（应用化学专业论文）CdTe与Au之间的荧光共振能量转移研究.pdf

c d t e 与a u 之间的荧光共振能量转移研究 摘要 本文构建了a u d n a c d t e 荧光共振能量转移体系，并对其进行了初步研究。 采用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制得了两种不同粒径的金纳米粒子，由透射 电镜照片可知粒径分别为1 2 n m ，1 6 n m ；紫外可见吸收光谱的最大吸收波长分别 为5 1 8 n m ，5 2 0 n m ；3 8 0 n m 激发波长下两者均没有荧光发射现象。1 0 0 0 0 r m i n 下离 心3 0 m i n 后金纳米粒子没有团聚变性。 采用水相法合成了表面修饰有羧基的c d t e 半导体纳米粒子，并对其进行了 纯化，由透射电镜照片可知粒子直径为2 5 n m ；紫外可见吸收光谱的最大吸收波 长为5 0 0 n m ；荧光发射波长为5 2 5 n m 。 金纳米粒子的吸收光谱与c d t e 纳米粒子的荧光发射光谱重叠，符合荧光共 振能量转移的要求，可以作为能量转移体系的供受体对。通过形成a u s 键将3 端修饰有- s h 的d n a 连接到金纳米粒子的表面。讨论了电解质对反应的影响，用 紫外吸收光谱进行了表征。通过形成酰胺键将5 端修饰有一n 也的d n a 连接到 c d t e 纳米粒子的表面，讨论了反应缓冲液、e d c 等对反应的影响，用琼脂糖凝胶 电泳进行了表征。通过d n a 间的杂交反应，将c d t e d n a 和a u d n a 组成链状探针， c d t e 纳米粒子发出的荧光大部分被金纳米粒子吸收，此时检测到的荧光强度较 弱。加入目标d n a 后，探针的双链被打开，c d t e 纳米粒子和金纳米粒子的距离 变大，c d t e 发出的荧光不能被金纳米粒子吸收，荧光强度变大。表明c d t e 纳米 粒子和金纳米粒子之间发生了共振能量转移，本文所构建的共振能量转移体系是 成功的。 关键词：d n a ；c d t e ；金纳米；荧光共振能量转移 fiu o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e rb e t w e e nc d t ea n da u a b s t r a c t a s y s t e mo ff l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e rc o m p o s e do fa u - d n aa n d c d t b d n aw a sb u i l ta n dr e s e a r c h e d t w os i z e so fa un a n o p a r t i c t e sw e r ep r e p a r e db yr e d u c i n gg o l dc h l o r i d ew i t h s o d i u mc i t r a t e t h et r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y , u v - v i ss p e c t r o s c o p ya n d f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yw e r ec a r r i e do u t c d t es e m i c o n d u c t o rn a n o p a r t i c l e sw e r es y n t h e s i z e di nw a t e r t h et r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p y , u v - v i ss p e c t r o s c o p ya n df l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y w e r e c a r r i e do u t t h eo v e r l a pb e t w e e ne m i s s i o ns p e c t r u mo ft h ec d t en a n o p a r t i c l ea n dt h e a b s o r p t i o no fa un a n o p a r t i c l ew a sc o n f i r m e db yt h es p e c t r o s c o p yr e s e a r c ho fc d t c a n da un a n o p a r t i c l e s a un a n o p a r t i c l e sw e r el i n k e dt o3 - s h - d n at h r o u g ha u s t h e e f f e c to fe l e c t r o l y t ew a sd i s c u s s e d t h e nt h eu v - v i ss p e c t r o s c o p yw a sc a r r i e do u t c d t en a n o p a r t i c l e sw e r el i n k e dt o5 - n h 2 0 d n at h r o u g h - c o o n h 一t h ee f f e c to f r e a c t i o nb u f f e ra n de d cw e r ed i s c u s s e d t h e na g a r o s e g e le l e c t r o p h o r e s i sw a s c a r r i e do u t t h ef l u o r e s c e n c eo fc d t e - d n a 、c d t e - d n a a ua n d c d t e d n a a u + t a r g e td n a w e r em e a s u r e d d a t as h o w e dt h a tt h ef l u o r e s c e n c eo f c d t e d n a a uc o n j u g a t e si sm i n i m u m w h e nw ea d d e dac o m p l e m e n t a r ys s d n at o c d t e - d n a a uc o n j u g a t e s t h ef l u o r e s c e n c eo ft h eh y b r i dm o l e c u l ei n c r e a s e ds ot h e s y s t e mo ff l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e rw a s s e tu ps u c c e s s f u l l y k e yw o r d ：c d t e ；a u ：n a n o p a r t i c l e ；d n a ；f l u o r e s c e n c e ；f r e t ； 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得云控王些盍堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名 ，步砰 签字日期2 即# 年；月fr 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解玉洼王些太堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权云洼王些盍堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：步胃哗 签字日期：纺舌年岁月日 导师签名：勿鬈锄砂唧型 签字日期：芘归；年，月咱 学位论文的主要创新点 一、首次采用半导体纳米粒子c d t e 代替传统荧光染料分子作为能 量给体。 二、首次采用1 6 n m 的金纳米粒子代替传统荧光染料分子作为能量给 体。 三、首次成功合成出链状探针。 第一章绪论 第一章绪论 1 1 生物传感器概述 生物传感器是在生物学、医学、电化学、光学、热学及电子技术等多种学科 相互渗透中成长起来的一门新学科。它是以生物学组件作为主要功能性元件，能 够感应特定的待测量并按照一定规律将其转换成可识别信号的器件或装置“1 。生 物传感器一般是由生物识别元件、转换元件、信号调节元件、数据处理器和信号 发生器组成。1 。其特点性强、分析速度快、操作简便、能进行在线分析甚至活体 分析且能检测极微量的物质。生物传感器基于它的生物敏感材料来自生物体，所 以应用范围相当广泛m ，。 生物传感器的分类方式有很多种，根据生物传感器的信号转换方式可分为压 电晶体生物传感器、电化学生物传感器、声学及光学生物传感器等。按照生物敏 感物质相互作用的类型可分为亲和型和代谢型两种。根据生物传感器中分子识别 元件上的敏感物质不同，把目前国内外在环境监测中常用的生物传感器分为酶传 感器、微生物传感器、免疫传感器、d n a 传感器、组织传感器、细胞传感器等。 生物传感器自提出以来，研究及发展速度非常快、具有广阔的发展前景。如今， 便携、快速、灵敏的d n a 传感器已被广泛应用到医学诊断、环境监测、军事和法 律等各个领域，在生活中发挥着越来越重要的作用。 1 2d n 生物传感器及研究概述 d n a 生物传感器是近几年发展起来的新型生物传感器“，这类传感器起步比 较晚，但却有很高的使用价值，已经引起了世界各国生物传感器学者的高度重视 。3 。d n a 生物传感器一起步就吸收了其它各种传感器的优点并充分利用高新科学 技术，发展速度十分迅猛，已经在许多的研究方面有所突破。d n a 生物传感器是 建立在d n a 杂交基础上的，我们先简单介绍一下d n a 碱基配对原则以及d n a 的变 性和复性。 1 2 1d n a 碱基配对与杂交 ( 1 ) d n a 的化学结构 d n a ( 脱氧核糖核酸) 是活细胞中最重要的分子，它含有特定细胞的全部遗传 信息。早期对d n a 的研究和各种实验表明，d n a 分子是一个长的高度有序的结构。 通过x 射线衍射分析，得到了关于d n a 分子的各个部分的大小和排列，观察到分 子是螺旋型的，核苷酸碱基是平面堆积，两个碱基之间的距离是0 3 4 n m 。化学 分析证明，d n a 分子含腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、胸腺嘧啶( t ) 和胞嘧啶( c ) 。 第一章绪论 d n a 双螺旋结构模型如图卜1 所示 戈 2 - 蝴b 黜 肛测a 图卜1 核酸可形成的3 种形式的螺旋 ( 2 ) d n a 的碱基匹配原则 在d n a 的双螺旋结构中，两条核苷酸链依靠彼此碱基之间形成的氢键相连系 而结合在起。根据分子模型计算，一条链上的嘌呤碱基必须与另一条链上的嘧 啶碱基相匹配，其距离才正好和双螺旋的直径相吻合。碱基之间所形成的氢键， 根据对碱基构象研究的结果，a 只能与t 相配对，形成两个氢键；g 与c 相配对， 形成三个氢键。所以g c 之间的连接较为稳定。上述碱基之间配对的原则称为碱 基互补，其具体结构如图1 - 2 所示。 c 肌 c h 、，h 封 掣 h 一 图卜2d n a 中碱基配对示意图 2 g p 、 u “k e ， h 扎 、o ，kf t 第一章绪论 ( 3 ) d n a 的变性、复性与杂交 d n a 的变性是指d n a 双螺旋结构的氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的 断裂。可以使d n a 变性的因素很多。由温度升高而引起的称热变性。由酸碱度改 变引起的称为酸碱变性“。当d n a 的稀盐溶液加热到8 0 - 1 0 0 。c 时，双螺旋结构 即发生解体，两条链分开，形成无规线团。一系列物化性质也随之发生改变：2 6 0 n m 处紫外吸收值升高，粘度降低，密度升高，同时改变二级结构，有时可以失去部 分或全部生物活性。d n a 的变性的特点是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的 温度范围内。通常把d n a 的双螺旋结构失去一半时的温度称为该d n a 的溶解温度 ( t m ) 。d n a 的t m 值一般在7 0 - 8 5 之间。 变性d n a 在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结 构，这过程称为复性。d n a 复性后许多物化性质得到恢复。生物活性也可以得到 部分恢复。将热变性的d n a 骤然冷却时，d n a 不可能复性。变性d n a 在缓慢冷却 时可以复性。 将不同来源的d n a 放在试管中，经热变性后，慢慢冷却，让其复性。若这些 异源d n a 之间在某些区域有相同的序列，则复性时，会形成杂交d n a 分子。d n a 杂交时严格遵守碱基互补配对原则。这也使得杂交技术成为d n a 的研究与检测方 面最有力的工具。 1 2 2d n a 的检测方法 生物传感器的一个重要组成部分是信号转换装置，它与分子识别基质可以是 同一器件，也可为不同器件。其作用是把所感知的d n a 与待测物质特异性结合产 生的微小变化转变为可记录的信号。根据是否选用指示标记物，可分为：( 1 ) 标 识型，如用荧光试剂或电活性试剂标记探针或靶基因，利用荧光或氧化还原信号 的改变进行检测。选择合适的杂交指示剂是此法的关键。( 2 ) 无标记型，如石英 微天平( q c m ) 及表面等离子体基元共振( s p r ) ，分别利用质量及折射率的变化 进行检测。此法简单、易于实现在线检测。而根据d n a 转换器件转换信号的不同， 又可分为电化学、光学、声表面波法及力学检测等。主要介绍一下光学检测法。 目前d n a 光学生物传感器主要是利用光波传导技术及消失波原理。当光完全 在棱镜底部发生全内反射时，产生的消失波渗透溶液介质可达3 0 0 h m ，使检测时 光吸收达到最大值，从而可提高分析的灵敏度。主要分为荧光型、表面等离子体 基元共振型及共振镜型。 荧光型检测法是在d n a 探针中或待测靶基因中标上荧光标记物，也可在d n a 杂交后加入荧光标记物。通过测定荧光标记嵌入d n a 双螺旋间所导致的荧光信号 的变化，检测d n a 。例如，g r a h a m “o 等人将1 6 m e r 或2 0 m e r 核普酸探针固定于光 纤表面，通过荧光素标记的核昔酸浓度与荧光响应的线性关系，检测了纳克级的 第一章绪论 d n a 序列，传感器表面可再生重复使用多次。最近，b i e r 等“”以花青二聚体y o y o 及p i c o g r e e n 作为与d n a 双链紧密亲合的荧光嵌入剂，由于与d n a 杂交体间的双 嵌入作用，使得完全配对、单碱基错配及两个以上不匹配所产生的荧光信号有明 显不同，从而能够明显区分不同d n a 序列，对目的基因的检出限达到3 0 n g l ， 是目前所报道中最灵敏的杂交传感器。循环再生6 0 次以后，仍能有很好的灵敏 度。 表面等离子体基元是金属表面上的表面电荷密度波。当改变入射角时，表面 等离子体基元共振可在反射光的一个非常尖锐的最小值观测。共振角对紧靠金属 膜外侧的介质折射率的变化非常灵敏。当金属膜表面固定的d n a 单链探针与溶液 中其互补体结合时，会引起消失波在液面与波导界面上折射率的改变，用光波导 将折射率的变化传输给检测器可进行检测。一种检测方式为s p r 扫描，是改变入 射角度，测定反射光强度与入射角的关系。如b i e r 等“3 1 以a v i d i n b i o t i n 法固 定d n a ，用s p r 扫描法进行了核酸杂交测试。通过比较发现在共振角，可配对的 碱基个数越多，共振信号就越强，反射光强度则越小。另一种检测方式为s p r 显微镜，是将入射角度固定在共振角附近，用c c d 射像检测反射光强与样品不同 部位的关系。c o r n “4 1 等人研究表明，此方式可区分单、双链d n a ，并有可能进 行突变识别。 1 3 荧光与荧光探针 1 3 1 荧光 荧光的应用、荧光探针技术和荧光检测仪器都在迅速的发展。荧光已经被广 泛应用于环境、化学、d n a 序列等方面的测量以及荧光原位杂交( f l u o r e s c e n e ci n s i t u h y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 的基因分析“”1 。荧光也已经用于流式细胞仪中细胞 辨别和搜寻。随着激光共焦荧光显微术和多光子激发荧光显微术的发展，荧光技 术己经成为生命科学，特别是活体原位检测的重要手段。由于荧光检测的灵敏性 以及放射仪器的昂贵和难以操作等原因，正在努力发展基于荧光的相关医疗仪 器，包括广泛应用的酶联结免疫检测和荧光偏振免疫检测。 1 3 2 生化荧光基团 荧光基团一般分为内源性和外源性两类。内源性的荧光基团就是那些自然就 发荧光的物质。内源性的荧光基团有色氨酸( t r y p t o p h a n ) 类，烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸( n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e ，n a d h ) ，氧化黄素( f l a v i na d e n i n ed i n u c l e o t i d e ，f a d 和f l a v i nm o m o n u c l e o t i d e ，f m n ) ，吡哆醛磷酸盐( p y r i d o x a l p h o s p h a t e ) 以及叶绿素( c h l o r o p h y l l ) 。外源性荧光基团用于标记那些不发光的 研究对象。目前己经发展了用于不同目的的上千种荧光探针“”如荧光( f i t c ) ， 4 第一章绪论 若丹明b ( r h o d a m i n e b ，r h b ) ，吖啶橙( a c r i d i n eo r a n g e ，a o ) ，绿色荧光蛋白 ( g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n s ，g f p s ) 等。 1 3 3 荧光探针 荧光探针分为两类：化学探针和基因探针( g r e e nf l u o r e s c e n c e p r o t e i n s ，g f p s ) 。 化学荧光探针：化学探针大多是含有共轭双键体系的化合物。共扼双键使其 容易吸收激发光，其吸收波长大多处于近紫外区或可见光区，发射波长多处于可 见光区。 化学荧光探针已经被广泛应用于化学、生物组织、微生物、d n a ，r n a 以及活 体细胞活性内的金属离子、p h 值、细胞活性、亚细胞器宫、细胞离子通道等方 面的研究中。按照探针标记对象和功能分类，化学荧光探针可以分为以下几类：( 1 ) 免疫细胞化学荧光探针，主要用于蛋白质、受体和单糖、多糖的示踪迹。( 2 ) 位 点探针，主要用于标记位点。( 3 ) 细胞器探针，主要用于标记亚细胞器。( 4 ) 核酸 探针。( 5 ) 蛋白质探针。( 6 ) 细胞活性探针。( 7 ) 膜和受体探针。( 8 ) 细胞膜电位和 细胞内p h 探针。( 9 ) 离子探针。 基因探针：绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，g f p ) 是近几年发展 起来的新型荧光基因探针。 绿色荧光蛋白( g f p ) 是一种来源于多管水母属( a e q u o r e av i c t o r i a ) 体内的 一种天然发光蛋白，它是由s h i m o m u r a 等首先发现的。“。虽然g f p 能自发荧光， 但野生型g f p 的荧光较弱，不利于遗传研究。如果对g f p 的生色团进行修饰，就 能诱发g f p 发生突变，从而改变g f p 的光谱特性，使g f p 在生物体中的发光强度 得以增强，有利于荧光的显现和肉眼观察。现在已经获得了多种g f p 的变异体， 如g f p s 6 5 t 、b f p 、c f p 、y f p 和d s r e d o ”2 6 。 1 4 荧光共振能量转移研究 1 4 1 荧光共振能量转移简介 1 9 4 8 年，f s r s t e r 创立了荧光共振能量转移( f r e t ) 的原则，这是一项应用能 量转移来测量分子内和分子间的距离的技术。当供体发射的荧光与受体发色团分 子的吸收光谱重叠，并且两个探针在几个原子直径范围以内时，就会发生一种非 放射性的能量转移，这种现象就n q f r e t 。 1 4 2 荧光共振能量转移技术的应用 ( 1 ) 无机离子的测定 聚乙烯醇是一种可溶于水的高分子化合物，先通过氰脉酞氯将荧光胺( 给予 体) 和铬黑t ( 接受体) 分别固定在聚乙烯醇的两个轻基上，将它作为试剂。在氨缓 第一章绪论 冲溶液中( p h = 9 6 ) ，由于铬黑t 的吸收光谱与荧光胺的荧光光谱重叠都很小，不 发生荧光能量转移，试剂溶液呈现出荧光：当加入镁离子后，镁同铬黑t 形成络合 物，其吸收光谱向紫移，并与荧光胺发射光谱重叠，发生荧光能量转移，导致荧 光熄灭，荧光熄灭程度与镁离子浓度成比例。用此法测定镁，比相应的铬黑t 光 度法灵敏度提高1 0 倍以上。7 1 ( 2 ) 酶的活性的测定 l a t t 等。”设计了一种底物，在该底物中丹酞单元作为能量受体，它在甚至相 隔三个甘氨酞基的情况下也能碎灭色氨酸的荧光，当色氨酸一甘氨酞基之间的键 断裂时，又能恢复色氨酸的荧光。基于这种能量转移，他们测定了浚肤酶的活性。 如果将发荧光的供体和生色团受体分别键合到反应过程中断裂基团的两侧， 那么当水解进行时，监测受体荧光的下降或供体荧光的增强，可用于分析水解酶。 0 一羧基荧光素与卵磷脂脂质体( l e c i t h i n1 i p o s o m e ) 混合时，荧光被粹灭，酶 破坏了脂质体并释放出荧光素而恢复荧光，从而提供了测定磷脂酶活性的方法 2 叫 o ( 3 ) 免疫分析 这是能量转移荧光分析中，应用最多和最成功的领域，最早由u l l m a n 啪1 等人 提出( 1 9 7 6 年) 。常用的实验方法有两种：竞争法和夹心法。 在竞争法中u 1 l m a n 等人选择荧光素作为给予体( d ) ，四甲基罗丹明异硫氰酸 盐作为接受体( a ) 。将抗原( a g ) 用荧光素标记，抗体( a b ) 用四甲基罗丹明标记， 让未被标记的抗原( 分析物) 与标记抗原和标记抗体的免疫复合按下式发生竞争 反应： a g + a 9 5 一a b 8 - - a g + a g a b 8 在免疫复合物种，荧光素标记的抗原( a 9 5 ) 转移激发能量到四甲基罗丹明标 记的抗体( a b 8 ) 上，导致荧光素荧光的熄灭当这一免疫复合物中加入待测分析物 ( a g ) 时，随着未标记的抗原浓度的增大，与抗体结合的标记抗原由于竞争反应的 结果而部分脱离抗体，能量转移荧光熄灭降低，荧光强度增加。 夹心法是将抗体的一半用荧光素标记，另一半用四甲基罗丹明标记。被分析的抗 原有两个位置能同抗体结合生成夹心免疫复合物，同时导致能量转移荧光熄灭。 其反应方程式为：a g + a b a b 8 一a g f - a g a b 8 试样中被分析的抗原浓度逾高，生成的夹心免疫复合物也逾多，荧光强度也 愈小。这两种方法对抗原的测定，灵敏度可达1 0 。5 范围，并已用于多种抗原或抗 体的测定。 ( 4 ) p h 传感器o ” 将荧光剂曙红作为给予体，非荧光p h 指示剂酚红作为接受体，固定在一聚合 第一章绪论 物膜( 如聚乙烯醇或牛血清蛋白) ，置于光导纤维的公共端。当p h = 8 时，酚红的 吸收光谱与曙红的发射光谱有最大程度的重叠。由于荧光能量转移的淬灭作用， 导致荧光强度随p h 值增高而降低，在p h = 6 o - 8 o 范围内，荧光强度与p h 值变化成 比例。 还有人将杂氧花青( o x a c y a n i n e ) 作为给予体，双十八烷基二硫代氨基甲酸 盐作为接受体，固定在单分子l b 膜上，做成了基于荧光能量转移的金属离子荧光 纤为传感器。“。 ( 5 ) 在大分子结构、功能研究的作用 f r e t 技术对生物大分子结构的分析在溶液中进行，无须复杂的结晶等样品处 理步骤，因而快速、灵敏，同时与x 一射线晶体衍射法相比，其测定结果更能反 映生物大分子结构与功能间的关系。 f r e t 技术可以轻松的分析生物大分子三维结构及特定位点间的距离。 n i c o l a s 1 等人以标记于特定非催化位点的卜苯胺基一8 一蔡磺酸( a n s ) 作为a ，催化 位点中t r p 残基为d ，测定了人类a 型及突变体n 型胞浆谷肤甘肤转移酶中d 、a 间 的距离，发现二者有所区别：n 型中距离为2 2 n m ，型中为1 8 2 n m 。 i s a c e 。”等人测定了对基因表达有调节作用的蛋白质分子中d n a 接合部为 m s x 一1 片断的空间结构。f r e t 还可用于单分子膜组成的描述m 3 b ，d n a 点突变的探 测。”、生物功能分子在激活前后结构变化 4 7 、生物小分子聚合成大分子的方式 及结构变化。“、分子游离态与结合态结构的变化情况“1 、分子结构转变中间 体等等m 1 ( 6 ) 核酸杂交分析方面的应用 f r e t 技术以常规荧光仪就可以灵敏、快速的测定核酸杂交。这一技术也可用 于固相分析或利用特殊的荧光显微镜进行单细胞分析，但需要特殊的辅助设备。 目前，f r e t 技术已经可以测定1 0 0 ul 体积中1 0 - ”m o l 数量级“”的杂交反应，与放 射分析具有相当的灵敏度，却避免了繁琐的分离手续。 f r e t 核酸杂交分析的原理很简单：当分别带有d ，a 标记物的核酸探针单链杂 交时，给体、受体之间的距离发生变化，就会引起荧光强度的变化。探针的设计 有以下几种模式：( a ) 在核酸双链探针的每条单链5 端进行标记，但只适用于碱基 数在6 2 0 之间的较短的寡聚核普酸链：( b ) 当链较长时，一条单链标记5 端，其互 补链标记3 端：( c ) 将核酸双链探针中的一条链截断，在生成的两条短链相邻端进 行标记：( d ) 作为更加简便的标记方法，只需要在条链的一端进行共价标记，而 使用嵌入式加入另一种荧光分子作为另一标记。但这种方法不能确定d ，a 间距 离，因为不知嵌入的荧光分子的位置与数量。 s i x o u 等人1 以f r e t 技术首次做到了对或细胞内核酸杂交反应的研究，他们 第一章绪论 以上述( b ) 方式标记了含2 8 个碱基的寡聚核昔酸单链及其互补链，并将二者的杂 交物注入活细胞中，观察其降解反应，发现注入细胞的寡聚核普酸可以与胞浆中 及核内非同原的互补链杂交。 f r e t 也可以用于核酸的定量分析。如在5 和3 端分别标记的d n a 杂交双链中加入 = j i i i 同量未标记互补链，分别测出能量转移效率e ，以e 对加入的未标物量做工作曲 线，用于未知量的测定。m o r r i s o n 等人1 以荧光素标记寡聚核昔酸单链5 端作为 d ，罗丹明标记其互补链3 端作为a ，形成一对探针，可测出6 p m o l 的靶d n a 分子。 p a r k h u r s t 等人1 采用了一种特殊的标记方法：在一条含1 6 个碱基的寡聚核 苷酸单链探针的3 端以荧光素( f ) 标记作为d ，5 端以罗丹明( r h * ) 标记作为a ， 其在溶液中以随机盘绕状态存在，首位平均距离很近，可发生有效能量转移。而 当其形成杂交双螺旋时，由于1 6 个碱基相当于1 5 n ，f 术，r h * 分别位于螺旋直径 的两端，距离变大，e 下降。用这种方法，p a r k h u r s t 等人可在n m o l um o l 范围内测定探针互补链。他们还观察了探针与其互补寡聚核苷酸链以及m 1 3 m p l 8 ( 十) d n a 杂交反应动力学之间的差别( 探针与m 1 3 m p l 8 ( + ) d n a 中6 2 9 1 - 6 3 0 6 序列的碱 基互补) ，发现杂交反应均为二级，反应常数分别为5 7 x l o s m o l l - i s 。1 和5 7 x 1 0 4 m o l l - 1 s ，这1 0 倍的差别被归于由d n a 大分子互补序列两端其它部分结构的波动 变化引起。 1 5 量子点应用于共振能量转移体系 1 5 1 量子点应用于共振能量转移体系的优势 传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样就会影响供体发 射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。最近的 一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处 4 7 - s 2 。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，这样就 减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的 光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，以最大限度地 避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光 区任一波长的光，也就是说它可以吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并 且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。 1 5 2 量子点共振能量转移体系的应用 ( 1 ) 应用于蛋白特异性结合的检测 较早用量子点的菇振能量转移原理，进行蛋白蛋白特异性结合研究的是 w a n g 等人“”，他们用发射光谱为6 1l n m 、5 5 5 n m 的红、绿量子点分别标记牛血清 白蛋白( b s a ) 和抗牛血清白蛋白抗体( i g g ) ，当二者形成免疫复合物时， b s a 8 第一章绪论 上的红色量子点荧光增强，i g g 上的绿色量子点荧光相应减弱，这是因为抗原、 抗体彼此结合，将两种量子点拉得足够近，使其发生偶极一偶极相互作用，这时 尺寸较小的绿色量子点的激发态能量转移给了尺寸较大的红色量子点激发态，即 发生了共振能量转移。当加入未标记量子点的b s a 时，它就会与q d b s a 发生竞 争，将q d b s a 从免疫复合物上取代下来，阻止了共振能量转移的发生，这时红 色量子点荧光强度降下来，而绿色量子点荧光强度又恢复原样。 w i l l a r d “”等人的工作中，将四甲基罗丹明( t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e ，t m r ) 标记的链霉亲和素( s t r e p t a v i d i n ) 与生物素化的b s a 特异性结合，用量子点标记 b s a ，这样就形成了以量子点作为能量供体，有机荧光物质t m r 作为能量受体的 共振能量转移体系，可以对生物素与链霉亲和素的结合进行捡测( 如图l 3 ) 。以 4 0 0 n m 的光进行激发，对于量子点来说有很高的激发效率，而对于t m r 来说则几 乎不被激发，当以这个波长对连接体进行激发时，由于发生了共振能量转移，t m r 荧光强度显著增强。 獠l 强 图l 一3 利用蛋白特异性结合的共振能量转移分析 ( 2 ) 应用于生物传感器的模型设计 除了用于免疫分析和其他特异性结合分析外，应用共振能量转移原理，量子 点在生物传感器方面的研究更是方兴未艾，在这些传感器中都是以量子点作为能 量供体，以有机荧光染料作为能量受体。c l a p p 。”等人将人工改造的并且保持结 合能力的麦芽糖结合蛋白( m a l t o s e b i n d i n gp r o t e i n ，m b p ) 与量子点不可逆静 电结合，花青染料( c y a n i n ed y e s ) 共价结合到m b p 上，形成q d m b p c y 3 。在 连接到量子点上的m b p 保持一定数目的情况下，增加m b p c y 3 时，量子点荧光强 度随之减弱，c y 3 荧光强度相应增加，也就是说包围在量子点周围的能量受体越 多，光谱重叠越好，能量转移效率越高，可以用如下公式表示： 668 e = n r o ( n r o + r ) n 代表平均一个量子点上结合的受体的个数， r o 代表能量传递达到5 0 时的距离。 9 第一章绪论 r 代表能量供、受体之间的距离 在连接到量子点上的m b p c y 3 数目一定的情况下对q d 。q d 。n m 、q d 。三种量 子点的能量转移效率进行比较，得到q d 。能量转移效率最高，也就是说该量子 点的发射光谱与c y 3 吸收光谱重叠程度最佳。 1 6 纳米金在生物学领域的应用 近年来，有关纳米材料的合成和应用方面的研究工作进展迅速，特别是纳米 金，在分子生物学领域的研究和应用已成为目前科学家研究的热点。鉴于金纳米 粒子与巯基之间有强的共价键合，这使得纳米金与巯基标记的生物活性分子结合 后形成的探针可用于生物体系的检测中。这种复合探针较早被人们用在免疫学检 测中，通过抗原一抗体的相互作用可以得到清晰的光学或电子显微镜图像。人们 对纳米金在功能化固体表面的化学组装行为也做了大量的研究，但对d n a 片段作 为程序化组装元件并未受到材料化学家足够的注意甚至还有一些争议。1 9 9 6 年以 来，美国西北大学纳米技术研究所纳米装配和分子自组装中, b e h a dh ，m i r k i n 教授领导的研究小组的人员在纳米金与d n a 片段之间的相互作用方面做了大量深 入细致的工作利用纳米金在d n a 片段作为组装分子的引导下可形成超分子结构 的特点，建立了用巯基化寡核苷酸探针标记纳米金并检测特定多核苷酸序列的新 方法。该小组在纳米金一寡核苷酸探针的制备、纳米金及其组装态的等离子体共 振吸收，以及用纳米金一寡核苷酸复合探针比色检测多核苷酸的方法等方面为特 定多核苷酸序列检测的研究和应用开辟了一个新领域。 纳米金探针具有很多优点，诸如较好的分辨率、稳定性和均一性，另外由于 其尺寸小，因此通过改进穿透性可用于定量标记生物体的抗原位点。常规电子显 微镜能够观测到金纳米晶体的最小的半径为1 4 n m ，当共价连接到抗体片断上时 有7 n m 的空间分辨率。在组织学上，用表面吸附有抗体的金纳米粒子( 1 0 4 0 n m ) 特异性标记生物大分子。在电子显微镜或者光学显微镜下可以通过银染反应来 改进晶体的能见度，对分析信号进行放大，对免疫分子的检测可以达至1 p g 水平。“。 也可以幂i 用催化还原银沉积在微电极中间导致欧姆电阻降低来对生物特异性反 应进行电学检测”“。金纳米粒子还可以被用来提高s p r 实时检测生物特异性反应 的灵敏度“”。胶体金对s p r 的增强作用首先体现在一个三明治夹一t l , 结构得到应用， 金标记二级抗体育结合在传感器表面导致等离子偏角的增大、共振带的加宽以及 最小反射比的增加，因而可检钡1 p m o l 水平的抗原。 利用三明治夹心结构，把用纳米金标记的分子连接到固相支持物表面后，在 合适条件下把纳米金粒子溶解成金离子，通过检测离子金达到对微量蛋白质检测 信号进行放大的目的。”。通过银染法对金纳米粒子的增长可以把检测限提高卜2 个数量级。依据纳米金凝聚过程中光学的变化，利用蛋白质a 与免疫球蛋白形成 第一章绪论 的夹心结构4 ”以及人i g g 对羊抗人i g g 的高选择性、多元结合的特点，建立了简便、 快速、灵敏的蛋白质检测方法。 蛋白质修饰的胶体会在生物分析技术中得到了广泛的应用 5 3 ，直到最近才 有用于d n a 分析的大量报道”，之后基于金纳米粒子的等离子芙振带光学特性 建立了许多d n a 分析方法“1 ，利用d n a 的互补识别作用把表面修饰有寡聚核苷酸 的金纳米粒子连接成体相材料，此时可以检测到体系光谱行为的显著变化( 金纳 米粒子5 2 0 r i m 处的等离子共振峰及其体相材料的7 0 0 n m 处的宽吸收峰均可作为检 测波长) ”3 。基于此原理建立了检钡u d n a 的分析方法，它具有简便、快速、灵敏 度高( 可达5 0 f m 0 1 ) 等特点叭3 。同时由于d n a 双链结构的溶解温度t 。由碱基序列、 链长等因素控制，胶体金体相材料与胶体溶液之间的可逆转换反映了d n a 分子的 可逆变性行为，此法检测到的d n a 变性曲线的峰宽较窄，可灵敏地检测d n a 序列的 多态性旧6 。但是还需要对此类超分子聚集体的光学现象做进一步研究，并建立 相应的均相分析方法用于生物医药诊断方面的简便、经济、可视传感技术的研究， 例如发病组织的核酸检测。 类似于酶联免疫反应的检测原理，利用待测分子的杂交作用把d n a 修饰的金 纳米粒子连接到固相支持物上面最近引起广泛关注“1 。固定在金纳米粒子上的 特异核酸与固定在表面的键合目标物进行杂交，这样就建立了比较灵敏的检测核 酸的芯片分析方法，通过在金粒子表面还原银离子沉积进行信号放大，得到比传 统测定核酸的荧光法高1 0 0 倍的灵敏度”1 。还可以利用纳米粒子的尺寸选择性进 行核酸阵列的多色标记“。胶体金纳米粒子还可以在石英晶体微天平“”3 。角度 决定的光散射”以及表面基元共振。”测定d n a 杂交信号放大的方法。 利用金纳米粒子对荧光的淬灭作用，把一端连有荧光基团另一端连有巯基的 特定寡聚核苷酸耦合到金纳米晶体上用于核酸均相分析的探针，比传统核酸信标 的灵敏度提高了i 0 0 倍”“。最近m i r k i n 报道了制备金纳米粒子一荧光分子一d n a 复合结构作为纳米探针，类似于酶连免疫一银染反应在金纳米粒子表面还原沉积 银纳米粒子，利用银的强拉曼效应可以作为生物多色标i 己进行d n a 的多组分或者 多态性测定n “。 1 7 课题研究的主要内容及意义 1 7 i 课题的主要内容 实验部分主要包括c d t e 半导体纳米粒子的合成及表征、c d t e - d n a 的合成、 金纳米粒子的合成及表征、a u d n a 的合成以及c d t e - d n a - a u 探针的合成，具体 内容如下： 1 、c d t e 半导体纳米粒子的合成及表征 采用水相法合成了表面修饰有一c o o h 的c d t e 纳米粒子，用透射电镜、紫 第一章绪论 外吸收光谱、荧光发射光谱等对其进行了表征，用高速离心的方法对其进行 了纯化。 2 、c d t e d n a 的合成及表征 通过c d t e 表面的一c o o h 与d n a 一端的一n h 2 的反应，将d n a 连接到c d t e 纳米粒子的表面，用琼脂糖凝胶电泳对实验结果进行了表征，讨论了偶联剂 用量和缓冲溶液对反应的影响。 3 、金纳米粒子的合成及表征 采用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备了金纳米粒子，用透射电镜、紫外 吸收光谱、荧光发射光谱等对其进行了表征，讨论了电解质对金纳米溶液的 影响。 4 、a u - d n a 的合成及表征 通过形成a u s 键将d n a 连接到金纳米粒子上，用紫外吸收光谱对实验结 果进行了表征。 5 、c d t e d n a a u 探针的合成 利用d n a 杂交反应合成了探针c d t e d n a a u ，并对此荧光共振能量转移体系 进行了评价。 1 7 2 课题的意义 随着人类基因组序列工作的初步完成，基因物质的杂交、错配检测等在病理 学、药理学、免疫学、分子生物学等方面得到了广泛应用，己受到各国科学家的 普遍重视。荧光标记的检测体系近年来在d n a 芯片中的重要作用已经获得认同， 并且在基因表达、基因突变、基因多态性研究和基因诊断等领域得到了应用。但 是传统的荧光标记共振能量转移体系一般采用荧光有机染料分子作为能量供受 体对。尽管荧光有机染料分子有很好的生物相溶性，但是需要用特定的波长激发 才能发出荧光，如果要同时检测多种疾病，就需要用不同波长的光激发，这样就 会造成检测体系中能量过多，不利于检测；同时不同波长的光激发之间的重叠也 会使各个能量给体和受体之间的能量转移变得不明显，增加数据分析的复杂性。 本文采用无机纳米粒子作为能量供受体对，具有较高的量子效率和良好的化学、 光学稳定性，其荧光寿命是普通有机染料分子的1 0 0 倍以上。 f r e t 技术具有独特的优越性，在今后科研领域，将与荧光显微镜结合用于 单个活细胞的分析，使人们对生命现象奥秘的探索向前迈进。 第二章理论部分 第二章理论部分 2 。1 荧光共振能量转移( f r e t ) 的发生及应用原理 当某些物质受紫外光、x 射线和电子射线等照射后会发射出各种颜色和不同 强度的可见光，而当照射停止后光线也随之很快地消失，这种光线就是荧光，它 是由第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象。1 9 4 8 年， f 6 r s t e r 首先提出，一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体( d o n o r ) 和能量 受体( a c c e p z o r ) 对，它们之间由于偶极一偶极的相互作用，激发供体分子的光子 能量hu 可能被传递至受体分子，而后受体分子通过发射出光子hu 。( hu hu ) 而松弛，其直观的表现就是供体和受体之间达到合适的距离内( 1 - 1 0 h m ) ，以供 体的激发光激发，供体产生的荧光强度比它单独存在时要低得多，而受体发射的 荧光却大大增强，同时伴随它们的荧光寿命的相应缩短和拉长，这就是荧光共振 能量转移”“，其过程如图2 - 1 所示。这种能量传递的过程不涉及到光子，它的效 率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相 对取向、以及供体与受体之间的距离等有关。 能量传递效率用公式表示就是：