（分析化学专业论文）新型胍基蛋白折叠色谱固定相的合成及其对rhgcsf的复性纯化研究.pdf

摘要 蛋白质复性技术是生物工程下游的热门技术之一。本实验合成了以精氨酸和肌酸为 端基的两种新型胍基蛋白折叠色谱固定相，深入研究了精氨酸型胍基蛋白折叠色谱固定 相的色谱性能，并将其应用于含有两对二硫键的重组人粒细胞集落刺激因子 ( r e c o m b i n a n th u m a ng r a n u l o c y t ec o l o n y - s t i m u l a t i n gf a c t o r ，r h g c s f ) 的复性纯化研究中。 本文主要包括以下4 个部分： 1 文献综述：简要介绍了蛋白质复性的意义及一般过程，详细论述了蛋白折叠液相 色谱法，总结了色谱固定相及精氨酸对于蛋白折叠的作用，综述了r h g - c s f 复性纯化的 研究进展。包括5 8 篇文献。 2 以硅胶为基质，合成了以精氨酸和肌酸为末端的两种新型胍基蛋白折叠色谱固定 相。用5 种标准酸性蛋白比较了其色谱分离性能，发现精氨酸型色谱固定相的色谱性能 更好。 3 探讨了在不同p h 值，不同流速条件下5 种酸性蛋白在精氨酸型胍基色谱固定相 上的分离情况；测定蛋白在柱上的质量回收率大于9 5 ；在选用b s a 为模型蛋白时测 定柱填料的最大吸附量大于4 6 1 m g 。实验结果表明，该种精氨酸型胍基蛋白折叠色谱 固定相具有典型的阴离子交换性质，对标准蛋白具有很好的分离效果，柱容量大，非特 异性吸附小。 4 利用合成的精氨酸型胍基蛋白折叠色谱固定相对在大肠杆菌中表达的r h g - c s f 进行了复性纯化，研究了不同的梯度、p h 值、脲浓度及流速对r h g - c s f 复性的影响。 在最优条件下，3 0 分钟内通过一步复性纯化得到了纯度为9 5 2 4 ，质量回收率为6 8 的f l a g c s f 。损失的r h g c s f 一部分在进样时不保留直接洗脱出来( 1 0 ) ；另一部分 沉淀在柱上而无法洗脱，即使在低流速下用0 5 m o f l n a c l 、8 m o l l 脲和2 0 m m o l l d t t 的强变性剂( 4 m l ) 冲洗色谱柱仍然无法很好的将其洗脱下来。 关键词：精氨酸，肌酸，阴离子交换色谱，色谱复性，重组人粒细胞集落刺激因子 a b s t r a c t p r o t e i nr e f o l d i n gi sar e s e a r c hh o tp o i n ti nd o w n s t r e a mo fb i o t e c h n o l o g y i nt h i sp a p e r , t w ok i n d so fc h r o m a t o g r a p h i cs t a t i o n a r yp h a s ec o u p l e dw i t ha r g i n i n ea n dc r e a t i n ew e r e s y n t h e s i z e d t h ea r g i n i n e t y p es t a t i o n a r yp h a s ew a si n t e n s i v e l yi n v e s t i g a t e da n de m p l o y e d f o rt h er e f o l d i n go ft h er e c o m b i n a n th u m a ng r a n u l o c y t ec o l o n y - s t i m u l a t i n gf a c t o r ( r h g - c s f ) w h i c hc o n t a i n i n gt w op a i r so fd i s u l f i d eb o n d t h i sa r t i c l ei n c l u d e sf o u rs e c t i o n s ： 1l i t e r a t u r er e v i e w i tc o n t i n e st h es i g n i f i c a n c ea n dm e t h o d s ，m a i n l yf o rp r o t e i nf o l d i n g l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( p f l c ) a n di t sr e l a t e dt e c h n o l o g y t h ec o n t r i b u t i o no fa r g i n i n ea n d s t a t i o n a r yp h a s et op r o t e i nr e f o l d i n ga n dt h er e c e n tr e s e a r e h so fr e f o l d i n ga n dp u r i f i c a t i o no f r h g - c s fw e r ea l s ob r i e f l yr e v i e w e r e d i tc o n t a i n s5 8r e f e r e n c e s 2t w ok i n d so fs i l i c a - b a s e ds t a t i o n a r yp h a s ec o u p l e dw i t ha r g i n i n eo rc r e a t i n ew e r e s y n t h e s i z e d w i t ho p t i m i z a t i o n a l c o n d i t i o na n d t e s t e d 丽t 1 1 s t a n d a r d p r o t e i n s ，t h e a r g i n i n e - t y p es t a t i o n a r yp h a s ew a sf o u n dt ob eb e t t e r 3w i t ht h es e p a r a t i o no ff i v ek i n d so fa c i d i cp r o t e i nu n d e rd i f f e r e n tp ha n dd i f f e r e n tf l o w r a t e ，t h em a s sr e c o v e r yo ft h ef i v ep r o t e i n sw e r ef o u n dt o t a l l yg r e a t e rt h a n9 5 w h e nb s a w a ss e l e c t e da st h em o d e lp r o t e i n , i t sm a x i m u ma d s o r b e da m o u ro ft h ea r g i n i n e t y p e s t a t i o n a r yp h a s ew a sm e a s u r e d 4 6 1 m g gp a c k i n g s t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tt h e s t a t i o n a r yp h a s eh a st h et y p i c a lc h a r a c t e ro fa n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dh a sg o o d c o l u m nc a p a c i t ya n ds m a l ln o n s p e c i f i ca d s o r p t i o n 4u s i n ga r g i n i n e - t y p ec h r o m a t o g r a p h i cs t a t i o n a r yp h a s et od or e f o l d i n ga n d p u r i f i c a t i o no f r h g - c s fe x p r e s s e di ne c o l i t h ee x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u to nd i f f e r e n tg r a d i e n t ，p i , u r e ac o n c e n t r a t i o na n df l o wr a t e w i t ha no p t i m i z a t i o n a lc o n d i t i o n ，t h ef i n a l l yo b t a i n e d r h g c s fh a dp u r i t yo f9 5 2 4 a n dm a s sr e c o v e r yo f6 8 b yo n l yo n es t e pi n3 0m i l l t h e s o u r c eo fm a s sl o s e sw a sf o u n dt ob eb o t ho fu n r e t a r do fr h g c s fa ss a m p l ei n j e c t i o n ( 10 ) a n dt h er e s ta ss o m ep r e c i p i t a t e do nt h es t a t i o n a r yp h a s ew h i c hd i dn o td i s s o l v e da si t w a se l u t e dw i t h4m l ，0 5 m o l ln a c l 、8 m o l lu r e aa n d2 0 m m o l ld t t k e yw o r d s ：a r g i n i n e ，c r e a t i n e , a n i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , p r o t e i nf o l d i n g c h r o m a t o g r a p h y , r e c o m b i n a n th u m a ng r a n u l o c y t ec o l o n y - s t i m u l a t i n gf a c t o r 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名： 2 歪! 垫 指导教师签名： 川引月c 。日 锄泻 年易月f ，o 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本 论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大 学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： j 虱沌 伽了年6 月i ? 日 西北大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 蛋白质复性的意义和一般过程 基因工程和发酵工程等生物技术的迅速发展，使人们可以根据需要来设计生产各种 生物产品，特别是那些自然原料缺乏而又无法通过常规方法大量获得的珍惜蛋白和多肽 类产品，如干扰素( i n t e r f e r o n ) 、胰岛素( i n s u l i n ) 、集落刺激因子( c o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r ) 等。在已有的用于重组蛋白质生产的表达体系中，大肠杆菌( e c o l i ) 表达系统是目前 基因工程蛋白生产最常用的表达体系【l l 。 当蛋白质在大肠杆菌中表达时，都会产生一种聚集体，称为包涵体( i n c l u s i o nb o d y ) 。 包涵体能够保护蛋白质不受宿主细胞的攻击，并且使在后续处理过程中可以用离心或透 析等简单的方法分离蛋白质；但是在包涵体中的蛋白质是没有任何生物活性的。生物工 程的重要挑战之一就在于如何将没有活性的包涵体中的蛋白转变为正确折叠，有生物活 性的天然活性蛋白，即蛋白质的复性 2 1 。 图1 1 为蛋白质复性的一般过程示意图。这个过程分为两步：首先将包涵体蛋白溶 解在一种变性溶液中，这种变性溶液可以是高浓度的脲或者盐酸胍，并加入少量的还原 剂以打开错误对接的二硫键。在高浓度脲或者盐酸胍中溶解的蛋白是以一种伸展的多肽 链形式存在的，没有任何生物活性。第二步通过移除变性剂使伸展的多肽链开始折叠复 性。在第二步的折叠复性过程中仍然会导致很多有错误三维结构的蛋白及沉淀的产生。 为了克服这种问题，至今已发展出多种蛋白质复性技术。 包涵体伸展的多肽链 第一步 溶解 第二步 移除变性剂 图1 - 1 蛋白质复性过程示意图 f i g 1 - 1 s c h e m a t i cd i a g r a mo ft h ep r o c e s so fp r o t e i nr e f o i d i n g 第一章前言 1 2 传统的蛋白质复性方法 1 2 1 稀释法 用复性缓冲液稀释含有高浓度变性剂的蛋白溶液使蛋白质复性的方法即为稀释复 性法，这是最常用的一种复性方法。在稀释过程中，蛋白周围的变性剂浓度减小，多肽 链会由于氨基酸残基之间存在的多种作用力：静电引力、疏水作用力、范德华力等而自 发的开始折叠复性【3 1 。 在稀释过程中，一般来说稀释倍数越大，复性效果越好【4 1 ，但这会导致复性后的溶 液体积过大，给后续的处理工作带来很大的负担。但是即使稀释很大的倍数，稀释法的 蛋白复性效率依旧不是很高，一般只有5 - - - , 2 0 1 5 1 。这是由于在稀释复性过程中会产生 蛋白的错误折叠和沉淀。 近年来发展出了的一种添加稀释复性法，就是在复性缓冲液中加入小分子添加剂， 如：精氨酸、脲、去污剂等来抑制复性过程中错误折叠和沉淀的产生【6 1 ，但这依然无法 克服稀释法本身所存在的问题。 1 2 2 透析法 透析法可以克服稀释法最终样品体积过大的问题。这种方法是将样品溶液装入透析 袋放入复性缓冲液中，盐和小分子量物质( 1 0 ，0 0 0 d a ) 会透过透析袋，而蛋白则会留 在透析袋中。这样，随着变性剂浓度逐渐减少，蛋白质开始逐渐折叠复性。一般这个过 程需要持续2 4 h ，时间较长，而且蛋白的复性效率依然较低【7 1 。 1 3 蛋白折叠液相色谱法 液相色谱( l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，l c ) 是一种最有效的纯化蛋白质的方法，而近 些年来也已成为基因重组蛋白质复性的重要手段。l c 法相对于传统的蛋白复性方法来 说，生物活性回收率增加，正确折叠的蛋白很容易与错误折叠的蛋白质分离开，复性蛋 白的浓度相对更高，因此色谱法被认为是有效的近乎理想的蛋白复性方法，被称为蛋白 折叠液相色谱法 8 , 9 1 。根据复性机理的不同，又可分为排阻色谱复性法，离子交换色谱复 性法，疏水色谱复性法和亲和色谱复性法。 1 3 1 排阻色谱 排阻色谱( s e c ) 是研究较为深入的一种色谱复性方法，利用s e c 可实现高浓度变 2 西北大学硕士学位论文 性蛋白复性的目的。图1 2 为排阻色谱对蛋白复性的示意图。排阻色谱介质中的微孔对 不同尺寸和形状的蛋白具有选择性。没有折叠的变性蛋白处于一种伸展状态，其s t o k e s 半径大，只能进入介质颗粒间的空隙，而不能进入颗粒内部的微孑l ，迁移速度快；而变 性剂小分子则能进入微孔内，迁移速度慢，变性蛋白因和变性剂得到分离而开始折叠。 正确折叠及未完全折叠的蛋白会因在形状和体积上的减小而进入微孔内，实现和变性蛋 白得到分离，从而减小了分子间的聚集，提高了复性效率。 图l - 2 排阻色谱蛋白复性原理示意图 f i g 1 - 2p r i n c i p l ed i a g r a mo fp r o t e i nr e f o l d i n gb ye x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y 在排阻色谱中经常采用脲梯度的方法对蛋白进行复性，这种方法是通过在色谱柱中 逐渐减小脲浓度给蛋白质提供一个更为缓和和易于控制的复性环境，避免了脲浓度突然 变化给蛋白折叠带来的不利影响。 很多蛋白都使用排阻色谱被成功复性。g u 等用溶菌酶作为模型蛋白研究了脲梯度 在排阻色谱中的应用【l 们。王骊丽等采用脲梯度s e c 对重组人干细胞因子( r h - s c f ) 进 行了复性及同时纯化，将质量回收率从3 1 5 提高到5 1 4 t 1 1 】。g u 等在排阻色谱上结合 了脲梯度和p h 梯度对大肠杆菌中表达的s c f v 融合蛋白进行了复性，在优化了多种条件 后，复性产率达到2 5 t 1 2 】。d o n g 等人将去污剂c t a b 和p 环糊精用于溶菌酶的s e c 复 性体系，考察两者联合使用的复性效果f l 引。刘等采用体积排阻色谱对大肠杆菌表达的重 组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( r h g m c s f ) 复性与同时纯化工艺进行了研究，得 到的r h g m c s f 质量回收率为4 2 3 ，纯度达8 6 4 t 1 4 1 。 1 3 2 离子交换色谱 离子交换色谱也是一种非常有效的蛋白质复性方法，它是利用蛋白和色谱固定相之 3 第一章前言 间的静电引力将变性蛋白吸附在固定相上来进行复性。图1 3 是离子交换色谱法复性的 示意图，变性蛋白首先被吸附在离子交换色谱固定相上，流动相中的变性蛋白的浓度减 小。变性蛋白的折叠可能发生在固定相表面，也可能发生在流动相中，这取决于蛋白本 身的性质及其周围的环境。部分折叠的蛋白依然可以通过静电引力被固定相所吸附。由 于这种吸附的存在，变性的蛋白被分开成为单个分子，在折叠的过程中就不会受到其他 蛋白分子的干扰，聚集的几率减小。在理想状态下蛋白流出色谱柱时完成折叠，得到正 确的构象【引。 图l - 3 离子交抉色谱蛋自复性原理示意图 r i g 1 - 3 p r i n c i p l ed i a g r a mo fp r o t e i nr e f o l d i n gb yi o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y 陈等利用离子交换色谱对在大肠杆菌中表达的人源f v 抗体进行了复性，最后的复 性产率达到了7 0 i s 】。“等在离子交换色谱柱上结合脲梯度和p h 梯度对4 0 m g m l 的溶 菌酶进行复性，最后的活性回收率为9 5 ，质量回收率为9 8 i 1 6 1 。t a n 等结合离子交换 色谱和亲和色谱对具有抗癌作用的重组蛋氨酸酶进行了复性，得到了质量回收率为 6 0 ，纯度大于9 8 的重组蛋氨酸酶【1 7 1 。m a u r i c e 对基因重组并在大肠杆菌中表达的杀 鲑气单胞菌进行了复性，利用q s e p h a r o s e 可以得到纯度大于9 5 的蛋白1 1 8 1 。f e n g 等用 q s e p h a r o s e 对在毕氏酵母中表达的载脂蛋白a i 进行了复性，得到的复性产率为6 0 t 1 9 1 。 m c d o n a l d 等人将重组r f g f 2 s a p 蛋白依次经阳离子交换，亲和和排阻色谱复性后得到 了高纯度的r f g f 2 s a p t 2 0 。z h a n g 等将人工分子伴侣和离子交换色谱结合，提高了还 原变性溶菌酶的复性效率【2 1 1 。w a n g 等用q s e p h a r o s e 对重组人粒细胞集落刺激因子 ( r h g - c s f ) 进行了复性，获得了纯度为9 4 ，质量回收率为4 9 的r h g c s f t 2 2 1 。 1 3 3 疏水色谱 疏水色谱复性的原理是高盐浓度流动相中的疏水作用力会推动变性蛋白分子朝着 疏水色谱固定相移动，并以氨基酸序列的非极性区牢牢地被吸附在固定相上，形成一个稳 4 g 伊 西北大学硕士学位论文 定的络合物，而该变性蛋白的亲水性部分则面向流动相。这样，变性蛋白分子在这种情况 下不能聚集。随着盐浓度的降低，变性蛋白分子从疏水色谱固定相上解吸附。由于蛋白质 的错误区域结构的热力学不稳定，它们在流动相中将通过瞬间消失以得到修正。随着在梯 度洗脱过程中蛋白质多次的吸附和解吸附，具有错误的区域结构的蛋白质分子将会变得 越来越少，而具有正确的区域结构的蛋白质分子将会变得越来越多，结果蛋白质得到完全 复性【2 3 】。 郭等使用高效疏水作用色谱直接从大肠杆菌表达的基因重组人干扰素一a ( r h l f n - t t ) 包涵体的裂解液中纯化了r h i f n - a ，该法的活性回收率分别比稀释法和透析法高1 0 倍和 1 6 倍【2 4 1 。w a n g 等研究了固定相和流动相盐种类、流动相p h 、梯度模式对h p h i c 分离纯 化重组牛朊病毒( r b p r p ) 的影响，在4 5 分钟非线性洗脱下得到了纯度9 6 ，质量回收率 8 7 的而p r p 【2 5 1 。白等用疏水相互色谱( h p m c ) 对还原胍变性牛胰岛素在疏水界面上的 折叠与复性进行了研究，结果表明采用氧化型流动相还原胍变性牛胰岛素复性效率可达 至t j 6 6 t 2 6 1 。l i 等在5 0 m g m l 初始蛋白浓度的条件下完成了对还原变性溶菌酶的复性，最 后的活性回收率达g t j 8 5 t 2 7 1 。 1 3 4 亲和色谱 亲和色谱( a f c ) 是一类专门用于生物大分子分离纯化的色谱。它是基于固定相的 配基与生物大分子之间的特殊的生物亲和能力的不同来进行生物大分子的分离。亲和色 谱可用于下列生物体系：酶、抗体、外援凝集素、核酸、激素及维生素、细胞。根据a f c 柱填料配基的不同，可将其分为固定化金属亲和色谱( i m a c ) 、脂质体亲和色谱和分子 伴侣亲和色谱【2 3 】。 亲和色谱已经被很多人用于蛋白质复性。s h i 等用g s t r a p h p 亲和色谱柱在流速为 0 5 m l m i n x 0 重组蛋白g s t h d l l l 进行复性，复性后g s t - l l d l l l 的纯度为9 7 ，质量回收率 为8 9 【2 8 1 。l i 等首先在多孔材料上键合染料配基，然后对过氧化氢酶进行复性研究，发 现相对与普通的稀释复性，复性效率提高t 2 0 t 2 9 1 。王等用c u 2 + 亚氨基- - 7 , 酸( i d a ) s e p h a r o s e 作为固定化金属离子亲和色谱的固定相，研究了大肠杆菌表达的重组人粒细胞 集落刺激因子的复性，通过一步纯化，得到了比活性为1 8 x 1 0 8 i u m g ，纯度为9 7 ，质 量回收率为3 2 的重组人粒细胞集落刺激因子【3 0 1 。l i 等用固定金属离子亲和色谱对干扰 素九进行了复性，经过复性后可以从1 l 的细菌原液中得到8 6 m g ，纯度大于9 5 的干扰素 3 1 1 。d o n g 等人用固定有分子伴侣e l 的亲和色谱固定相研究了溶菌酶的复性，得到 5 第一章前言 的溶菌酶质量回收率高t 9 7 ，活性回收率高于8 1 t 3 2 1 。 1 4 蛋白复性过程中的二硫键对接 二硫键是由半胱氨酸( c y s t e i n e ，c y s ) 侧链巯基( - s h ) 共价交联形成，它能够稳定 蛋白质的折叠构象，是许多蛋白折叠途径中的限速步骤。在蛋白质折叠早期，二硫键的 形成呈现错误的倾向，半胱氨酸间出现不正确的配对，或者是虽然正确配对，但形成的 空间构象却抑制进一步的折叠【3 3 1 。产生正确二硫键的一般方法有空气氧化法和化学试剂 氧化法，在蛋白折叠液相色谱中，一般采用化学试剂氧化法，即在流动相中加入各类含 巯基的小分子来促进二硫键的对接。例如利用氧化还原谷胱甘肽加速二硫键对接的过程 如图1 _ 4 所示。 6 s s g g s h g s h 图l - 4 巯基- 二硫键交换反应原理示意图 f i g 1 - 4p r i n c i p l ed i a g r a mo ft h i o l - d i s u l f i d ee x c h a n g er e a c t i o n 一个蛋白分子的两个半胱氨酸的巯基通过与氧化型谷胱甘肽( g s s g ) 发生巯基二 硫键的交换反应来完成二硫键的对接。 1 5 色谱固定相对蛋白复性的影响 通常蛋白折叠研究都是在缓冲液中进行的，而蛋白折叠色谱法主要是在固体( 色谱 固定相) 表面上进行的，因此固定相表面性质对蛋白折叠起到了关键性的作用，而缓冲 液( 流动相) 则起着辅助蛋白分子折叠的作用。依据蛋白性质的不同，可以合成各种不 同类型的固定相并配合以多种流动相，从而使得m c 、i e c 、a f c 和s e c 均可用于变性蛋 白的复性，并且比通常在缓冲液中进行变性蛋白复性效果更好。 但传统的色谱固定相对蛋白折叠的作用有限。p h a d t a r e 在1 9 9 4 年将分子伴侣g r o e l 固定在凝胶基质上，实现了对谷氨酰氨合成酶( g l u m m i n es y n t h e t a s e ，g s ) 和微管蛋白 ( t u b l i n ，t u ) 蛋白的复性p 4 1 。孙彦等采用固定化g r o e l 的色谱柱对还原变性溶菌酶进 行了复性，详细研究了流动相中的g u h c l 浓度，流速，上样体积和上样浓度等因素对溶 菌酶复性的影响，所得活性回收率为8 1 t 3 5 】。而a l t a m i r a n o 教授用三组份折叠亲合柱 6 西北大学硕士学位论文 ( t e r n m 3 r r e f o l d i n gm a t r i x ，m i n i c h a p e r o n e d s b a - p p i - a g a r o s e ) 能使在通常单独用蛋白折叠 缓冲溶液中根本不能复性而且质量回收率仅为5 的s c o r p i o nt o x i o nc n 5 完全复性，质量 回收率高达8 7 ，这主要是分子伴侣a f c 柱的贡献【3 6 , 3 7 1 。虽然分子伴侣是一种高效的促 进蛋白折叠剂，可大大提高蛋白质的复性效率，将其固定在基质上就可以部分地克服稀 释法中同时引入了杂蛋白( 即分子伴侣) 缺陷，并可重复使用，但是分子伴侣价格昂贵， 限制了其应用。 而迄今为止，已发现多种具有抑制变性蛋白分子间疏水性相互作用、促进蛋白质复 性的溶质辅助因子，包括聚乙二醇( p e g ) i 3 8 】、环糊精【3 9 】、精氨酸m 、脯氨酸【4 1 一、 表面活性剂和去垢剂【4 3 】等多种分子。它们的作用类似于分子伴侣，因此也被称之为“人 工分子伴侣”。而键合有人工分子伴侣的色谱固定相也被证实有利于蛋白的复性：实验 发现采用具有人工分子伴侣功能的聚乙二醇改型的i - - p i - - i i c 固定相对蛋白复性机理与分 子伴侣法有极为相似之处m ，并发现固定相表面能在分子水平上为变性蛋白提供高出通 常在溶液中蛋白折叠数十至数百倍的能量【4 5 】，从而指出其对变性蛋白折叠起十分重要的 作用；y o s h i m o t o 等用固定化脂质体色谱( i m m o b i l i z e dl i p o s o m ec h r o m a t o g r a p h y ) 对碳酸 酐酶、溶菌酶和核糖核酸酶a 的复性进行了研究，作者认为脂质体可作为一种双水相系 统，有人工分子伴侣的功能 4 6 1 。它对不同浓度变性剂变性的具有不同分子构象的蛋白具 有高度的选择性，不同分子构象的蛋白在柱子上的保留与局部疏水性( 1 0 c a l h y d r o p h o b i c i t y ) 相关。 1 6 精氨酸简介及其在蛋白质复性中的研究 精氨酸( a r g i n i n e ) ，分子式为c 6 h i 4 n 4 0 2 ，分子量为1 7 4 2 0 ，天然精氨酸为l - 型， 在水中结晶的产物含两分子结晶水，在乙醇中结晶的是无水物。由于胍基的存在，精氨 酸呈碱性，易与酸反应形成盐。图1 5 为精氨酸结构示意图。 叱n y n 八人丫洲 图1 - 5 精氨酸结构示意图 f i g 1 - 5 s t r u c t u r ed i a g r a mo fa r g i n i n e 7 第一章前言 精氨酸是一种非常有用的溶液添加剂，在生物技术和药物生产中有很多应用。t a r a k a w a 等发现精氨酸可以抑制蛋白储藏过程中的聚剿4 7 1 。t a r a k a w a 等还发现精氨酸 有利于抗体从蛋白a 柱上的洗脱【4 引。 在蛋白质复性方面，精氨酸对复性的显著影响也多次得到了证实。l i u 等人认为其 提高复性效率的机理是精氨酸可以增加蛋白质的溶解性，阻止蛋白质分子之间通过疏水 作用发生凝聚而产生沉淀【4 9 1 。f 锄等人通过在排阻色谱上运用精氨酸和脲梯度对2 0 m 酌m 的n t a 蛋白进行复性，得到了活性回收率为3 7 的n t a 蛋白【5 们。吴等人在研究中发现， 碱性的精氨酸在质量分数0 2 时可减少蛋白质凝聚，显著提高复性效果，重组t p a 蛋白 复性后的活性可提高5 0 以上【5 1 1 。针对人们对于精氨酸是否是一种蛋白变性剂， m a t s u j i r o 等人也在实验中得到了精氨酸并不是一种蛋白变性剂的结论【5 2 1 。在上述实验 中，都总结出精氨酸的胍基是精氨酸在蛋白生产复性中能起重要的作用的直接原因。 1 7 重组人粒细胞集落刺激因子( r h g c s f ) 概述 1 7 1g - c s f 的结构及生物学功能 粒细胞集落刺激因子( g r a n u l o c y t ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r , g - c s f ) 是集落刺激因 子c s f 的一种。根据细胞因子刺激不同造血细胞系或不同分化阶段的细胞在半固体培养 基中形成的不同细胞集落，被分别命名为粒细胞c s f ( g c s f ) ，巨噬细胞c s f ( m c s f ) ， 粒细胞和巨噬细胞c s f ( a 讧c s f ) ，多重集落刺激因子( m u l t i - c s f ，又称几3 ) ，干细 胞因子( s c f ) ，红细胞生成素( e p o ) 等。 粒细胞集落刺激因子( g - c s f ) ，属于造血生长因子，是目前己知血细胞集落刺激 因子中特异刺激粒系祖细胞增殖、分化乃至维持其功能、存活所必须的一种造血生长因 子，同时也是成熟的中性白细胞的功能活化因子，对机体应激防御系统有重要意义，在 造血、血液病细胞生长和机体免疫功能中具有不可忽视的作用【5 3 】。 g - c s f 主要来源于巨噬细胞、内皮细胞及纤维母细胞。天然g c s f 的分子量是 1 9 6 k d ，等电点为约为6 1 ，分子中含有5 个半胱氨酸残基，可形成两个二硫键，有糖 基化，对酸和碱( p h2 1 0 ) 、热( 7 0 ，3 0 m i n ，5 0 失活) 及强变性剂( 8 m o l l 脲，6 m o l l 盐酸胍) 相对稳定，是具有三级结构的酸性糖蛋白。 重组人粒细胞集落刺激因子是d n a 重组技术产生的人粒细胞集落刺激因子【5 4 1 ，与 天然的g c s f 的氨基酸序列和糖链几乎完全相同，不同的是重组人g - c s f 链的n 端含 有蛋氨酸，其生物学活性与天然的g c s f 相同。 8 西北大学硕士学位论文 1 7 2r h g c s f 的研究进展 由于天然g c s f 非常有限，远远不能满足临床上的需求，因此必须通过基因工程 的手段生产。近年来国内外众多实验室已成功将g c s f 基因重组到大肠杆菌内，并得 到了高效表达，获得了高纯度的活性蛋白r h g c s f 。方向东等人用7 m o l l 盐酸胍溶解 表达的包涵体，在g s h g s s g 存在条件下采用稀释法复性，然后采用弱阳离子交换色 谱( w c x ) 一步纯化，纯化后的g 。c s f 比活为1 0 x 1 0 8i u m g ，纯度达到9 5 ，质量回 收率为3 5 5 5 】。w a n g 等使用c u 2 + 亚氨基二乙酸s e p h a r o s e 固定化金属亲和色谱，在低 脲浓度下采用咪唑为洗脱剂，线性梯度洗脱，一步纯化和复性了r h g c s f ，结果显示， 复性后r h g c s f 纯度为9 7 ，比活性为1 0 x 1 0 8i u m g ，质量回收率为3 2 t 5 6 】。w a n g 等使用离子交换色谱法对r h g - c s f 进行了复性，考察了复性过程中影响复性效率的因 素，在最优复性条件下，复性后r h g c s f 的活性为3 0 x 1 0 8 i u m g ，纯度为9 4 ，质量回 收率为4 9 t 5 7 1 。d a s a r i 等在e c o i l 体系中表达了r h g - c s f ，并对其复性和纯化过程进行 了优化。作者采用径向流过滤技术( t f f ) 对包涵体抽提液进行了复性，优化了包涵体的 清洗、溶解以及复性过程，最终得到回收率为6 9 和纯度为9 9 的r h g - c s f s s 】。 1 8 本实验的研究工作 综上所述，离子交换色谱、分子伴侣、人工分子伴侣都已经广泛应用于蛋白质折叠 复性，而将分子伴侣、人工分子伴侣键合在色谱固定相上也已经被证实有利于多种蛋白 质的折叠复性。本实验旨在将一种含有胍基的人工分子伴侣键合到色谱固定相上并研究 其对蛋白复性的影响。 实验首先通过表面化学改性，将含有胍基的精氨酸和肌酸键合到硅胶基质上制备出 一种性能优良的阴离子交换色谱固定相；然后将这种色谱固定相用于r h g - c s f 的复性纯 化中，提高了r h g c s f 复性的质量回收率。 9 第一章前言 参考文献 【1 m i s a w as ，k u m a g a ii r e f o l d i n go ft h e r a p e u t i cp r o t e i n sp r o d u c e di ne s c h e r i c h i ac o l ia s i n c l u s i o nb o d i e s j p e p t i d es c i e n c e ，1 9 9 9 ，5 1 ( 4 ) ：2 9 7 3 0 7 【2 】c l a r kd b e p r o t e i nr e f o l d i n gf o ri n d u s t r i a lp r o c e s s e s j c u r r e n to p i n i o ni n b i o t e c h n o l o g y , 2 0 0 1 ，v 1 2 ( 2 ) ：2 0 2 2 0 7 【3 】w a n gf w ，l i uy d ，c h e nj ，e ta 1 c h r o m a t o g r a p h i cr e f o l d i n go fp r o t e i n s ：m o l e c u l a r a c t i o na n dc o l u m nc o n t r o l j c h i n ap a r t i c u o l o g y , 2 0 0 5 ，v 3 ( 6 ) ：3 3 7 3 4 2 【4 “j j ，l i uy d ，w a n gf w ，e ta 1 h y d r o p h o b i ei n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h yc o r r e c t l y r e f o l d i n gp r o t e i n sa s s i s t e db yg l y c e r o la n du r e a 乎a d i e n t s 叨j o u r n a lo fc h r o m a t o g r a p h y a2 0 0 4 ，v 1 0 6 1 ( 2 ) ：1 9 3 - - - 1 9 9 【5 w a n gl l ，g e n gx d l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yo fr e c o m b i n a n tp r o t e i n sa n dp r o t e i n 。d i - u g s r j o u r n a lo f c h r o m a t o g r a p h yb ，2 0 0 8 ，v 8 6 6 ( 1 2 ) ：1 3 3 - 1 5 3 6 l i l l eh ，s c h w a r ze ，r u d o l p hr a d v a n c e si nr e f o l d i n go f p r o t e i n sp r o d u c e di ne c o l i j c u r r e n to p i n i o ni nb i o t e c h n o l o g y , 1 9 9 8 ，v 9 ( 5 ) ：4 9 7 5 0 1 7 】7 s e a d e rj d ，h e y l e ye j s e p a r a t i o np r o c e s sp r i n c i p l e m j 0 l l nw i l e y & s o n s ，l n c ，n e w y 0 r k , 1 9 9 8 ：7 4 7 8 】f o r c i n i t id p r o t e i nr e f o l d i n gu s i n ga q u e o u st w o p h a s es y s t e m s f 1 j o u r n a lo f c h r o m a t o g r a p h y 凡1 9 9 4 ，v 6 6 8 ( 1 ) ：9 5 1 0 0 【9 】m i d d e l b e r ga p j p r e p a r a t i v ep r o t e i nr e f o l d i n g j t r e n d si nb i o t e c h n o l o g y , 2 0 0 2 ，v 2 0 ( 10 ) ：4 3 7 4 4 3 10 g uz y ，s uz g ，j a n s o nj c u r e ag r a d i e n ts i z e - e x c l u s i o nc h r o r r i a t o g r a p h ye n h a n c e d t h ey i e l do fl y s o z y m er e f o l d i n g j j o u r n a lo fc h r o m a t o g r a p h ya ，2 0 0 1 ，v 9 1 8 ( 2 ) ：3 11 3 1 8 1 1 】王骊丽，耿信笃脲梯度体积排阻色谱复性并同时纯化r h s c f j 第四军医大学学报， 2 0 0 5 ，v 2 6 ( 1 5 ) ：1 3 4 9 1 3 5 1 12 g uz y ，w e i d e n h a u p tm ，i v a n o v an ，e ta 1 c h r o m a t o g r a p h i cm e t h o d sf o rt h ei s o l a t i o n o f , a n dr e f o l d i n go fp r o t e i n sf r o m ，e s c h e r i c h i ac o l ii n c l u s i o nb o d i e s j p r o t e i n e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o n ，2 0 0 2 ，v 2 5 ( 1 ) ：1 7 4 1 7 9 1 3 d o n gx y ，w a n gy ，s h ij h ，e ta 1 s i z ee x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h yw i t ha l la r t i f i c i a l 1 0 西北大学硕士学位论文 c h a p e r o n es y s t e m e n h a n c e d l y s o z y m er e n a t u r a t i o n j e n z y m ea n dm i