（应用化学专业论文）亲水性萘酰亚胺阳离子荧光分子探针的设计、合成及性能.pdf

摘要 设计、合成了一系列具有可反应基团和亲水基团等的4 - 哌嗪基一1 ，8 一萘酰亚 胺衍生物，这些分子是进一步合成复杂荧光探针的中间体。研究了其中三种完 全水溶性分子作为氢离子荧光分子探针的识别性能，它们均为性能良好的氢离 子荧光分子开关。 研究了溶剂极性对n - ( 2 ( 2 羟乙氧基) 乙基) 4 吗啉基- 1 ，8 - 萘酰亚胺荧光的 影响，发现该化合物是一个对环境极性比较敏感的荧光分子探针。 设计、合成了一系列新的不同识别基团、不同亲水性的双荧光团荧光分子 探针，从中发现了2 ，6 - 二氨甲基吡啶为连接基团和识别基团的双荧光团荧光分 子探针是在中性缓冲水溶液中能够高度敏感性和选择性地络合促进荧光增强 识别汞离子的探针。在此基础上，实现了该探针在活细胞内对汞离予的荧光成 像检测。并得到一些关于短期细胞汞中毒时汞离子分布的信息。 在借鉴了小肽荧光探针以及聚酰胺氨基( p a m a m ) 树枝状分子与金属离子 的结合性能研究的基础上，根据4 氨基1 ，8 - 萘酰亚胺荧光母体的特点以及荧光 探针分子构造的基本原理，设计、合成了新的单萘酰弧胺功能化的p a m a m 树 枝状荧光分子探针。该探针分子具有良好的水溶性，在t r i s h c i 的中性缓冲溶 液中，于常见金属离子中( c r ”、n a + 、k + 、c a ”、m g ”、z n ”、c d 抖、c o ”、 p b ”、n i ”、f e ”、a g + 和c u 2 + ) 能够专一选择性地、可逆、敏感、荧光淬灭识 别c u ”。另外，根据c u 2 + 识别过程中的光谱现象，提出了一种新的p a m a m 树枝状分子与c u 2 + 在水溶液中络合的结构模型。 设计、合成了三种新的三臂荧光分子探针，该类探针是具有荧光开关能力 的p e t 体系。 大连理工火学博士学位论文 设计、合成了一个新的由蒽和4 氨基1 ，8 蔡酰亚胺两种荧光团组成的光诱 导电子转移，并且同时发生激发态能量转移的分子器件。该分子可作为氢离子 探针使用。 关键词：荧光分子探针，萘酰亚胺，分子识别，过渡金属离子，莺金属离子 a b s t r a c t as e r i e so f4 - p i p e r i z i n y l 一1 ，8 - n a p h t h l i m i d e sd e r i v a t i v e sw i t hr e a c t i v eg r o u p s a n d h y d r o p h i l i cg r o u p s w e r e d e s i g n e d a n d s y n t h e s i z e d ，w h i c h w e r eu s e da s m e d i u mo fs y n t h e s i z i n gc o m p l i c a t e df l u o r e s c e n tp r o b e s t h er e c o g n i t i o no ft h r e e w a t e r s o l v a b l ep r o b e st o p r o t o n sw e r es t u d i e d ，t h e r e s u l t ss h o wt h e ya r ew e l l f l u o r e s c e n ts w i t c h e sf o rp r o t o n s i tw a sf o u n dt h a t n - ( 2 - ( 2 一h y d r o x y l e t b o x y l ) e t h y l ) 一4 一m o r p h o l i n y l 一1 ，8 一 n a p h t h a m i d ei sas e n s i t i v ef l u o r e s c e n tp r o b et os o l v e n tp o l a r i t y as e r i e so fn o v e lf l u o r e s c e n tp r o b e sw i t ht w on a p h t h a l i m i d e sa n dd i f f e r e n t a c c e p t e r sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d i tw a sf o u n dt h a tt h en o v e lf l u o r e s c e n t p r o b e sw i t h2 ，6 一d i a m i n o m e t h y l p y r i d i n ea ss p a c e ra n da c c e p t e rc a nc o o r d i n a t e d w i t hh 9 2 + s e n s i t i v e l ya n ds e l e c t i v e l y ，a n dt h ec o m p l e xi n d u c e dt h ef l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n ti nn e u t r a lb u f f e r a q u e o u s b e s t t o m yk n o w l e d g e t h e f i r s t f l u o r e s c e n t i m a g e o ft h e p r o b e t o h g ”i n l i v ec e l lw a so b t a i n e d ，a n dt h e d i s t r i b u t i o no f h 9 2 + i nl i v i n g c e l lc a nb es e e nu n d e r l a s e r s c a n n i n g c o n f o c a l m i c r o s c o p e ap o l y a m j d o a m i n e ( p a m a m ) d e n d r i m e r f u n e t i o n a l i z e dw i t ha s i n g l e 4 - a m i n o 一1 ，8 - n a p h t h a l i m i d eg r o u pw a ss y n t h e s i z e db a s e d o nt h ec h a r a c t ero f n a p h t h a l i m i d ea n dt h ep r i n c i p l eo fc o n s t r u c t i o no ff l u o r e s c e n tp r o b e ，m e a n w h i l e t h es h o r t p e p t i d ep r o b e sa n dc o o r d i n a t i o np r o p e r t i e so fp a m a m d e n d r i m e rw i t h m e t a li o n sw e r er e f e r e n c e d i t sf l u o r e s c e n c eb e h a v i o ro ft h en e wd e n d r i m e rh a s b e e ns t u d i e di nt h ea b s e n c eo rp r e s e n c eo f p r o t o n so rm e t a li o n s t h es y s t e mw a s av e r ys e n s i t i v ec h e m o s e n s o rw h i c hd i s p l a y e ds e l e c t i v e r e s p o n s eo ff l u o r e s c e n c e q u e n c h i n go n l y t o w a r d sc u ”i nn e u t r a l b u f f e r a q u e o u s s o l u t i o n an e w c o o r di n a t i o ns t r u c t u r em o d e li n a q u e o u sw a sp r o p o s e da c c o r d i n gt ot h es p e c t r u m 大连理r 大学博士学位论文 o ft h ep a m a mw i t hc u “ t h r e en o v e lf l u o r e s c e n tp r o b e sw i t ht h r e e f l u o r o p h o r e sw e r ed e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d t h i sk i n do fp r o b e si sp e ts y s t e mw i t hf l u o r e s c e n ts w i t c h an e wm o l e c u l a rd e v i c ew i t ha n t h r a c e n ea n d n a p h t h a l i m i d ef l u o r o p h o r e sw a s d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d ，w h i c ha c t sv i ab o t hp h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e ra n d e n e r g yt r a n s f e r ，a n di ti sa ne f f i c i e n tp r o t o np r o b e k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n tp r o b e ，n a p h t h a l i m i d e s ，m o l e c u l a r r e c o g n i t i o n ，t r a n s i t i o n m e t a li o n s ，h e a v ym e t a li o n s 奎堡矍三查兰堕主兰垡堡墨 1 1 概述 第一章前言 荧光分子探针( f l u o r e s c e n t m o l e c u l a r p r o b e ) 、荧光分子开关( f l u o r e s c e n t m o l e c u l a rs w i t c h ) 和荧光分子传感器( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rs e n s o r ) 是在荧光分 子识别( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ) 中经常使用的概念。荧光分子探针是 其中内涵最广的一个概念，一一般凡是在一定体系内，当某一种物质或体系的某 一物理性质发生变化时该分子的荧光信号能发生相应的改变的分子就可称为 某一物质或某一一物理性质的荧光分子探针；荧光分子开关是指在识别过程中分 子荧光信号有明显强弱变化的荧光分子探针；荧光分子传感器是指在识别过程 中分子荧光信号能够快速、可逆响应的荧光分子探针。所谓分子识别是指分子 之间( 主体与客体或称之为受体与底物) 靠非共价键力的选择性结合并产生某 种特定功能的过程。单纯的结合不是识别，识别是有目标的结合，它是通过一 系列结构确定的分子间相互作用而组成的模式识别过程。结合形成的超分子体 系是由它的稳定性和选择性，即形成过程中的能量和信息量来表征的【”1 。 分子识别是广泛存在的自然现象，特别是在生命过程中，分子识别起着极 其晕要的作用。但分子识别作为分子之间发生的事件，人需要借助一定的技术 手段才能感知伴随分子事件发生所产生的物理信号。分子荧光作为传感信号具 有以下优点：可达到单分子检测的高灵敏性、可开关、可实现人与分子的通讯、 对亚微粒具有可视的亚纳米空间分辨并且是亚毫秒时间分辨的。另外人们已经 积累了许多关于分子结构、超分子结构以及环境因素对分子荧光影响的知识并 在定程度上揭示了其内在的规律【”。所以人们设计、合成了大量能够将分子 识别事件通过分子的荧光信号有效表达的复杂荧光分子，这些分子也就是所谓 的荧光分子探针。 荧光分子探针是超分子科学中最为引人入胜的领域之一，它的主要功能包 兰二望墅i 一 括分子识别和将识别信息转换成荧光信号两部分。识别是超分子化学的核心内 容，是分子存贮和超分子读取分子信息的过程。这种分子间识别是分子在更高 的结构层次上实现功能的基础，是分子间自组装的前提。但由于这种结台是由 非共价键完成的，通常形成的结构稳定性较低，给研究带来一定的困难。荧光 分子探针能将这种分子结合信息转换成易检测的荧光信号，而且可在单分子水 平上实现原位、实时检测。因此，在化学走向超分子科学并与生命科学、材料 科学等学科高度交叉的今天荧光分子探针得到各研究领域的广泛关注是非常 自然的。 目前报道的荧光分子探针的被识别客体从最简单的质子到手性分子 4j 、蛋 白t ”、寡聚核苷酸序列t 6 ，7 1 等于差万别。那么，荧光分子探针的识别功能部分 就要具有与被识别分子互补的结构以便读取被识别分子完整的结构信息，提高 识别的选择性和敏感性。也就是说，探针分子的识别部分通常应具有与被识别 分子同等的复杂性，而对于复杂客体分子实际设计探针分子的识别基凼时，通 常只针对客体分子易于识别的特征部分设计互补的识别基团。另外，探针分子 还要完成识别信息向荧光信号的转变。除识别基团的复杂性外，仅就为实现识 别信息向荧光信号的转变，在这方面利用的光物理和光化学机理是多种多样 的。囡此，为实现这些转换机理所设计、合成的探针分子的化学结构更是纷繁 复杂【8j 。一些探针分子尽管取得了良好的识别效果，但人们并不是十分清楚识 别及信号转换的详细机理。还有一些关于荧光探针分子报道的结果是错误的， 例如在有机溶剂中将探针识别基与氢离子的结合误认为是与目标物种的结台 “】。同样是由于荧光分子探针的高度敏感性，识别研究中要特别小心，否则 就容易出现错误结果。总之，荧光分子探针是一个十分活跃、精彩纷呈，但又 充满着未知和挑战的新研究领域。 在本论文中研究的主要是阳离子( 过渡金属、重金属离子以及氢离子) 的 荧光分子探针，所以本章主要以近年来报道的过渡金属及重金属离子的荧光分 子探针为例综述该类荧光探针的作用原理和取得的主要进展。氢离子以及碱金 查堕里三查堂堡圭堂垡堡苎一 属、碱土金属离子在自然界中同样是重要的，但它们本身不像过渡金属及重金 属离子，对有机荧光分子没有淬灭作用。这类探针设计中的可预见性强，没有 太多悬念，目前已有许多商品供应，有关研究相对较少】。 过渡金属及重金属广泛地存在于自然界中，其中的一些元素在生命过程中 具有重要的功能，而另外一些元素则在很低浓度时就对生物具有极强的毒性。 这些物质的检测对生命、环境和医学科学以及工、农业生产等都有重要的意义。 荧光探针检测技术应用于过渡金属及重金属离子的检测，可实现微环境的原 位、实时检测。但通常由于过渡金属及重金属离子可通过自旋一轨道耦合2 以及电子或能量转移”3 】使荧光团淬灭，导致检测灵敏度下降。另外，淬灭的荧 光探针很难用于显微荧光成像检测。 2 0 0 1 年，r u r a c k ，k ， 8 】对已有的过渡金属及重金属离子络合促进的荧光发 射探针的原理进行了如下描述：“在过去的几年中，利用荧光传感器分子，实 时、原位分析过渡金属和霞金属离子的研究受到了广泛的关注。由于多数这类 金属离子通常对有机染料分子的荧光具有内在的淬灭作用，最近的许多研究多 致力于设计具有络合诱导的荧光促进的探针设计。这样的探针在增加选择性和 敏感性方面被寄予厚望。然而，到目前为止，在这个研究领域中利用的光物理 和光化学机理以及传感器分子的化学结构是多种多样的，很少有关于建立理性 分子探针设计基本观念的尝试。” k r i m e r ，r ”4 j 认为理想的传感器分子应具有以下特性：“只对一种金属离 子的高选择性、高敏感性、快速可逆响应( 实时) 、微米水平上的原位响应并 且易于操作。”r u r a c k ，k 之所以特别强调过渡金属及重金属离子络合促进的荧 光发射增强探针，一方面是荧光增强的探针比淬灭探针性能好：另一方面是因 为这方面取得成功的范例较少。d es i l v a ，a p 1 3 1 在1 9 9 7 年对荧光荧光开关和传 感器进行全面综述时，使用了“杰出的”( d i s t i n g u i s h e d ) 这样词评价一个在 有机溶剂中能被c u ”等过渡金属离子络和促进荧光增强的开关分子，当时这种 塑：里萱曼 过渡金属离子络台促进荧光发射增强的探针是极少的”1 。几年后的今天，这一 领域的情况与当时已经明显不同了。 荧光分子探针的主要应用领域是生物、医学和环境监测，所以在水溶液中 的识别才具有潜在的广泛应用价值。另外，许多探针分子的荧光性质会受质子 的影响，在水溶液中可以通过缓冲溶液控制稳定的p h 值，使识别研究的结果 更可靠。由于水分子对金属离子较强的水合作用以及水分子对探针分子识别基 团较强的结合，使水溶液中的金属离子识别比有机溶剂中具有更大的难度”1 。 根据以上论述，通常评价荧光分子探针的性能应主要考虑灵敏性、选择性、 实时性和原位检测性能四方面因素。灵敏性中包括许多因素；首先，探针与被 检测物的结合强度是识别灵敏性的前提；其次，识别信息的荧光信号转换效率 同样影响识别灵敏性，荧光增强的探针一般会比荧光淬灭的相应探针灵敏性 高；另外，荧光团的荧光波长、量子产率、斯托克斯位移、背景荧光干扰等也 会影响探针的检测灵敏性；灵敏性还与仪器性能有关。选择性主要取决于探针 与被检测物的结合选择性；有时某些被结合的客体可赢接影响荧光团的荧光发 射性能，这种情况下识别选择性还与被结合的客体性质有关；专一选择性是最 好的。实时性主要包括识别响应的速度和可逆性两方面，如果可逆响应的速度 快于或与被检测客体的变化速度相匹配，则可称之为实时响应探针( 传感器) 。 原位检测性能主要取决于探针分子与被检测体系的相溶性，探针能以独立的分 子状态分散于被检测体系并发出识别信号；从目前的实际情况来看，水溶性探 针比非水溶性探针好：其实在一定限度内，荧光探针检测的空间分辨率取决于 仪器n 上述评价探针性能的主要因素并不是评价研究工作水平的指标，对于研 究工作来说创新性是最重要的。 1 2 荧光分子探针识别原理 1 2 1 光诱导电子转移3 ，1 7 1 ( p e tp h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ) 4 盔蓬翌三查兰竖主兰堕丝三 在各种阳离子荧光分子探针中，利用p e t 原理设汁的荧光分子探针最为常 见。这类搛针设计原理明确，特别是对于碱金属、碱土金属和氢离子通常都可 获得荧光增强的探针。典型的p e t 荧光探针体系是由具有电子给予能力的识别 基团r ，通过连接基团s 和荧光基团f 相连，三部分构成的功能分子。其中荧 光团的功能是光吸收和荧光信号的发射并且它的发射强度与识别基团的结合 状态相关；识别基团的功能是结合客体并将结合信息传递给荧光团：这两部分 被连接基团相连成一个分子并且使识别信息有效地转化为荧光强度变化。 在p e t 荧光分子探针中，识别基团与荧光团之间的识别信息与荧光信号之 间的转化是靠光诱导电子转移完成的。p e t 荧光分子探针的具体1 ：作过程如 下：具有电子给予能力的识别基团能够将其处于最高能级的电子转入激发态荧 光幽因电子激发而空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁回原基态 轨道发射荧光，导致荧光团的荧光淬灭；然而，当识别基团与客体结合后，降 低，识别基团的给电子能力，p e t 过程被减弱或不再发生，使荧光团的荧光发 射增强。因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱。一日受 体与客体相结台，荧光团就会发射出强荧光( 见图1 1 ) 。p e t 荧光探针的作用 机制呵由前线轨道能量来进一步说明( 见图1 2 ) 。由于与客体结合前后，荧光 强度差别很大，呈明显的“关”，“开”状态，这类探针又被称为荧光分子开关。 已报道的p e t 荧光开关分子中，多数都是以脂肪胺及其衍生物或芳胺及其 衍生物作为识别基团，同时作为p e t 的电子给体( 荧光淬灭基团) ；荧光团和 识别基之间的连接基一般是距甲基、乙撑基或丙撑基等短链烷基，过长的连接 基将使p e t 效果变差。 圈1 - 1p e t 荧光开关一般原理示意图 f i g u r e1 - 1t h ea b r i d g e dg e n e r a lv i e wo fp r i n c i p l eo fp e tf l u o r e s c e n ts w i t c h e s 兰= 主盟童 e = ：寸件n凯i ! 升“ 艇lut_七2本emission f l u o r o p h o r ef r e er e c e p t o r f l u o r o p h o r e b o u n dr e c e p t o r 图1 - 2p e t 机制的前线轨道理论示意图 f i g u r e1 - 2f r o n t i e ro r b i l a le n e r g yd i a g r a me l a b o r a t i n gt h em e c h a n i s mo fp e ts w i t c h e s d es i l v a 的研究组利用多种荧光团，设计了大量的p e t 荧光分子探针，用 于氢离予、碱金属及碱土金属离子等的识别【1 引，并将荧光开关分子作为分子逻 辑门器件1 ”。化合物1 【2 0 3 是一个带氮杂冠醚识别基的p e t 荧光分子探针，在 甲醇中和k + 络合后，荧光量子产率从o 0 0 3 增加至0 1 4 。钱旭红【2 1 】等合成的 以4 - 氨基- 1 ，8 - 萘酰亚胺衍生物为荧光团的p e t 荧光探针( 化台物2 ) ，是有效 的氧离子探针，已被m o l e c u l a rp r o b e 公司推广为细胞内酸性内酯质探针。d e s i l v a 研究小组还利用萘酰亚胺与蒽两个荧光团通过烷基链相连设计了一个比 较复杂的荧光化台物3 【2 。在它的烷基链中间的识别基氮原子靠近蒽荧光团， 它只与蒽发生p e t 作用。另外，两个荧光团间的距离较远，没有明显的相互影 响。随着p h 值的增加，蒽发射峰的强度急剧降低，用于氢离子识别可作为荧 光比例探针。化合物4 是d es i l v a 小组设计的、在p e t 荧光分子探针中为数不 多的以丙撑基为连接基识别效果好于乙撑基的氢离子荧光分子探针2 ”。 霎趣菱莛 6 曲 针毗，探光| 兰荧 r n e rp 彭 l p t l式“ 2 鲫鼬 大连理工人学博士学位论文 上述荧光分子探针是典型的以脂肪胺衍生物为识别基和p e t 荧光淬灭基 团的探针。一般脂肪胺比芳香胺碱性强，作为氢离子探针识别基，荧光突变通 常在中性到碱性范围内；如果作为离子识别基团，探针适用的p h 值范围较窄。 芳香胺或在脂肪胺上连接适当的吸电子基团( 过强的吸电子基团将使氨基失去 对荧光团的淬灭能力和或与客体的结合能力) 作为识别基团可用于设计荧光 突变在中性到酸性范围内的氢离子探针：如果作为离子识别基团，探针适用的 p h 值范围相对宽一些。非常有代表性的例子如化台物5 和6 ，由它们的p h 一 荧光滴定曲线得到的p k 。分别是8 7 和5 7 。d es i l v a 是以这两个化合物用来 说明对于4 一氨基- l ，8 - 萘酰亚胺荧光分子衍生物的p e t 是有途径选择性的 ( p a t h - s e l e c t i v ep e t ) ，连接在4 氨基上的淬灭基团是有效的【2 ”。 直接以芳胺为识别基团的p e t 氢离子荧光探针很少，化合物7 是一个在缓 冲溶液中的钠离子探针。该探针对氢离子也有响应，p k 。值为5 5 ，p h 值大于 7 以后荧光达到稳定的最小值，不干扰钠离子测定。另外，利用类似于e d t a 结构的多羧甲基芳胺作为识别基设计的p e t 离子荧光探针很多，化合物8 是一 个有代表性的螯合型的p e t 荧光分子探针，可以有效识别碱土金属c a 2 + 2 引。 5 式1 - 2p e t 荧光探针 s c h e m e1 - 2p e tf l u o r e s c e n tp r o b e s 少数p e t 荧光探针的识别基中不含碱性基团( 如氨基) ，这样的探针检测 v一丫pp 礤 兰：童堕童 金属离子时基本不受环境p h 值的影响。化合物9 是一个不受氢离子影响的钠 离子荧光开关分子i ”1 。而化合物1 0 同时具有两个不同的识别基团，分别识别 氢离子( 吗啉基) 和钠离子( 苯并冠醚基) ，只有当它们都存在时探针的荧光 才能够亮，它是氢离子和钠离子的逻辑“与门分子 2 ”。 大多数p e t 荧光分子探针的设计是基于受体与客体的结合，使p e t 过程 受到抑制，使荧光团发射出强荧光的原理设计的。但是当探针与过渡金属或重 金属离子结合时，由于其外层d 电子的氧化还原行为，可能发生激发态荧光团 与键合的金属离子之间的电子转移，导致荧光淬灭。另外，也可能发生能量转 移淬灭【1 ”。例如化合物1 1 2 8 1 和1 2 2 9 1 ，荧光团以及荧光团与识别基的连接基团 都相同，识别基团不同，在相同的溶剂中c u ( u ) 使后者荧光显著增强，前者强 烈淬灭。总之，氢离子、碱金属以及碱土金属离子通常都可根据p e t 原理设训 出荧光增强的探针；过渡金属或重金属离子识别时情况复杂的多。 91 0 1 11 2 式i 一3p e t 荧光探针 s c h e m e1 - 3p e tf l u o r e s c e n tp r o b e s 1 2 2 分子内电荷转移川( i c ti n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 文献中也将这一原理称为光诱导电荷转移”i ( p c tp h o t o i n d u c e dc h a r g e t r a n s f e r ) 。典型的i c t 荧光探针分子是由荧光团与识别基团直接相连构成的， 这类探针的荧光团上分别连有推电子基( 电子给体) 和吸电子基( 电予受体) ， 并且推电子基或吸电子基团本身又充当识别基团或识别基团的部分。该分子 大连理工大学博士学位论文 被光子激发后会进一步增加从电子给体向电子受体的电荷转移。当识别基刚与 客体结合时，会对荧光团的推拉电子作用产生影响( 减弱或强化电荷转移) ， 从而导致荧光光潜的变化，主要是光谱蓝移或红移。一般情况下，i c t 荧光探 针对荧光强度的影响不像p e t 荧光探针那样显著。 化合物1 3 为典型的i c t 荧光探针 ” ，氮杂冠醚既是识别基团，同时电是 推一拉电子体系的电子给体。当冠醚与碱土金属离子如c a 2 + 络合时，由于金属 离子的拉电子效应，降低了冠醚氮原子的供电子能力，因此发生荧光蓝移，且 荧光增强。识别基团为电子接受体的i c t 荧光探针如化合物1 4 ”】，在探针分 子处于未结合状态时，二甲氨基和氮杂冠醚部分均为电子给体；当冠醚与碱土 金属c a ”结合后，拉电子能力增强，使探针转化成推一拉电子体系，荧光发生 红移。化合物1 5 i 】的苯并冠醚识别基团与香豆素荧光团是间接相连的，但当 钙离子与之结合时荧光波长显著红移、强度略有淬灭。这种现象出现可以设想 是荧光团中的羰基氧参与了配位，促进了荧光团的电荷转移。多数i c t 荧光探 针在结合客体后，荧光光谱移动在2 0 n m 左右，荧光强度变化不明显。但化合 物1 6 与钙离子结合后荧光波长兰移9 5 n m ”】；而化合物1 7 f 33 1 的荧光强度发生 了显著变化，与l i + 络合荧光增强9 0 倍，与m 9 2 + 络合增加2 2 5 0 倍。 式l - 4 i c t 荧光探针 s c h e m e1 - 4i c tf l u o r e s c e n tp r o b e s 在i c t 中，有一种情况被称为扭曲的分子内电荷转移 9 墨二皇堑童 一 i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 。在具有推墙! 电子共轭体系的荧光分子中，如果 推电子基( 如二甲氨基 是通过单键与荧光团相连的，当荧光团被光子激发时， 由于强烈的分子内光诱导电荷转移，导致原来与芳环共平面的电子给体绕单键 旋转，而与劳环平面处于正交状态，原来的共轭系统被破坏，部分电荷转移变 为完全韵电子转移，形成t i c t 激发态。当形成t i c t 激发态时，原有的i c t 荧光则被淬灭。t i c t 态常常不发射荧光或者发射弱的长波荧光，少数情况下 出现i c t 与t i c t 双重荧光现象1 3 4 , 3 5 1 。 化合物1 8 f 3 副是典型的能够发射双荧光的t i c t 荧光分子探针，以该化合物 为母体的衍生物被广泛地用于t i c t 双荧光现象的各种研究中1 3 6 ，多年来该化 合物一直倍受关注卯】。化合物1 9 也表现为双重荧光【3 8 】。分子中单键的旋转与 分子所在的微环境极性、黏度、温度等因素密切相关，因此这类探针经常被用 于微环境黏度、极性的检测；另外也可用于表蔼活性荆在溶液中的聚集状态、 生物大分子的折叠情况检测。化合物2 0 f 3 9 1 表现为双重荧光，短波发射带为局 部激发态产生的，长波发射带来源于t i c t 态，与阳离子键合后，由于氮杂冠 醚与阳离子的相互作用，长波吸收带强度下降。化合物2 1c 4 0 1 表现出非常特殊 的三重荧光现象，除了局部激发态和t i c t 态产生的双霞荧光外，由于全氮杂 冠醚的柔软性能导致形成了激基缔合物，产生了第三重荧光。第三重荧光的产 生取决于溶剂，p h 和键合阳离子的微扰作用。 c b h l 3 “、c a h l 3 1 9 式1 - 5t i c t 荧光探针 s c h e m e1 - 5t i c tf l u o r e s c e n t p r o b e s 。岛“ 。奠一扑 ，c 太y八他 大连理= e ( 学博士学位论文 1 2 3 激基缔合物 4 1 1 ( e x c i m e r ) 当两个相同的荧光团，如多环芳烃萘、蒽和芘等连接到一个受体分子的合 适位置时，其中一个被激发的荧光团( 单体) 会和另一个处于基态的荧光团形成 分子内激基缔台物。它的发射光谱不同于单体，表现为一个新的、强而宽、长 波、无精细结构发射蜂。由于形成这种激基缔合物需要激发态分子与基态分子 达到“碰撞”距离3 5 a ，因此荧光团问的距离是激基缔合物形成和破坏的关键。 所以利用各种分子问作用力改变两个荧光团之间的距离，如用结合客体前后单 体激基缔合物的荧光光谱变化表达客体被识别的信息。萘、芘、葸等荧光团 由于具有较长的激发单线态寿命，易形成激基缔合物，常常被用于此类探针中。 化合物2 2 1 4 “，通过酰胺连结了4 个萘分子，z n 2 + 进入分子空腔，改变了4 个萘荧光团的位置，导致激基缔合物荧光增强。化合物2 3 t 4 3 1 具有双芘荧光发 色团，氮杂冠醚络合k + 或b a 2 + 后，使荧光发射增强，同时单体激基缔合物的 荧光强度比发生变化。化合物2 4 4 4 1 是两个萘荧光团通过聚醚链连接的荧光化 合物，碱土金属离子c a “、b a 2 + 可以与氧乙烯链上的多个氧原予以及酯键上的 氧原子络合，造成链的收缩，使两个萘环得以靠近，促进激基缔合物的形成， 使萘单体发射荧光强度减弱。化合物2 5 f 4 53 是第个以杯芳烃为识别基的荧光 离子探针，当锂离子被结合时，单体荧光增强，激基缔合物的荧光强度减弱。 式1 - 6 基于激基缔合物原理的探针 s c h e m e1 - 6t h e p r o b e sb a s e do i lm o n o m e r e x c i m e rm e c h a n i s m 凸x 吏簇9 歹毒 p n 蕃 r l 多 奄 。几。瓮。 囝吣 第璋前言 1 2 4 荧光共振能量转移 4 ，4 6 1 ( f r e tf l u or e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ) 当能量给体荧光园d 与能量受体荧光团a 相隔的距离远大于d - a 的碰撞 直径时，只要d 与a 的基态和第一激发态两者的能级间能量差相当，或者说d 的发射光谱与a 的吸收光谱能有效重叠，就可能发生从d 到a 的非辐射能量 转移，又称为长距离能量转移( 甚至相距远达7 0 1 0 0 a t 4 7 1 ) 。实际上d a 发生能 量转移两者除了光谱重叠外，还必须以适当的方式排列。a 可以是荧光团，也 可以是荧光淬灭团。前一种情形，激发d 时，由于能量转移，将观察到a 的 荧光发射。而后一种情形，则只能观察到d 的荧光变化，多用于核酸检测 。 化合物2 6 用多肽将罗丹明b 和氨基香豆素连接。氨基香豆素的激发和发 射的波长分别是4 0 9 n m 和4 7 3 n m ，而罗丹明b 的激发和发射的波长分别是 5 6 8 n m 和5 8 3 n m 。在中性缓冲溶液中，当n i 2 + 被两个荧光团间的氨基酸残基结 合后，两个荧光团问的距离减小，f r e t 显著。当用波长为4 0 9 n m 的光激发氨 基香豆素时，随着n i 2 + 浓度的增加，在5 8 3 n m 罗丹明b 的发射光谱逐渐增强【4 9 。 z b 式1 7f r e t 荧光探针 s c h e m e1 - 7af r e tf l u o r e s c e n tp r o b l e 化合物2 7 中有两个不同的荧光团，分子中的脂肪叔胺能够通过p e t 淬灭葸的 荧光a 在酸性条件下，该p e t 过程被禁阻，但蒽被激发后并不发射荧光，而是 将能量转移给查耳酮使其发射荧光5 。在2 8 中有两种不同的荧光团，其中的 三氨乙基胺衍生物是一个络合锌离子促进荧光发射的p e t 荧光分子探针；当溶 查垄望三查堂壁主兰堡堡墨 液中含有羧基香豆索时，它也能够与锌离子络合使之与荧光凼蔡充分靠近，发 生能量转移。当用短波光激发萘时，主要发射的是香豆素的荧光5 1 1 。 2 72 8 式1 - 8f r e t 荧光探针 s c h e m e1 - 8f r e tf l u o r e s c e n tp r o b ew i t ht w ok i n d so fc o u m a r i n 近年来基于f r e t 原理设计合成光学分子器件是一个非常活跃的研究领域，例 如光收获树枝状分子、光变频器分子等5 2 。5 ”。 1 2 5 基于其它原理的荧光分子探针 大多数阳离子荧光分子探针是基于上述原理设计的，还有少量探针是按照 其它原理设计的，也许有些是意外所得，但常常有出奇制胜的效果。 化合物2 9 的乙腈溶液中加入汞离子后荧光显著增强( 3 4 倍) 并红移，进 一步用质谱检测发现生成了脱硫产物3 0 。化合物2 9 是对汞离子有选择性的化 学反应荧光分子探针，这类不可逆的化学计量性的识别分子也被称为化学计量 剂f c h e m o d o s i m e t e f l 5 “。 毋* 且* 饧詈毋。且。弋 2 9 3 0 式1 - 9 反应性荧光探针 s c h e m ei - 9ar e a c t i v ef l u o r e s c e n tp r o b e 藩、g百 爹 至：芏塑童 化合物3 1 在p h = 4 7 5 的缓冲溶液中，加入c u 2 + 后，绿色荧光淬灭，溶液 颜色从橙色变为黄色，该识别过程被称为光学双通道识别 s 7 o 最近我们也发现 化合物3 2 在中性缓冲溶液中，加入a f 后，黄绿色荧光淬灭，溶液颜色从浅 黄色变为红色5 ”。化合物3 3 在水溶液中，加入h 9 2 + 后，荧光淬灭，溶液颜色 从浅琥珀色变为红色” 。这些双通道识别具有很好的选择性，另外，也为这些 离子的检测提供了方便、直观的方法。 念双驴h o 3 1 3 2 33 式1 - 1 0 双通道荧光探针 s c h e m e1 - 1 0t w o c h a n n e lf l u o r e s c e n tm o l e c u l a rp r o b e s 化合物3 4 荧光很弱，在乙腈溶液中对铅离子具有选择性荧光增强识别效 果。识别过程中荧光增强4 0 倍并有1 5 n m 的荧光红移，这种识别现象是铅离子 配位时影响了探针分子的光诱导分子内电荷转移及分子的构象刚性的结果 6 0 l 。 3 4 3 5 式1 - 1 1 酮氨基香豆素荧光探针 s c h e m e1 - 1 1ak e t o a m i n o e o u m a r i nf l u o r e s c e n tp r o b e 通常与探针结合的过渡金属离子的不同价态对荧光团的荧光影响不同，可 以通过结合的金属离子的氧化还原实现荧光分子的开关。在配合物3 6 中，三价 镍离子通过激发态丹磺酰胺荧光团向金属离子的电子转移将荧光淬灭；相应的 二价配合物3 7 则不与荧光团间发生电子转移，荧光处于“开”的状态。铜等金 1 4 查堡望王查堂堕主堂垡兰苎 属离子也广泛存在这种现象6 ”。 3 63 7 式1 1 2 基于过渡金属氧化- 还原的荧光探针 s c h e m e1 - 1 2at r a n s i t i o nm e t a lr e d o xb a s e df l u o r e s c e n tp r o b e 尽管前面已经叙述了很多阳离子荧光分子探针识别的作用原理和典型的 探针分子，还是有许多基于其它设计原理的探针分子具有良好的识别效果不能 一一列举。例如光致异构荧光识别、分子自组装界面膜及两亲分子溶液中自聚 集荧光识别等，这些分子设计的同样精彩，令人叹为观止! 1 8 ，6 2 州】 1 3 荧光团 荧光基团是荧光分子探针的最基本组成部分，作用是将分子识别信息表达 为荧光信号。前面阐述了多种将分子识别信息表达为荧光信号的光物理和化学 机理以及能够实现这些机理的典型分子结构。有些有机荧光分子本身就具有对 金属离子的配位能力并表现出显著的荧光变化，这些荧光分子可直接作为探针 使用，例如8 羟基喹啉等。 一般来说所有荧光化合物都可做荧光分子探针的荧光发射团，通常芳香族 化合物：如稠环芳烃，以蔡、葸、芘为主要代表的稠环芳烃类都具有强而稳定 的荧光。它们作为缔构最简单的荧光团，经常用于基础理论的研究。另外它们 易产生激基缔合物荧光 6 ”，这一特性是其它种类的荧光团小能代替的。 以荧光素( 化台物3 s ) 和罗丹明为代表的贴吨类荧光化合物 6 6 , 6 7 是非常著 名的荧光染料，经常被用于各类荧光分子探针的合成。菁类荧光染料( 化合物 3 9 ) 6 8 1 是近年来倍受青睐的生物大分子标记用荧光染料，特点是波长可调范围 第一章前言 特别大，可以进入近红外区，能有效避开生物体系的背景荧光，提商探针的灵 敏性。吡略甲川类荧光团( 化合物4 0 ) l 6 9 ，7 0 1 的特点是荧光量子效率高，随取代 基变化其荧光波长可调范围大，不易受环境p h 的影响，近年来的几个基于该 荧光团合成的金属离子荧光分子探针颇为引人注目。1 ，8 - 萘酰亚胺也是一类重 要的荧光化合物 7 1 , 7 2 ，特别是4 位有强烈供电基团如氨基的衍生物都能够发射 强荧光、光稳定性好、荧光发射波长适中、s t o c k s 位移大，也经常被用于荧光 分子探针的合成。其它常用的荧光团还有吖啶7 ”，丹磺酰胺” ，n b d 7 ”，香 豆素类【7 6 l 等【7 ”。 “w 哆“一e 锵m 螂磁她 式1 - 1 3 四种典型荧光化合物 s c h e m e1 - 1 3f o u ri m p o r t a n tf l u o r e s c e n tc o m p o u n d s 尽管，一般来说几乎所有的荧光化合物都可以用作荧光探针的信号基团， 但实际上不同荧光化合物之间性质差别巨大，以一类荧光化合物为荧光团设计 的有效识别结构用于另一类荧光团未必有效。就连相同的识别基团和连接基团 连接在4 - 氨基- l ，8 一萘酰亚胺不同的位置上识别效果就会截然0 i 同，而且这种现 象并非偶然 ”】；另外，4 - 氨基一1 ，8 萘酰亚胺的酰胺氮原子上连接烷基氨不是有 效的p e t 体系，而4 - 烷氧基一1 ，8 - 蔡酰亚胺的酰胺氮原子上连接烷基胺则是有 效的p e t 体系 7 9 1 o 可见细微的结构差别就可能导致探针性能的明显不同，对 于一个初涉此领域的研究者来说，如果不想做过于循规蹈矩的丁作，从失败中 学到的肯定会比在成功中的多是可想而知的。实践是胜负师。 探针中荧光团的选择除了要考虑光物理因素外，还要考虑合成路线的合理 性。这主要是指要便于与识别基团的连接，理论上荧光团的许多位置都可能以 不同方式连接识别基团，但通常的现实可连接位置及方式是非常有限的；如果 1 6 盎 大连理工大学博士学位论文 没有特别的目的，创造新的连接位置可能会是得不偿失。 1 4 识别基团 识别是荧光分子探针的基本目的，识别基团是为实现对目标物种的识别而 台成的探针的结构单元。对于阳离子识