免疫去势综述.doc

GnRH免疫去势研究进展姓名：宋志慧（云南农业大学动物遗传育种与繁殖专业，学号2010210344）摘 要：动物免疫去势是近十多年来得到广泛研究的一门控制动物繁殖的技术，现已形成了激素免疫学。文章主要对 GnRH免疫去势在生产中的进展和可行性 、作用机制、影响因素、应用前景及其存在问题等进行了论述。关键词：GnRH免疫；激素免疫；去势；GnRH immune castration research progressSong zhihui(Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Yunnan Agricultural University, 2010210344)Abstract:Animal immune castration is near ten years are widely a door control of animal reproductive technology, has created a hormone immunology. This article mainly for GnRH immune castration in production of progress and feasibility, mechanism, influencing factors and application foreground and its existing problems are discussed.Key words:GnRH immune； Hormone immune； castration免疫去势是在激素免疫学的基础之上进行操作的。而激素免疫学是应用激素免疫中和技术(HIN)的科学 ，激素免疫即以激素为抗原，刺激动物机体产生抗体，即抗激素，并以激素抗体主动或被动地中和动物机体的内源性激素，使其生物活性部分或完全丧失，引起内分泌系统的平衡失调，从而改变下丘脑一垂体一性腺轴之间的正常反馈调节关系，减少性腺激素的合成与释放，使动物大部分或完全丧失生育能力而达到去势的目的 。1 动物免疫去势的兴起与发展早在1899年有学者将人的精子注射绐异种动物，发现精子具有抗原性。1900年 Metchniko用豚鼠精子注射到其他豚鼠体内，得到抗精子的自身抗体，并发现该鼠产生了所谓“精子毒素”的活性 1953年Freund在豚鼠间注射睾丸组织液和佛氏完全佐剂，使被注鼠不能产生精子，成功率达 100 。1973年Arimura等首次发现GnRH主动免疫公兔后，垂体LH和FSH分泌减少睾丸严重萎缩，这说明GnRH抗体能中和内源的GnRH，从而抑制垂体LH和FSH的合成和分泌， 使性腺萎缩，达到免疫去势的目的。1977年由 Scaramuzzi氏首先发明主动免疫类固醇激素可以提高母羊的排卵率，从而创立了这门新兴的边缘科学，并推动了HIN的发展。1979年Robertson用合成的 LHRH给2头3周龄公牛免疫，在3次重复注射后抗体效价均达到1：1000以上，皆表现无精或少精。1979年Mutty给成年猴往射 FSH抗血清，发现生精和生育力均下降。1984年Walker等用睾酮主动免疫未性成熟的公羊，结果是睾丸增重 2，性成熟后的精子量亦增加 3O一50。1986年Rober研制出r一种动物免疫去势苗，成功率达 100。MarLernueei等(1984)和 Herman等(1990)均报道，GnRH主动免疫引起血浆 LH水平急剧降低，而 FSH 只有轻度降低 。2 GnRH 免疫去势的机制 1971年 Shally AV【1】和 Guillenmin R【2】从猪的下丘脑首先分离出促性腺激素释放激素并由此获得了诺贝尔生理学奖。鉴定其结构为 9种不同氨基酸残基组的1O肽。GnRH 由丘脑下部的GnRH神经元细胞合成，贮存于细胞内，受到一定的刺激以后就会释放出来 ，通过垂体门脉进入垂体前叶而产生生理效应，调节LH和 FSH两种性腺激素。在生理条件下调节机体生殖系统的功能，但是当大剂量给予外源性 GnRH或其类似物时，会对生殖系统产生抑制作用 。通过利用机体的免疫系统操纵一定的生理过程来调节内分泌活动是可能的。GnRH免疫雄性动物可以使幼龄雄性动物睾丸停止发育和成年雄性动物睾丸退化。用 GnRh免疫动物后，机体产生大量的抗 GnRH的特异性抗体，与内源性的 GnRH 结合使其失去生物活性，从而导致下丘脑一垂体一性腺轴功能的破坏，抑制LH和 FSH的释放，使被免疫的动物表现睾丸卵巢萎缩和重量减轻、血清睾酮水平下降，这在 Meloen R H【3】 等和Oonk H B【4-5】等的文章中有所论述。辛长砺【6】等用LRH类似物与牛血清白蛋白连接(BSA)对公雏进行免疫，两次注射，用两种佐剂，宰后摘取睾丸称重，结果表明：实验组与对照组差异极下部产生并贮存于该腺体内，当机体受到一定的显著(PO01)。Xian X Y【7-9】等用 GnRH并列体二聚物调物(D-Lys GnRHtandem-dimer)与卵清白蛋白(OVA)体一性腺轴，影响生殖内分泌和生殖细胞的发育。结合，用 Spell作佐剂，以不同的剂量免疫公猪，结果显示，四个免疫组中各有一头没有反应，其中1Og剂量发展，出现了一个新的边缘性学科激素免疫 组免疫效果好，其睾丸大小及重量、血清睾酮水平、促黄体素水平和脂肪中雄烯酮的含量与对照组有显著的差异。岳海宁【10】等用 GnRH来免疫公羊，发现LH的水平比手术去势组的要低，但其睾酮浓度与手术去势的羊没有显著差异90d之内睾丸的大小没有改变，说明其生长受到抑制。 用GnRH免疫雌性动物，使下丘脑一垂体一卵巢轴功能破坏，影响激素的分泌，只要在相当低的免疫水平就能中断雌性动物的发情周期。Bishop D K 【11】等使用GnRH免疫小母牛，血浆中孕酮、雌二醇的浓度下降，若使用促性腺激素(GTH)，孕酮与雌二醇的浓度又升高，但与对照组雌二醇水平相比仍较低，孕酮则没有差别，表明GnRH处理影响了雌二醇对GTH的反应性。Esben F J【12-13】等证明GnRH能抑制去除垂体大鼠卵巢、子宫的增重，说明了GnRH可以直接作用于性腺。GnRH免疫不仅能终止正常鼠的妊娠，也能终止去除垂体大鼠的妊娠。利用免疫组织学、ABC法及图象分析技术，发现妊娠与非妊娠的大鼠子宫内膜均表达GnRH及其受体口 。GnRH由下丘脑以脉冲方式产生，通过垂体前叶，从而调节垂体前叶分泌 LH和 FSH，LH和FSH又有调节性腺的功能。GnRH与具有免疫原性的大分子蛋白载体偶联后免疫动物，可诱导体内产生特异性抗 GnRH的抗体【14】。该抗体特异地中和动物体内的GnRH，从而影响到与 GnRH有关的 LH、FSH等激素的合成与分泌，使动物正常的生殖性能发生改变。GnRH不仅可以通过影响垂体 LH 和 FSH 的分泌调节性腺功能，而且可以直接作用于性腺，其作用是抑制性的。应用去除垂体大鼠所做的实验表明：GnRH的作用主要是降低性腺上LH和HCG的受体数目而不改变受体的亲和力。研究发现，鼠的睾丸和卵巢上均有GnRH受体存在，GnRH直接与受体结合，抑制生殖功能【15】。 3 GnRH免疫去势的方法 在具体的免疫操作程序上，可分为口服或注射的方法。口服法由于消化酶的破坏而使其作用降低，这样需要的剂量必须增大，一般为毫克级；而注射法则可避免上述缺点和不足，只要微克级就能达到目的。 GnRh作为自身的物质很难被免疫系统识别，因而用其作免疫原没有很好的免疫原性，为增加其免疫原性将其与大分子的载体蛋白结合。作为载体其分子量应大且能结合更多的 GnRH而不影响其生物活性 。早期曾将GnRH与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)直接偶联，后来用碳二亚胺作偶联剂。以BSA与 GnRH 偶联为例，使用碳二亚胺将 BSA中的自由羧基与 GnRH分子中的酚羟基脱去一分子水形成酯键而达到偶联目的。也可以通过改变 GnRH 的分子结构来增加其免疫原性，Meloen等将两分子 GnRH连接起来形成 20个氨基酸的肽作免疫原，这是一种新的方法，有很好的免疫效果。在此基础上，Oonk H B等又把末端带有半胱氨酸(CYS)的 20氨基酸序列的聚合体并列，形成GnRH并列二聚体 (GnRHtandem-dimer)，再与载体蛋白偶联作免疫原，进一步加强了免疫原性 。在进行免疫时，也可以使用佐剂以加强免疫原性，用两次免疫来加强效果。4 GnRH免疫去势在生产中的应用 因为传统的手术去势可能造成应激和感染，化学去势时药物浓度难以把握，而免疫去势则可克服上述的缺点【16】。GnRH免疫由于引起垂体促性腺激素尤其是 LH水平的下降，将导致性腺、性激素的变化，最终导致生育力的降低甚至丧失【17】。当体内抗体滴度下降后，其生殖机能还可以恢复。赵伟等用合成的GnRH主动免疫公猪，可使血清中睾酮浓度下降，试验组睾丸和附睾的重量比对照组轻，且单位面积内的曲精管数，试验组明显比对照组少(P0.01)，效果可持续3个月。不论从睾酮含量、精子生成还是从组织学方面来看，GnRH主动免疫去势的效果都很明显。Meleonh和 Oonk等人用 GnRH免疫猪后，其性腺不同程度的萎缩，脂肪中的雄烯酮和粪臭素水平降低，去除了膻味，还可以减少雄性动物的争斗行为，促进生长，从而提高饲料的利用效率，减少动物之间的伤害和对人的危险。国内一些人对公猪的研究的出免疫去势可以引起公猪暂时性表型改变，性表现丧失，第二性征延期出现，成功地产生了五个月的功能性去势期。免疫去势初期，T淋巴细胞系统反应积极，中后期，B淋巴细胞系统异常活泼，并持续较长时间。免疫去势早期可成功地诱发睾丸，后期引起间质反馈增生，问质纤维网状组织出现淀粉样变性，精细管出现压迫性萎缩。免疫去势可促进增重，其胴体中瘦肉率明显高于阉公猪。免疫去势猪肉品尝无异味【18】。在家禽方面，费维真等用 GnRH抗原对10日龄、17日龄海赛克斯商品代公鸡人工免疫两次，结果显示实验组各 日龄鸡冠的体积小于对照组，60日龄、90日龄实验组鸡体重显著大于对照组，表明用GnRH免疫去势公鸡可以促进其生长发育。张云桥Ll 用 LHRH免疫公鸡，结果表明其睾丸、肉垂和鸡冠均发生 不同程度的萎缩 ，血清睾酮水平降低 ，肉的品质提高。GnRH免疫去势在肉牛上的研究也较多。Jago等和 Huxsoll等用 GnRH免疫公牛，不仅睾丸、精囊重量降低，还减少了公牛的性行为和侵略行为，从而减少牛群的混乱及对牧场围栏的损坏；公牛相互爬 跨现象也明显减少，而且提高了肉品质量。虽然胴体重或 El增重较完整公牛差，但优于阉割公牛。GnRH免疫去势技术在其他动物上也有研究，都能使睾丸萎缩或者发育不良，睾酮含量下降，雄性特征减弱，而且这种免疫效果是可逆的，这在经济动物和宠物的繁殖上很有应用价值。Freundenberger 等对公鹿主动免疫GnRH可以降低秋季血液 LH和睾酮的含量，降低性行为，增加体重和提高鹿肉质量。5 影响 GnRH 免疫效果的因素 用自身的 GnRH分子作免疫原没有很好的免疫效果，是因为 GnRH 的分子量小，而且是自身物质，很难被免疫系统识别。Robertson【19】(1984)报道用GnRHHAS(human serum albumin，HAS)和弗氏完全佐剂来免疫公牛，只有一半有免疫反应，不同的免疫原对结果的影响很大。GnRH单体与载体蛋白结合，如与BSA、KLH、HAS、0VA结合,效果不好。Meloen K HL3 报 道，即使多次免疫也不是所有的动物都表现出好的效果，用GnRHKLH免疫公猪，5头中有2头睾丸萎缩;2头变化不大，1头没有变化,屠宰时有2头检测出血清睾酮；而用GnRH的重复序列即 2O个氨基酸的类 GnRH免疫,则能彻底阻止睾丸的发育和消除内分泌的功能。Oonk H B等又将GnRH 二聚物并列化后与0VA结合，免疫取得了更好的效果。佐剂对免疫效果有很大的影响，弗氏佐剂由于其价格昂贵不能得到商业的应用，一种合成的 muramyldipeptide可以替代弗氏佐剂，有同样的效果。Oonk H B等用 GnRHtandem-KLH分别和3种佐剂，完全弗氏佐剂(complete freund S adju vant，CFA)、不完全弗氏佐剂(incomplete freund Sadjuvant，IFA)及 Specol混合进行试验，结果表明 Specol 的效果要比前2种好【20】。 此外，免疫剂量也有很大的影响。XianYZ等用GnRH并列体二聚物与0VA结合免疫公猪，最后发现1Og剂量的免疫效果最好；在免疫剂量相同的情况下，两次免疫比一次免疫的效果好。免疫动物的年龄也与效果有一定的关系。 6 GnRH 免疫去势的应用前景 对于肉用家畜来说，在其性成熟之前，可以利用睾酮促进生长，但是手术去势则消除了这一作用，而免疫去势能弥补这一缺点，在 LHRH 抗体产生以前睾酮可完全发挥其促生长作用【21】。当前，主要的问题是阐明免疫可以促进生长的机制以便能更好的促使其在生产中的应用；由于我国的养殖业科技含量普遍较低【22】，动物生产性能水平不高，在各种养殖动物适时地采取有效的去势或阉割方法是一个重要措施。如果用 GnRH等激素免疫去势技术广泛取代传统的手术去势方法，将对提高我国畜牧业的生产水平起到重要作用。然而，目前 GnRH免疫去势效果的持续时间有点令人不满意，还需要在免疫原的构建、免疫的最佳时间、剂量、注射方法以及更好的佐剂以及免疫程序方面做进一步研究【23】。再者，就是如何能研制出价格更低廉、效果更突出的免疫制剂。特别是能够在分子水平或基因水平探明GnRH等激素免疫去势技术的原理，对于开发研制出具有更佳效果的基因工程疫苗无疑会奠定坚实的基础，这样方能发挥其更好的作用，促进动物激素免疫学的快速发展。参考文献1 Shally A VStructure of the porcine LH-and FSHreleasing hor mone conformation of the proposed structure by conventional sequential analysesJBiochera Res Commun，1971，44(1)l 459463 2 Guillenmin IL Purification amino acid composition and N-terminus of the hypothalamic luteinziug hormone releasing factor(LRF)o-vine originJBiochem Biothy Commun，1971，44(1)：205-210 3 Mdoen R H，Turkstra J A，Canknof H，et aL Efficient immunocas tration of male piglets by immunoneutraiization of GnRH using a OnRH-like peptideJVaccine，1994，12(12)l11524 Oonk H B，Turkstra J A，Lankhof H，et aL Testis size after iln-lunocastration as 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