（生物化学与分子生物学专业论文）果蝇microrna184功能的初步研究.pdf

中文摘要 果蝇m i c r o r n a 一1 8 4 功能的初步研究 研究生：胡江波 导师：袁榴娣( 教授) 东南大学发育与疾病相关基因教育部重点实验室 中文摘要 近些年来，越来越多的证据表明小的非编码r n a 分子也以一种保守的方式调控发育的关键环 节。目前已发现了至少4 类调节性的非编码r n a 分子，包括m i c r o r n a s ( m i r n a s ) ，s h o r t i n t e r f e r i n gr n a s ( s i r n a ) ，r e p e a t - a s s o c i a t e ds m a l li n t e r f e r i n gr n a s ( r a s i r n a s ) a n dp i w i i n t e r a c t i n g r n a s ( p i r n a s ) 瞰，6 引。在这些小分子r n a 中，m i r n a s 是物种进化上最为保守，并且能够在转录 后水平调节众多生命过程，包括胚胎发育。 m i r - 1 8 4 在果蝇、小鼠、人中具有高度的保守性，在黑腹果蝇d m e l a n o g a s t e r 的胚胎、幼虫、 成虫中普遍表达，并随着果蝇的发育其表达水平也逐渐升高。有文献报道，果蝇胚胎m i r - 1 8 4 的 原位杂交提示，m i r - 1 8 4 主要表达在果蝇胚胎的中胚层和部分内胚层【m l 。 为了研究m i r - 1 8 4 在果蝇发育过程中的重要作用，首先我们构建了m i r 1 8 4 的转基因果蝇， 显微注射果蝇胚胎得到3 株红眼果蝇。然后，我们利用不同组织特异性的g a m 工具果蝇驱动过 表达，分析表型，并用非放射性地高辛标记n o r t h e r nb l o t 检测m i r 1 8 4 过表达。当使用中胚层特 异性的2 4 b g a l 4 驱动时则出现了有趣的表型，果蝇可以发育到3 龄幼虫期，但却不能发育到蛹 期，同时与对照相比，三龄幼虫体型也明显变小；而且三龄幼虫的口钩也出现发育异常。据推测可 能与蜕皮激素通路有关。为了判断对蜕皮激素通路的影响情况，我们尝试了蜕皮激素喂食试验。 结果未能挽救2 4 b g a l 4 驱动u a s m i r - i 8 4 而导致的表型，因此可以断定蜕皮激素的合成和释放 途径未受到影响，而应考虑蜕皮激素下游的级联反应途径受到了影响。 其次我们筛选m i r - 1 8 4 的突变体果蝇。从b l o o m i n g t o n 购买了一株p e l e m e n t 果蝇，并采用 l o c a lm u t a g e n e s i si m p r e c i s ep e l e m e n te x c i s i o n 的方法试图获得m i r - 1 8 4 的突变体。 同时为了寻找m i r - 1 8 4 可能的靶基因，我们尝试在细胞水平筛选m i r - 1 8 4 可能的靶基因。为 完成这一目的，先是利用两个生物信息学黼m i r 越i d a 和p i c t a r , 初步圈定了1 0 个基因。之后， 构建了p a e l u c i f e r a s e 3 u t r 的重组质粒，首先在p a c 的空载质粒中连接报告基因l u c i f e r a s e ，然 后再连接预测靶基因的3 u t r ，从而获得测序正确的1 0 个3 u t r 克隆。 我们把3 u t r 重组质粒和m i r - 1 8 4 共转果蝇s 2 细胞，并以p a c 空载和无关m i r 作为阴性对 照，同时转染b g a l 作为内参。通过检测报告基因| u c i f e r a s e 的表达水平，来推测m i r - 1 8 4 与靶基 因3 u t r 的相互作用情况。结果显示，c g 8 1 2 1 、c g 6 5 8 3 、c g l 0 2 1 7 连接的报告基因水平有明 显下降，为下一步寻找到m i r - 1 8 4 的靶基因提供了可靠的数据。 关键词：m i r n a ；s 2 细胞；m i r - 1 9 4 ；u a s ：g a h 英文摘要 t h e p r i m a r yr e s e a r c ho f m i c r o r n a - 1 8 4f u n c t i o n si n d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r g r a d u a t es t u d e n t ：h uj i a n g b o s u p e r v i s o r ：y u a nl i u d i k e yl a b o r a t o r yo fd e v e l o p m e n t a lg e n e sa n dh u m a nd i s e a s e ， 。 m i n i s t r yo fe d u c a t i o ns o u t h e a s tu n i v e r s i t y a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，e v i d e n c eh a sa c c u m u l a t e dt h a ts m a l ln o n - c o d i n gr n a sa r ea l s ou s e di na c o n s e r v e dm a n n e rt o r e g u l a t ek e yd e v e l o p m e n t a le v e n t s a tl e a s tf o u rc l a s s e so fr e g u l a t o r ys m a l l n o n c o d i n gr n a sh a v eb e e nd e s c r i b e d ，i n c l u d i n gm i c r o r n a s ( m i r n a s ) ，s h o r ti n t e r f e r i n gr n a s ( s i r n a ) ，r e p e a t - a s s o c i a t e ds m a l li n t e r f e r i n gr n a s ( r a s i r h a s ) a n dp i w i i n t e r a c t i n g r n a s ( p i r n a s ) 6 2 , 6 3 1 a m o n gt h e s es m a l lr n a s ，m i r n a sa r et h em o s tp h y l o g e n e t i c a l l yc o n s e r v e da n df u n c t i o n p o s t t r a a s c r i p t i o n a l l yt or e g u l a t em a n yp h y s i o l o g i cp r o c e s s e s ，i n c l u d i n ge m b r y o n i cd e v e l o p m e n t m i g - 1 8 4i sam i r n ac o n s e r v e di nd m e l a n o g a s t e ra n dd p s e u d o o b s c u r a , m o u s e ，h u m a n i t e x p r e s s e sa ta l ls t a g e so fd m e l a n o g a s t e r t h ee x p r e s s i o nl e v e li n c r e a s e sp r o g r e s s i v e l ya si n d i v i d u a l d e v e l o p e m e n t m i r 一18 4d i s p l a y se x p r e s s i o n i nt h e m e s o d e r m ，a n t e r i o re n d o d e r m ，a n dp o s t e r i o r e n d o d e r mo fg e r m b a n d - e x t e n d i n ge m b r y o sb yi ns i t uh y b r i d i z a t i o nt on a s c e n tm i r n at r a n s c r i p t s 1 4 1 i no r d e rt os t u d yt h ei m p o r t a n tr e g u l a t i o nr o l eo fm i r - 18 4d u r i n gt h ed m e l a n o g a s t e rg r o w t h ，w e c o n s t r u c t e dt h et r a n s g e n ed r o s o p h i l ao f m i r - 18 4 w h e r e a f l e r , o v e re x p r e s s i o no f m i r - 18 4w a sf i n i s h e d b yu s i n go fd i f f e r e n tg a l 4t o o lf l i e s ，a tt h es a m et i m ew ef i n i s h e dt h en o n i s o t o p i cd e t e c t i o no f o v e r e x p r e s s i o no f m i r - i8 4u s i n go f n o r t h e r nb l o tw i t hd i g o x i g e n i nl a b l e dr n ap r o b e s l a t em e s o d e r m e x p r e s s i o nu s i n gt h e2 4 b - g a l 4d r i v e rs h o w e di n t e r e s t i n gr e s u l t s d r o s o p h i l ac o u l dd e v e l o p m e n tt ot h i r d i n s t a rl a v a l ，b u ts t a y e da tt h i ss t a g ea n dc o u l dn o tf u r t h e rd e v e l o p m e n tt op u p a a tt h es a m et i m e ，t h es i z e o ft h i r di n s t a rl a v a lb e c a m es m a l l e ro b v i o u s ；t h em o u t h h o o k sb a c a m em a l f o r m e d w ep r e s u m ei th a sa r e l a t i o nw i t he c d y s o n es i g n a lp a t h w a y t h e nw e 灯i e de c d y s o n ef e e d i n ge x p e r i m e n t s e c d y s o n ef a i l e dt o r e s c u s et h ep h e n o t y p e w ea l s os t u d ym i r - 1 8 4l o s s o f - f u n c t i o nt ob u i l dm i r - 18 4n u l lm u t a n t w eo b t a i n e dap - e l e m e n t s t r a i nf r o mb l o o m i n g t o n w ea t t e m p t e dt og e tm i r - 1 8 4n u l lm u t a n tu s i n go fl o c a lm u t a g e n e s i s i m p r e c i s ep - e l e m e n te x c i s i o n i no r d e rt ol o o kf o rt h ep o s s i b l e l yt a r g e tg e n eo fm i r - 18 4 ，w ea t t e m p t e dt of i l t e rt h ep o s s i b l e l y t a r g e tg e n e so fm i r - 18 4o nt h e c e l ll e v e l w ec o t a n s f e c t i o nr e c o m b i n ep l a s m i do f3 u t ra n d p a c m i r - 18 4i n t od r o s o p h i l as 2c e l l a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so fr e l a t i v el u c i f e r a s ea c t i v i t yt h a tw a s m e a s u r e d ，w ea n a l y s i st h er e l a t i o nb e t w e e nm i r - 1 8 4a n dt h e3 u t ro f t a r g e tg e n e s t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h el u c i t e r a s ee x p r e s s i o nl e v e lo f w h i c hc o n n e c t e dt h e3 u t ro fc g 812l 、c g 6 5 8 3 、c gl0 217 r e d u c e ds i g n i f i c a n t l y t h i sp r o v i d e sc r e d i b l ed a t af o rs e a r c h i n go u tt h et r u et a r g e tg e n e so fm i r - 18 4 k e yw e r d s ：m i r n a ；s 2c e l l s ；m i r - 1 8 4 ；u a s ；g a l 4 囊要缭咚词表 主要缩略词表 缩写词 英文 中文 m i c r o r n a微r n am i r n a 非编码r n a n c r n an o n c o d in gr n a s i r n as m a lli n t e r f e r e n c er n a 小平涉r n a r 跫瓣矗r i b o s o m a lr n a孩糖体r n a t r a n s f e rr n a转运r n at r n a 核耱核酸酶r n a s er i b o n u c l e a 小分子r n as n r n as m a l ln u c l e i cr n a 核仁小分子r n a s n o r n as m a l ln u c l e o l a rr n a 小细胞质r n as c r n as m a l lc y t o p l a s m i cr n a 初鬟) j m i r n a 复合体p r i m i r n ap r i m a r yt r a n s c r i p t sm i r n a 前体m i r n a p r e m i r n ap r e c u r s o rm ir n a r n a 诱导沉默复含体 r i s cr n ai n d u c e dsil e n c i n gc o m p l e x 核：终酸 n tn u c l e o t i d e 编码序列 c d s c o d i n gs e q u e n c e r n a 干扰 跫凇ij i 漱i n t e r f e r e n c e 非翻译区u t ru n t r a n s l a t e dr e g i o n 焦碳酸二乙酯 d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a 骀牛壶清 f b sf e t a lb o v i n es e r u m m i r n a 诱导的沉默复合物m i r i s cm i r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x 开放的阅读框o r f o p e nr e a df r a m e l u r i a - b e r t a n i 培养基 l bl u r i a - b e r t a n im e d i u m 中枢神经系统 c n sc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m 溴纯乙锭 e be t b i d i m nb r o m i d e 光密度o d o p t i c a ld e n s i t 逆转录r tr e v e r s et r a n s c r i p t i 荧光素酶l u cl u c i f e r a s e 聚丙烯酞胺凝胶电泳 p a g e p o l y a c r y la m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i 磷酸盐缓冲液 p b s p h o s p h a t eb u f e r e ds a l i n 胎牛血清f b sf e t a lb o v i n es e r u m 牛觑清白蕉白b s ab o v i n es e r u ma l b u m i 去离子承d 酾d e i o n iz e dw a t e r 乙酸、e d t a 缓冲液 t a et r i sg l a c i a la c e t i ca n de d t ab u f e r 硼酸、e d t a 缓冲液 t b et r i sb o r a c i ca n de d t ab u r e t 碱基对 b p b a s ep a i r 微升 ulm i c r o l i t e 分钟 m l nm i n u t e 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文 的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档 的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借 阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东 南大学研究生院办理。 研究生签名：罩悯导师签名：组日期： 序言 序言 近年来，国际分子生物学顶尖级杂志c n s ( c e l l n a t u r e s c i c e n c e ) ，连续把r n a 的研究进展列 为“十大科技突破之一”，其中最引人注目的当是m i c r o r n a 。1 9 9 3 年，a m b r o s 首先在c e l l 杂志 上撰文发现了一段非编码的单链小分子r n a ，具有调节发育时相的作用，这是首次对m i c r o r n a 进行报道。目前的研究表明，m i c r o r n a 在基因转录后水平上，通过与靶m r n a ( 信使r n a ) 互补 结合，对基因的表达起负调节作用或基因沉默。m i c r o r n a 在物种间具有高度的保守性、时序性 和组织特异性。 2 0 0 7 年1 2 月，s a n g e rm i r b a s e 数据库升级至v 1 0 1 版。新版本报道的m i c r o r n a 序列信息从5 0 7 1 条增至5 3 9 5 条。新增m i c r o r n a 序列信息主要集中在植物( 新增1 4 4 条) ，约占新增总序列信息 的一半。同时新增8 个物种：b r a s s i c ao l e r a c e a ( 甘蓝) ( 1 ) ，b r a s s i c ar a p a ( 芜菁) ( 1 ) ，c a r i c ap a p c w a ( 番木瓜) ( 1 ) ，一v i t i sv i n i f e r a ( 葡萄) ( 1 0 0 ) ，p v g a t h r i xb i e t i ( 滇金丝猴) ( 1 1 ) ，s 丝, n p h a l a n i z u s s v n d a c t y l u s ( 合 趾猿) ( 11 ) ，旦丝地点型i 幽旦堑q 玉盘鹜塑( 盘基网柄菌) ( 2 ) ，m o u s ec y t o m e g a l o v i r u s ( d 、鼠巨细胞病毒) ( 1 8 ) 。 h o m o s a p i e n s ( i k 类) ，m u sm u s c u l u s ( 4 鼠) ，地n q 丛曼g i 丛甄大鼠) d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ( 黑腹 果蝇) 分别增至5 4 1 条，4 4 3 条，2 8 7 条，1 5 2 条。 m i r 1 8 4 是一种广泛存在于果蝇口m e l a n o g a s t e r ，口p s e u d o o b s c u r a ，小鼠，人等多种生 物中的m i r n a ，序列比对分析发现m i r - 1 8 4 在果蝇1 2m e l a n o g a s t e r ，口p s e u d o o b s c u r a ，小鼠， 人中具有高度的保守性( 图1 ) 。 d - a - - i i r l84 d p s 一_ i r 一1 8 4 h s a 一- 1 r 一18 4 l i l t u - - i ti r l8 , l l u g g 矗c g g g a a c u g a u 矗a g g g c2 2 u g g c g g a g a c u g g g g c2 2 u g g a c g 6 矗g a a c u g a u a a g g g u2 2 u g g c g g a g a c u g a u a a g g g u2 2 鼍t l l 鼍并薹* * 一譬1 1 1x 鲁* t l - * * 图1m i r 1 8 4 在入、小鼠、果蝇中的保守性 根据b 主主巳；么么旦! ! ：墨垒卫g 旦! ：垒里：坠k 么苎q 主! 坌兰旦么! i 塑么坐i ! 翌垒i 凸旦金墨：璺b 堡! 自勺报道，果虫黾 m i r 一1 8 4 位于星b ；璺垒垒墨圣q 竺= 垒垒垒曼垒q 垒 ：3 ，成熟的m i r 18 4 是由一个9 0n t 左右具茎环结构的单链r n a 前体经 过d i c e r 酶加工而来( 图2 ) 。 d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e rm i r - 18 4s t e m - l o o p d m e m i r - l8 4 。 图2m i r 1 8 4 的加工过程 d m e m i r 一18 4 * 堡里壅芏鲤主堂垡堡墨 果蝇胚胎m i r 18 4 的原位杂交i “1 表明m i r + 1 8 4 主要表达在中胚层和内胚层。 g 强 图3 果蝇胚胎m i r i 的腺住泉定 p n a s 如0 51 0 2 【5 0 】：ib 0 1 7 一i8 0 2 2 ) 斑马鱼胚胎应用l n a m i r - 】8 4 探针的原位杂交表明，m i r 1 8 4 主要表达在品状体；孵化腺； t 酉4 马龟胚胎应用l n a m i r 1 8 4 搽针的* 杂交 ( v 、_ q e n h o m se e ta l ，s c i e n c e2 0 0 5 ，3 6 9 ，3 1 0 _ 3 1 1 ) 为了分析m i r - 1 8 4 在果蝇发育不同阶段的表达，我们提取o r e g o n r 野生型黑腹果蝇胚胎、幼虫、 成虫- 1 1 总r n a 制备r 杂交所要的a n t i m i r 】8 4 的探针用m i r v a n a t mm i r n ad e t e c t i o nk i t 检测 m i r 1 8 4 在果蝇不同发育阶段的表达。检测结粜显而，m i r 一1 8 4 在口m e l o n o g a s t e r 胚胎、幼虫、成 虫中普遍表达其表达在果蝇发育的不同时期存在定的时问特异性，随着果蝇的发育其表达水 平逐渐升高( 本实验审数据) 。 奄靠 矿扩矿 2 】b p 囤5m i r - i8 4 在泉蝇胚胎、幼虫、成虫中表达谱分析。箭头所指为m i r 1 8 4 特异性的信e ，5 s r n a 为内参。 性对照为2 9 b p 挥针位置，目性对照为y e t r n a 探针杂变。 y o n g x i n c h e r t mo 等人在研究 成神经细胞瘤时发现，当把m i r 1 8 4 的前体转染k e l l y 或 s k - n a s 细胞时会导致细胞凋亡的增加。进而说b w m i r i8 4 在细胞捌r ：过程中发挥了重要作用 同时也提示m i c m r n a 在肿瘤发牛中的重要作用。 在2 0 0 8 年最新的一篇文献中，t a s u k u n o m u r a ”等人报道r 小鼠中m i r - 1 8 4 在甲基化通路中 的相戈作用；在小鼠r p m i r - 1 0 4 是一种大脑特异性的m i c r o r n a ，当叫基c p g 结合蛋e 1 2 ( m e c p 2 ) 结 合到其肩动子上时m i r 1 8 4 的表达披抑制，反之，m e c p 2 击极化时m i r t 8 4 的表达则上调。 一- 文献综述 文献综述 果蝇m i c r o r n a 功能研究的新进展 2 0 0 0 年，r n a 的研究进展被美国 1 0 0 m l ，加 水定容至1 l ，室温保存。 3 ) s x t b e ：5 4 9 秭s 碱，2 7 5 9 硼酸，2 0 m l0 5 me d t a ( p h 8 0 ) ，加水定容至l l ，室温保存。 7 果蝇基因组提取试剂 a 液：l o o m mt r i s - c l ( p h 7 5 ) ，l o o m me d t a ，l o o m b ln a c i ，0 5 s d s ，室温储存。 b 液：5 m 乙酸钾2 0 0 m l ，6 m 氯化锂5 0 0m l ，混匀，4 c 储存。 8 提取质粒所需缓冲液 ( 1 ) 溶液l ：5 0 r a m 葡萄糖，2 5 m mt r i s h c i ( p h 8 o ) ，1 0 m me d t a ( p h 8 0 ) ，4 c 保存。 ( 2 ) 溶液i i ：5 mn a o h4 0 0 1 ，i o s d s1 0 0 p l ，加蒸馏水至l m i ，现用现配。 ( 3 ) 溶液i i l ：5 m 乙酸钾6 0 m l ，冰乙酸1 1 5 m l 加水定容至1 0 0 m l ，4 c 保存。 9 细胞转染所需试剂 ( 1 ) 2m c a c l 2 ：2 9 4 9c a c l 2 溶于1 0 0 m i 蒸馏水中，过滤除菌后，一2 0 ( 3 保存。 ( 2 ) 2 x h b s ：5 0 m mh e p e s ，1 5m mn a 2 h p 0 4 ，2 8 0 m mn a c i ，调p h 至7 1 ，过滤后2 0 。c 保 存。 1 0 且一半乳糖苷酶的活性测定所需试剂 ( 1 ) 磷酸缓冲液：0 1 0 8 9n a h 2 p 0 4 ，0 5 2 8 9n a 2 h p 0 4 ，加蒸馏水定容至5 0 m l ，高压灭菌。 ( 2 ) o n p g 溶液o om 1 ) - l o m l 磷酸钠缓冲液，o 0 4 90 硝基一b _ d 吡喃糖苷，滤后一2 0 c 保存。 ( 3 ) 镁离子溶液( 1m 1 ) ：6 1 0 0 1d h 2 0 ，2 9 0 0 1b 一硫基乙醇，1 0 0 0 11 mm g c i 2 。 ( 4 ) lmn a 2 c 0 3 ( 终止液) ：1 0 6 9n a 2 c 0 3 加蒸馏水到1 0 0 m l 。 二主要仪器设备 1 g h p 9 0 8 0 隔水式恒温培养箱( 上海一恒科技有限公司) 2 p c r 扩增仪( e p p e n d o r f 公司) 3 电磁炉( 美的公司) 4 微波炉( 上海松下微波炉有限公司) 1 4 第一章材料与方法 5 凝胶成像系统( 上海培清科技有限公司) 6 紫外割胶仪( 上海天能科技有限公司) 7 扫椭仪( 明基公司) 8 d k - 8 d 数显恒温水浴锅( 江苏b 金坛医疗仪器厂) 9 台式冷冻离心机( e p p e n d o r f 公司) i o 微量移液- 器( g i l s o n 公司) l i 脱色摇床t y - 8 0 b ( 南京新校园生物技术研究所) 1 2 紫外分光光度计6 4 0 5 ( j e n w a y 公司) 1 3 台式离心机( e p p e n d o f f 公司) 1 4 d y h 2 i i i 型稳压稳流电泳仪( 北京市六一仪器厂) 1 5 纯水仪( m i l l i p o m 公司) 1 6 加热混匀器( e p p e n d o r f 公司) 1 7 c x - 2 0 0 0u v - c r o s s l i n k e r ( 美国u v p 公司) 1 8 m o d e l 5 5 0 酶标仪( 美国b i o r a d 公司) 1 9 细茼振荡摇床( 上海市离心机研究所) 2 0 h a n g p i n g f a16 0 4 电子天平( 上海天平仪器厂) 2 i 一7 0 低温冰箱( 德国诬门子) 2 2 d h g 9 1 4 6 a 型电热恒温鼓风干燥箱( 上海精宏实验设备有限公司) 2 3 高速低温离心机( b e c k m a n 公司) 2 4 p h 计( j e n w a y3 5 1 0p hm e t e r ) 2 5 倒置显微镜( 日本o l y m p a s 公司产品) 2 6 t u r n e rl u m i n o m e t e r2 0 2 0 “ 三、实验方法 1 果蝇基因组d n a 的提取： ( 1 ) 于1 5 m l e p 管巾收集的果蝇成虫5 只，加入4 0 0 f i 的b u f f e r a 液充分研磨； ( 2 ) 将e p 管置6 5 水浴3 0 分钟； ( 3 ) 加入8 0 0l a l 的b u f f e r b 液，颠倒混匀数次，置e p 管于冰上1 0 分钟； ( 4 ) 室温离心( 1 3 0 0 0 r p m ，1 5 m i n ) ，移上清至一新管； ( 5 ) 取l m l 上清，加入6 0 0 扯l 异丙醇，混匀，室温离心( 1 2 0 0 0 r p m ，1 0 m i n ) ； ( 6 ) 弃去上清，加7 0 乙醇i m l 洗沉淀，以1 2 0 0 0 r p m 的转速离- t ) , 5 m i n ，弃去上清，干燥5 m i n ； ( 7 ) 加t e 溶液2 0 p i 溶解沉淀，- 2 0 c 保存。 1 重组质粒的构建 1 1p c r 反应：依据“分子克隆”上的常规方法 i ) 反应体系： 1 5 东南大学硕士学位论文 d n t p m i x2 5 m m 4 0 9 l 上游引物1 0 p m1 0 i l l 下游引物1 0 p m 1 0 t d d n ap o y m e r a s e ( 2 5 岬1 ) 0 5 p l 模板 1 0 $ t l d d h 2 0 3 8 1 1 1 总反应体系5 0 9 l 2 ) p c r 扫“增反应条件：经d n a c l u b 软件预测，适宜退火温度为5 5 c 。 9 5 4 r a i n 9 4 5 5 7 2 7 2 1 0 m i n 1 2 酶切反应：用相应的酶同时双酶切载体和纯化p c r 产物 载体 l0 x b u f 佗r 酶i 酶i i d d h 2 0 3 9 l ( 1 u g ) 2 9 l i p i i p i 1 4 t l 总反应体系 2 0 9 l 3 7 水浴酶切4 小时或者过夜酶切。 1 3 熏组质粒的连接反应： 纯化酶切后的载体 3 i l l 纯化酶切后的p c r 产物 10 9 l t 4d n a 连接酶b u f f e r 2 p i t 4d n a 连接酶 i g l d d h 2 04 1 t l 总反应体系 2 0 9 l 1 6 连接过夜 1 4 转化：细菌( d h 5 a ) 感受态的制备及质粒的转化( 依据“分子克隆”上的方法) 1 ) 接种少量细菌至2 mll b 液体培养基中，在3 7 c ，2 0 0 转分条件下过夜培养； 2 ) 次日，以1 ：5 0 的体积比例接种至3 m l 新鲜l b 培养基中，相同条件下培养至细菌浓度的o d 6 0 0 值为0 4 左右： 3 ) 在4 c 、4 0 0 0 转分条件下离，t , , 10 分钟收集菌液 1 6 s e c y c 8 2 毫； 批曼 o o r 3 3 l 第一章材料与方法 4 ) 冰预冷的0 1 mc a c l 2 溶液3 0 0 1 重悬沉淀后，4 ，4 0 0 0 转，分条件下离- l , l o 分钟，弃上清； 5 ) 用冰预冷的o i mc a c l 2 溶液l o o p l 重悬沉淀，将微量离心管置于冰上3 0 分钟 6 ) 加质粒l i i i ，继续冰浴3 0 分钟； 7 ) 将微量离心管在4 2 c 水浴中热激9 0 秒，随后迅速将微量离心管放回冰上2 分钟； 8 ) 加等体积的新鲜l b 液体培养基，在3 7 c 、2 0 0 转分的条件下培养4 5 分钟： 9 ) 擐后吸取1 0 0 9 l 茵液均匀涂在l a ( 含有氨苄青霉素5 0 微克，毫升的l b 培养基) 固体培养板上， 于3 7 c 孵育箱中孵育1 6 4 时后观察结果。( 以上操作均在无菌条件下进行) 1 5 质粒d n a 的小量提取 1 ) 挑取转化有质粒的阳性d h 5 a 单克隆菌落至2 m ll a 液体培养基中，在3 7 ( 2 ，2 0 0 转肜的条 件下振荡培养过夜。 2 ) 次日，首先保种部分菌液至终浓度1 5 的甘油，然后转1 5 m l 菌液至微量离心管中，以 1 2 0 0 0 9 的转速离一t 3 0 秒。 3 ) 弃去一h 清加预冷的溶液i1 0 0 p l 重悬沉淀，室温放置5 分钟后。 4 ) 加2 0 0 u l 新鲜配制的溶液i i ，上一f 颠倒混匀后，冰上放置5 分钏， 5 ) 加i5 0 p l 预冷的溶液i l t ，缓慢混匀，冰上放置5 一lo 分钟 6 ) 以1 2 0 0 0 9 的转速离一0 5 分钟，离心后的上清转至一个新的微量离心管中，加o 8 倍体积异丙 醇，混匀后室温放置5 一i o 分钟，以1 2 0 0 0 9 的转速离心5 分钟，弃去上清。 7 ) 加7 0 乙醇l m l 洗沉淀，以1 2 0 0 0 9 的转速离心1 分钟。 8 ) 弃去上清后，加t e 溶液2 0 i l l 溶解沉淀，2 0 ( 2 保存。 1 6 转染细胞的质粒提取、纯化( 采用l n v i t r o g e n 公司质粒中量抽提试剂盒) 1 ) 将重组质粒以l ：5 0 的比例接种至5 0 m ll a 培养基中，于3 t c2 5 0 r p m 过夜培养。 2 ) 在室温以1 2 0 0 0 r p m 离心5r a i n 收获荫体。 3 ) 向离心管中加入4 m lb u f f e rr 3 以重悬菌体。 4 ) 向离心管中加入4 m lb u f f e rl 2 ，温和颠倒离心管4 - 6 次以充分混匀液体，室温放置5 m i n 。 5 ) 向离心管中加入4 m lb u f f e r n 3 ，迅速温和颠倒离心管4 6 次。不要涡旋。 6 ) 室温以 1 5 0 0 0 9 离心1 0 分钟，小心地将上清移入一新的离心管中，冉次以 1 5 0 0 0 9 离心 5 m i n 。 7 ) 向i n v i t r o g e n 亲和柱中加入l o m lb u f f e re q ，通过重力作用使液体流尽以平衡柱子。 8 ) 将步骤6 所获得的上清加入平衡好的亲和柱中，让液体在重力作用下自然流尽。 9 ) 向柱中分别加入l om lb u f f e rw 8 洗涤两次。 l o ) 用5m lb u f f e r e 4 洗脱并收集d n a 1 1 ) 向收集液中加3 5m l 异丙醇，轻轻混匀，4 c 、1 3 0 0 0 r p m 离心3 0 分钟，小心弃去上清。 1 2 ) 用3 m l7 0 乙醇洗涤d n a 沉淀，于4 c 以 l s 0 0 0 9 离心5 分钟，弃去上清。 1 3 ) 干燥d n a ，溶于无菌水。存于一2 0 。 1 4 ) 对抽提的质粒量及纯度的分析：将抽提的质粒以1 ：2 0 的比例稀释，在o d 2 6 0 与o d 2 8 0 双 1 7 东南大学硕士学位论文 波长下，测定质粒浓度与纯度。其中o d 2 加读数为质粒浓度，o d 2 6 0 o d 2 8 0 读数为质粒纯度。 2 果蝇s 2 细胞培养及瞬时转染 果蝇s 2 细胞培养使用s c h n e d e r 培养基( 补以1 0 胎牛血清) ，在2 8 ( 2 无c 0 2 培养箱中培养。待 细胞生长状态良好时进行瞬时转染分析。转染时在1 2 ：f l 板中接种l 1 0 6 个细胞，加入jm i 含1 0 胎牛血清的s c h n e i d e r 培养基，置2 8 ( 2 无c 0 2 培养箱中培养6 1 6 h ( 细胞生长至对数生长期达2 4 l o 卟细胞m 1 ) 后进行转染。培养转染采用的是磷酸钙转染的方法。具体操作为： 1 ) 在1 5 m l e p p e n d o r f 管中配制以下试剂 溶液a ： 2 m c a c l 2 转染载体 1 2 9 l 6 0 9 9 补水到总体积 1 0 0 9 l 溶液b ： 0 0 肚l2 xh b s ； 2 ) 将a 缓慢加入b 中，边加边轻轻混匀。此过程约持续l 2 m i n ； 3 ) 室温放置3 0 m i n ，以形成c a 3 p 0 4 一d n a 复合物。将混合的液体逐滴加至细胞内； 4 ) 混匀后置2 8 c 无c 0 2 培养箱中继续培养： 5 ) 2 4 h 后，用含1 0 胎牛血清的s c h n e i d e r 培养基给细胞换液。 3 荧光素酶活性和乒。半乳糖苷酶活性测定 细胞转染2 5 天后裂解细胞。先吸去培养液，用p b s 洗2 遍，在每个培养孔( 1 2 孑l 板) 中加 入1 0 0 9 lr e p o r t e ri y s i sb u f f e r ( p r o m e g a ) ，保证充分覆盖细胞，冻溶一次，确保细胞裂解。将细胞 裂解液移至1 5 m le p p e n d o 嘴中，振荡1 0 1 5 s ，离心( 1 2 0 0 0 9 ，2m i n ，4 ) ，转移上清于新 管。即制备好的细胞裂解液，一7 0 贮存或测定。 3 ，l 荧光素酶活性的测定( 采用的是p r o m e g a 公司荧光素酶检测试剂盒) 。 荧光索酶活性测定前将制备好的细胞裂解液及荧光素酶底物提前平衡至室温，取2 0 9 l 的 细胞裂解液，加入8 0 p l 荧光素酶底物，迅速混匀，置光度计中，记录读数。 3 2p 半乳糖苷酶活性测定( 根据分予克隆的方法) 在每个用于测定转染细胞裂解物的e p p e n d o r f 管中，加入 1 0 0 x m 9 2 +3 1 a l 1x o n p g 6 6 1 l 1 1 细胞裂解物 3 0 9 l 0 1m o l l n a 3 p 0 4 2 01g l 总体积 3 0 0 9 l 迅速混匀，置3 7 ( 2 保温3 0 r a i n ，以5 0 0 9 limn a 2 c 0 3 终止显色反