜质子梯度增高时，含双 环氧的紫黄质( v i o l a x a n t h i n ) 在去环氧化酶的催化下，经过单环氧的玉米黄质 ( a n t h e r o x a n t h i n ) 转化为无环氧的玉米黄质( z e a x a n t h i n ) ，使叶片吸收的过剩光能变成 热能耗散掉 2 2 1 。叶黄素循环过程中的各色素之间的转变发生在类囊体膜的两侧，通过诱 导多肽构型的变化或者改变色素附近电荷密度对脱环氧化酶的催化活性进行影响，因此 其对p h 的变化比较敏感。有关叶黄素循环的过程目前还存在着较大的争论，但是其循 环作用过程与l h c i i 密切相关。 1 2 2 3l h c i i 的磷酸化与激发能分配的调控 光合作用中与电子传递相偶联的a d p 与无机磷酸( p i ) 酯化形成a t p 的作用称光 合磷酸化。其作用机理目前仍多以化学渗透学说解释，在电子传递和a t p 形成之间起偶 联作用的是膜内外之间存在质子电动势梯度。光合磷酸化主要通过质体醌( p q ) 的氧化 还原过程造成类囊体膜内外p h 差，在膜内外形成电势差。同时，在膜内外之间也存在 质子电动势梯度，使质子由膜内向膜外流动，当质子通过膜上的c f o 及c f l 向膜外移动 时，发生磷酸化作用，即催化a