（林产化学加工工程专业论文）油橄榄叶抗氧化物有效成分及其含量变化规律研究.pdf

摘要 油橄榄叶主要含有橄榄苦苷、黄酮和多酚等抗氧化物。本文研究了油橄榄叶中橄榄 苦苷单体的制备方法，通过光谱鉴定其化学结构；建立了橄榄苦苷、黄酮、多酚不同抗 氧化物的分析方法，并对不同品种不同月份油橄榄叶中檄榄苦苷、黄酮、多酚的含量变 化规律进行了研究；通过单因素实验和正交实验优化确定油橄榄叶提取的最佳工艺，采 用大孔树脂吸附纯化并优化其大孔树脂吸附条件制备，橄榄苦苷含量较高的油橄榄叶提 取物。 采用乙醇一水( 6 0 ：4 0 ) 对油橄榄叶进行提取，依次届石油醚和乙酸乙酯萃取，乙酸 乙酯萃取相经过硅胶柱层析，再用液相制备色谱，制备得含量9 5 以上的单体，通过取、 u v 、m s 、n m r 鉴定，确定该化合物为橄榄苦苷。 采用o d s ( 0 4 6 m m x1 5 0 m m ，5 9 m ) 色谱柱，流动相为甲醇：水( o 2 醋酸) = 4 5 ：5 5 ， 检测波长为2 3 0 r i m ，流速为l m l m i n 。建立油橄榄叶中橄榄苦苷的h p l c 分析方法。研究 了阿斯、皮瓜尔等9 个品种油橄榄叶中橄榄苦苷含量。科拉地中橄榄苦苷含量最高，配 多灵中含量最少。9 个品种中，橄榄苦苷含量大致分布在三个区域，其含量分别在1 7 、 1 1 和7 左右。同时研究了阿斯、莱星、皮削利3 个品种油橄榄叶中橄榄苦苷含量随不 同月份的变化规律。3 个品种橄榄苦苷的含量总体趋势是：阿斯 皮削利 莱星。一年有两 个高峰期，分别是在2 月份和5 月份，2 月份的含量最高。两个低谷期则是在1 1 月份和 4 月份。 采用比色法，研究阿斯、莱星、皮肖口利3 个品种不同月份油橄榄叶中黄酮和多酚的 含量及其随时间变化规律。其中黄酮含量较高的时期大体为1 2 月份到次年的3 月份，两 个低谷期则在1 0 月份和次年的4 月份。最高的为2 月份的阿斯，达到了1 2 5 4 ；最低 的为1 0 月份的莱星，为2 0 1 。多酚含量较高的为2 、3 月份，低谷期则是在1 0 、1 1 月 份。多酚含量最高的为3 月份的阿颠为9 7 2 。含量最低的为1 0 月份的莱星，只有2 5 3 。 优化了油橄榄叶提取物的工业生产工艺条件。采用水浴热提方式，提取条件为：用 8 0 乙醇一水提取，提取时间3 5h ，温度：7 0 ，固液比：1 ：1 0 。采用大孔树脂吸附分 离纯化，通过对比不同树脂对橄榄苦瞢的吸跗，筛选出选择性吸附好的a b 8 树脂，吸附 量为3 2 1 m g g 湿树脂。a b 一8 树脂纯化的最佳条件为：样品上样浓度为2r n g m l ，流速为 3 m l m i n ，7 0 z , 醇一水洗脱，洗脱液用量为3 b v 。制备的油橄榄叶提取物，橄榄苦苷含 量为4 7 9 。 关键词；油橄榄叶，橄榄苦苷，光谱特征，含量分析 a b s t r a c t t h e r ea r em a n ya n t i o x i d a n t si no l i v el e a v e ss u c ha s o l e u r o p e i n f l a v o n o i d sa n d p o l y p h e n o l s t h em e t h o do fp r e p a r i n go l e u r o p e i nm o n o m e rw a se s t a b l i s h e d ，a n di t sc h e m i c a l s t r u c t u r ew a sc o n f i r m e db ys p e c t r a la n a l y s i s t h ea n a l y t i cm e t h o d so fo l e u r o p e i n ，f l a v o n o i d s a n dp o l y p h e n o l sw e r ee s t a b l i s h e da n dv a r i a t i o no ft h ec o n t e n t sw e r es t u d i e d t h ee x t r a c t i o n a n dt h ep u r i f c a t i o nt e c h n o l o g i e sw e r es t u d i e d t h eb e t t e re x t r a c tt e c h n o l o g i e sw e r es t u d i e db y o r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n dt h er e s i n sw e r eu s e dt op u r i f e dt h ee x t r a c to f o l i v el e a v e s o l i v el e a v e sw e r ee x t r a c t e dw i t he t o h h 2 0 ( 6 0 ：4 0 ) a n dt h e ne x t r a c t e db yp e t r o l e u me t h e r a n d e t h y la c e t a t e t h ee t h y la c e t a t ef r a c t i o nw a ss u b j e c t e dt os i l i c a g e lc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y , a n dt r e a t e dw i t hp r e p a r a t i o nh p l c ，t h e nap r o d u c tw i t hc o n t e n to f9 5 o l e u r o p e i nw a sg o t i tw a sc o n f i r m e dt ob eo l e u r o p e i nb yu vi rm sa n dn m r t h ei d e n t i f i c a t i o no f o l e u r o p e i nw a sc a r r i e do u tb yh p l c t h ec o l u m nw a so d s ( 0 4 6 n m 1 5 0 r a m ，5 p m ) ；t h em o b i l ep h a s ew a s4 5 m e o ha n d5 5 w a t e rw i t h0 2 a c e t i c a c i d q u a n t i f i c a t i o no f o l e u r o p e i nw a sc a r r i e do u ta t2 3 0m n t h ef l o wr a t ew a sl m l m i n 1 1 1 e c o n t e n t so fo l e u r o p e i ni no l i v el e a v e so fd i f f e r e n tb r e e d sw e r es t u d i e d t h ek e l a d io l i v el e a v e s h a dt h eh i 曲e s to l e u r o p e i nc o n t e n t t h ep e i d u o l i n go l i v el e a v e sh a dt h el o w e s to l e u r o p e i n c o n t e n t t h ec o n t e n to f o l e n r o p e i ni nt h e9b r e e d sd i s t r i b u t e di nt h r e ea r e a s a b o u t l 7 1 1 a n d 7 t h ec o n t e n t so f o l e u r o p e i ni nb r e e d so f a s e o l a n o 、l e e c i n o 、p i c h o l i n eo l i v el e a v e sc o l l e c t e d i i ld i f f e r e n tm o n t h sw e r es t u d i e d t h ec o n t e n t so fo l e u r o p e i nw e r ed e t e r m i n e db yi - i p l c t h e a g c o l a n oo l i v el e a v e sh a dt h eh i g h e s to l e u r o p e i nc o n t e n t , t h e nt h ep i c h o l i n e ，a n dt h el e e c i n o o l i v el e a v e sh a dt h el e a s t n eh i 曲e rc o n t e n t so fo l e u r o p e i nw a si nf e b r u a r ya n dm a y t h e l o w e r c o n t e n t s o f o l e u r o p e i n w a s i n n o v e m b e r a n d a p r i l t h ec h a n g eo ff l a v o n o i d sa n dp o l y p h e n o l sc o n t e n t si no l i v el e a v e sc o l l e c t e di nd i f f e r e n t m o n t h sw a ss t u d i e db yc o l o r i m e t r y t h eh i g h e rc o n t e n t so ff l a v o n o i d sw e r ef r o md e c e m b e rt o n e x tm a r c h t h el o w e rc o n t e n t so ff l a v o n o i d sw e r ei no c t o b e ra n da p r i l t h et h eh i g h e s t f a v o n o i d sc o n t e n tw a si nf e b r u a r yo f t h ea s c o l a n o ( 1 2 5 4 ) ，t h el o w e s tw a si no c t o b e ro f t h e l e e c i n o ( 2 0 1 ) t h eh i g i l e s tp o l y p h e n o lc o n t e n tw a si nm a r c ho ft h ea s c o l a n o ( 9 7 2 ) , t h e l o w e s tw a si no c t o b e ro ft h el e c c i n o ，o n l y2 5 3 t h eb e s te x t r a c t i o nt e c h n o l o g yw a ss t u d i e d i tw a se x t r a c t e dw i t h8 0 e t o h h 2 0f o r3 t i m e s ，e a c ht i m ef o r3 5h t h ep r o p o r t i o no fo l i v el e a v e sa n ds o l v e n td o s a g ew a s1 ：1 0a n dt h e t e m p e r a t u r ew a s7 0 ( 2 t h eb e s tp u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yb yr e s i nw a ss t u d i e d t h ea b - 8r e s i n w a sb e t t e rt h a no t h e rr e s i n s t h eq u a n t i t yo fs a t u r a t e da d s o r p t i o no f a b 一8w a s3 2 1 m g p e rl g w e tr e s i n t h eb e s tc o n d i t i o nw a ss t u d i e d 7 0 e t o h - h 2 0w a su s e dt oe l u t eo l e u r o p e i na n dt h e c o n c e n t r a t i o no ft h es a m p l ew a s2m g m l t h ef l o wr a t ew a s3 m l m i n t h ed o s a g eo fs o l v e n t t oe l u t ew a s3 b v t h ec o n t e n to f o l e u r o p e i nw a s4 7 9 i nt h ep u r i f i e de x t r a c to f o l i v el e a v e s k e y w o r d s ：o l i v el e a v e so l e u r o p e i ns p e c t r u mc h a r a c t e r c o n t e n ta n a l y s i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得本 研究生培养单位或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：、编霞 日期： 叼年 月j 细 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解中国林业科学研究院有关保留、使用学位论文的规定，中国林业科学研 究院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 中国林业科学研究院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：刍彩霞 导师签名： 町年1 月留日 砷年7 月 学位论文作者毕业联系方式 工作单位：中国林科院林产化工研究所 联系电话：0 2 5 8 5 4 8 2 4 6 7 电子邮件：c a i x i a g a 0 1 9 8 1 y a h o o c o n l c n 通讯地址、邮编：南京市锁金五村1 6 号2 1 0 0 4 2 第一章绪论 1 1 研究背景 油橄榄( o e ae u r o p a e al ) 属木犀科( o e a c e a e ) 、木犀榄属( o e a ) 常绿乔木， 是世界著名的木本油料树种，有4 0 0 0 多年的栽培历史。油橄榄主要分布在北纬4 5 。到南 纬3 7 。之间，中心分布区是地中海国家，希腊、意大利、突尼斯、西班牙为集中产地， 现在世界各国均引种栽培【l 。j 。全世界油橄榄的种植面积已超过8 8 0 万公顷( 约8 亿株油橄 榄树) ，主要以鲜果加工橄榄油。我国传统中药所用的橄榄为橄榄科植物橄榄( c a n a r i u m a l b u mr a e u s c h ) 的果实，也称野橄榄，与油橄榄( 木犀科) 不是同一属植物，二者的用 途明显不同【4 j 。 从油橄榄果实中榨取的油称橄榄油，油橄榄鲜果的含油率一般为2 0 3 0 ，其油产 量每年约为2 0 0 多万吨，占世界植物油总量的第4 位。橄榄油的品质在植物油中居首位。 因此具有“食用植物油皇后”的美称【2 l 。 很多流行病学研究显示，地中海区域的人群的心血管疾病以及癌症发病率要低于其 它地区。进一步研究显示，这与该地区的膳食结构密不可分。“地中海膳食”不仅包括很 多水果、蔬菜、鱼肉，而且橄榄油在膳食结构中也起着至关重要的作用。目前，已经把 该膳食的健康效果归因于不饱和脂肪酸和一些微量化合物，特别是橄榄油来源的诸多酚 类化合物。至此，橄榄油及其所含有的生物酚类化合物引起了世人的关注，甚至橄榄油 还被诸多学者称为是一种非常完美的“功能性食品” 5 - s 。 橄榄油在工业和医药制造业上也有广泛的用途。橄榄油加到乳制品、肉及鱼罐头中 可改善其保存性和风味；作为印染用油，它能使颜色鲜艳且牢固；作为研磨剂，在电子 和精密仪器制造中是其它材料无法替代的“指定之物”；在化妆品制造业用作高级配料。 在医药上可用于配制各种抗菌素及维生素针剂和软膏；橄榄油对胃及十二指肠溃疡的治 疗有明显疗效，在烧、烫伤创面涂上橄榄油，不仅伤口愈合快，而且不会留下疤痕。美 国、德国等西方国家把橄榄油写进药典，明确表述它有治烫伤、降三高( 高血压、高血 脂、高血糖) 、防老年痴呆、治癌、治胆结石等作用。 长期以来，人们一直从橄榄油中提取有效活性成份，然而，生物学家发现，橄榄叶 含有的抗氧化活性成份较之橄榄油更为突出( 高1 0 0 倍) ，尤其是橄榄苦苷( o l e u r o p e i n ) 和黄酮类化合物在叶中的含量明显高于果实和树皮。 第一章绪论 橄榄苦苷是一种生物活性物质，具有极强的抗氧化能力，用于护肤品可以促进肌肤 原蛋白再生，纠正老化痕迹，重现光滑无细纹、年轻有弹性的肌肤，自然抵御由氧化而 导致的肌肤破坏，免受紫外线伤害，有效维持肌肤柔嫩与弹性，国外许多知名品牌的高 档化妆品中均有添加。同时橄榄苦苷具有强力的抗细菌和抗病毒特性，可用于制造治疗 病毒，细菌、原生动物类、寄生虫和吸血虫等所引起的疾病和治疗感冒的新药。国外已 生产有标准的橄榄叶提取物，其橄榄苦昔的含量为1 5 3 0 ，用于化妆品和食品补充 剂及药品。目前法国、意大利、以色列已有以橄榄叶提取物为主要成份的化妆品和药品 面市，受到消费者和患者的好评。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 国外研究现状 据考古学家们发掘的古代遗物分析，在地中海沿岸地区，已有4 0 0 0 多年的栽培历史。 1 6 世纪初期，由伊比利亚半岛的移民把它引种到秘鲁、智利和南美洲的其他国家。1 9 世 纪初期，相继到北美洲、大洋洲和亚洲东部，迄今油橄榄已扩大到世界六大洲的3 0 多个 国家，遍布北纬4 5 。到南纬3 7 0 的广大地区。亚洲有：巴基斯坦、叙利亚、黎巴嫩、约旦、 伊拉克、伊朗、土耳其、日本、中国等。非洲有突尼斯、阿尔及利亚、摩洛哥、利比亚、 埃及、南非等。美洲有美国。拉丁美洲有里西哥、智利、阿根廷、乌拉圭、秘鲁等国。 大洋洲有澳大利亚。欧洲有意大利、西班牙、希腊、法国、阿尔巴尼亚、南斯拉夫、独 联体的南部等。油橄榄主要分布在地中海区域各国，主产国有西班牙、意大利、希腊、 葡萄牙、突尼斯、土耳其、法国、阿尔巴尼亚等。目前全世界生长着8 亿多株油橄榄树， 其中西班牙2 亿株，意大利i 8 亿株，这两个国家就占了世界栽培总数的一半l “ 国外学者对油橄榄的化学成分已进行了广泛和深入的研究工作，从中已分离到几十 个化合物。九十年代以前，主要研究了橄榄油的化学成分；近年来，研究工作集中在油 橄榄叶及榨油后的果渣上。从橄榄油和油橄榄叶中分离到的化学成分主要有：黄酮类、 裂环烯醚萜类、简单酚类、木酚素类、咖啡酰苯乙醇苷类咿j 。 1 2 1 1 主要有效成分 ( 1 )黄酮类化合物从油橄榄叶分离的黄酮类化合物有2 0 多种，其中主要是从油 檄榄叶和果中分离得到的，从油橄榄叶中分离得到的黄酮类化合物主要有芹菜素，芦丁、 杨梅黄酮、槲皮素、山奈酚、橘皮素及以它们为母体结构的糖苷，其中黄酮营元的含量 约占总黄酮的3 5 - - 4 0 。还从油橄榄果中检测到其它一些黄酮醇类糖苷，如：木犀草素 第一章绪论 一7 一葡萄糖苷、芦丁，以及花色苷类，如矢车菊苷、飞燕草苷等【1 阻。 h o h o o h 扛g 描n a l e _ o l i n 坳i c 讹 k m p 断o l q u 既e e l i n o h 图卜1 油橄榄叶中部分黄酮和黄酮酵的化学结构。 f i g 1 1 c h e m i c a ls t r u c t u r eo f f l a v o n e sa n df l a v o n o l si no l i v el e a v e s ( 2 )裂环烯醚萜类裂环烯醚萜是环戊烷单萜衍生物中的一类化合物，是由环烯醚 萜类化合物在c 7 、c 8 处裂环而成，只占环烯醚萜类的很小一部分。到1 9 9 1 年为止，从 植物中分离并鉴定的裂环烯醚萜约有1 2 0 个，其母核具半缩醛结构，化学性质活泼，一 般都与糖结合成苷，其苷类大多数是白色晶体或无定形粉末。裂环烯醚萜类化合物结构 类型较多，在母核上常常连有酚羟基、萜类等结构，有的还与另一个环烯醚萜组成复合 物或双萜，甚至还有寡聚裂环烯醚萜【1 - 1 8 1 。 裂环烯醚萜类化合物因其在多种天然产物生物途径中的重要性而被认为是木犀榄科 植物化学分类学上的标记化合物。木犀科约2 0 属5 0 0 种，广泛分布在温带、亚热带及热 带地区。我国有1 2 属，2 0 0 种，南北各省均有分布【1 9 1 。目前，从木犀科的木犀榄属( o l e a ) 、 丁香属( s y r i n g a ) ，茉莉属( j a s m i n u m ) ，女贞属( i g u s t r u m ) 、木犀属( o s m a n t h u s ) 、连翘属 ( f o r s y t h i a ) 和雪柳属( f o n t a n e s i a ) 等的多种植物中均己分离出裂环烯醚萜类化学成分l l ”。 裂环烯醚萜类化合物主要从油橄榄叶中得到的，s c a r p a t i 研究组从油橄榄叶中分离 得到橄榄苦苷是最具有代表性的化合物，g a r o b o l d i 等对橄榄苦苷进行n m r 分析，确定 3 第一章绪论 了其化学结构f 2 0 】。其后又分离出o l e o s i d e 的二甲酯、l i g s t r o s i d e 和橄榄苦苷的裂环马钱子 苷的类似物o l e u r o s i d e 。橄榄的果实中也分离得到橄榄苦苷和l i g s t r o s i d e ，同时得到少量 的e o m o s i d e 。我国学者研究了云南产橄榄( o y u e n n a n e n a i s ) ，从中分离得到了 1 0 - h y d r o x y l i g s t r o s i d ，1 0 一h y d r o l o l e u r o p e i n 和o l e a - y u a nn a n o s i d e 。g a r i b o l d i 等从油橄榄中 分离得到e l e n o l i ca c i d 、m e t h y l e l e n o l a t e 、o l e o s i d e 。k u w a j i m a 等从油橄榄中分离得到 s e c o l o g a n i n 、m e t h y l s e c o l o g a n i n 、o l e u r o s i d et e t r a a c e t a t e 和s e c o l o g a n o s i d e 。p a i v a - m a r t i n s 从油橄榄叶中分离得到3 , 4 一d i h y d r o x y p h e n y l e t h y l4 - f o r m a l 3 一f o r m y l m e t h y l 4 一h e x e n o a t e 。 ( 3 )咖啡酰苯乙醇苷类从油橄榄叶中分离得到2 个此类化合物，分别是 v e r b a s c o s i d e 和o l e o a c e o s i d e 。其结构见图2 【2 1 。捌： ：肾乜： v e r b a s e o s i d e ：r 。i = r _ h ar f hr 3 = h o l e o a c e o s i d e ：r _ i = r h ar 2 = h r 3 = o l e o s y l 图1 2 毛蕊花苷和o l e o a c e o s i d e 化学结构 f i g 1 - 2 c h e m i c a ls t i u c t u r eo f v e r b a s e o s i d ea n do l e o a e e o s i d e ( 4 )木酚素类油橄榄中存在少量木酚素类，已鉴定的有两种，即( + ) 一乙酰基 松脂醇和( + ) 一松脂醇，还有它们的糖苷化合物。木酚素在橄榄油的含量较为丰富， 在粗橄榄油中约为4 0 m g k g ，几乎是所有简单酚类化合物的总和1 2 a 。 ( 5 )其它类型的化合物除上所述，油橄榄中还有大量简单酚类化合物、有机酸类 等，包括有生育酚、绿原酸、香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、橄榄内酯原儿茶酸、酪醇、羟 基酪醇等。一般来说，酪醇及羟基酪醇是油橄榄中最主要简单酚类化合物。 i 2 1 2 生物转化 ( i )橄榄苦苷在生物中的形成过程见图3 1 2 4 1 ： 第一章绪论 州。”“一”一 “嗽慧鬣= ： 。眉r o ：珂1 再 ，、一 、，j ，、， q m kmk 图卜3 橄榄苦苷在木犀科植物中的形成过程 f i g 1 - 3p r o p o s e db i o 町m n l 硝cp 拙w a yf o ro l n n o p e i ni no l c e ( 2 ) 橄榄苦苷的分解： ， 橄榄苦苷的分解一般有3 种方法，酶水解法、酸水解和碱水解。 r a f f a e u a 等用h y p e r t h e r m o p h i l i c1 3 - g l u e o s i d a s e 为水解酶，在1 3 - g l u e o s i d a s e 作用下，先 脱去糖基，在p h 值为7 0 ，温度为6 0 时，分解为化合物1 ，继续2 h ，化合物1 接着分 解为h y d r o x y t y r o s o l 、e l e n o l i ca c i d 和化合物2 ，其结构见图1 4 嘲。 c r i s t i n 等研究了用酸和碱提取油橄榄叶及对用酸碱分解油橄榄叶提取物的情况。油 橄榄叶提取物先用水溶解，加入盐酸，搅拌2 h ，溶液分成2 份，一份用n a o h 中和至中 性，另一份搅拌2 4 h 后，用n a o h 中和至中性。同样的，碱水解为在提取物水溶液中加 入碱水解，搅拌2 h ，溶液分成2 份，一份用h c i 中和至中性，另一份搅拌2 4 h 后，用 h c l 中和至中性。用酸碱提取方法时，取一定量油橄榄叶粉末，用甲醇水溶解，加入i m o l l 的盐酸或n a o h ，搅拌2 h ，溶液分成2 份，一份用n a o h 或盐酸中和至中性，另一份搅 拌2 4 h 后，用n a o h 或盐酸中和至中性。结果发现，酸水解2 h 后，橄榄苦苷含量减小， 碱水解2 h 后，样品图谱中橄榄苦苷峰很小。在用酸碱提取时，酸提取2 h 和2 4 h 后，橄 榄苦苷分别损失了4 0 并n9 9 ，碱提取2 h 和2 4 h 后，橄榄苦苷分别损失了9 8 和1 0 0 ， 从直接提取和提取物水解2 方面来说，都是碱水解效果较好f 2 6 】。 龟 毒一 一 签 第一章绪论 一趣 薅。瑟 l 一 。m 图卜4 檄榄苦苷主要水解产物 f i g ，1 - 4 t h e m a i nr e a c t i o n p r o d u c t s o f o l e u r o p e i n h y d r o l y s i s ( 3 )主要酚类化合物之间关系 图1 - 5 油橄榄叶中部分酚类的结构关系1 2 7 1 f i g 1 5s t r u c t u r a lr e l a t i o n s h i p so f i m p o r t a n tp h e n o l i cc o m p o u n d si no l i v e 1 2 1 3 有效成分提取及检测 6 删嚣 m 叫 第一章绪论 ( 1 ) 橄榄苦苷的发现历程 1 9 0 8 年，b o u r q u e l o t 等就从油橄榄果中发现橄榄苦苷，它是油橄榄果中的苦味素， 以后的时间里，橄榄苦苷的性质及分离方法被广泛研究【2 引。 1 9 5 7 年，1 l d i a zb l a s c o 等分别从油橄榄叶及果中得到橄榄苦苷，并测定其含量。油 橄榄果中檄榄苦苷含量为o 1 ，叶中含量为o 3 。文中介绍了分别从叶中和橄榄油中提 取用橄榄苦苷的方法，并介绍了橄榄苦苷简单的定性方法。油橄榄叶用乙醇水浴热提， 浓缩后，再用乙酸乙酯萃取，浓缩，然后用甲醇溶解，并在热水浴中浓缩制成千粉。橄 榄油加入到水中加热l h ，不断搅动，油水分层，水层分离出来，浓缩即可。橄榄苦苷初 步分析方法为：取2 0 m l 橄榄苦苷溶液，加入1 m l l 0 n a n 0 2 ，l m l 乙酸，1 5 s 后，加入 l m l 3 0 n a o h ，出现胭脂红色，说明有橄榄苦苷【2 9 】。 1 9 5 8 年，p a n i z z i 等初步研究了橄榄苦苷的化学结构，确定其有三部分构成，糖基、 c 8 h 1 0 0 3 和c l l h l 4 0 6 。1 9 6 0 年，他又研究了橄榄苦苷的化学特征，确定了其化学结构【3 0 】。 1 9 6 4 年，b k n o r t j e 等提出了纯化橄榄苦苷的方法。取2 k g 油橄榄果，用丙酮浸泡， 过滤，滤液浓缩，用氯仿萃取，然后调节p h 值到8 5 左右，用乙酸乙酯连续提取2 4 h ， 浓缩，样品再过酸式硅酸镁柱，用乙酸乙酯洗脱，浓缩即可【3 “。 1 9 6 9 年，c o h e n 等提出了不同的纯化方法。油橄榄提取物用水溶解，在其盐溶液中 # 、 加入5 凝胶，使单宁沉淀，过滤，浓缩滤液，过a h 0 3 柱，分离黄酮，在第1 5 个组分 段得到一物质，在f e c l 3 和香革醛盐酸中不显色，但在3 4 0 n m 荧光下有强吸收，确定为 橄榄苦苷【3 2 】。 1 9 8 6 年，g a r i b o l d i 等报道了橄榄苦苷的n m r 数据【3 3 】。至此，橄榄苦苷的分离和鉴 定方法趋于完善。有关油橄榄和橄榄苦苷的研究也日趋成熟。 ( 2 ) 提取分离方法 天然产物提取过程中最常采用的一般是溶剂法，有溶剂冷浸和水浴热提等。近年来 新兴起的提取技术还有超临界流体萃取法、微波提取法、超声波辅助溶剂技术等。在油 橄榄有效成分分离中，过去用的较多的还是溶剂提取法，现在，随着科技的发展，其他 方法也应用到其分离过程中。 d a n i e l l er y 锄等采用溶剂法提取。取一定量的油橄榄叶干粉，用固液比l ：2 0 的甲醇： 水( 1 ：1 ) 溶解，搅拌混合2 0s ，然后室温下静置3 0 m i n ，过滤，滤液用等量正己烷萃取， 滤液分为3 部分，用甲醇：水，( 1 ：1 ) 溶解，分别搅拌2 h ，2 4 h 和不搅拌，然后样品过微滤 膜，h p l c 进样分析【2 6 】。 第一章绪论 a l f o n s o 等对不同颜色和不同采集时期的油橄榄叶进行了研究。他的提取分离方法 为：1 9 油橄榄叶粉末，用3 5 0 m l 甲醇：水( 2 3 ：1 ) 提取，涡流搅拌6 m i n ，过滤，3 0 c 下真空浓缩，剩余水相调节p h 值为3 1 ，用3 5 0 m l 乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层， 用固相萃取柱萃取，用4 5 m l 甲醇洗脱【州。 r j a p o n l u j a i l 等采用了超声波辅助提取。他采用了水浴热提，并在提取器中插入超 声波探测器辅助提取，同时将提取设备和检测设备连接，进行超声波辅助提取动态监测。 用甲醇：水( 5 9 ：4 1 ) 在4 0 下提取，且提取液以5 m l m m 的速度循环。并与常规溶剂提 取比较，在4 0 c 下，用甲醇：水( 5 9 ：4 1 ) 提取2 4 h ，结果发现，超声波辅助提取效果远远 好于单纯溶剂提取( 3 ”。 r j a p o n l u j a i l 还采用了微波辅助萃取并优化了其提取条件。他从微波功率、提取时 间、提取溶剂3 个方面进行提取条件优化，以提取物得率作为参数来考察。微波功率选 择范围为1 0 0 2 0 0 w ，提取时间为5 - 1 5 r a i n ，乙醇浓度选择8 0 1 0 0 乙醇水溶液。得到 的优化条件为：i g 油橄榄叶用8 m l s 0 e 。醇水溶液提取，微波功率为2 0 0 w ，提取时间 为8 r a m 。提取物浓缩，h p l c 分析【3 6 】。 f l e f l o c h 等采用超临界萃取( s f e ) 从油橄榄叶中提取多酚，并用f c 试剂测定其 含量。它采用7 6 8 0 th e w l e t tp a c k a r d 超临界萃取设备，进行s f e 提取条件优化。在压力 1 5 5 3 4 4 b a r ，0 - 2 0 q j 醇为夹带剂，c 0 2 流速为0 - 4 m l m i n ，样品量3 0 2 0 0 r a g 样品提取时 间为5 - 1 4 0 r a i n ，在不同温度下提取。结果发现：采用1 0 甲醇为夹带剂时，总酚提取率 最高，且提取时间越长，提取温度越高，总酚提取率越高。得到s f e 提取优化条件：压 力3 4 4 b a r ，1 0 甲醇为夹带剂，流速4m l m i n ，时间1 4 0 r a i n ，温度1 2 0 。在此条件下， 与甲醇超声波辅助萃取比较，发现甲醇超声波辅助萃取时，总酚含量为1 6 8 8 m g k g ，s f e 萃取时，总酚含量为7 6 m g k g 。效果没有超声辅助萃取好f 翊。 ( 3 ) 分析方法天然产物分析中，最常用的方法有波层色谱法、高效液相色谱法、 气相色谱法等。本节从这几个方面介绍油橄榄叶有效成分提取分离现状。 ( a ) 薄层色谱 国外对油橄榄叶中物质的t l c 分析，主要是对黄酮物质和裂环烯醚萜物质的分析。 其中，裂环烯醚萜物质的分析方法主要有p 1 1 ： a ) 以氯仿一甲醇一水一甲酸作为展开剂，四者比例为6 0 ：2 0 ：l ：1 b ) 以氯仿一甲醇一乙酸为展开剂，比例为7 ：3 ：1 ，紫光灯下在2 5 4 n m 处可看到斑点，用1 0 阿魏酸作喷显剂可以确定裂环烯醚萜类 第一章绪论 c ) 以乙酸乙酯一甲醇一水为展开剂，三者比例为2 0 0 ：3 5 ：2 7 ，然后用1 对甲苯磺酸和2 香 草醛乙醇溶液为显色剂。其中非酚类物质显灰色，橄榄苦苷显橘红色。 攀) 以正己烷一乙酸乙酯一甲醇为展开剂，比例为9 ：9 ：2 d 以正丁醇：醋酸：水为展开剂，三者比例为4 ：1 ：5 。 ( b ) 高效液相色谱h p l c h p l c 定性及定量测定是目前分析中最常用的一种方法。油橄榄叶有效成分的分析 一般都用h p l c 。检测时常用紫外检测器或二极管阵列检测器。 采用紫外检测器时，检测波长在2 3 0 n m 或2 8 0 a m ，色谱柱一般都采用c 1 8 柱，分析时 流速一般在l m l m i n ，其它影响分析效果的因素最主要的是流动相。流动相一般都采用 梯度洗脱方式。文献中关于流动相主要有以下几种 4 2 - 5 1 】： 流动相：溶剂a 水：醋酸= 1 0 ：1 溶剂b 甲醇：乙腈：醋酸= 9 5 ：5 ：1 采用梯度洗脱方式，刚开始时，用1 0 b 洗脱，并在保留时间1 0 r a i n 时达豺3 0 b ， 保持5 r a i n ，然后在保留时间2 5 r a i n 时达到4 0 b ，在保留时间4 0 r a i n 时达到5 0 b ，在 保留时间5 0 r a i n 时达到1 0 0 b ，保持至保留时间至8 0 r a i n 。 流动相：溶剂a o 1 磷酸水溶液溶剂b7 0 7 , 腈水溶液 采用梯度洗脱方式，开始时，用2 0 b 洗脱，并在保留时间3 0 m i n 时达到5 q b ， 然后在保留时间5 0 r a i n 时达到1 0 0 b 。 在上述洗脱方式的基础上，用同种流动相，找到一种更好的洗脱方式：开始时，用 1 0 0 0 1 3 洗脱，并在保留时间2 5 r a i n 时达到2 5 b ，然后在保留时间3 5 m i n 时达到8 0 b ， 在保留时间3 7 r a i n 时达到1 0 0 b ，保持3 m i n ，在保留时间5 0 m i n 时降到1 0 b 。 流动相：溶剂a 甲醇：醋酸= 1 0 0 ：1溶剂b 水：醋酸= 1 0 0 ：1 采用梯度洗脱，开始时，用2 0 a 洗脱，并在保留时间3 0 m i n 时达到8 0 a ，保持 5 r a i n ，然后在保留时间5 0 r a i n 时1 0 0 a ，保持5 r a i n 。 流动相：溶剂ao 1 甲酸水溶液溶剂b0 1 甲酸一甲醇溶液 开始时，用2 0 b 洗脱，保持5 m i n ，并在保留时间3 5 r a i n 时达到8 0 0 o i 3 ，然后在保 留时间3 7 m i n 时达到1 0 0 b ，保持3 r a i n ，在保留时间4 2 m i n 时降到2 0 b 。 流动相：溶剂a2 醋酸一水b ：甲醇c ：乙腈 开始时，9 5 a 5 b ，在保留时间为8 m i n 时，流动相为6 0 a 2 0 b 2 0 c ，在保留 时间为1 7 m i n 时为4 0 b 6 0 c ，保持l o m i n ，在保留时间为3 7 m i n 时流动相为 6 0 a 2 0 b 2 0 c ，5 m i n 内转为9 5 a ，5 b 。 第一章绪论 流动相：蒸馏水：乙腈= 7 9 ：2 1 ，蒸馏水、乙腈各用o 1 磷酸酸化，采用单一洗脱方式， 用内标法测定样品含量。 流动相：水：甲醇= 3 ：7 ，采用单一洗脱方式。 1 2 1 4 生物活性 ( 1 )对心血管系统的作用“地中海饮食”有助于心血管疾病的预防已得到流行病 学的支持。与此同时，已有很多研究指出橄榄油对这种效果的重要性。一项e u 项目研 究证明：橄榄油对餐后脂质代谢及血栓症具有很好的有益效果。经常摄食橄榄油，可有 效的减缓餐后脂质代谢及血栓症应答，而且，如果采用来源于橄榄油的单不饱和脂肪酸 替代膳食中饱和脂肪，将改善餐后脂质代谢及血栓症，同时显著降低血浆胆固醇的水平 【5 2 】。 p e t k o v 等报道油橄榄叶中的主要裂环烯醚萜苷橄榄苦苷，可使离体兔心脏的冠脉血 流增加5 0 ，并显示出抗心律失常和解痉作用 5 3 - 5 4 1 。从油橄榄中分离出的裂环烯醚萜 0 1 e a c e i n ，是很强的血管紧张素转化酶抑制剂，许多裂环烯醚萜苷( 包括橄榄苦苷) 没有血 管紧张素转化酶抑制作用，但由酶催化水解产生的相应的苷元却显示出与0 1 e a c e i n 相似的 作用【m 。 p e t r o n i 等采用a d p 或胶原诱导富含血小板的血浆的凝聚，检讨了油橄榄叶提取物对 血小板的影响，发现羟基酪醇可完全抑制胶原诱导的血小板凝聚。他们还研究了羟基酪 醇对体外白血球的花生四烯酸一5 一脂质氧合酶代谢物形成的影响，发现羟基酪醇可抑制 白细胞三烯的产生，对其氧化代谢物也有类似的抑制效果。d r i s s 等研究了橄榄苦苷在体 外对血小板聚集、红细胞畸形和红细胞膜脂肪酸预氧化感受性的影响，发现橄榄苦苷可 改善红血球畸形【躅。 ( 2 )抗氧化作用1 9 8 8 年，c h i m i 等用油橄榄叶中分离的物质在避光条件下作抗氧 化实验。用预氧化值和共轭二烯在2 3 2 n m 处的吸收，估计抗氧化速率。五种化合物的相对 抑制效应以下列顺序排列：h y d r o x y t y r o l e a f f e i ea e i d b h t o l e u r o p e i n t y r o s o l 【鲫 1 9 9 5 年，v i s i o l i 等检测了油橄榄中酚类化合物对l d l 的体外氧化过程的影响，发现它 们在较低浓度下对脂质氧化的不同指标，如维生素e 含量、t a r s 物质的形成、脂质过氧化 物、多不饱和脂肪酸含量、蛋白质的修饰及共轭双烯的形成等，都有一种抑制效果印j 1 9 9 7 年，该研究小组再进一步检测了油橄榄中不同酚类化合物，发现橄榄苦苷浓度为 l 旷5 m 时可有效阻止c u s o 。诱导的l d l 氧化【5 8 1 。五种化合物胶束的抗氧化性以下列顺序增 加：b h t t y r o s o c a f f e i e a c i d o l e u r o p e i n h y d r o a y t y r o s o 。通过加铁的肝细胞培养模型观察 第一章绪论 苯酚类自然化合物的抗氧化性，发现橄榄苦苷可清除过氧化物阴离子，从而达到抑制铁 毒性的效果 1 9 9 5 年，g u t i e r r e z 等以2 5 或5 0 m g k g 的剂量注入w i s t a r 菌株雄鼠体内三周，通过 t l c 腰i d 测试发