（发育生物学专业论文）tip30诱导肝癌细胞凋亡信号转导途径的研究.pdf

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l 骨架中。井经过真核细胞的包装形成完整的有感染能力的腺病毒。且利用p c r 和蛋白印迹杂交证明了目的基因的转录和表达。由于我们选择的载体带有绿色荧 光蛋白( g f p ) ，使得在整个病毒扩增及下一步的细胞实验中观察就更为方便。a d t i p 3 0 的构建为以后的细胞学实验及动物实验提供了一个有力的工具。 细胞凋亡是细胞的多基因协同调控的程序性死亡过程，是维持细胞数目均衡 和组织大小，保证机体正常生长发育的先决条件。很多肿瘤的发生不仅是细胞增 殖的加快，凋亡受抑也是肿瘤发生的一个重要因素。促凋亡基因的表达增强或凋 亡抑制基因的突变或缺失是使正常细胞恶性变的重要原因。目前已被认识和克隆 的与肿瘤细胞凋亡相关的基因有p 5 3 、p 2 1 、c m y c 及b c l 2 家族蛋白等。它们受 外部或内部信号的刺激被激活或阻断来促进或抑制肿瘤细胞的凋亡，诱导细胞凋 亡是抗肿瘤的主要机制之一。 t i p 3 0 基因是1 9 9 7 年s h t i v e l m a n 用r n a 差异显示技术比较高转移性小细胞 肺癌及低转移性小细胞肺癌细胞系时首先发现的一种与肿瘤转移有关的基因。 1 9 9 8 年肖华等亦发现一种分子量为3 0 k d 的转录共分子，可特异性地提高h i v - 1 增殖调节蛋白1 1 a t 的转录，并命名为t i p 3 0 ( t a ti n t e r a c t i n gp r o t e i n 3 0 ) 。该基因定 位于人类第1 1 号染色体，其c d n a 序列表明它有一个编码含2 4 2 个氨基酸残基 的多肽的开放读框，5 端始第9 9 位有第一个甲硫氨酸密码子。序列库比对分析 发现哺乳动物的t i p 3 0 氨基酸序列与线虫、酵母和大肠杆菌中的有高度的同源 性，表明t i p 3 0 蛋白在进化上是高度保守的。近年来的研究表明，t i p 3 0 c c 3 可 通过诱导细胞凋亡来抑制小细胞肺癌的生长，进一步的研究表明：将外源t i p 3 0 导入小细胞肺癌中可诱导一系列的凋亡相关基因，如：b a d 、s i v a 和转移相关基 山东入学博士学位论文 m l 因，如：n m 2 3 h 2 的表达。目前t i p 3 0 在肝癌组织中的表达、在肝癌发生发展 过程中可能存在的作用未见有文献报道。 本研究中，我们用带有人类野生型t i p 3 0 基因的复制缺陷型腺病毒载体感 染人肝癌细胞系：h e p g 2 ( p 5 3 基因野生型、h e p 3 b ( p 5 3 基函缺陷型) 和 p l c r p f 5 ( p 5 3 基因突变型) ，探讨t i p 3 0 凋亡调控的分子机制。本研究从以下 几个方面入手：1t i p 3 0 引起的细胞凋亡形态变化。2t 1 p 3 0 对一些凋亡相关基 因的调节，如对p 5 3 b a x b a d b c l x l 的调节。3t i p 3 0 是否介导线粒体凋亡信 号转导途径：包括线粒体膜位变化、对下游凋亡调节园子c a s p a s e 9 ，一3 和p a r p 的激活。阐明t i p 3 0 参与凋亡的分子机制将为其在基因治疗的临床应用奠定理 论攮础。 研究方法 1 i j 一种安全、高教的a d e a s y1 t m 系统构建了t 1 p 3 0 c c ，基因的复制缺陷型腺 病毒载体，为后续实验准备了平台。 2 x i ta s s a y d n af r a g m e n t a t i o n ，i ns i t u3 e n dl a b e l i n go fd n a ，a n n e x i n v f i t c 用来检测不同的时间中，感染细胞的死亡率和凋亡率。并且用荧光显微 镜观察了凋亡细胞的形态变化。 3 不同时间i t ，用w e s t e r nb l o t t i n g 检测t i p 3 0 对一系列掏亡相关基因如：p 5 3 ， b a x ，b a k ，b a da n db c l - x l 的表达调控。 4 用f l o wc y t o m e t r y 和荧光显微镜检测线粒体膜位变化，用w e s t e r nb l o t t i n g 检测t i p 3 0 对下游凋亡调节因子c a s p a s e 一9 ，一3 。和p a r p 的剪切。 5 为了确定t i p 3 0 介导的凋亡途径是否为c a s p a s e 依赖型，用c a s p a s e 广谱抑 制剂z v a d f m k 在细胞感染前2 小时处理细胞，然后f l o wc y t o m e t r y 检测细 胞凋亡率和p a r p 的剪切。 研究结果 1 实验表明：肝癌细胞分别感染a d t i p 3 0 、a d g f p 并用未感染细胞作对照。 感染后细胞培养5 8 天，用x t t 法检测细胞死亡率。在h e p g 2 细胞培养5 - b 山东大学博上学位论文 天中，细胞死亡率从9 97 ，6 8 3 到1 0 显著降低。而在h e p 3 b 和 p l c ，r p f ，5 细胞中，死亡率分别从9 7 8 6 2 1 降到4 4 3 和从9 8 1 ， 6 8 6 降到5 0 4 。细胞感染a d g f p 后，其死亡率相对于感染a d t i p 3 0 低很多。相反地，对照细胞( 未感染病毒) 在传代后8 1 0 天仍保持较高的 生长率。结果表明：t i p 3 0 诱导细胞死亡过程中与p 5 3 有加和作用。 2 ，如s i t u3 e n dl a b e l i n go fd n a 实验提示：a d t i p 3 0 诱导的细胞死亡为 细胞凋亡。在h e p g 2 ，h e p 3 b ，a n dp l c r p f 5 细胞中，细胞凋亡率在感染 后2 4 h 达到高峰。在h e p g 2 细胞中，凋亡率在2 4 h 为7 5 5 ，是h e p 3 b ( 4 8 1 ) 和扎c r p f 5 ( 6 3 ) 细胞的i 5 到2 倍但在未感染的对照细胞中几乎 无凋亡现象。 3 用流式细胞技术检测的细胞凋亡结果表明：在感染后1 2 ，2 4 和3 6 h ，h e p g 2 细胞的凋亡率为3 2 3 6 ，6 1 0 4 和8 1 6 7 。同时在相同时间内，h e p 3 b 和 p l c r p f 5 细胞的凋亡率分别为1 2 3 8 ，3 4 0 8 ，5 0 7 1 和1 1 2 6 ， 2 3 1 7 ，5 3 5 2 ：在未感染对照细胞中几乎无凋亡现象。 4 d n af r a g m e n t a t i o n 实验表明：在h e p g 2 细胞中，d n a 梯度在感染a d t i p 3 0 2 4h 后可检测到。然而，在h e p 3 b 和p l c r p f 5 细胞，d n a 梯度在3 6h 才 能检测到。在未感染细胞中，没有d n a 梯度出现。 5 t i p 3 0 对凋亡相关基因的调节结果如下： ( 1 ) 在感染后6 8h ，h e p g 2 细胞的p 5 3 水平显著升高后在1 2 2 4h 下降。 用蛋白密度计量仪测定的数据表明：感染a d t i p 3 0 的细胞p 5 3 水平比 感染a d g f p 的高2 3 倍。在感染后3 6 h ，细胞几乎全部凋亡的情况下， p 5 3 水平急剧下降。 ( 2 ) 在感染a d - t i p 3 0 后1 2h ，h e p g 2 细胞的b a x 和b a d 从细胞质向线粒 体内跃迂。而在h e p 3 b 和p l c r p f s 细胞中，只有b a d 的跃迁。在三 种细胞中，t i p 3 0 对b a k 无影响，同时，b c l x l 的表达水平下降1 2 倍。 6 线粒体膜通透性( v m ) 变化检测表明：在h e p g 2 细胞中，感染2 4h ，细胞 呈现高比率的线粒体膜通透性变化。而在h e p 3 b 和p l c i r p f f 5 细胞几乎没 有这种变化。提示：t i p 3 0 介导的细胞凋亡通过调节线粒体膜通透性( 1 l rm ) 变化并且为p 5 3 依赖型。 山东大学博士学位论文 7 在h e p g 2 细胞感染a d t i p 3 0 后，细胞色素c 从线粒体释放到细胞质中。 而在h e p 3 b 和p l c r p f 5 细胞中则未检测到细胞色素c 的释放。这表明 t i p 3 0 通过上调p 5 3 后促进b a x 从线粒体到细胞质的释放并最后导致细胞 包索c 的释放。 8 感染a d - t i p 3 0 后，在h e p g 2 细胞中，其p r o c a s p a s e 一3 和p r o c a s p a s e 一9 减 少，同时它们的剪切产物在细胞质中可以被检测到，而且p a r p 被酶切为其 8 6k d 的产物。 在p l c i r p f 5 细胞和h e p 3 b 细胞中，p a r p 的酶切产 物也可被检测到。 9 加入c a s p a s e s 抑制剂z - v a d f m k 后，细胞的凋亡和p a r p 的剪切被阻断， 这表明t i p 3 0 诱导的凋亡为c a s p a s e 依赖型。 结论： 1 通过对t i p 3 0 介导的肝癌细胞的凋亡率的检测，我们确定：t i p 3 0 可引起肝 癌细胞的凋亡。t i p 3 0 为公认的肿瘤生长抑制因予。 2 在h e p g 2 细胞中。t i p 3 0 介导的凋亡信号转导途径为：上调p 5 3 后促进b a x 和b a d 从细胞质向线粒体的跃迁，引起细胞色素c 的释放。然后激活c a s p a s e 9 3 和剪切p a r p 。因而t i p 3 0 介导的凋亡信号转导途径为p 5 3 1 m i t o c h o n d r i a l c a s p a s e 一9 途径。 3 在无p 5 3 功能的h e p 3 b 和p l c r p f 5 中，t i p 3 0 仍然能诱导细胞凋亡。说 明t i p 3 0 诱导的p 5 3 依赖型凋亡只存在于某些细胞中，这些细胞中可能存在 与t i p 3 0 超作用的其他因子，t i p 3 0 可能通过这些因子促进b a d 的跃迁、下 调b c l x l 和剪切p a r p 。虽然线粒体凋亡途径已被深入研究，但其上游调节因 予还有待于发现本研究为肝癌的治疗提供了可靠的理论依据。 关键词：t i p 3 0 ：细胞凋亡：p 5 3 ；线粒体：s p a 弛；p a r p 山东大学博士学位论文 i n v o l v e h e n to f1 1 ：p 3 0 i na p o p t o s i ss i g n a l t r a n s d u c t l 0 np a t h w a yi nh e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o h ac e l l s a b s t r a c t b a c k g r o u n da n do b j e d d v e h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a ( h c c ) i s o n eo ft h em o s tc o m m o n m a l i g n a n c i e s w o h d w i d e i ns o m e c a s e s io p e r a t i o nt om o s tp a t i e n t si sn o1 0 n g e r f e a s i b l e v a n o u ss t u d i e sa l s oh a v es h o w nt h a tc o m b i n a t i o no f t u m o r - s u p p r e s s o rg e n et h e r a p yw i t hc o n v e n t i o n a la n t i c a n c e rt h e r a p y c a ny i e l d s y n e r g i s t i ct h e r a p e u u cb e n e f 船g e n et h e r a p yi s a p m m i s i n ga p p r o a c hf o r i n o p e r a b l eh c c t u m o r - s u p p r e s s o rg e n e sp l a yp o t a lr o l e si nm a i n t a i n i n gg e n o m ei n t e g r i t y a n di nr e g u l a t i n gc e l lp r o l i f e r a t i o n ，d i f f e r e n t i a t i o n ，a n da p o p t o s i s t h u s , u s eo f t u m o r - s u p p r e s s o rg e n e s a sa n t i c a n c e r t h e r a p e u t i c s h a sb e e n i n v e s t i g a t e d r i g o r o u s l yi n b o t he x p e r i m e n t a la n dd i n i c a lr e s e a r c h e s t r a n s f e ro fv a r i o u s t u m o r - s u p p r e s s o rg e n e sd i r e c t i yt oc a n c e rc e l l sh a sb e e nd e m o n s t r a t e dt o s u p p r e s st u m o rg r o w t hv i ai n d u c t i o no fa p o p t o s i sa n dc e l l - o d ea r r e s t c l i n i c a l t r i a l sw i t h t u m o r - s u p p r e s s o rg e n e s , e s p e d a l l y t h e p 5 3g e n e ，h a v e d e m o n s t r a t e dt h a tt h et r e a t m e n ti sw e l lt o l e r a t e da n dw i t hf a v o r a b l ec l i n i c a i r e s p o n s e s ，i n d u d i n gap a t h o l o g i c a l l yc o m p l e t er e s p o n s eh a v eb e e no b s e r v e di n as u b s e to fp a t i e n t sw i t hc a n c e r sr e s i s t a n tt oc o n v e n t i o n a lt h e r a p y e f f i c i e n t s y s t e m i cg e n ed e l i v e r ys y s t e m sw i l lb er e q u i r e du l t i m a t e l yf o rt r e a t m e n to f c a n c e l r e p l i c a t i o n - d e f e c t i v ea d e n o v i r u s e sa r ev 目3 t o r so fc h o i c ef o rd e l i v e n n g c o r r e c t i v eg e n e si n t oh u m a nc a l l s t h e p o t e n t i a l u s eo fa d e n o v i r u s e si n t h e r a p ya g a i n s t c a n c e rh a se v o k e da r a p i d l ym o v i n g f i e l do fr e s e a r c h a d e n o v i r u s e sa r en o n - e n v e l o p e d 。d o u b l e - s t r a n d e dd n av i r u s e sa n da r e 6 山东大学博士学位论文 a b o u t7 0t o9 0n mi nd i a m e t e r t h e yh a v ei c o s a h e d r a lc a p s i d s w h i c hi sb u i l t u pf r o m2 5 2c a p s o m e r s o fw h i c h2 4 0 a r eh e x a v a l e n ta n d 气2i s n u 乱e oa t 们e a p i c e s ) a r ep e n t a v a l e n t a ”p e n t o nf i b e f p r o j e c t sf r o me a c ha p e x i tc o n s i s t so f as l e n d e rs h a f tw i t ha g t o b u l a rh e a da n di s i n v o ) v e di nt h ep r o c e s so f a t t a c h m e n t o ft h ev i r u s p a r t i c l e t ot h eh o s tc e i l t h ef i b e r sc o n t a i n s p e c i e s - s p e c i f i ca n t i g e n i c d e t e r m i n a n ta n ds u b o r d i n a t e s u b g e n u s s p e c i f i c a n t i g e n i cd e t e r m i n a n t t h eg e n o m e i s3 0 5 0 k ba n dc o n s i s t so fn o n s t r u c t u r a l e a d yg e n e s ( e l - e 4 ) s t r u c t u r a ll a t eg e n e s a n dr n a p o l y m e r a s et r a n s c r i p t i o n s a d e n o v i r u sa d o p t e df o rt u m o rg e n et h e r a p yi st r a d i t i o n a l l yc l a s s i f i e di , n t ot w o t y p e s ：r e p l i c a t i o n - d e f e c t i v et y p e sa n dr e p l i c a t i o nt y p e i nr e p l i c a t i o n - d e f e c t i v e t y p e ，t h ee 1a r e ai sm i s s i n ga n d t h ee x o g e n o u s g e n e - e x p r e s s 讯g b o xi sc l o n e o i ne la r e a o rt h en o n n e c e s s a r ye 3a r e ai sr e p l i c a t e d d u et on sa d v a n t a g e sa q e n o v i r u si s e 时e n s e l yu t i l i z e d i nt h er e c e n t y e a r s ( 1 ) b r o a dh o s t i tc a ni n f e c ta l lc e l l so t h e rt h a nl y m p h o c y t e s ( 2 ) h i g h i n f e c t i v ee f f i c i e n c y i tc a ni n f e c ta l lt h ec e l l so fp r o l i f e r a t i o ns t a g ea n ds t a t i o n a r y s t a g e ( 3 ) h i g hs a f e t y i tc a n n o tb ei n s e r t e dt oh u m a n c h r o m o s o m e sa n dt h u s c a n n o t i n d u c ei n s e r t i o n m u t a t i o n ( 4 ) e x p r e s s i n gm a n y g e n e s a tt h es a m e t i m e t h u sp r o v i d e sp o s s i b i l i t yo fu n i t e d g e n et h e r a p y ( 5 ) p r o l i f e r a t ee 炳c b n u y 瓢 p a c k e d c e l l sw i t h h i g h t i t r a t e i nt h i s e x p e r i m e n t w e s e l e c t e d t h e r e p l i c a t i o n d e f e c t i v e a d e n o v i r u s f o rt h es a y , eo fd a t ec t i o nw ec h o o s e t r a c k 。c m v b e a r i n gg f p ( g r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i n ) g e n e t h i s k i n d o f a d e n o v i r u sh a sal e f ta r ma n dar i g h ta 丌nt h a tc a nr e c o m b i n ew i t ha d e a s y 一1 t h r o u g hc o t r a n s f e c t i o nw i t hh o s tb a c t e r i ab j 5 1 8 3 t h ee x o g e n o u sg e n ei s c o m b i n e di n t ot h es k e t c ho f a d e a s yt h r o u g hh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n l a t e r i ti sp a c k e dw i t h e u k a r y o c y t et oe n d o wi t s i n f e c t i v ea b i l i t yi nt h i sw a yt h e t r a n s c r i p t i o n a n de x p r e s s i o no ft h et a r g e tg e n ec a nb ee a s i l ym o n i t o r e d t h r o u g hp c r a n d w e s t e r n b l o t t i n g i no u re x p e r i m e n t 。g f pe x p r e s s e d b yt h e v e c t o rm a k e si te v e nm o r ec o n v e n i e n ta n de a s yf o rd e t e c t i o ni nt h ef ur t h e r c e l l u l a re x p e r i m e n t a n dc a r tb eu s e di na n i m a | e x p e r i m e n t sa s 睇 a p o p t o s i sa sag e n e t i c a l l yr e g u l a t e dp r o c e s sh a sac r i t i c a le n d p o i n tt h a t 1 山东大学博士学位论文 c o i n c i d e sw i t ht h et h e r a p e u t i cg o a lo fs u c c e s s f u lt r e a t m e n tf r o mt h es t u d yo f s i n g l eg e n e f u n c t i o n u p t o c o m p l e xt a r g e t v a l i d a t i o n s t i p 3 0i sa n p r o a p o p t o t i cg e n en e w l y f o u n dt h a ti se x p r e s s e du b i q u i t o u s l yi nh u m a nt i s s u e a n ds o m et u m o rt i s s u e sw i t hp r o p e r t i e so fs e r i n e t h r e o n i n ek i n a s e c o d i n ga p o l y p e p t i d eo f2 4 2a m i n oa c i d sl o n g i ti si d e n t i f i e da sac o f a c t o rt os p e c i a l l y e n h a n c eh u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s - 1 ( h i v - 1 ) t a t - a c t i v a t e dt r a n s c r i p t i o n b yp h o s p h o r y l a t i n gt h eh e p t a p e p t i d er e p e a t so fc t e r m i n a ld o m a i n ( c t d yo f t h el a r g e s tr n a p o l y m e r a s e 1 1s u b u n i ti nat a t d e p e n d a n tm a n n e r m o r e o v e r , t i p 3 0i sam e t a s t a s i ss u p p r e s s o rt h a ti n h i b i t sm e t a s t a s i so ft h ev a r i a n ts m a l l c e l ll u n gc a r c i n o m a ( v - s c l s ) b y p r e d i s p o s i n gc e l l st oa p o p t o s i s f ur t h e r m o r e 。 e c t o p i ce x p r e s s i o no ft i p 3 0i nv o s c l cc e l l si n d u c e se x p r e s s i o no fan u m b e r o fg e n e st h a ti n c l u d et h ea p o p t o s i s r e l a t e dg e n e sb a da n ds i v a ，a sw e l la s m e t a s t a s i ss u p p r e s s o rn m 2 3 一h 2 i no u rs t u d y h u m a nh e p a t o b l a s t o mc e l ll i n e s h e p g 2 ( w h i c hi sp 5 3 一w i l dt y p e ) ，h e p 3 b ( w h i c hi sp 5 3n u l l ) ，p l c ，r p f ，5 ( w h i c h i sp 5 3m u t a t i o n a l ) i n f e c t e dw i t har e p l i c a t i o nd e f e c t i v ea d - t i p 3 0v e c t o rb e a r i n g aw i l d t y p eh u m a ni s u s e dt od e l i n e a t ef u r t h e rt h em o l e c u l a rm e c h a n i s m s w h e r e b yt ip 3 0p o t e n t i a t e sa p o p t o s i s w ew i l l d e t e c tt h ea p o p t o s i ss i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y t i p 3 0i n v o l v e d t h r o u g hm o r p h o l o g i c a lc h a n g e i n i n f e c t e dc e l l st oas u b s e to f a p o p t o s i s r e l a t e dg e n e ，t h ec h a n g e o f m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n e p o t e n t i a l a n dt h ed o w n s t r e a mf a c t o r ss u c ha s c a s p a s e 一3 ，一9a n dp a r ee l u c i d a t i n gt h e m e c h a n i s m b yw h i c h t i p 3 0i n d u c e d c e l ld e a t hm i g h te s t a b l i s hi ta sa na n t i c a n c e ra p p r o a c h m e t h o d s 1 w es e l e c tas a f ea n de f f e c t i v e a d e a s y t ms y s t e m t oc o n s t r u c tt h e a d t i p 3 0 2 x t ta s s a y , d n a f r a g m e n t a t i o n ns i t u3 e n dl a b e l i n go fd n a a n n e x i n - v f i t ca r em a d et od e t e c tc e l td e a t ha n da p e p t o s i si nc e l l sa tv a r i o u st i m e i n t e r v a l ss u b s e q u e n tt oi n f e c t i o n t h em o r p h o l o g i c a lc h a n g e so fa p o p t o t i c 8 山东入学博士学位论文 c e l l sa r ea l s oo b s e r v e db yf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e 3 f u r t h e r m o r e ，t od e t e r m i n ew h e t h e rt i p 3 0h a sa ne f f e c to nt h ee x p r e s s i o n l e v e l s o fs o m ea p o p t o s i s - r e l a t e dg e n ep r o d u c t ss u c ha sp 5 3 b a x 。b a k ， b a da n db c l x l ，as i m i l a rt i m ec o u r s ee x p e r i m e n ti sp e r f o r m e dw i t hw e s t e r n b l o t t i n g 4 i no r d e rt od e t e r m i n ew h e t h e rt i p 3 0i n v o l v e sm i t o c h o n dr i a ，c a s p a s e 一9 s i g n a lp a t h w a y m i t o c h o n d r i am e m b r a n ep o t e n t i a l ( u m ) t h ea c t i v a t i o no f p r o c a s p a s e 一9 3a n dp a r pa r ed e t e c t e db yf l o wc y t o m e t r ya n dw e s t e r n b l o t t i n g m o r e o v e r , m o r p h o l o g i c a lc h a n g e i nt h em i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ei s o b s e r v e db yf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e 5 i no r d e rt os t u d yw e a t h e rt h ea p o p t o t i cp a t h w a yw a sc a s p a s e d e p e n d e n t ， t h r e ec e l ll i n e sa r ep r e t r e a t e dw i t ht h ec e l lp e r m e a b l eb r o a d s p e c t r u m c a s p a s ei n h i b i t o rz - 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g f pa r ef o u n dt oh a v er e l a t i v e l yl o w e rc e l ld e a t hu n t i l5 - 8d a y s o nt h e c o n t r a r y c o n t r o lc e l l s ( n ov i