（微生物学专业论文）溶菌酶高产菌株的筛选及其产酶研究.pdf

摘要 本论文系统研究了产溶菌酶菌株的分离筛选及鉴定，发酵条件的优化和粗酶液酶 学性质，研究结果如下： 从不同地区采集的1 5 6 个土壤样品中进行筛选，最终，从河北农业大学标本园的 果园土壤中筛选得到一高产菌株。通过产酶菌株的分离筛选，建立了一套快速、准确 的溶菌酶高产菌株筛选方法：通过添加金黄色葡萄球菌的双层平板分离初筛，琼脂打 孔法进行高抑菌活性菌株的初步筛选，验证抑菌物质的初筛方法，测定酶活力的复筛 的方法；确定了合理、客观的综合考察酶活的方法。 对菌株s 2 6 b 进行鉴定，分别在光学显微镜和扫描电镜下观察了菌体形态、大小， 并对其在营养琼脂平板上的单菌落形态、大小、颜色等特征进行了描述；通过一系列 生理生化试验及1 6 s r d n a 保守序列的分析，将此菌株初步鉴定为溶杆菌( l y s o b a c t e r s 2 6 b ) 。 对溶杆菌s 2 6 b 的发酵条件进行了研究，确定其最佳培养基成分及最佳培养条 件。研究了不同碳源、氮源、无机盐、表面活性剂、不同培养温度、时间、p h 值等 主要因素对溶杆菌s 2 6 b 产酶的影响，进行发酵条件优化，优化结果表明，菌株产酶 优化的培养基为，可溶性淀粉1 2 5 ，牛肉膏2 5 ，玉米浆1 0 ，t w e e n 8 00 1 ； 优化发酵条件为，接种量3 ，发酵培养基的起始p h 为7 0 ，装液量4 0 3 0 0m l ，摇 床2 8 ，2 0 0r m i n ，培养4 0h 。经过发酵条件优化，菌株产酶活力可达61 6 6 6 7u m l 。 酶学性质研究发现，菌株溶菌酶的基本酶学性质为：最适作用温度7 5 ，7 5 下的半衰期为1 7 3m i n ；最适作用p h 值为7 0 ，酶的p h 稳定范围在3 叽1 1 0 之间； 其中，m 矿，m n 2 + ，c u 2 + ，a 1 3 + ，c a 2 + 对溶菌酶水解底物有不同程度的抑制，酶活力 分别下降了4 1 7 ，4 0 8 ，4 0 6 ，1 6 7 ，1 2 5 ，其他金属离子对酶活力基本 没有影响。s d s 对溶菌酶的活性抑制明显，使酶活力下降了3 3 5 。e d t a 使酶活力 升高了1 7 。与鸡卵清溶菌酶相比较，s 2 6 b 溶菌酶对受试菌株有不同程度的抑制和 杀灭作用，抑菌谱比卵清溶菌酶广泛。 关键词：溶菌酶；菌株筛选；菌株鉴定；酶活力测定；发酵优化；酶学性质 s c r e e n i n gf o rm g hl y s o z y m e - y i e l d i n gs t r a i n sa n d t h es t u d i e so nf e r m e n t a t i o no f p r o d u c i n gl y s o z y m e a u t h o r ：l iq i a n s u p e r v i s o f = j i ay m g - m i n m a j o r m i c r o b i o l o g y a b s t r a c t s y s t e m a t i cs t u d yo nt h es c r e e n i n go fl y s o z y m 争y i e l d i n gs t r a i n s ，l i q u i df e r m e n t a t i o no f l a c t a s eh i g hp r o d u c i n gs t r a i ns 2 - 6 ba n da l z y m ep r o p e r t i e sw e r ec a r r i e do u ti nt h i sp a p e r t h em a i nr e s u l t sw g l ea sf o l l o w i n g ： s c r e e n i n go fh i g h y i e l d i n gl y s o z y m es t r a i n s ，t h em e t h o do ft h ep r i m a r ys c r e e n i n gh a s t h r e es t a n d a r d s ，l y t i cz o n eo nt h ed o u b l el a y e rp l a t e s ，l y t i cz o n eo fl i q u i df e r m e n t a t i o n , i d e n t i f y i n gt h ef e r m e n tp r o d u c t , r e s p e c t i v e l y , t h es e c o n ds c r e e n i n gw a sa i z y m ea c t i v i t y a s s a y t h e nw eo b t a i n e dab a c t e r i u mn a m e ds 2 - 6 bf r o mt h eo r c h a r ds o i ls a m p l ef r o m a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t yo fh e b c i i ti n c l u d e dt h a tw ec a nf i n dt h eh i g h - y i e l d i n gl y s o z y m e s t r a i n sb yt h eo p t i m a lm e t h o d t h es t r a i ns 2 6 bw a si d e n t i f i e d t h r o u g ho p t i cm i c r o s c o p ea n ds c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e ，t h es 2 6 b sm o d a l i t y , s i z ew s ao b s e r v e d m o d a l i t y , s i z ea n de o l o u ro fc o l o n y b o t ho nb r o t ha g a rc u l t u r em e d i u mw e r ed e s c r i b e d t h r o u g ht h et r a d i t i o n a lp h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a lt e s t , t o g e t h e r 谢mt h e16 s r d n as e q u e n c ea n d p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，t h e s t r a i ns 2 6 bw a s f i n a l l ya s c e r t a i n e dt ob el y s o b a c t e r ( l y s o b a c t e rs 2 6 b ) t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fl y s o b a c t e rs 2 6 b ，i n c l u d i n gc a r b o ns o u r c e ) n i t r o g e n s o u r c e , i n o r g a n i cs a l t , s u r f a c t a n t ，t e m p e r a t u r e , f o r m a t i o nt i m e , p hv a l u ea n ds oo n , w e r e i n v e s t i g a t e di ns h a k ef l a s kl e v e l t h eo r t h o g o n a lt e s to ft h et h r e ef a c t o r ss h o w e dt h a tt h e o p t i m i z e dc u l t u r em e d i u mw a ss o l u b l es t a r c h1 5 ，m e a t - e x t r a c t2 5 ，c 0 1s t e e p0 5 ， t w e e n - 8 0o 1 t h r o u g hs h a k ef l a s ke x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s f o rs 2 - 6s t r a i nw e r e2 8 i n c u b a t i o n ，i n o c u l u m sl e v e l3 0 ( v v ) ，v o l u m er a t i o 4 0 m l 3 0 0 m l ，s h a k es p e e d2 0 0 r p mf o r m a t i o nt i m e4 0ha n di n i t i a lp h7 5 t h em a x i m a l a c t i v i t yw a s616 7u m lu n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，w h i c hw a sa b o u t3t i m e so ft h e i n i t i a ls t r a i n t h et e s to fc r u d ee 埴l z y m ei n d i c a t e dt h a to p t i m a lt e m p e r a t u r eo fl y s o b a c t e rs 2 - 6 bw a s 7 5 ，t h eh a l fl i f co fr e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s17 3r a i n o p t i m a lp hw a s7 0a n di tw a s s t a b l ea tp h3 0 - 11 0a tr o o mt e m p e r a t u r e t h em e t a li r o n sa n dr e a g e n tm 9 2 + ，m n 2 + ，c u 2 + ， a i 计，c a 十，s d sh a v ei n h i b i t e do nl y s o z y m e e d t ah a sa c t i v a t i o no nl y s o z y m e c o m p a r e d w i t hc h i c k e nl y s o z y m e , t h el y s o b a c t e rs 2 6 bl y s o z y m eh a sm o r ew i d e l ya n t i m i c r o b i a l s p e c t r u m l y s o b a c t e rs 2 - 6 bl y s o z y m ch a sd i f f e r e n te f f e c to ne x p e r i m e n t e db a c t e r i u m k e yw o r d s ：l y s o z y m e ；s c r e e n n i n g ；b a c t e r i a lc l a s s i f i c a t i o n ；l y s o z y m ea c t i v i t ya s s a y ； f e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o n ；l y s o z y m e p r o p e r t i e s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签 签字日期：加动年歹月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑兰堡盎些态堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑兰垦盛些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名彦 导师签名夕复羡民 签字日期：二研年月日 签字日期：略年月，日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 溶菌酶高产菌株的筛选及其产酶研究 1 引言 对溶菌酶( l y s o z y m ee c3 2 1 1 7 ) 的研究，是从尼科耳( n i c o u e ) 1 9 0 7 年发表枯草芽孢杆菌 ( a 舶t l s ) 溶解因子的报道开始的。两年后，拉希琴科( l a s c h t s c h e n k o ) 指出，鸡卵清有强抑 菌作用，是酶作用的结果。1 9 2 2 年，弗莱明( f l e m i n g ) 发现人的鼻涕、唾液、眼泪也有强的溶 菌活性，并把其溶菌作用的因子命名为溶菌酶。此后，溶菌酶在多种生物体中发现，研究也越来 越深入，以至于在生命科学的多种领域尤其是在酶学研究中溶菌酶都是作为一种模式酶来进行研 究的，它是第一个进行氨基酸序列测定的蛋白剧，是第一个借助x 射线衍射确定出立体构造的 酶【2 j ，也是第一种详细阐述作用机制的酶【3 j ，在免疫学及物理化学研究方面，溶菌酶也是一种模 式物质【4 1 。 溶菌酶广泛存在于各种生命体中，是一种有效的抗菌剂，又称为n 乙酰胞壁质肽聚糖水解酶 ( p e p t i d o g l y c a nn - a c e t y l m u r a m u r a m o y l h y d r o l a s e ) ，简称胞壁质酶 1 1 溶菌酶的理化性质 1 1 1 溶菌酶的分布 目前已知溶菌酶在自然界中分布极为广泛，已经发现高等动植物组织及分泌物、原生动物、 昆虫和各种微生物中都有溶菌酶存在【5 1 。 ( 1 ) 动物溶菌酶 鸡卵清中含有相当量的溶菌酶( 约3 4 尸3 5 ) 。鸡蛋壳膜中溶菌酶的含量约为1 3 。火鸡、 鹌鹑、珍珠鸡和鸭，这些鸟类的卵清溶菌酶和鸡卵清溶菌酶的比活性非常相似，但是鹅和黑天鹅 的卵清溶菌酶与其他鸟类卵清溶菌酶差异很大。人溶菌酶的溶菌活性比鸡溶菌酶高3 倍，这两种 酶有着非常相似的多级结构。两栖动物中只有青蛙的腓肠肌肉中含有溶菌酶。蜜蜂，蚜虫溶菌酶 酶活力是鸡卵清溶菌酶酶活的2 0 倍。银色沙蚕溶菌酶，与鸡，人溶菌酶很接近。此外，土壤变 形虫中也发现有溶菌酶。 ( 2 ) 植物溶菌酶 植物中的溶菌酶通常比动物来源的溶菌酶具有较大的分子量( 表1 ) 。除了表中列举的植物， 人们还在萝卜叶【6 】中发现了溶菌酶。 表l 植物溶菌酶 t a b l ell y s o z y m ei np l a n t s 植物溶菌酶分子量 最适p h 最适温度( ) 等电点( p i )其他 木瓜 2 4 6 0 04 5 一105 鸡溶菌酶酶活的1 3 无花果 2 9 1 0 04 6 一一 性质与木瓜溶菌酶相似 芜菁 大麦 菜心【7 】 5 o 4 o 5 8 5 0 _ 一 6 0 9 0 - 9 5 一 热稳定性差 ( 3 ) 微生物溶菌酶 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 人们从上世纪6 0 年代发现微生物也产生溶菌酶，并且进展很快。溶菌酶可以用溶菌谱来作 为酶专一性的主要指标，但由于这类酶的作用机制十分复杂，所以这种分类并不能反映酶的作用 本质，现在以酶的作用性质来进行分类。已知参与微生物细胞壁溶解作用的酶大致可分为作用于 糖苷键和作用于肽和酰胺部分两大类一般把微生物产生的溶菌酶分为7 类： 内n 乙酰已糖胺酶一 这类酶与卵清溶菌酶一样，能分解构成细菌细胞壁骨架的聚糖，是主要的细菌细胞壁溶解酶， 属于糖苷酶型的溶菌酶。包括以下两种酶： 内n 乙酰胞壁酰胺酶( e n d o - n a 螂u r a m i d a s e ) ：水解n - 乙酰胞壁酸( n a m ) 与n 乙酰氨 基葡萄糖( n a g ) 之间的肛l ，4 键。 内乙酰氨基葡萄糖苷酶c e n d o - n - a c 蛾7 1 9 l u e o s a m i n i d a s e ) ：水解n 乙酰氨基葡萄糖( n a g ) 与 n 乙酰胞壁酸( n a m ) 之间的争l ，4 键。 内乙酰胞壁酰胺酶与内- n 乙酰氨基葡萄糖苷酶均是作用于肛1 ，4 糖苷键的溶菌酶。鸡卵清溶 菌酶是内n 乙酰胞壁酰胺酶，当它以甲壳质( 聚n 乙酰氨基葡萄糖) 为底物时，又具有内- n 一乙酰 氨基葡萄糖苷酶的活性。但微生物来源的糖苷酶型的溶菌酶对于甲壳质却无作用，当它作用于肽 聚糖时，不是切开n 乙酰胞壁酸( n a m ) 与n 乙酰氨基葡萄糖( n a g ) 间的p 1 4 键，便是切 开n 乙酰氨基葡萄糖( n a g ) 与n 乙酰胞壁酸( n a m ) 间的争l 4 键，还未发现对二者都能切 开的酶。大多数糖苷型的溶菌酶属于内_ n 乙酰胞壁酰胺酶。 酰胺酶 n 乙酰胞壁酸- l 丙氨酸酰胺酶( n a c e t y l m u r a m y l l - a l a n i n ea m i d a s e 简写m a 酰胺酶) 能切开肽 聚糖与肽之间结合点的酶，又称自溶素( a u t o l y s i n ) ，白色链霉菌g 等所产生的溶菌酶群中含有该 酶，在微生物细胞的自溶作用上起着重要作用。 内肽酶( p e p t i d a s c ) 和蛋白酶 能切开肽聚糖中肽段部分的肽键，单独存在时多少呈溶菌作用，而在有葡聚糖酶共存时可明 显促进真菌细胞壁的溶解。 已经发现3 0 多种具有溶菌作用的微生物内肽酶，如葡萄球菌 e p i d e r m i d e s ) 产生的葡萄球菌 素( l y s o s t a p h i n ) 、白色链霉菌g 所产生的内肽酶、粘杆菌a 王广1 ( m y x o b a c t e ra l - i ) 的内肽酶、堆囊 菌( s o r a n g i u m ) 的a ，b 酶等，均是著名的溶菌性内肽酶。生产这类酶的微生物还有枯草杆菌、无 色杆菌( a c h r o m o b a c t e r ) ，气单孢杆菌( a e r o m o n a s ) 、黄杆菌( f l a v o b a c t e r ) 、巨大芽孢杆菌等等。不 少溶菌性内肽酶的作用位点已清楚。 l ，3 ，p l ，6 葡聚糖酶和甘露糖酶( 葡甘露糖酶) 能分解酵母菌细胞壁。 磷酸甘露糖酶 与p 1 3 ，争1 乒葡聚糖酶和甘露糖酶( 葡甘露糖酶) 共同作用，能分解真菌细胞壁，形成原生质。 壳多糖酶 与葡聚糖酶共同作用，能分解霉菌或酵母菌。 脱乙酰壳多糖酶 主要分解霉菌中的毛霉菌( m u c o r ) 和根霉菌( r h z o p u s ) 。 后四种能分解酵母菌、霉菌的溶菌酶，这些酶多是日本学者发现和精制的。酶来源不同，其 2 溶菌酶高产菌株的筛选及其产酶研究 性质及作用机制略有差异 1 1 2 溶菌酶的分型 根据氨基酸组成、酶催化活性及免疫学交叉反应嘲，可以将溶菌酶分为四个主要的类型：c 型、g 型、t 型及c h 型。 ( 1 ) c 型( c 蚰k 删 代表为鸡卵清溶菌酶( h 啷莉沁l y s o z ”n e ，h e w - l ) ，具有胞壁质酶和壳聚糖酶两种活性， 能分解甲壳质( n a g 的聚合物) ，自然界存在的多种溶菌酶都属于此类型，如脊椎动物、多数鸟类、 少数微生物等产生的溶菌酶。其中鸡卵清溶菌酶研究得最为深入。该酶分子量为1 4 3k d ，等电 点为ii 1 ，由1 2 9 个氨基酸组成，利用x 射线衍射，求得该酶体积4 5 x 3 0 x 3 0 ( r i m 3 ) 。在酶分子 中，- s s 键和t r p 含量较高，其中s s 专e 与酶的稳定性有关，t r p 则是酶与底物结合必需的。3 5 位g l u 和5 2 位a s p 是酶的主要催化基团 9 1 。 ( 2 ) g 型( g o o s e - t y p e ) 代表为鹅卵清溶菌酶( o o o s ee g g - w h i t el y s o z y m e ，g e w l ) ，只有鹅及黑天鹅等少数几个种属于 此类型。与c 型存在很大差异，只有胞壁质酶活性，无壳聚糖活性，不能分解甲壳质，不能分解 细胞壁降解后的四糖产物( n a g - n a m - n a g - n a m ) 。g e w l 分子量为2 0 5k d ，由1 8 5 个氨基酸 组成，s s 键和t r p 含量远小于c 型溶菌酶，稳定性能差，活性中心结构与鸡及其他鸟类的完全 不同，7 3 位g l u 和8 6 位a s p 可能是酶的主要催化基团【1 o 】。 ( 3 ) t 型( t 4 - t y p e ) 代表为细菌噬菌体t 4 溶菌酶( b a c t e r i o p h a g e 3 4l y s o z y m e ，t 4 l ) ，噬菌体产生的能够裂解细菌 细胞的溶菌素多属于此类型。在酶学分类上，t 型溶菌酶多属于胞壁质酶，少数还有酰胺酶、内 肽酶、氨基葡糖苷酶活性。与分解细菌肽聚糖的溶菌酶不同，t 型溶菌酶能作用于荚膜和粘液的 多糖类物质，并与噬菌体感染的周期息息相关。在作用机制上，t 型溶菌酶也与分解细胞壁的溶 菌酶不同，它只能减少菌体的体积，而不能使菌体死绝。t 4 l 分子量为1 8 7k d ，由1 6 4 个氨基 酸组成，ll 位g l u 和2 0 位a s p 是酶的主要催化基团【1 2 0 4 】 ( 4 ) c h 型( c h a l a r o s i s - t y p e ) 代表为拟内串生孢霉( c h a l a r o s i s ) 产生的溶菌酶( c n a l a r o s i sl y s o z t m e ，c h l ) ，此种类型溶菌 酶的研究是在寻找能够分解金黄色葡萄球菌( & a u t e u s ) 的酶的过程中开展起来的。sa u t e u s 的 细胞壁肽聚糖中的n a m6 位羟基的乙酰化结构，使前面三种类型的溶菌酶不能对其发挥作用。 1 9 6 3 年，h a s h 发现了c h a l a r o s i s 产生n ，o 二乙酰胞壁质酶，能够溶解& a u t e u s 的细胞壁，这也 是目前发现的唯一一种能够产生溶菌酶的霉菌。c h l 分子量为2 2 4k d ，由2 11 个氨基酸组成，6 位a s p 和3 3 位g l u 可能参与了酶的催化过程。产生此类溶菌酶的生物主要是细菌噬菌体和革兰 氏阳性细菌，研究的比较透彻的除c h l 之外，还包括肺炎链球菌( s t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e ) 的c p 噬菌体溶菌酶，乳杆菌属( z a c t o b a c i l l u s ) 的m v l 和c a d h 噬菌体溶菌酶以及球孢链霉菌( s t r e p t o m y c e s g l o b i s p o r u s ) 和丁酸梭菌( c l o s t r i d i u m6 “移棚绷) 产生的溶菌酶等【i 引 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 1 3 溶菌酶的作用机理 细菌细胞壁是由骨架物质和胞壁间质组成的，溶菌酶主要作用于骨架物质_ 肽聚糖部分，肽 聚糖是由n a g 和n a m 以b 1 4 糖苷键连接起来的多聚体，并通过连接在n a m 上的短肽链之间 的肽键使聚糖部分交联成网状，以维持细胞的稳定性。各种溶菌酶作用于肽聚糖的不同部分。例 如，胞壁质酶作用于n a g4 位碳原子和n a ml 位碳原子之间形成的肛l 4 糖苷键，自然界中存 在的溶菌酶多属于此类，我们通常所说的鸡蛋清溶菌酶，就是一种内- n 乙酰胞壁质酶。另外， 酰胺酶作用于连接n a m 与短肽链之间的n 乙酰胞壁酰山丙氨酸键，内肽酶、蛋白酶作用于形 成短肽链的肽键等等。溶菌酶发生作用后，由于骨架物质的裂解，细胞壁结构发生塌陷、脱落， 细菌细胞即形成原生质体结构，该结构受到内外渗透压变化影响较大，很容易造成胞内物质泄漏， 最终导致菌体细胞破裂、溶解，直至死亡【1 6 1 7 1 。 不同细菌细胞壁结构差异很大，这不仅表现在非聚糖部分，肽聚糖部分也是如此。这些差异 造成了一种溶菌酶作用于不同细菌时溶菌活性的差异。比如，同样是革兰氏阳性细菌，金黄色葡 萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u $ ) 与溶壁微球菌( m i c m c o c c u sl y s o d e i k t i c u s ) 对某种溶菌酶的敏感性就 有明显区别，能分解溶壁微球菌的酶，一般不能分解金黄色葡萄球菌；能分解金黄色葡萄球菌的 酶一般不能分解溶壁微球菌。通常认为有三种结构在溶菌酶的作用过程中起关键作用，一是肽聚 糖聚糖部分的o 乙酰基，二是肽聚糖中的短肽链结构，三是非聚糖成分。 ( 1 ) 聚糖部分的o 乙酰基 n a m6 位碳原子上的羟基是否乙酰化对溶菌酶特别是胞壁质酶的活性影响很大。一般的溶壁 微球菌( 此l y s o d e i k t i c u s ) 对溶菌酶高度敏感，但这种菌也有一些菌株对溶菌酶呈非敏感性。 b r u m f i t t 等人研究了这些非敏感菌株，发现这类菌株n a m 上被o 乙酰化，作为n 乙酰胞壁质酶 的l y s o z y m e 对其也是无能为力，而拟内串生孢霉( c h a l a r o p s i s ) 产生的溶菌酶c h 是一种n ，0 - - - 乙 酰胞壁质酶( n ，o = d i a c e t y l m u r a m i d a s e ) ，它就能有效地分解& a u t e u s 的细胞壁。 ( 2 ) 肽聚糖中的短肽链结构 短肽链的组成及其交联程度决定了内肽酶和酰胺酶的作用对象，对糖苷酶型溶菌酶( 如胞壁质 酶) 的活性也有一定影响。金黄色葡萄球菌( & a u t e u s ) 对鸡卵清溶菌酶不敏感，其细胞壁短肽链 交联频度较高也是原因之一，这可以用“空间位阻效应”进行解释。 ( 3 ) 非聚糖部分 在革兰氏阳性细菌中，非聚糖成分中的磷壁酸质、链球菌的特异性多糖和a 群链球菌特异性 m 蛋白等微量物质对溶菌酶的作用影响颇为明显，它们的存在与否直接决定了酶分子能否与底物 肽聚糖进行结合。 而在革兰氏阴性细菌中，肽聚糖部分仅占细胞壁的5 砣0 ，它们被脂蛋白、磷脂和脂多 糖等组成的厚厚外膜所包围。一般认为，外膜可阻止膜的渗透，所以一般溶菌酶对多数革兰氏阴 性菌没有作用，但加入e d t a 或胰蛋白酶等物质，把细胞壁外膜的一部分变为可溶或切断外膜脂 蛋白与聚糖之间的连接键，再加入溶菌酶，便会出现显著的溶菌现象。 4 溶菌酶高产菌株的筛选及其产酶研究 1 1 4 溶菌酶的活性中心 多数溶菌酶的活性中心由g l u - 3 5 和a s p - 5 2 组成，此外，t r p - 6 2 ，a s p - 1 0 1 ，t r p - 1 0 8 和a r g - 1 1 4 等氨基酸残基对“底物一酶复合物”的形成也起着重要作用【l 明。通过定点诱变研究，发现残基 g l u - 3 5 和t r p - 1 0 9 之间的范德华力对维护溶菌酶的生物活性具有重要作用。当以a s p 取代残基 g l u - 3 5 后人溶菌酶只保留了很弱的酶活性，而当以a l a 进行取代时，则完全丧失了酶活性。因 此，在溶菌酶活性中心第3 5 位氨基酸残基上的侧链基团对维护溶菌酶的活性具有重要作用。若 残基t r i m 0 9 为p h e 或a l a 进行取代时，则导致入溶茵酶分子的结构发生重大变化。所以残基 g l u 3 5 和t r p - 1 0 9 之间的范德华力决定了人溶菌酶的生物活性。 木瓜溶菌酶的活性中心除包括g l u 3 5 。a s p - 5 2 外，还需要一个c y s 。而残基t r p 并不参与酶 与底物的结合。木瓜溶菌酶受组胺强烈抑制，同时也受n 乙酰葡糖胺的强烈抑制，这一点与卵清 溶菌酶的性质相近1 1 9 】。利用p h 动力学和化学修饰等方法对萝卜溶菌酶的活性中心研究发现，活 性中心由g l u 。a s p 残基的羧基，t r p 及h i s 残基共同构成，巯基s h 不参与酶活性中心的形成。 与卵清溶菌酶的特性不同的是。萝卜溶菌酶受组胺显著抑制，但基本上不受n 乙酰葡糖胺的抑制 2 0 , 2 1 1 1 5 酶活力测定 溶菌酶活性的测定方法通常有2 种： ( 1 ) 以溶壁微球菌培养液或冻干粉为底物，用作用前后浊度的变化表示溶菌酶活性程度。 ( 2 ) 以细胞壁为底物，用作用前后浊度的变化表示溶菌酶活性程度。 但以上方法是固液两相反应，难以准确测定反应速度。后来，有人对测定方法进行了改进， 用水溶性多糖乙二醇甲壳质制备成均匀状态底物，用来测定溶菌酶活性蚴。 1 1 6 溶菌酶的抑菌谱 不同溶菌酶的抑菌谱不同，一般地对革兰氏阳性菌的抑菌效果最为显著，研究证实鸡蛋清溶 菌酶对溶壁微球菌、黄色八叠球菌、枯草芽孢杆菌和生孢梭菌等有良好溶菌作用。其中，溶壁微 球菌是目前用来检测溶菌酶生物活性的模式试验菌株。鸡蛋清溶菌酶的抗菌谱还不广泛，若单独 使用则对革兰氏阴性菌的抑制作用并不明显。如果能将溶菌酶与甘氨酸或e d t a 等结合使用，则 对抑制或杀灭单核增生李氏菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、副溶血弧菌等有显著作用 5 1 。 微生物来源的溶菌酶大多数能够溶解金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性细菌，但有些菌株只能溶 解阴性的绿脓杆菌。同时，各种细菌细胞壁中的肽聚糖对细胞壁溶解酶的敏感性是因细胞壁的组 成与构造而异的。同一种酶对同一种微生物细胞壁的作用，也受到该微生物的培养条件的影响， 处于对数生长期的的菌体，细胞壁中肽聚糖含量最低，对溶菌酶最敏感，同时细胞与离体细胞壁 对溶菌酶的抵抗性也不同。将细胞用酸，碱，加热，冰冻或表面活性剂、丙酮等处理，可使许多 对溶菌酶有抵抗性的细菌变成容易溶解，尤其对革兰氏阳性菌更为明显，例如：添加碱，- - y 大大 促进溶菌酶的作用，使不少抗性菌株象沙门氏菌、志贺氏菌和铜绿假单胞菌、大肠杆菌等充分溶 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 解。此外，植酸钙、氨基酸，有机酸等可增强蛋清溶菌酶的作用，而c m c 、果胶、琼脂等可削 弱溶菌酶的作用。 1 2 国内外溶菌酶的研究进展 近年来，国内外对溶菌酶的研究主要集中在不同种类溶菌酶的作用机制，基因特性、构建工 程菌株和蛋白质化学等方面。大多研究重点是微生物中异质表达溶菌酶，获得酶活力更高的溶菌 酶，并将其分离纯化，大量用于食品工业。近年来有报道表明，卵清溶菌酶基因可以作为表达外 源蛋白的载体。国内相关研究主要集中在人、动物及植物来源的溶菌酶，对这些溶菌酶进行分子 生物学研究，其中研究较多的是卵清溶菌酶，例如对其基因克隆及高效转基因工程菌株的构建。 应用方面研究，主要包括比较溶菌酶与其他生物防腐剂、化学防腐剂的作用效果异同和抑菌范围， 以及工业生产中提取工艺的优化等。 1 2 1 产溶菌酶微生物选育研究 从上世纪3 0 年代开始，科学家逐渐从微生物中寻找能够产生裂解菌体细胞或芽孢的酶。在 这方面日本学者的贡献较大。1 9 3 6 年，麦耶等人发表了微生物有溶菌活性的报道。同年，威尔士 ( w e l s c h ) 等人，从土壤中分离出了土壤微生物 后来鉴定是白色链霉菌( s t r e p t o m y c e sa l b u sg ) 1 ， 它产生的溶菌酶能够溶s a u r e u s 。五十年代以后，国际上有关链霉菌产生溶菌酶的报道层出不穷， 由于该菌产生的溶菌酶多属于c h 型( 拟内串生孢霉产的溶菌酶) ，溶菌谱比其他类型的溶菌酶广 泛，因此得到了广大学者的重视。七十年代，日本学者对微生物尤其是链霉菌产生的溶菌酶进行 了大量细致的工作，并且卓有成效。h e y m e r 等人( 1 9 7 5 ) 从一株s a l b u s 的培养液中纯化出一种 内- n 乙酰胞壁质酶，它能够作用于大肠杆菌，已有人利用该酶处理a 族链球菌细胞壁制备多种 免疫佐剂。有报道显示灰色链霉菌h - 4 0 2 菌株、p - 5 1 菌株可以产生溶菌谱较广的溶菌酶。w a r d 等人( 1 9 6 8 ) 发现的& 神a 岱可以产生e i 和e 2 两种酶，均为c h 型。其中e 1 分子量为1 1 8 k d ， 等电点为8 5 1 0 0 ；e 2 分子量1 3 5k d ，等电点1 0 左右，分解& a l r e l s 最适p l - i 值为7 8 。1 9 8 8 年，z i n k e v i c h i u t e 等人也报道了s g r s e u s 可产溶菌酶，z i n k e v i c h i u t e 等人通过分级沉淀的方法从 一株s g r s e u s 发酵液中获得溶菌酶纯品，该酶溶菌谱较窄，对链球菌、葡萄球菌活性较高，等电 点为8 一1 0 5 。v o l k e r 等研究发现通过向培养基中添加细胞壁来诱导增加发酵产m u t a n o l y s i n 的量。 八十年代以后，该菌产生的溶菌酶开始作为一种工具酶出现在生命科学的各个领域，并在食品防 腐、医疗保健等行业发挥独特作用 2 3 - 2 7 1 。 到目前为止，国内学者对细菌溶菌酶进行了详细研究，其中许多有重要价值。山东大学采用 双层平板法( 指示菌为溶壁微球菌) 筛选出产溶菌酶灰色链霉菌，酶活力达到1 8 0 u m l ，并对灰 色链霉菌r x 1 7 溶菌酶分离纯化及酶学性质进行研究，发现灰色链霉菌r x - 1 7 的发酵液中含有 两种溶菌酶r 1 ，r 2 。r 1 分子量为1 6 8k d ，最适作用温度5 5 ，最适p h 值为6 0 。r 2 分子量 为2 4 8k d ，最适作用温度7 0 ，最适p h 值为7 0 t 2 s 3 2 1 。除了上述菌株之外，在红霉素链霉菌 ( & e r y t h a e u s ) 、光滑( 制酵母) 链霉菌( $ 1 e v o r i s ) 、墨西菲链霉菌( sr e c i f e n s i s ) 、吸水链霉菌 ( s h y g r o s c o p i c u s ) 以及天蓝色链霉菌( & c o e l i c o l o r ) 中均有产溶菌酶的报道。中国海洋大学采 6 溶菌酶高产菌株的筛选及其产酶研究 用金黄色葡萄球菌为指示菌从海洋淤泥中筛选出蜡状芽孢杆菌s - 1 2 - 8 6 ，酶活力为3 1u m l ，并 对纯化后溶菌酶性质研究表明，该酶分子量约为3 9k d ，对溶壁微球菌的最适作用温度为3 5 ， 最适作用p h 为8 o ，在5 0 以下和p h5 帖1 0 0 之间都有较好的稳定性，与常见金属离子和化学 试剂有良好的配伍性，广谱杀菌，对多种致病菌也有较强的溶菌作用 3 3 - - 3 5 1 。 产溶菌酶的微生物主要分布于芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、链霉菌属( s t r e p t o m y e e s ) 、乳球菌属 ( l a c t o c o c c u s ) 、链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 、梭菌属( c l o s t r i d i u m ) 、假单孢菌( p s e u d o m o n a s ) 等。其中国内对于微生物来源的溶菌酶研究较少，主要集中在链霉菌属和芽孢杆菌属。但所研究 菌株产酶能力低，无法达到应用要求。 目前微生物溶菌酶种类包括：( 1 ) 溶葡萄球菌素( l y s o s t a p h i n ) 它可以有效的抑制金黄色 葡萄球菌，研究发现它对感染金黄色葡萄球菌的实验动物有一定免疫效果，并能减少致病菌数量。 ( 2 ) 变链球菌素( m u t a n o l y s i n ) ，链霉菌属中球孢链霉菌( s t r e p t o m y c e s 咖6 卸d ，凇1 8 2 9 ) 产生的， 它可以快速裂解致龋齿的变链球菌( s t r e p t o c o c c u sm u t a n s ) ，通过对培养基成分和发酵条件的优化 后，酶活力可以达到2 4 0u m l 。m u t a n o l y s i n 中的四种主要成分是n 乙酰胞壁质酶m l 和m 2 ，a m 3 内肽酶以及n 乙酰胞壁酰山丙氨酸酰氨酶。在这四种组分中，m 1 和m 2 起主要作用，其中m 1 具 w n ，o 二乙酰胞壁质酶活力，可能属c l l 型溶菌酶，而m 2 更接近于c 型( 卵清溶菌酶) 3 6 - - 3 s 1 。( 3 ) 芽孢裂解酶( s p o r ep m ) r t e x 1 蛳ce n z y m e s ) ，这种酶已经从巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) ，蜡 状芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) ，产气夹膜梭菌( c l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s ) 中纯化得到。通过对枯草 芽孢杆菌芽孢皮层肽聚糖及菌株生长曲线研究发现至少存在三种酶对芽孢的水解起作用，其中包 括：葡萄糖苷酶( g l u c o s a m i n i d a s e ) ，水解转糖基酶( 1 y r i ct r a n s g l y c o s y l a s e ) 和一种并无水解效用 的差相异构酶。 一般认为，溶菌酶对革兰氏阳性菌的抑菌效果最为显著，已有研究证实它对溶壁微球菌 ( m i c r o c o c c u sl y s o d e i k t i c u s ) 、黄色八叠球菌( s a r c i n a f l a v a ) 、巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) 、 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 、丁酸梭菌( c l o s t r i d i u m b u t y r i u m ) 、生孢梭菌( c l a s t r i d i u ms p o t o g e n e s ) 、酪丁酸梭菌( c l o s t r i d i u mt y r o b u t y r i u m ) 、金黄色 葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 等有良好溶菌作用。其中，溶壁微球菌是目前用来检测溶菌酶 生物活性的模式试验菌株。 1 2 2 溶菌酶理论的研究 在过去很长一段时间中，溶菌酶一直被当作一种理想的模型，用于蛋白质的空间构象、酶动 力学及分子进化等方面的研究，其中有许多关于蛋白晶体及蛋白质结构与功能关系研究进展都是 通过对溶菌酶的研究而获得的。其中，卵清溶菌酶( c h i n k e nl y s o z y m ec l ) 是酶学领域中研究得 最透彻的一个蛋白质分子，也是目前蛋白质热力学稳定性研究领域中最好的模式蛋白。通过氨基 酸的定点突变研究，发现溶菌酶的热力学稳定性与氨基酸残基侧链的大小和疏水性密切相关。各 种不同作用机制的溶菌酶已成为研究多种细菌细胞壁结构的重要实验工具。 近年来，a b d e l m a d j i da t r i h 等研究芽孢外壁溶解酶对枯草芽孢杆菌芽孢的热稳定性以及耐碱 性，发现这种酶能明显削弱芽孢的耐热和耐碱性，并且减少芽孢形成数量。h c h i r a k k a l 等人对芽 孢外壁溶解蛋i 兰i s i e b 和c w l j 酶学性质、作用机理以及编码序列特征进行研究。a m i n ai a t r t o v i c 等 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 报道通过测定溶菌酶的活性和对2 脱氧葡萄糖的敏感性来鉴别不同来源的s t r e p t o c o c c u sb o v b 。 a s t r i dr a u 等报道t s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r p ：生的溶菌酶的分子空间结构以及氨基酸顺序。还有报 道表明，溶菌酶是研究细菌细胞壁免疫生物学活性的重要因素。目前已从鸟类蛋清和哺乳动物中 分离出超过2 0 种不同氨基酸序列的溶菌酶，其中有8 种动物溶菌酶已经由x 射线晶体学方法确定 了其三维空间结构，这些对维持酶活性的稳定及未知的生物学功能有重要作用。 1 2 3 分子生物学研究 关于微生物来源溶菌酶的工程菌株报道中，链霉菌属较多。对该属研究主要目的是在微生物 中异质表达溶菌酶，并将其分离、纯化，为大量用于食品工业提供了可能。有报道表明溶菌酶的 基因结构较为复杂，溶菌酶前体基因序列的长度是成熟m r n a 序列长度的7 倍。对卵清溶菌酶 的研究发现，在外显子