（发育生物学专业论文）拟南芥种子发育过程中shb1基因的表达与功能分析.pdf

英文缩略表 英文缩写英文名称中文名称 a m p 陋p b p c a l 江v 3 5 s c k c d n a d d h 2 0 d e p c d m s o d n a d n t p e b e d t a f a a g m g u s n y g a m p i c i l l i n a d e n o s i n et r i p h o s p b a t e b a s ep a i r p r o m o t e ro fc a l i f l o w e rm o s o i cv i r u s c o n t r o l c o m p l e m e n t a r yd n a d i s t i l l e da n dd e i o n i z e dw a t e r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i m e t h y ls u l p h o x i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y f i b o n u e l e o s i d et r i p h o s p h a t e d h i d i u mb r o m i d e d i s o d i u me t h y l e n d i a m i n e t e t r a e e t a t e f o r m a l i n a c e t i ca c i d g e r m i n a t i o nm e d i u m p - g l u e u r o n i d a s e h y g r o m y c i nb 氨苄青霉素 腺苷三磷酸 碱基对 花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子 对照 互补d n a 重蒸水 焦碳酸二乙酯 二甲基亚砜 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 福尔马林固定液 萌发培养基 d 葡萄糖苷酸酶 潮霉素 i p t g i s o p r o p y l 廿l i 。1 3 - d - g a l 矗t 。s i d e 嚣暑基书- d _ 硫代半乳 k a c k a r l l b k a n a m y c i n l u r i a b e r t a n im e d i u m 醋酸钾 卡那霉素 l b 培养基 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 日期： 盟章谚姐缉舭趣盈瑚盈盈凇 山东农业大学硕士学位论文 摘要 种子是人类粮食的重要来源，有些植物的种子还是重要的工业原料， 与人类的生产生活密不可分。因此，通过遗传学和分子学手段提高种子产 量具有重要的现实意义。种子大小是影响产量的主要因素之一，以拟南芥 作为模式植物，研究调控种子大小的分子机理和寻找控制种子大小的基 因，不仅具有重要的理论价值，而且还可将其应用于实践，对提高种子产 量起着至关重要的作用。拟南芥功能获得突变体s h b l - d 的种子明显较野 生型的大，功能缺失突变体s h b l - l 的种子稍微比野生型的小。本实验通 过对这两种突变体在控制种子大小方面的研究，初步得出了如下结果和结 论： 1 s h b l - d 突变体胚的细胞面积和细胞数目增加 对成熟胚细胞大小及细胞数目的分析结果显示，与w a s s i l e w s k i j a ( w s ) 野生型相比，s h b l - d 突变体胚的细胞面积和细胞数目都增加；s h b l - l 缺 失突变体胚的细胞面积与细胞数目与c o l u m b i a ( c 0 1 ) 野生型相比，略有 变小。 2 砌6 j 国突变体种子的发育时期延迟 对授粉后同一时间突变体与野生型种子的发育时期进行了对比分析， 研究发现s h b l - d 突变体胚的发育较w s 野生型延迟；s h b l - l 突变体胚的 发育时期与c o l 野生型基本_ 致。 3 s h b j 基因在多种器官中表达 g u s 报告基因在s h b l 启动子驱动下的表达结果显示，在拟南芥的花、 成熟花粉粒、花粉管、小苗及未授粉胚珠中具有g u s 信号积累，证明s h b l 基因在拟南芥植株的多种器官中表达。m r n a 原位杂交结果显示该基因在 不同发育时期的胚和胚乳中表达，表明s h b l 基因在种子发育过程中可能 起重要的调控作用。 4 s 肋j - d 突变体胚乳的细胞化延迟 拟南芥种子发育过程中s h b l 基因的表达与功能分析 对授粉后5 天以及胚发育处于相同时期的s h b l - d 突变体和w s 野生 型种子进行组织切片分析，结果表明这两种条件下，野生型种子的胚乳已 经开始细胞化，而突变体种子的胚乳依然没有细胞化，推测可能是突变体 胚乳细胞化的延迟导致了种子体积的变大。 以上结果表明s h b l 基因参与了对拟南芥种子大小的控制。在s h b l - d 功能获得突变体中，s h b l 基因过量表达，使得种子变大。该研究发现了 一个对种子大小有正调控作用的基因，为深入研究种子大小决定的机理提 供了重要资料。 关键词：拟南芥；s h b l - d 功能获得突变体；s h b l - l 功能缺失突变体；种 子大小；胚乳细胞化 2 山东农业大学硕士学位论文 e x f a n df u m ；t i o na n a l y s i s s h b lgemexpressiona n df u n c t i o na n a l y s i so fe n es h b d u r i n ga r a b i d , ，p s i ss e e dd , p l o m e n d u r i n ga r a b i d o p s i s e e dd e v e p l o m e n t a b s t r a c t s e e d sa r et h em o s ti m p o r t a n tr e s o u r c e so fh u m a nf o o d ，a n ds o m es e e d s a r es i g n i f i c a n ti n d u s t r i a lm a t e r i a l s ，w h i c hh a sac l o s er e l a t i o n s h i pw i t hh u m a n l i f ea n dp r o d u c t i o n t h e r e f o r e ，i m p r o v i n gt h es e e dy i e l db yv a r i o u sg e n e t i c a n dm o l e c u l a rm e t h o d sh a sa ni m p o r t a n tr o l e s e e ds i z ei so n eo ft h em a i n f a c t o r st oa f f e c ts e e dy i e l d u s i n ga r a b i d o p s i sa st h em o d e l p l a n t ，s t u d y0 1 1t h e m o l e c u l a rm e c h a n i s ma n d f i n d i n gn e wg e n e st o c o n t r o ls e e ds i z eh a v e i m p o r t a n tt h e o r e t i c a lv a l u e sa n dc a nb eu s e dt op r a c t i c e ，w h i c hp l a y sa c r u c i a l r o l ei nt h ei m p r o v e m e n to fs e e dy i e l d s e e d so fag a i n - o f - f u n c t i o nm u t a n t s h b l - d , a r el a r g e rt h a nt h a to fw a s s i l e w s k i j a ( w s ) w i l dt y p e w h i l es e e d so fa l o s s - o f - f u n c t i o nm u t a n ts h b l - l ，a r es l i g h t l ys m a l l e rt h a nc o l o m b i a ( c 0 1 ) w i l d t y p e t h r o u g ht h es t u d yo ft h et w ok i n d so f m u t a n t si nt h ec o n t r o lo fs e e ds i z e ， f o l l o w i n gr e s u l t sa n dc o n c l u s i o n sw e r eo b t a i n e d ： 1 b o t he m b r y oc e l ls i z ea n dc e l ln u m b e ra r ei n c r e a s e di ns h b l - dm u t a n t a n a l y s i so fc e l ls i z ea n dc e l ln u m b e ri nm a t u r ee m b r y o si n d i c a t e dt h a t b o t hc e l ls i z ea n dc e l ln u m b e rw e r ei n c r e a s e di ns h b l - dm u t a n te m b r y o s c o m p a r e dw i t hw sw i l dt y p e ，一a n db o t ho ft h e mw e r es l i g h t l yr e d u c e di n s h b l - lm u t a n te m b r y o s 2 s e e dd e v e l o p m e n ts t a g e sa r ed e l a 3 ；e di ns h b l - dm u t a n t c o m p a r a t i v ea n a l y s i sb e t w e e ns h b l - dm u t a n ta n d 脓w i l dt y p es e e d sa t t h es a m et i m ea f t e rp o l l i n a t i o ns h o w e dt h a tt h ee m b r y od e v e l o p m e n ts t a g ei n s h b l - dm u t a n ti sl a t e rt h a nt h a to fw sw i l dt y p e ；w h i l et h ep r o g r e s so f e m b r y o d e v e l o p m e n ti ss i m i l a rb e t w e e ns h b l - lm u t a n ta n dc o lw i l dt y p e 3 e x p r e s s i o no ts h b li nd i f f e r e n to r g a n s 3 拟南芥种子发育过程中s h b l 基因的表达与功能分析 t ou n d e r s t a n dt h ee x p r e s s i o np a a e r no fs h b lg e n e ，w ee x a m i n e dt h e e x p r e s s i o no fb e t a - g l u c u r o n i d a s e ( g u s ) g e n ed r i v e nb yt h es h b lp r o m o t e r t h eg u ss i g n a lw a sd e t e c t e di nf l o w e r s ，m a t u r ep o l l e ng r a i n s ，p o l l e nt u b e s ， s e e d l i n g sa n dp r e - p o l l i n a t e do v u l e s t h i sd a t ai n d i c a t e st h a ts h b li se x p r e s s e d i nd i f f e r e n to r g a n s i n s i t uh y b r i d i z a t i o ne x p e r i m e n tr e v e a l e dt h a ts h b lw a s e x p r e s s e di ne m b r y o sa n de n d o s p e r ma td i f f e r e n td e v e l o p m e n ts t a g e s t h e s e r e s u l t ss u g g e s tt h a ts h b li si n v o l v e di nt h ec o n t r o lo fs e e dd e v e l o p m e n t 4 d e l a y e de n d o s p e r mc d l u l a r i z a t i o no f s h b l - dm u t a n t c y t o l o g i c a la n a l y s i ss h o w e dt h a te n d o s p e r mo fw sw i l dt y p eh a sb e e n c e l l u l a r i z e d ，w h i l ee n d o s p e r mo fs h b l - dm u t a n th a sn o tb e e nc e l l u l a r i z e da t5 d a y sa f t e rp o l l i n a t i o n , a n da tt h ee a r l y - h e a r te m b r y os t a g e t h i sr e s u l tr e v e a l s t h a td e l a y e de n d o s p e r mc e l l u l a r i z a t i o nm a yc a u s ep r o d u c i n gl a r g e rs e e d s t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e t h a ts h b lg e n ei si n v o l v e di nt h ec o n t r o lo f a r a b i d o p s i ss e e ds i z e s h b l g e n ei so v e r e x p r e s s e di n s h b l - dm u t a n ta n d r e s u l t si nl a r g e rs e e d s o u rd a t ap r o v i d e di m p o r t a n ti n f o r m a t i o nt o 如吡e r s t u d yt h em e c h a n i s m o fs e e ds i z ed e t e r m i n a t i o n k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i s ；s h b l - dg a i n o f - f u n c t i o nm u t a n t ；s h b l - l l o s s - o f - f u n e f i o nm u t a n t ；s e e ds i z e ；e n d o s p e r me e l l u l a r i z a t i o n 4 山东农业大学碗士学位论文 1 引言 种子与人类的生活有着极为密切的关系。富含淀粉、蛋白质的水稻、 小麦、玉米等作物的种子，是人类赖以生存的食粮；大豆、花生、油菜、 芝麻等的种子含油量高，是食用油的主要来源：可可、咖啡的种子可作饮 料；蓖麻、巴豆等的种子具有药用价值。因而提高种子的产量和质量对于 改善人类生活水平起着非常重要的作用( 徐汉9 即等，1 9 9 5 ) 。遗传改良或 基因工程是提高种子产量的有效手段之一。寻找与高产相关的功能基因对 作物高产育种具有重要的理论意义和应用价值。种子大小是决定作物产量 的重要因素之一，相关分子遗传调控机理目前了解的还不够透彻。深入了 解调控种子大小的分子机理，将有助于以后利用基因工程的手段提高作物 产量。 1 1 被子植物种子的发育 被子植物的花经过传粉、受精之后，雌蕊内的胚珠逐渐发育成为种子。 种子通常由胚、胚乳和种皮三部分组成，胚和胚乳经过双受精现象发育而 来，种皮则由珠被发育而来。花粉管到达胚囊后，由一个退化助细胞的丝 状器基部进入。另个助细胞可短期暂存也可相继退化。随后，花粉管顶 端或亚顶端的一侧形成一个小孔，释放出营养核、两个精细胞和花粉管物 质。其中一个精细胞与卵细胞融合形成合子，将来发育成胚；另一个精细 胞与中央细胞的两个极核融合形成初生胚乳核，将来发育成胚乳。这种现 象称为双受精现象。 二舅鞠例。刘渤 啦“酬m d o _ 山d 蚰口l o 山a 如碰 w a 加持5 h d 圈1 i 模式植物拟南芥的种子发育过程示意图( v e n k a t e s a i i ，2 0 0 5 ) 。 群一 拟南芥种子发育过程中s h b i 基因的表达与功能分析 ( 左边) 未授粉胚珠包括一个单倍体卵细胞和两个单倍体的中央细胞，外面由母本组织珠被包裹 ( 中间) 种子由双受精发育而来：卵细胞与中央细胞分别与花粉管中的两个单倍体精细胞融含 种子的生长受来自中央细胞的三倍体胚乳的迅速分裂而驱动，同时伴随着珠被的伸长来源于卵 细胞的二倍体胚的生长滞后。( 右) 在成熟种子中，胚发育成熟，代替了大部分胚乳。珠被分化成 外面的种皮 f i g 1 - ls c h e m a t i cs k e t c ho f s e e dd e v e l o p m e n ti nt l l cm o d e lp l a n t a r a b i d o p s i s ( t e f t ) t h eu n f e r t i l i z e do v u l ec o n t a i n st h eh a p l o i de g gc e l la n dt h ed o u b l eh a p l o i dc e n t r a lc e l l ，e n c l o s e d w i t h i nt h em a t e r n a lt i s s u eo f t h ei n t e g u m e n t s ( c e n t ) s e e dd e w e l o p m e n tf o l l o w sd o u b l ef e r t i l i z a t i o no f t h ee g ga n dc e n t r a lc e l l sb yt h et w oh a p l o i ds p e r mc e l l sw i t h i nt h ep o l l e n 鼬。g r o w t ho ft h es e e di s d r i v e nb yr a p i dd i v i s i o n so ft h et r i p l o i de n d o s p e r md e r i v e df r o mt h ec e n t r a lc e l l , a c c o m p a n i e db y e l o n g a t i o no f t h em a t e r n a li n t e g u m e n t s t h eg r o w t ho f t h ed i p l o i de m b r y od e r i v e df r o mt h ee g gc e l ll a g s b e h i n d ( r i g h t ) i nt h em a t u r cs e e d , t h ee m b r y oh a sg r o w nt of u l ls i z e , r e p l a c i n gm o s to ft h ee n d o s p e r m , a n dt h ei n t e g u m e n t sh a v ed i f f e r e n t i a t e di n t ot h es e e dc o a t 1 1 1 被子植物胚的发育 被子植物的卵细胞在受精之后形成二倍体的合子。胚的发育从合子开 始，合子形成后通常需经过一段时间的休眠期。合子通过休眠后，便开始 进行分裂。受精卵的第一次分裂均为横向不均等分裂，形成大小不等的两 个细胞，近珠孔的细胞较长，高度液泡化，称为基细胞；远珠孔的细胞较 小，细胞质浓，称为项细胞。随后，基细胞产生的细胞继续进行多次横向 分裂，形成单列多细胞的胚柄备在胚柄的生长过程中，顶细胞相应进行分 裂，首先发生一次纵向分裂，接着进行与第一次壁垂直的第二次纵向分裂， 形成包含4 个细胞的四分体胚；紧接着每个细胞进行一次横向分裂，产生 由8 个细胞组成的八分体胚；然后，这8 个细胞各进行一次平周分裂，形 成8 个外层的原表皮细胞和8 个内层细胞，得到包含1 6 个细胞的早期球 形胚。胚体继续增大，在顶端两侧部位的细胞分裂较多，生长较快，形成 两个突起，称为子叶原基，此时整个胚体呈心形。继而子叶原基生长延伸， 形成两片形状大小相似的子叶，紧接子叶基部的胚轴也相应伸长，整个胚 体呈鱼雷形。以后，在两片子叶基部相连处的凹陷部分分化出胚芽j 与胚 芽相对的一端，由胚体基部细胞和与其相接的一个胚柄细胞不断分裂，共 6 山东农业大学硕士学位论文 同参与胚根的分化，至此，幼胚分化完成。随着幼胚的发育，胚轴和子叶 显著延伸，最终，成熟胚在胚囊内弯曲呈马蹄形，胚柄退化消失。下图是 十字花科拟南芥的胚胎发育过程模式图( 蒋丽等，2 0 0 7 ) ： m + f 哼。聱一 bcd e f g 图1 2 双子叶植物拟南芥的胚胎垃育过程。 ( a ) 伸长期台于，( b ) 合于经过第一次分裂，产生i 十顼细胞( 绿色) 和一个基细胞( 粉红色) ： ( c ) 四丹体胚：顶细胞经历2 扶纵向分裂，产生吉有4 个细胞的胚体和2 个细胞的屉柄 ( d ) 1 6 细胞球形胚。8 细胞胚的所有细胞经过l 攻平周分裂，产生包含8 个细胞的表皮矩和8 个细胞的内部组绠；( e ) 早期心形胚，( f ) 心形胚子叶和胚根原基已经出现 g ) 成熟胚胎。 1 ：顶细胞；2 。基细胞，3 ：胚根原细胞。形成来来的r o c 和根冠中央区，r m ：根尖生长点s m ：茎 尖生长点。 f i g1 - 2e m b r y o g e n e s i so f d i c o t y l e d o n a 7 yp l a n t s “r a $ i d o p s m ( ) e l o n g a t e dz y g o t m ( b ) t h cf i r s td i v i s i o no f t h ez y g o t e p r o d u c i n g 如a p i c a l l 【( g r e e n ) 加da b 啪l c e l l ( p i n k ) ；( c ) q u a d r 卸te m b w o ：t h ea p i c a lc e i li n ( b ) d i v i d t w i c el o n g i t u d i n a l l y ，p r o d u c i n ga4 - c e l l e m b 口o ；( d ) a1 6 - c e l lg l o b u l a re m b r y o ：d e r i v e df r o ma n8 - c e l le m b r y oa 加rap e r i e l l n a ld i v i s i o ni n e v e r yc e l l ；( e ) e a r l yb c 缸一s h a p e de m b r y o ；( f ) h e a r t s h a p e de m b q o w i t hv i s i b l ec o t y l e d o n 肌di 0 0 t p r l m o r d i a ；( g ) m b 口o i ：a p i c a lc e i l ；2 ：b a s a lc e l t ；3 h y p o p h y s i s p r o d u c i n gr o ca n dc e n t r a lr e g i o no f t h em o tc a p ；r mr o o t m e r l m e ms m ：s h o o ta p i c a l m e d s t e m 11 2 被子植物胚乳的发育 被子植物胚乳的发育是从初生胚乳核即受精极核开始。初生胚乳核一 般是三倍体结构，胚乳核初期分裂速度较快因此，当合子进行第一次分 裂时，胚乳核已达到相当数量。胚乳的发育进程较早于胚的发育，为幼胚 拟南芥种子发育过程中s h b l 基因的表达与功能分析 的生长发育和正在萌发的小苗及时提供必需的营养物质。 胚乳发育的几种不同模式已经得到阐述，一般分为核型胚乳和细胞型 胚乳两种基本类型。其中核型胚乳是最普遍的模式，常见于拟南芥和许多 重要粮食作物中。核型胚乳的发育主要包括两个时期：合胞体时期和随后 的细胞化时期( l o p e sa n dl a r k i n s ，1 9 9 3 ；o l s e na n db r o w n , 1 9 9 5 ) 。在胚乳 发育早期，胚乳核和以后核的多次分裂，都不相伴产生细胞壁，众多细胞 核游离分散于细胞中，产生一个多核细胞合胞体。每个核由一个胞质球 和放射状的微管系统围绕，组成了一个核质域( n c d ) 。在合胞体末期， 随着游离核的增多和胚囊内中央液泡的形成与扩大，游离核连同细胞质被 挤向胚囊的周缘，胚乳由在细胞质内围绕大的中央液泡的一层n c d 组成。 在种子发育的一个特定时期，胚乳开始细胞化。细胞化的胚乳分化成几种 行使不同功能的细胞类型( l o p e sa n dl a r k i n s ，1 9 9 3 ；o l s e n , 2 0 0 1 ，2 0 0 4 ) 。 在拟南芥中，胚乳细胞化发生在胚发育形态正在转变的种子当中 ( m a n s f i e l da n db r i a r t y ，19 9 0 ；b r o w ne ta 1 ，19 9 9 ；b o i s n a r d - l o r i ge ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。在合胞体时期，拟南芥胚乳分化成三个不同的区域：在珠孔端围 绕胚的珠孔胚乳区m i c r o p y l a re n d o s p e r m ( m c e ) ，合点端的合点胚乳区 c h a l a z a le n d o s p e r m ( c z e ) 以及位于珠孔胚乳与合点胚乳之间的外周胚乳 区- p e r i p h e r a le n d o s p e r m ( p e n ) ( m a n s f i e l da n db r i a r t y ，1 9 9 0 ；b r o w ne ta 1 ， 1 9 9 9 ，2 0 0 3 ；b o i s n a r d l o f i ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。细胞化首先发生在珠孔胚乳区， 然后是外周胚乳区，合点胚乳区和靠近合点胚乳区的外周胚乳区不发生细 胞化( m a n s f i e l da n db r i a r t y ，19 9 0 ；b r o w ne ta 1 ，19 9 9 ；n g u y e ne ta 1 ，2 0 0 0 ； b o i s n a r d l o r i ge ta 1 ，2 0 0 1 ；s o r e n s e ne ta 1 ，2 0 0 2 ；g u i t t o ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 。其中 外周胚乳区( p e n ) 的细胞化发生在胚乳细胞核第八次有丝分裂之后 ( s o r e n s e ne ta 1 2 0 0 2 ) 。 1 1 。3 被子植物种皮的发育 种皮位于种子的最外层，是由珠被发育而来的保护结构。拟南芥具有 两层珠被，外珠被发育成外种皮，内珠被发育成内种皮。成熟种子的外表 一般可见到种脐、种孔和种脊等结构。种脐是种子成熟后脱离种柄或胎座 而在种皮上留下的疤痕，通常呈椭圆形或圆形。种孔由胚珠上的珠孔发育 8 山东农业大学硕士学位论文 形成，种子萌发时通过种孔吸收水分，胚根从此孔伸出。种脊由珠脊发育 而来，位于种脐的一侧，是倒生胚珠的外珠被与珠柄愈合形成的纵脊遗留 下来的痕迹，其内有维管束贯穿。 1 2 影响种子发育的因素 被子植物经双受精之后形成了二倍体的胚和三倍体的胚乳，种子发育 就以胚和胚乳的迅速生长为标志，直到种子成熟。同时，母本胚珠也经历 相应的生长来适应胚乳和胚的生长，胚珠的珠被最终发育成成熟种子的种 皮。在拟南芥和大部分双子叶植物中，胚乳最终被发育的胚所消耗和吸收， 成熟种子腔被胚所占满( v e n k a t e s a n ，2 0 0 5 ) 。种子发育不仅需要许多基因 的共同参与，而且涉及不同剂量亲本基因组之间的互作。 孟德尔遗传学说认为，来自父本和母本的基因组对有性生殖产生的合 子起着同等重要的作用。然而，近来有关种子发育研究的成果表明，在种 子发育早期阶段，来自父本和母本基因组的作用不是等同的，许多基因的 作用方式表现出亲源效应( p a r e n t - o f - o r i g i ne f f e c t ) 。种子早期的发育受到 后生过程( e p i g e n e t i cp r o c e s s ) 的调节。这些后生过程包括基因组印迹、 d n a 甲基化和染色体的修饰等，它们影响许多基因的表达。父本和母本 染色体组之间复杂的互作，涉及到遗传的和后生过程的众多因素，使得种 子发育成为当今生殖生物学热点研究领域之一。此外，许多植物还具有无 融合生殖特征，即不经过雌雄细胞的受精过程就能产生有胚种子，这一过 程亦涉及到控制种子正常发育的相关基因的改变。 1 2 1 影响胚发育的因素 卵细胞与精子融合形成合子，合子进一步发育成为成熟的胚。胚的发 育涉及到一系列基因的时空表达和相互作用。以拟南芥( a r a b i d o p s i s t h a l i a n a ) 为模式植物，应用突变体分析和基因克隆技术，已鉴定和分离 了一些影响胚胎形成的基因，例如：l e c 2 ( l e a f yc o t y l e d o n2 ) 、g n o m , 肘删t e r o 、f a c k e 和a g l l 5 ( a g a 坳明乩i k e1 5 ) 等。三e 编码 一个含b 3 区域( 植物特有的一种d n a 结合基序) 的转录调控因子，它 9 拟南芥种子发育过程中s h b l 基因的表达与功能分析 控制胚发育的正确启动，在胚发育早期和后期均大量表达( s t o n ee ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。g n o m 基因编码鸟嘌呤核苷酸交换因子( g e f ) ，它作用于a d p 核糖基化因子( a i 强) g 型蛋白，影响合子的第一次分裂( g r e b ee ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。与正常合子第一次不对称分裂相反，g n o m 突变体的合子第一次 分离时是对称的，表现出顶基极性( a p i c a l b a s a lp o l a r i t y ) 缺陷型，没有 根和下胚轴。m p( 彪蝴撇傩)基因编码一种含d n a 结合域的蛋 白质，它影响胚中维管组织和胚体模式的建立( h a r d t k ea n db e r l e t h ，1 9 9 8 ) 。 f , , , i c k e l 基因的产物是参与脂类生物合成的一种固醇还原酶( s t e r o lc - 1 4 r e d u c t a s e ) ，它影响发育过程中胚细胞的分裂、扩展和有序排列( s e h r i e k e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。f a c 碰基因突变特异地减少了下胚轴的形成，使得胚根 几乎贴到子叶上。a g l l 5 在胚胎发生过程中以转录因子的形式来调控其它 基因的表达，是促进和维持胚胎发育的一个关键因子( h e c ke ta 1 ，1 9 9 5 ； e l l e ne ta 1 2 0 0 3 ) 。 1 2 2 影响胚乳发育的因素 伴随着受精卵发育形成胚的过程，受精极核进一步分裂形成胚乳。近 年来，应用突变体分析和分子遗传学方法已分离、鉴定出一些参与胚乳发 育的基因。t i t a n 蛋白与a d p 核糖基化因子相关，是小分子g t p 结合 蛋白r a s 家族的成员，调控着真核细胞的多种功能。乃( 咒) 基因 突变改变了胚乳发育中的减数分裂和细胞循环控制( t z a f r i re ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 三个不依赖于受精而形成种子的f i s ( 尼r m 上列册肛刀v d e p 啪e t 鲫) 基因，即f i s l m e d e a ( o h a d e ta 1 ，1 9 9 9 ) 、f i s 2 ( l u oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 昶f i s 3 f i e( f e l 疆i l l z a t i o n 1 n d e p e n d e n te n d o s p e r l 讧、) ( g r o s s n i k l a u se ta 1 ，1 9 9 8 ；k j y o s u ee ta 1 ，1 9 9 9 ；l u oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 基因均在 胚乳的合胞体时期表达( v i e l l e c a l z a d ae ta 1 ，1 9 9 9 ；l u oe ta 1 ，2 0 0 0 ； y a d e g a r ie ta 1 ，2 0 0 0 ；w a n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) ，任何一个发生突变，都引起胚乳 核分裂及胚乳发育模式建成的紊乱。a g l 6 2 ( 彳g 4 m - d 潲圮积碧6 2 ) 基因编 码一个i 类m a d s 功能域蛋白( p a r e n i e o v ae ta 1 ，2 0 0 3 ) ，作为转录因子 起作用。在种子发育过程中，a g l 6 2 在胚乳的合胞体时期强烈表达，在细 胞化即将发生之前表达量迅速下降。在a 9 1 6 2 突变体种子中，胚乳细胞化 1 0 山东农业大学硕士学位论文 提前，表明a g l 6 2 对抑制合胞体时期胚乳细胞化的发生起到了重要作用。 拟南芥a g l 8 0 ( 么g a m o u s - l i k e8 0 ) 基因是中央细胞和胚乳发育所必需 的一个基因( p o r t e r e i k oe ta 1 ，2 0 0 6 ) 。a g l 8 0 编码一个i 类m a d s 功能 域蛋白，在中央细胞和胚乳发育的早期表达。a g l 8 0 突变体中雌配子体没 有明显的表型。然而用野生型花粉给a g l 8 0 雌配子体授粉，胚乳核不再存 在，中央细胞的腔被高度自发荧光的物质所填充，表明a g l 8 0 是胚乳早 期的发育所需要的( p o r t e r e i k oe ta 1 ，2 0 0 6 ) 。胚乳细胞化在一组拟南芥突 变体中受到影响，包括a o c h 5 ，k n o l l e ，h i n k e l , o p e nh o u s e ，r u n k e l , p l e i a d e ，a n d s p a t z l e ( s o r e n s e ne ta 1 ，2 0 0 2 ；i n g o u f fe ta 1 ，2 0 0 5 b ) 。其中一些基因编码 的蛋白直接参与细胞化过程，其它基因间接调控胚乳的细胞化。拟南芥影 响胚乳发育的调控因子还包括u ( 删u ) 类基因，这类基因包含们， 1 k u 2 和m i n l 3 ( g a r c i ae ta 1 ，2 0 0 3 ；l u oe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。在i k u l ，i k u 2 和m i n i 3 突变体中，胚乳细胞化提前，核增殖程度下降( g a r c i ae ta 1 ，2 0 0 3 ；l u oe ta 1 ， 2 0 0 5 ) ，表明这些基因对起始胚乳的细胞化起到了重要作用。 1 2 3 无融合生殖与种子发育 多种植物可以通过无融合生殖的方式来产生种子。无融合生殖主要有 两种途径，一是胚珠内的大孢子母细胞未能进行正常的减数分裂，这样就 产生一个二倍体的胚囊和一个染色体数目没有减半的卵细胞，这种二倍体 的卵细胞不经受精就能够自发地发育形成胚( 例如孤雌生殖) 。另一条途 径是卵细胞以外的其他未减半的二倍体细胞( 如珠心组织的细胞) 直接发 育为胚。在无融合生殖过程中，二倍体的极核或某些细胞可行使胚乳原初 细胞的功能，在不受精的情况下，分裂发育为胚乳。胚乳的发育也可以不 依赖于胚的发育而进行。无融合生殖后代是母本的复制品，不含来自父本 的遗传物质，遗传有母体的全部特征。 人们以有性繁殖的拟南芥为实验材料，进行了许多研究，以期能鉴定 和分离到那些可不经受精就能产生种子的突变基因。虽然迄今还没有获得 拟南芥的无融合生殖突变体，但已获得了上文所描述的3 个f i s 突变基 因。每个f i s 基因的突变都能导致胚乳在不受精的情况下增殖和发育。 自发的胚乳发育是一些植物无融合生殖的特征之一。然而，即使在受精的 拟南芥种子发育过程中s h b l 基因的表达与功能分析 情况下，f i s 基因突变的胚也不发育，一直到成熟，种子还是卷缩状，并 且体积极小，几乎看不见。这暗示着无融合生殖中胚和胚乳的发育可能受 不同的基因所控制。 1 2 4 基因组印迹与种子发育 基因组印迹( g e n o m i ei m p r i n t i n g ) 是一种非盂德尔遗传现象，它是指 在配子或合子发生期间，来自亲本的等位基因或染色体产生专一性的加工 修饰，导致后代体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达活性，又 称遗传印迹或亲代印迹或配子印迹( z ix i a o y u a ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。印迹基 因的特点就是基因的表达与否决定于其亲本来源，导致两个不同亲源的等 位基因具有不同的表型效应，即具有亲源效应( s c o t te ta 1 ，1 9 9 8 ；l i n , 1 9 8 4 ) 。 一 基因组印迹与胚胎发育有关，已发现哺乳动物的许多印迹基因控制胚 胎的生长，并仅在外胚组织中表达。外胚组织是母体向胚胎输送营养物质 的渠道，被子植物种子的胚乳具有与之相似的功能，也是发生基因印迹的 重要部位。早在1 9 7 0 年，k e r m i e l e 就已发现，调控玉米糊粉层中花青素 积累的尺基因会发生印迹。但是，玉米胚乳中先后鉴定到的印迹基因对 种子的形态发生均无明显影响，因此对种子发育过程中印迹基因功能的研 究，绝大部分来自种内不同染色体倍性间杂交的结果( f r e d e r i cb ，2 0 0 4 ) 。 直到1 9 9 8 年，g r o s s n i k l a u s 等发现，拟南芥m e a ( 彪删) 基因对胚胎 发生有母源控制的作用。随后的研究证实m e a 在胚乳中得到印迹，而且 m e a 基因的编码产物与果蝇和哺乳动物的p c g 蛋白同源，后者对同源异 型基因的表达及细胞增殖均具有调控作用。至此，基因组印迹对种子发育 的影响才取得突破性进展。 1 2 4 1 亲源效应和亲本冲突学说 用来解释哺乳动物和植物中印迹现象的学说，称为亲本冲突学说 ( p a r e n t a lc o n f l i c tt h e o r y ) 。该学说( h a i g e ta 1 ，19 8 9 ) 认为，相同或不同 染色体倍性间杂交后代的种子之所以出现相反的表型，是由于在母本资源 1 2 山东农业大学硕士学位论文 分配到子代中时，母本、父本和子代间存在利益冲突。由于母本产生的子 代可能来自多个父本，而每个子代均与母本具有同等的相关性，因此母本 试图给所有子代提供均等的资源。父本则努力将最多的母本资源引向自己 的子代，从而保证自身的遗传连续性。因此，促进母本资源分配的基因应 是父源表达的。而作为平衡，限制母本资源在子代中分配的基因则是母源 表达的。因