（生物医学工程专业论文）人外周血hperiod1相互作用蛋白的筛选.pdf

四川大学硕上学位论文 人外周血h p e r l 相互作用蛋白的筛选 生物医学工程专业 研究生冀治鸿指导教师王正荣 自然界大多数生物的生理活动均呈现周期约2 4 小时的节律变化，这些现象 称为近日节律。哺乳动物近日节律中枢位于下丘脑视交叉上核( s c n ) ，其产生 的分子机制为一系列节律基因及其表达产物组成的转录和转录后调控所形成反 馈环路。这些基因包括p e r l ，n 以，n 刀， c o ，c n ，2 ，b m a l l 和c l o c k 等。 目前的研究发现，近日节律基因在一些外周组织，如肝、肾、肺等表达。忍r ， 作为近日节律分子振荡的核心元件，在s c n 中产生和维持起重要作用，在外周 组织中也有丰富的表达。然而，迄今为止，外周组织p e r l 的功能尚不十分清楚。 为了完善h p e r l 在近日节律分子振荡的机制，本文采用酵母双杂交技术，以 h p e r l 的b h l h - p a s 结构域为诱饵蛋白对人血液e d n a 文库进行筛选，寻找与 其相互作用的新蛋白，为进一步研究h p e r l 的功能提供新的线索。 构建人血液e d n a 文库。通过r t - p c r 扩增h p e r l p a s 结构域的编码序列， 获得的片断与质粒载体p g b k t 7 连接重组为诱饵质粒p k 砌n r 膦。检测转 化诱饵质粒的酵母a h l 0 9 是否有自激活发生以及重组诱饵蛋白的毒性。顺序转 染法构建酵母双杂交系统，筛选人血液e d n a 文库中能与诱饵蛋白h p e r l p a s 结构域相互作用的蛋白。采用营养缺陷培养基、b 半乳糖苷酶印膜法检测报告基 因的表达。阳性克隆经p c r 扩增后，进行测序和生物信息学分析。 经酶切和基因测序鉴定证实重组诱饵质粒p g b k t 7 h p e r l b h l h p a s 构建成功。 自激活检测和毒性检测实验表明诱饵蛋白对酵母a h l 0 9 无毒性作用。酵母双杂 交文库营养缺陷筛选得到1 1 4 个阳性克隆，b 半乳糖苷酶检测报告基因获得4 6 个蓝色克隆。通过测序和生物信息学分析，其中之一能与p e r l 相互作用的蛋白 为l s m d l 。 利用酵母双杂交系统筛选了与p e r l 相互作用的新蛋白l s m d l 。 关键词：近日节律；h p e r l ；酵母双杂交；l s m d l 四川大学硕l 学位论文 s c r e e n i n gn o v e lh p e r ii n t e r a c t i n gp r o t e i n s m a j o r ：b i o m e d i c a le n g i n e e r i n g s t u d e n t ：z h i h o n gj i s u p e r v i s o r ：z h e n g r o n gw a n g a b s t r a c t i na l m o s ta l ll i v i n go r g a n i s m s ，v a r i o u sp h y s i o l o g i c a la n db e h a v i o r a lf u n c t i o n s a r ee x p r e s s e dr h y t h m i c a l l yw i t hap e r i o do fa b o u t2 4h o u r s t h e s ed a i l yr h y t h m s ， r e f e r r e dt oa sc i r c a d i a nr h y t h m ，a r ec o n t r o l l e db ys e l f - s u s t a i n e db i o l o g i c a lo s c i l l a t o r s ， w h i c hi n v o l v et r a n s c r i p t i o n a l - t r a n s l a t i o n a lf e e d b a c kl o o p so f c i r c a d i a ng e n e s ，n a m e l y , p e r l p e r 27p e r 3 c r y l 7c ，了2 ，b m a l l a n dc o c k 武乱i nm a m m a l s ，l th a sb e e n e s t a b l i s h e dt h a tam a s t e rc i r c a d i a no s c i l l a t o re x i s t s i nt h e h y p o t h a l a m i c s u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u s ( s c n ) r e c e n t l y ，i tw a sa l s of o u n di np e r i p h e r a lo r g a n s ， s u c ha sl i v e r ，k i d n e y ，l u n ga n dt h eo t h e rt i s s u e s a sac r i t i c a lc o m p o n e n to fc i r c a d i a n , p e r lp l a y sa j li m p o r t a n tr o l ei nr e s e t t i n ga n ds u s t a i n i n gc i r c a d i a no s c i l l a t i o n ，b u ti t s m e c h a n i s mh a sn o tb e e nf u l l yc l a r i f i e dy e t t of i n dn o v e lp r o t e i n si n t e r a c t i n gw i t hh p e r lb ys c a n n i n ge d n al i b r a r yi n h u m a nb l o o d , t op r o m o t eu n d e r s t a n d i n g sa b o u tm e c h a n i s m so f t h ec i r c a d i a nr h y t h m s ， y e a s tt w o - b y b r i ds y s t e mw a sa p p l i e d ，h p e r lb h l h - p a sd o m a i n a st h eb a i t t h ee d n al i b r a r yo fh u m a nb l o o dw a sc o n s t r u c t e da c c o r d i n g t ob d m a t c h m a k e r t ml i b r a r yc o n s t r u c t i o n & s c r e e n i n gk i t s t h es e q u e n c ee n c o d i n gp a s d o m a i no fh p e r lw a sa m p l i f i e db yr t p c i lt h ea m p l i f i e df r a g m e n tw a sl i g a s e d w i t ht h ev e c t o rp g b k t 7t oc o n s t r u c tr e c o m b i n a n tb a i tp l a s m i dp g b k t t h p e r l p a s t h er e c o m b i n a n tb a i tp l a s m i di st e s t e df o rt r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o na n d t o x i c i t y u s i n gs e q u e n t i a lt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d t oc o n s t r u c ty e a s tt w o - h y b r i ds y s t e m ( m a t c h m a k e r g a l 4t w o h y b r i ds y s t e m ，b dc l o n t e c h ) ，t os c r e e nn o v e lh p e r l i n t e r a c t i n gp r o t e i n s t h et r a n s f o r m a n t sw e r es e l e c t e do i ld e f i c i e n tm e d i u ma n dt h e p o s i t i v ec l o n e sw e r et e s t e de x p r e s s i o no fr e p o r tg e n et h r o u g h1 3 - g a l a c t o s i d a s ea s s a y a m p l i f i e dd n af r a g m e n t so ft h ep o s i t i v ec l o n e st h r o u g hp c r w e r es e q u e n c e da n d 2 四川大学硕j 。学位论文 a n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d s i tw a sp r o v e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a sc o n s t r u c t e d c o r r e c t l yb y d i g e s t e dw i t he n d o n u c l e a s ea n ds e q u e n c e dt h ed n a - b df u s i o ni si n a c t i v ea n d n o n t o x i c f o r t y 。s i xp o s i t i v ec o l o n i e sw e r es e l e c t e db yt h ey e a s tt w o h y b r i ds y s t e m l s m d lp r o t e i nw a so b t a i n e da f t e rv e r i f i c a t i o n w es c r e e n e dan o v e lp r o t e i nl s m d lw h i c hc a nb ei n t e r a c t e dw i t hh p e r ib y u s i n gy e a s tt w o h y b r i ds y s t e m k e yw o r d s ：c i r c a d i a n ；h p e r l ；y e a s tt w o h y b r i d ；l s m d l 3 - 四川i 大学硕l 学位论文 第一章前言 地球的自转公转运动产生了周而复始的昼夜更替和季节变换，与之相应， 自然界从简单的单细胞生物到复杂的高等动植物以及人类，几乎所有生物的体 内生理活动和外在行为都呈现周期约2 4 小时的节律变化，即近日节律( c i r c a d i a n r h y t h m s ) 1 1 2 1 。近日节律是生物体在发生和进化过程中不断与环境变化相适应的 结果。生物体这种对环境变化的前瞻性适应有利于生物的生存和物种的延续。 哺乳动物体内的不同组织和细胞均广泛存在近日节律，且各组织和细胞的 自主振荡表现出和谐一致的节律现象1 3 ，4 j 。研究证实，哺乳动物近日节律中枢位 于下丘脑前部的视交叉上核( s u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u s ，s c n ) 1 5 , 6 1 。s c n 通过调节 人的多种生理和行为，包括：人的睡眠一清醒节律、体温、激素水平、认知和 记忆能力。破坏s c n 后这些活动和行为的近日节律均消失，而通过移植s c n 组 织则可使近日节律得到恢复【7 。 近日节律系统是近日节律的结构基础，由一系列近日节律基因及其编码的 蛋白质组成，彼此相互作用，构成了一个或多个正负反馈环路，以大约2 4 小时 为周期进行节律振荡【9 ，1 0 l 。这些基因包括p e r i o d l ( p e r l ) 、p e r i o d 2 ( p e r 2 ) 、p e r i o d 3 ( p e r 3 ) 、c r y p t o c h r o m e l ( c r y l ) 、c r y p t o c h r o m e 2 ( c r y 2 ) 、c l o c k 、b m a l l 和t i m l e s s 基因等。其中，c l o c k 和b m a l l 是正性因素，都包含两个结构域，一个是结合 d n a 的碱性螺旋环螺旋( b h l h ) 结构域，一个是蛋白与蛋白结合的p a s 结构 域。c l o c k 和b m a l l 通过p a s 结构域形成杂二聚体，然后通过b h l h 结构域 与n r 和c r y 基因启动子的e b o x 结合，激活肋和c r y 基因的转录，在胞浆 中被翻译成蛋白质p e r 和c r y 。在细胞浆内，p e r 可被酪蛋白激酶i ( c k i ) 磷 酸化，磷酸化的p e r 易被蛋白酶降解i l l - 1 4 1 ，从而产生了时间的延迟。未降解的 p e r 与c r y 结合后进入细胞核内抑制c l o c 汨m a l l 二聚体对甩r 和c r y 基 因的转录激活作用，从而使心r j 、p e r 2 、p e r 3 、c r y l 、c r y 2 等基因的转录减少， 进而解除对c l c i c k b m a l l 的抑制，导致凡，、凡，2 、n 订、c r y l 、c r y 2 等基 因的转录又重新增加，使近日节律的分子振荡得以产生和维持。由于基因的转 录和蛋白进入细胞核需要一定的时间，使近日节律的分子振荡的周期正好2 4h 左右l l5 1 ( 图1 ) 。c r y l 2 和b m a l l 对启动这个循环是十分重要的。敲除小鼠体内 四川大学硕l 二学位论文 的这些基因后会导致小鼠持续性的夜间活动节律失常【l ”。最近发现的d e c l 和 d e c 2 家族也可以抑制c l o c k b m a l l 异二聚体对p 打和c r y 基因的转录激活， 与n r 和c r y 一起构成反馈环的负性因素【i 引。这条负反馈环路是哺乳动物近日 节律基因调控的核心环路，该环路十分稳定，较为精确地保证了生物体的2 4 小 时节律。这种节律稳定的扩大化使得生物体在细胞内、细胞间，器官、系统等 多个层次产生稳定的近日节律。 图l 哺乳动物近日节律的核心反馈环路 除了上述主要反馈环路外，近日节律还存在其它辅助分子调控环路。近年 的研究表明，c l o c k 和b m a l l 的异源二聚体在激活p 盯j 2 和c r y l 2 转录的 同时，也激活孤儿核受体( o r p h a n n u c l e a rr e c e p t o r ) 基因r e v - e r b 口的转录。r e v - e r b 口的表达产物r e v - e r bq 蛋白则通过与r o r a 相互作用以抑制b m a l l 的转录。因 此，当p e r l 和p e r 2 转运到核内与c r y l 和c r y 2 形成稳定的抑制复合物，通过 直接与c l o c k 和或b m a l l 作用，在抑制n r ，和n ，2 表达的同时，也抑制了 r e v - e r ba 的转录，使得b m a l l 的转录解除抑制，从而使其表达随即增加并进入 到下一个循环i 9 - 2 1j ( 图2 ) 。 四j i i 大学硕1 二学位论文 图2 哺乳动物近日节律的辅助反馈环路 研究表明，在众多的近日节律基因及其产物中，p e r l 及其蛋白产物p e r l 在近日节律系统中处于重要地位。n r j 在近日节律中枢一下丘脑视交叉上核 ( s u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u s ，s c n ) 中主要起维持系统的稳定和精确的作用，在外 周组织中起控制节律周期的主导作用1 2 2 1 。在心，突变的小鼠动物模型中，小鼠 的活动周期缩短，近日节律的准确性和稳定性都有所降低。n r 和忍以双突变 的小鼠动物模型则表现为在连续黑暗条件下行为节律立即消失。若将，台r ，或 n 门基因导入n r 突变的果蝇细胞，则可使这种果蝇的近日节律恢复，其原因 是有缺陷的果蝇缺失肋j 表达产物p e r i 蛋 2 3 - 2 5 1 。可见心，j 基因对近日节律 机制是必需的。而对近日节律分子水平的研究也正说明了这一点。n ，j 作为近 日节律反馈环路的核心成分，在转录水平上对近日节律起负反馈调控作用，其 变化是分子水平节律振荡的重要标志，同时由于它们表达丰度较高，节律振荡 幅度较大，常被用作检查节律状态的指剥2 6 】。在翻译后水平上，p e r 蛋白在细 胞核与细胞浆之间的穿梭对近日节律起重要调节作用。这些机制使机体的近日 节律系统形成了一个较为稳定的平衡 2 7 - 3 0 1 。 n ，除了在近日节律的产生和调控机制方面发挥重要作用外，还与很多疾 病的发生息息相关。n r ，与肿瘤的发生有关。研究发现，在慢性单核细胞性白 血病急性髓样细胞性变患者体内发现有e t v 6 基因与h p e r l 基因反义链融合，而 四川i 大学硕上学位论文 这种融合基因并不表达蛋白，从而导致凡r ，蛋白表达下降，研究者认为这可能 是白血病的发生机制之一【3 ”。在项对5 5 例中国台湾乳腺癌患者手术切除标本 的研究中发现，5 3 例标本的肿瘤细胞中p e r l 蛋白的表达与周围正常细胞的表 达不一致，进一步检测发现，其中半数尸打，基因的启动子区有c p g 位点的甲基 化，甲基化的p e r l 基因失去表达活性而引起近日节律失调，并且c p g 位点是 否甲基化与癌基因c e r b 的表达紧密相关，n ，j 基因表达失活的同时导致癌基因 c e r b 过度表达，因此可推测p e r l 可能在乳腺癌的发生发展中发挥着重要作用 p 2 1 。p e r j 与机体的生物代谢有关。在凡r 或凡以突变的大鼠体内，5 氨基酮 戊酸合酶2 表达的节律消失，而它又是红细胞内十因子( 亚铁血红素) 合成的 限速酶 3 3 j 。n r 与药物成瘾有关。研究发现胚胎细胞阶段进行n r ，等位基因突 变的n ，。果蝇突变体对可卡因的敏感性行为反应降低，而野生型果蝇接触可卡 因时表现出如人或小鼠等所表现出来的药物反应1 3 4 - l 。由此可见凡r ，在维系机 体正常生理生化状态中发挥着重要作用。 近年来，有人采用d n a 芯片技术对s c n 和其它外周组织的近日节律基因 进行了大规模的筛选 3 6 - 3 8 1 。发现各组织呈近日节律表达的基因多达1 0 。不同 组织如s c n 和肝脏之间，肝脏和心脏之间存在5 - 1 0 的共表达基因。其中n r j 基因在多数组织中均有表达1 3 9 - 4 2 1 。目前的研究表明，人1 ：3 腔粘膜和皮肤细胞中 h p e r l 、h c r y l 、h b m a l l 基因都有近日节律表达；人外周血单个核细胞( p b m c ) 中h p e r l h p e r 2 、h p e r 3 和h d e c l 基因也存在近日节律表达。但迄今为止，n r 无论是在近日节律调控系统还是在疾病发生发展中的具体机制尚不十分清楚。 比如，尽管我们知道p e r 和c r y 相互作用后可以抑制c l o c k b m a i ，1 异二聚 体与n ，和c r y 基因上游启动子区的e b o x 的结合，从而使心r j 、n 以、凡刀、 c r y l 、c r y 2 等基因的转录减少，但对其具体发生机制所知甚少。尸台r j 在多种疾 病的发生发展中的作用和机制也远没有研究清楚。因此十分有必要对肋j 进行 深入系统的研究。近年来研究者们已陆续发现了一些和p e r l 相互作用的蛋白。 如n o n o 和w d r 5 蛋白可以通过影响p e r l 的活性而参与调控近日节律的分子 振荡 4 3 o 通过酵母双杂交技术筛选到的p e r l 相互作用蛋白p i p s 、r a c k 、l a m r l 可能与近日节律的信号输入和输出有关【槔舶j 。 h p e r l 和转录因子a r n t 、a h r 及s i m 共有一个p a s 结构域1 4 7 , 4 8 ，但与这 四川大学硕上学位论文 3 个转录因子不同的是，h p e r l 没有碱性螺旋环螺旋结构( b a s i c h e l i x l o o p h e l i x ，b h l h ) ，也没有d n a 结合域【4 8 】。p a s 结构域由约2 6 0 3 l o 个 氨基酸组成1 4 9 1 ，分为p a s 1 和p a s 2 两个保守区域。在p a s 1 和p a s 2 间为一 相对非保守的间隔序列垆。p a s 结构域由于结构较长和序列的多样性，可执行 众多的生化功能。其中最主要的功能是介导p a s 蛋白的二聚化以及非p a s 蛋白 相互作用【4 8 ，卯】。研究证实，h p e r l 的p a s 结构域是蛋白与蛋白之间相互作用的 位点。由于h p e r i 没有d n a 结合的结构域，其功能的发挥很可能是通过与蛋 白的相互作用来实现的，因此，我们选择h p e r l 的p a s 结构域作为研究的对象， 以期找到与”e r l 相作用的蛋白。 酵母双杂交系统( y e a s tt w o h y b r i ds y s t e m ) 是在真核模式生物酵母中进行的， 研究活细胞内蛋白质相互作用的一种有效手段，对蛋白质之间微弱的、瞬间的 作用也能够通过报告基因的表达产物敏感的检测得到，具有很高的灵敏度，是 近年来在研究蛋白与蛋白相互作用中首选的方法之一。自1 9 8 9 年n a t u r e 杂志首 先描述该系统以来p “，这种研究蛋白质相互作用的方法得到愈来愈广泛的应用， 并得到不断完善和发展。酵母双杂交系统最突出的特点是可以在细菌、噬菌体 或酵母这些生长快速容易操作的体系中研究哺乳动物活细胞内的蛋白质一蛋白 质之间的相互作用，而且通过筛选ed n a 文库就可以直接找到与感兴趣的蛋白 相互作用蛋白的d n a 序列。它具有如下优点：1 ) 采用酵母作为报道株，菌株生 长速度快，步骤简单，容易操作。所有实验操作均在核酸水平上进行，省去了 纯化蛋白质的繁琐步骤；筛选出与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白后，可以同时获 得该蛋白的编码基因，并不需重建这种相互作用。2 ) 敏感度高。许多微弱或瞬间 的蛋白之间相互作用，可借助报告基因表达过程中多级放大效应反映出来。3 ) 在真核酵母活细胞内进行，蛋白易于保持天然折叠状态，不易受外界影响，作 用条件更接近体内真实水平情引。4 ) 酵母有许多营养缺陷标记，结果易于筛选。5 ) 应用范围比较广泛。酵母双杂交系统可用不同器官、组织和细胞构建e d n a 文 库，用于分析胞浆蛋白、胞核蛋白与膜结合蛋白等多种不同部位及功能的蛋白； 另一方面，酵母双杂交系统中的诱饵蛋白可以是完整的蛋白质，也可以是蛋白 质的一个功能区，甚至可以是约2 2 个氨基酸的短肽，这更扩大了系统的运用范 围1 5 4 1 。此系统可应用于以下方面 5 5 - 5 8 1 ：1 ) 寻找与目的蛋白相互作用的蛋白，尤 其是筛选e d n a 文库。2 ) 可用于特异性检测己知蛋白之间的相互作用。3 1 确定蛋 g 四川大学硕j 二学位论文 白相互作用位点甚至关键氨基酸。4 1 确定蛋白之间弱相互作用。5 ) 确定基因治疗 中多肽类药物作用机制。6 ) 建立蛋白相互作用图谱。 本世纪8 0 年代末期对真核转录因子的研究为酵母双杂交系统的创立提供了 理论基础。研究证实，真核生物基因中有一种特殊的上游活化序列( u p s t r e a m a c t i v a t i n gs e q u e n c e ，u a s ) ，可以在转录水平上对基因表达进行调控。很多真核 基因的表达处于低水平，一旦有转录激活蛋白与这些基因的上游活化序列相结 合则会诱导基因高水平表达。酵母的转录激活蛋白g a l 4 具有两个相互独立的 结构域：d n a 结合结构域( b i n d i n gd o m a i n ，b d ) 和转录激活结构域( a c t i v a t i o n d o m a i n ，a d ) 。b d 由位于n 末端的1 1 4 7 个氨基酸构成，负责结合上游活化 序列，具有结合特异性d n a 序列的功能。a d 由位于c 末端的7 6 8 8 8 1 个氨基 酸构成，负责通过与转录过程中的其它成份之间的结合作用引导r n a 聚合酶复 合体启动，激活效应基因的转录。二者相辅相成不可或缺，前者负责使转录激 活结构域定位于所调节基因的上游，后者负责基因的转录激活。只有当两者结 合才能作为转录激活蛋白起作用，分开则不能起作用。理论上，任何一个a d 都 可以与任何一个b d 结合组成一个具有功能的转录激活蛋白激活基因的转录。而 且，即使b d 和a d 之间没有共价结合，只要二者能够通过一定的方式在空间上 彼此靠近( 如借助其他蛋白的相互结合而足够接近) ，也同样可以组建一个具 有功能的转录激活蛋i 兰1 1 5 9 。 基于上述理论，f i e l d s 和s o n 9 1 5 2 j 首先提出了酵母双杂交系统。目前发展起 来的各种双杂交系统大多是以f i e l d s 等建立的系统为基础的。典型的酵母双杂交 系统通常包括一种经过改造的酵母菌株和两个表达融合蛋白的重组质粒。酵母 改造菌株已经被去除了相应转录激活因子的编码基因，但含有u a s 和特定的报 告基因( l a c z ，h i s 3 ，l e u 2 等) ，因此酵母菌株本身并无报告基因的转录活性。 其报告基因的激活有赖于外源转录激活因子的转入，即b d 和a d 的转入。酵母 双杂交系统巧妙的将酵母转录因子的两个功能域分解，然后分别与有待研究的 蛋白质( x 或y ) 形成融合蛋白，即两个杂交体b d x 和a d y ，一般将b d x 称为诱饵蛋白( b a i tp r o t e i n ) ，a d y 则被称为猎物蛋白( p r e yp r o t e i n ) 。将这两 个融合蛋白在酵母菌种共表达，如果x 和y 之间存在相互作用，则激活酵母菌 株报告基因的转录活性使之表达。反之，x 和y 之间没有相互作用时报告基因 四川大学硕t ：学位论文 将不表达( 图3 ) 。这样可通过生化或遗传学的方法检测报告基因的转录与否以 筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白质。 图3 酵母双杂交系统构建的基本的原理 因此，本研究利用酵母双杂交技术，从人血液e d n a 文库中筛选与p e r l 相互作用的新蛋白，以进一步了解p e r l 在近日节律系统的分子振荡机制以及在 各种疾病的发生发展中的作用机制。 婴型奎兰堡兰兰鱼堡苎 参考文献 1 - p i l l e n d r i g hc s t e m p o r a lo r g a n i z a t i o n ：r e f l e c t i o n so fad a r w i n i a nc l o c k - w a t c h e r , a n n u r e v p h y s i 0 1 1 9 9 3 ，5 5 ：1 7 5 4 2 h a s t i n g sm h ，r e d d ya b ，m a y w o o de s ac l o c k w o r kw e b ：c i r c a d i a nt i m i n gi nb r a i na n d p e r i p h e r y , i nh e a l t ha n dd i s e a s e n a t r e v n e u r o s c i 2 0 0 3 4 ：6 4 9 - 6 6 1 3 r e p p e r ts m ，w e a v e rd r c o o r d i n a t i o no fc i r c a d i a nt i m i n gi nm a m m a l s n a t u r e 2 0 0 2 ，4 1 8 9 3 5 - 9 4 1 4 s c h i b l e ru ，s a s s o n e - c o r s ieaw e bo f c i r c a d i a np a c e m a k e r s c e 2 0 0 2 i1l ：9 1 9 9 2 2 5 d c k l e i n , & y m o o r e s m r e p p e f ts u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u s ：t h em i n d sc l o c k ( o x f o r du n i v p r e s s ，n e wy o r k , 1 9 9 1 ) 6 d r w e a v e r ac i r c a d i a nc l o c k n a t u r e 2 0 0 3 4 2 1 ：1 7 7 - 1 8 2 7 m o o r er y e i c h l e rv b l o s so fac i r c a d i a na d r e n a lc o r t i c o s t e r o n e r h y t h mf o l l o w i n g s u p r a c h i a s m a t i cl e s i o ni nt h er a t b r a i nr e s 1 9 7 2 ，4 2 ：2 0 1 - 2 0 6 8 s a w a k iy ，n i h o n m a t s ui ，k a w a m u r ah t r a n s p l a n t a t i o no ft h en e o n a t a l s u p r a c h i a s m a t i c n u c l e u si n t or a t sw i t h c o m p l e t eb i l a t e r a ls u p r a c h i a s m a t i el e s i o n n e u r o a c ir e s 1 9 9 4 1 ： 6 7 - 7 2 9 r u t t e rj ，r e i e km ，m c k n i g h ts l m e t a b o l i s ma n dt h ec o n t r o lo f c i r c a d i a nr h y t h m s a n n ur e v b i o c h e m 2 0 0 2 ，7 1 ：3 0 7 - 3 3 1 1 0 c l a y t o nj d ，k y r i a c o uc p ，r e p p e r t k e e p i n gt i m ew i t ht h eh u m a ng e n o m e n a t u r c 2 0 0 1 1 5 ； 4 0 9 ( 6 8 2 2 ) ：8 2 9 - 8 3 1 1i c a m a c h of ，c i l i om ，g u oy ，e ta 1 h u m a nc a s e i nk i n a s ei d e l t ap h o s p h o r y l a t i o no fh u m a n c i r c a d i a nc l o c kp r o t e i n sp e r i o dia n d2 f e b s l e # 2 0 0 1 ，4 8 9 ：1 5 9 - 1 6 5 1 2 e i d ee j ，v i e l h a b e re l ，h i n zw a , c ta 1 t h ec i r c a d i a nr e g u l a t o r yp r o t e i n sb m a l la n d c r y p t o c h r o m e s a r es u b s t r a t e so fc a s e i nk i n a s e l e p s i l o n j b t 0 1 c h e m 2 0 0 2 2 7 7 ： 1 7 2 4 吕- 1 7 2 5 4 四川大学硕j ：学位论文 1 3 k e e s l e rg a ，c a m a c h of ，g n oy ，e ta i p h o s p h o r y l a t i o na n dd e s t a b i l i z a t i o no f h u m a n p e r i o di c l o c kp r o t e i nb yh a m a nc a s e i nk i n a s eie p s i l o n n e u r o r e p o r t 2 0 0 0 ，l l ( 5 ) ：9 5 1 9 5 5 1 4 一l o w r e yp l , s h i m o m u r ak a n t o c hm p ，e ta 1 p o s i t i o n a ls y n t e n i cc l o n i n ga n df u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o no f t h em a m m a l i a nc i r c a d i a nm u t a t i o nt a u s c i e n c e 2 0 0 0 2 8 8 ：4 8 3 - - 4 9 2 1 5 n i c o l a sc e r m a k i a n ，d i a n eb b o i v i nam o l e c u l a rp e r s p e c t i v eo fh u m a nc i r c a d i a nr h y t h m d i s o r d e r s b r a nr e s e a r c hr e v 招w s2 0 0 3 ；4 2 ：2 0 4 - 2 2 0 1 6 n i c h o l a si l l ，p a u lec e n t r a la n dp e r i p h e r a lc i r c a d i a no s e i l l a t o r m e c h a n i s m si nf l i e sa n d m a m m a l s j o u r n a l o f c e l l s c i e n c e2 0 0 2 ；1 1 5 ：3 3 6 9 3 3 7 7 1 7 o k a m u r ah ，m i y a k es ，s u m iy ，e ta 1 p h o t i ci n d u c t i o no f m p e r la n dr o p e r 2i nc r y - d e f i c i e n t m i c el a c k i n ga b i o l o g i c a lc l o c k s c i e n c e ，1 9 9 9 ，2 8 6 ：2 5 3 1 - 2 5 3 4 1 8 h o n m as ，k a w a m o t ot ，t a k a g iy ，f n j i m o t ol ( ，s a t of ，n o s h i r om ，k a t oy ，h o n m ak d e c i a n dd e c 2a l er e g u l a t o r so ft h em a m m a l i a nm o l e c u l a rc l o c k n a t u r e 2 0 0 2 ，2 4 ；4 1 9 ( 6 9 0 9 ) 8 4 1 一 9 p r e i t n e rn ，d a m i o l af ，l o p e rm o l i n al ，e ta 1 t h eo r p h a nn u c l e a rr e c e p t o rr e v - e r b c o n t r o l sc i r c a d i a nt r a n s c r i p t i o nw i t h i nt h ep o s i t i v el i m bo f t h em a m m a l i a nc i r c a d i a no s c i l l a t o r c p , 2 0 0 2 11 0 ：2 5 1 - 2 6 0 2 0 u e d ah r , c h e nw ，a d a c h ia ，e la 1 ai r a n s c r i p t i o nf a c t o r r e s p o n s ee l e m e n tf o rg e n e e x p r e s s i o nd u r i n gc i r c a d i a nn i g h t n a t u r e ，2 0 0 2 ，4 1 8 ：5 3 4 - 5 3 9 2 1 y uw ，n o m u r am ，i k e d am i n t e r a c t i n gf e e d b a c k l o o p sw i t h i nt h em a m m a l i a nc l o c k ： b m a l ! i sn e g a t i v e l ya u t o r e g u l a t e da n du p r e g u l a t e db yc r y l ，c r y 2 ，a n dp e r 2 b i o c h e m b i o p h y sr e sc o m m ，2 0 0 2 ，2 9 0 ：9 3 3 - 9 4 2 2 2 o k a m u r ah i n t e g r a t i o no fm a m m a l i a nc i r c a d i a nc l o c ks i g n a l s ：f r o mm o l e c u l et ob e h a v i o r j e n d o c r i n 0 1 2 0 0 3 ，17 7 ( 1 ) ：3 - 6 2 3 b a ekj i nx w ，m a y w o o de s ，e ta 1 d i f f e r e n t i a lf u n c t i o n so fr o p e r 2 ，m p e r 2 a n dr o p e r 3i n t h es c nc i r c a d i a nc l o c k n e u r o n ，2 0 0 1 ，3 0 ：5 2 5 5 3 6 2 4 z h e n gb ，a l b r e c h tu ，k a a s i kk e ta 1 n o n r e d u n d a n tr o l e so ft h em 忍，a n dm p e r 2 g e n e si n 1 2 婴型查兰堡! 兰垡堡苎 t h em a m m a l i a nc i r c a d i a nc l o c k c e , 2 0 0 1 ，1 0 5 ：6 8 3 - 6 9 4 2 5 s h i g e y o s h iy ，m e y e rb e r n s t e i ne ，y a g i t sk c ta 1 r e s t o r a t i o no fc i r c a d i a nb e h a v i o r a l r h y t h m si nap e r i o dn u l ld r o s p h i l am u t a n t ( p e r 0 1 ) b ym a m m a l i a np e d o dh o m o l o g u e sm p e n a n d r o p e r 2 g e n e s c e l l s 2 0 0 2 ，1 ：1 6 3 1 7 1 2 6 c h a l l c te ，p o i r e lv j ，m a l a na ，e ta 1 l i g h te x p o s u r ed u r i n gd a y t i m em o d u l a t e se x p r e s s i o no f p e r la n dp e r 2c l o c kg e n e si nt h es u p r a c h i a s m a t i cn u c l