（生理学专业论文）牛免疫球蛋白lambda轻链恒定区序列的克隆与研究.pdf

摘要 抗体是一种重要的生物大分子，对于人体免除细菌、病毒等病原体的侵扰起着非常重要的 作用。人类多克隆抗体在诸多疾病的治疗过程中显示出了巨大的功效，但由丁二它来源的局限性限 制了其在临床应用中的发展。转基因技术的发展有可能使动物获得人的免疫球蛋白基因，从而大 最生产人的抗体，即利用基因打靶技术，敲除牛的免疫球蛋白基因，同时敲入人的免疫球蛋白基 因，牛生产的抗体就可能转变成表达人免疫球蛋白基因的抗体，可用来给人体注射，治疗艾滋病、 癌症等目前不能治疗的恶性疾病。 本研究的主要目的是获得关于牛免疫球蛋白l a m b d a 轻链恒定区的序列为获得敲除免疫球 蛋白基因的转基因牛打下基础。通过筛选牛基因组d n a 文库，获得含有牛免疫球蛋白l a m b d a 轻 链的阳性克隆进而获得免疫球蛋白l a m b d a 轻链c 区的序列，主要工作包括： 1 、以牛l a m b d a 轻链cx 区保守序列为探针，利用p c r 与原位杂交的方法，从牛 噬菌体基 因组文库中筛选得到两个含有牛免疫球蛋白l a m b d a 轻链cx 区的阳性克隆，酶切分析表明他们分 别含有大小为7 k b 和9 k b 的外源片段。采用p c r 筛选系统，从牛的b a c 基因组文库中筛选得到一 个含有牛免瘦球蛋白l a m b d a 轻链c 区的阳性克隆。酶切后的脉冲电泳( p f g e ) 结果表明其插入 片度长度为1 3 0 k b 左右。 2 、为研究l a $ b d a 轻链c x 的数量和i g 的结构，将得到的b a c 阳性克隆用不同限制性内 切酶酶切，然后与4 0 8 b p 的cx 区特异性探针杂交，s o u t h e r nb l o t 杂交结果显示有7 条阳性条 带。这一结果表明牛免疫球蛋白l a m b d a 轻链至少含有7 个c - 区，跨越了轻链大小约4 0 k b 的范 嗣。 3 、将筛选得到的 噬菌体阳性菌斑和b f i c 阳性克隆酶切后的阳性条带分别回收，连接于克 隆载体p g e m 一3 z f ( + ) 上，得到5 个重组质粒；p g e m 一3 z f 2 8 ，p o e m - 3 z f s l ，p g e m - 3 z f s 2 ，p g e m - 3 z f s 3 和p g e 8 3 z f s 4 ，含有c - 的插入片段的长度分别为2 6 6 0 b p ，1 6 8 2 b p ，2 5 1 4 b p ，1 8 6 0 b p 和1 8 0 6 b p 。 4 、利用获得的五个阳性克隆片段的序列，设计六对不同的引物进行p c r 扩增，分析扩增产 物彼此间的芙系，结果表明阳性片段s 3 ，s 2 和s 4 依次相邻，分布在牛l a r a b d a 轻链上1 5 k b 的范 围内。 5 、将本研究得到牛的4 个cx 基因序列与人的7 个c 。和小鼠的4 个cx 进行同源性比较发现， 牛i g c x 与小鼠i g cx 的同源性高于牛t g c - 与人i g c - 的同源性，从进化起源上看，牛与小鼠可能 有更近的亲缘关系。 关键词：牛，免疫球蛋白基因，l a m b d a 轻链，转基因 a b s t r a c t i m m u n o g l o b u l i ni sv e r yi m p o r t a n tf o rh u m a nb o d yt or e s i s tt h ep a t h o g e n ss u c ha sb a c t e r i aa n dv i r u s h u m a np o l y c i o n a la n t i b o d i e s ( h p a b s ) a r eu s e f u lt h e r a p e u t i c st ot r e a tm a n yd i s e a s e s , b u tt h e ya r e a v a i l a b l eo n l yf r o mh u m a nd o n o r sa n dt h e i rs u p p l ya n da p p l i c a t i o ni sl i m i t e d t r a n s g e n i cc a t t l ec a r r y i n g h l gl o c ic o u l db eu s e f u lf o rl a r g ev o l u m ec o m m e r c i a lp r o d u c t i o no f h p a b s ，w h i c hc a l lb eu s e di nc l i n i c t h e r a p i ae s p e c i a l l a r yf o rt h e d i f f i c u l td i s e a s e ss u c ha sa i d sa n dc a n c e r s t r a n s g e n o s i sc o m p f i s e s k n o c k i n g - o u tb o v i n el gg e n e si nl i v e s t o c ka n dk n o c k i n g - i nh l gg e n el o c i t h ef o c u so ft h e d i s s e r t a t i o nw o r ki st og a i ns o m es e q u e n c ei n f o r m a t i o na b o u tt h eb o v i n e i m m u n o g l o b u l i nl a m b d al i g h tc h a i nc o n s t a n tr e g i o n s e v e m lp o s i t i v ec l o n e sc o n t a i n i n gt h eb o v i n ec g e n es e g m e n tw e r ei s o l a t e df r o mb o v i n eg e n o m i cd n al i b r a r y a b o u t15 k bg e r m l i n ed n as e q u e n c e w a ss e q u e n c e d t h er e s e a r c hw o r ki n c l u d i n g ： 1 ab o v i n eg e n o m i el - p h a g ed n al i b r a r ya n dab o v i n eg e n o m i cb a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ( b a c ) l i b r a r yw e r es c r e e n e dw i t hap r o b es p e c i f i cf o ri m m u n o g l o b u l i nl a m b d al i g h tc h a i nl o c i t w o r e c o m b i n a n tp h a g ec l o n e sc o n t a i n i n gt h ec xg e n es e g m e n tw e r ei s o l a t e df r o mt h el - p h a g el i b r a r ya n d t h ei n s e r ts e g m e n t sw e r e7 k ba n d9 k br e s p e c t i v e l y o n ep o s i t i v eb a cc l o n ew a si s o l a t e da n dp u l s ef i e l d g e le l e c t r o p h o r e s i s ( p f g e ) r e s u l tv e r i f i e dt h a tt h ei n s e r ts i z ew a sa b o u t1 3 0 k b 2 t h eb a cc l o n ed n aw a sd i g e s t e dw i t he i g h td i f f e r e n tr e s t r i c t i o ne n z y m e sa n ds u b j e c t e dt o s o u t h e r nb l o ta n a l y s i sb yh y b r i d i z a t i o nw i t ha4 0 8 b pc xp r o b e s e v e np o s i t i v el a n e sw e r ep r e s e n t e da t t h em o s t t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r ea tl e a s ts e v e nc 1s e g m e n t si nt h eb o v i n ei m m u n o g l o b u l i n l a m b d al i g h tc h a i nc o n s t a n tr e g i o n 3 f i v ep o s i t i v el a n e si s o l a t e df r o mt h ec l o n e sw e r ec l o n e di n t ot h ep g e m 3 z 疽十) v e c t o ra n dt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dw e r en a m e dp g e m - 3 z f 2 8 ，p g e m - 3 z f s l ，p g e m - 3 z f s 2 ，p g e m - 3 z f s 3a n d p g e m - 3 z f s 4 t h ei n s e r ts e g m e n t sc o n t a i n e dt h ec x g e n ew e r es e q u e n c e da n dt h el e n g t ho ft h e mw e r e 2 6 6 0 b p ，1 6 8 2 b p ，2 5 1 4 b p ，1 8 6 0 b pa n d1 8 0 6 b pr e s p e c t i v e l y 4 c o n s t a n tr e g i o n - s p e c i f i cp c rw e r ec o n d u c t e dt oi n v e s t i g a t eh o wt h ep o s i t i v es e q u e n c e sw eg o t a r r a n g e du s i n gs e v e r a ld i f f e r e n tp r i m e r s t h ep c rp r o d u c t si n d i c a t e dt h a tt h es e g m e n t ss 3 s 2a n ds 4 a l i g n e di nt h el a m b d al i g h tc o n s t a n tr e g i o na n ds p a na b o u t15 k bd i s t a n c e 5 c o m p a r i n gf i f t e e nc xs e q u e n c e s ，i n c l u d i n gf o u rb o v i n e , s e v e nh u m a na n df o u rm o u s ei g c ，w e h a v em a p p e dt h ee v o l u t i o nt r e eo ft h el a m m al i g h tc h a i nc o n s t a n tg e n e s t h eh o m o l o , g yb e t w e e nt h e b o v i n ea n dt h em o u s ew a sh i g h e rt h a nt h a tb e t w e e nt h eb o v i n ea n dt h eh u m a n t h eb o v i n ea n dt h e m o u s em a y b eh a v ec l o s e rr e l a t i v er e l a t i o n s h i pf r o me v o l v e m e n ta s p e c t k e yw o r d s ：b o v i n e ，i m m u n o g l o b u l i n ，l i g h tc h a i nc o n s t a n tr e g i o n , t r a n s g e n e i i a b b a c c c d r d d a b d b p d s f v e f r g e a s h v r i g j l m c a b m k m r u p p a c p f g e r a s r s s s c f v s l g s p t d t v y a c 缩略词 a m i b o d y b a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e s c o n s t a n tr e g i o n c o m p l e m e n t a r i y d e t e r m i n i n gr e g i o n d i v e r s i t yr e g i o n s i n g l ed o m a i na n t i b o d y s d n a b i n d i n gp r o t e i n d i s u l f i d e ，s t a b i l i z e df v e n h a n c e r f r a m e w o r kr e g i o n g e n ee n g i n e e r i n ga n t i b o d y s h y p e r v a r i a b l er e g i o n i m m u n o g l o b u l i n j o i n i n gr e g i o n l e a d e rs e q u e n c e m o n o c l o n a la n t i b o d y m e m b r a n ei g m o l e c u l a rr e c o g n i t i o nu n i t p r o m o t e r p 1 d e r i v e da r t i f i c i a lc h r o m o s o m e p u l s e df i e l dg e le l e c t r o p h o r e s i s r e c o m b i n a n ta n t i b o d y r e c o m b i n a t i o ns i g n a ls e q u e n c e s i n g l ec h a i nf v ， s e c r e t e di g s e c r e t o r yp i e c e t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e v a r i a b l er e g i o n y e a s ta r t i f i c i a lc h r o m o s o m e s i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作内容及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或 证书丽使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：1 鸯丽劫 时间： 上咿歹 年占月印目 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：7 筝面拍 时间：2 j -年g 月伽日 导师签名： 似。够 时间：硼年z f 月纱日 中国农业人学博士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 免疫球蛋白的生物学特性 抗体( a n t i b o d y ，h b ) 是由b 淋巴细胞识别抗原后增殖分化成浆细胞，由浆细胞合成分泌 的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。1 9 6 8 年和1 9 7 2 年世界卫生组织和国际免疫学会 联合会的专r j 委员会先后决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋 白( i m m u n o g l o b u l i n ，i g ) 。免疫球蛋白是化学结构的概念，而抗体是其生物学功能的概念。免 疫球蛋白分为分泌型( s e c r e t e di g ，s i g ) 和膜型( m e m b r a n ei g ，m i g ) ，前者主要存在与血液、 组织液及外分泌液中发挥免疫作用，后者是b 细胞表面的抗原受体。 1 1 免疫球蛋白的基本结构 1 1 1 重链和轻链 1 )重链( h e a v yc h a i n ，n 链) ：i g u 的分子量为5 0 7 0k d a ，由4 5 0 5 5 0 个氨基酸残基组成， 由于构成重链的氨基酸、糖分子等成分的种类、含量和结构的差异，重链的免疫原性各不 相同，据此可将i g 分为五类( c l a s s ) ；i g a 、i g d 、i g e 、i g g 、i g i ，其相应的重链分别为a 、 6 、e 、y 、u 链。同类i g 根据其铰链区氦基酸组成和二硫键数目、空间、位置的不同， 又可分为不同的亚类( s u b c l a s s ) ，如i g a 和i g g 又分成：i g a l 和i g a 2 、i g g l 、i g g 2 、i g g 3 和1 9 6 4 。 2 )轻链( l i g h tc h a i n ，l 链) ：i g l 的分子量约2 4 k d a ，由2 1 0 个氨基酸残基组成。由于轻链 免疫原性的不同，可分为k 和 链两种，据此将i g 分为k 和 两型( t y p e ) 。任一型轻链 可以和任一类重链组成完整的i g 分子。在人类血清中k 型和 型i g 的含最分别为6 0 和 4 0 。 11 2 可变区和恒定区 1 ) 可变区( v a r i a b l er e g i o n ，v 区) ：在i g 多肽链的氨基端，轻链的1 2 和重链的1 4 ( y 、 n 、6 ) 或1 5 ( u 、e ) 范围内，因氨基酸组成及序列变化较大，称为可变区。重链和轻链 的v 区分别以v h 和v l 表示。在v h 和v l 内各有三个氨基酸组成和排列顺序易发生高度变 化的区域，称为高变区( h y p e r v a r i a b l er e g i o n ，h v r ) 或互补性决定区 ( c o m p l e m e n t a r i y d e t e r m i n i n gr e g i o n ，c d r ) ，分别为c d r i 、c d r 2 和c d r 3 ，其中c d r 3 的变异程度最大。v h 和v l 的3 个c d r 共同组成i g 的抗原结合部位( a n t i g e n - b i n d i n gs i r e ) 。 c d r 的结构差异决定了i g 分子与抗原结合的特异性，i g 借此部位识别结台抗原发挥免疫 效应。 i g 分子v 区c d r 之外的部位氨基酸组成及排列相对保守，称为骨架区( f r a m e w o r k 1 中国农业人学博士学位论文第一章文献综述 r e g i o n ，f r ) ，v h 和v l 各有4 个骨架区f r l ，f r 2 ，f r 3 和f r 4 。其作用主要是稳定c d r 的 空间结构，以利于t g 的c d r 与抗原决定簇精细的特异结合。 2 ) 恒定区( c o n s t a n tr e g i o n ，c 区) ：在i g 近羧基端的轻链的1 2 及重链的3 4 或4 5 区 域内，由于其氨基酸组成和排列顺序在同一物种的同一类别i g 中相对稳定，而被称为恒定 区，具有激活补体，结合细胞表面f c 受体而介导调理、穿过胎盘和粘膜屏障等免疫作用。 1 1 3 铰链区( h i n g er e g i o n ) 位于c m 和c 咄之间，铰链区含有丰富的脯氨酸，不形成a 一螺旋，因此易伸展弯曲。对蛋 白酶敏感，易被木瓜蛋白酶和胃蛋白酶水解。其主要功能是通过改变两个y 形臂之间的距离，使 i g 高变区易于结合不同空间位置的抗原表位。五类i g 中只有i 洲和i g e 没有铰链区结构。 图1 1 抗体( i g q ) 基本结构图 f i g | ，lt h e b a s i cs t l a l c t u r e o f i g o i 注：田11 和12 来i l l 免疫学信息耐 1 1 4 功能区 图1 ，2 抗体立体结构图 f i 9 1 2t h r e e - d i m e n s i o n e dm o d e lo f t h eh u m a ni g g i g 分子的两条重链和两条轻链都可以折叠成几个球形结构。每个球形结构一般均具有其特 定的功能，称为i g 的功能区或结构域( d o m a i n ) 。每个功能区约有i i 0 个氨基酸残基组成，其二 级结构是由儿股多肽链折叠形成的两个反向平行的1 3 片层，b 片层中心的两个半胱氨酸残基由 一个链内二硫键垂直连接，形成“b 桶状”( 1 3 一b a r r e l ) 结构。 轻链有v 。和c 。两个功能区：i 耵、i g a 和i g d 的重链有h 、c m 、c m 、c h s 四个功能区，而i g m 和i g e 除此之外还含有一个c m 功能区。 2 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 115 其它成分 构成免疫球蛋白的其他结构还有：连接链( j o i n i n gc h a i n ，j 链) 和分泌片( s e c r e t o r yp i e c e ， s p ) ，j 链存在于分泌型i g a 和i g m 中，是由浆细胞产生的一种糖蛋白，富含半胱氨酸，主要作用 是以共价键的方式由两个二硫键将i g 单体连接形成多聚体，如i g a 二聚体和i g m 五聚体。s p 又 称分泌成分，是由粘膜上皮细胞产生的一种含糖多肽，作为分泌型i g a 的一个辅助成分，以非共 价键方式连接到i g a 分子二聚体上，与j 链共同组成分泌型i g a ( s i g a ) 。 1 2 免疫球蛋白基因的结构 免疫球蛋白( i g ) 分子由位于不同染色体上的i gk 、i g 和i g h 基因编码。编码一条i g 多 肽链的基因是胚系中数个分隔开的d n a 片段( 基因片段) 经重排而形成的。免疫球蛋白基因结构 的发现经历了一个复杂的过程。1 9 6 5 年，d r e y e r 和b e n n e t t 首先提出假说，认为i g 的v 区和c 区由分隔存在的基因所编码，在淋巴细胞发育过程中这两个基因发生易位而重排在一起。l o 年之 后，s u s u m ut o n e g a w a 及其同事在一种产生抗体的骨髓瘤或浆细胞瘤的研究中，发现其细胞的i g 基因结构与其他不承担i g 合成的胚胎细胞的i g 基因不同。他们利用s o u t h e r n 点杂交技术所证 明：在产生和不产生抗体的细胞中，i g 基因的d n h 片段大小不同，对这种d n a 片段大小不同的解 释是，任何i g 轻链( l ) 或重链( h ) 的v 区和c 区均有不同的基因片段所编码。这些基因片段 在胚胎细胞中的定位相隔较远。而在承担抗体合成的细胞，如b 细胞中却连结在一起。这样，i g 基因在b 细胞的个体发育中经历了d n a 的重排或重组过程。t o n e g a w a 等因对免疫球蛋白基因结构 研究有重大突破获1 9 8 7 年诺贝尔生理学和医学奖。 1 2 1i g 重链基因 人的重链基因位于1 4 号染色体，由先导序列基因( l e a d e rs e q u e n c e ，l ) 、可变区基因 ( v a r i a b l er e g i o n ，) 、多样性基因( d i v e r s i t y ，d h ) 、连接区基因( j o i n i n g ，j h ) 和恒定区基 因( c o n s t a n tr e g i o n ，c a ) 五种不同基因片段所组成。v 、d 、j 、c 的各个外显子之间都有无编码 功能的长短不等的碱基序列插入。 1 )先导序列基因( l )每个v u 基因片段上游有两个l 基因片段，编码约2 0 3 0 个疏水性氨 基酸的先导序列( 或称信号肽) 。 2 )可变区基因片段( v 。)人类基因组中存在许多基因片段，目前已鉴定出1 2 0 个左矗 具有开放阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) 并能进行重排转录和表达功能性v h 基因片段。 v 1 基因片段编码重链可变区n 端的9 6 1 0 1 个氨基酸残基，包括c d r l 、c d r 2 和f r l 、f r 2 和f r 3 。小鼠v h 基因片段至少可分为九个家族( f a m i l y ) ，每个家族含有2 6 0 个成员不等， 多为集群分布。 3 )多样性基冈片段( d h )d h 基因片段在v l t 基因的3 端，仅存在于重链基因中而不存在下 轻链基因，蹁基因片段编码重链v 区大部分c d r 3 ，其特点是序列和长度多变。人类有3 0 多 个有功能的d f l 片段可编码5 9 个氨基酸。重组时先进行d h 和j h 的重组，然后再进行v - d r j n 中国农业大学博上学位论文第章文献综述 的重组。v , - d h 连接处、d 基因片断及d h j h 连接处编码的肽段，构成了c d r 3 4 ) 连接基因片段( j h ：)是连接v 和c 基因的片段，位于d i i 基因的3 端。j h 编码约1 5 l 7 个氨基酸残基，包括重链v 区c d r 3 中除d n 编码外的其余部分和第四骨架医。人类9 个 山基冈片段中6 个是有功能的。 5 ) 恒定区基因片段( c n )每个重链恒定区基因由多个外显子组成，位于j 基因片段的下游， 每个外显子编码一个结构域( d o n m a i n ) ，铰链区( h in g er e g i o n ) 由单独的外显子所编码， 但u 重链的铰链区是由g 2 外显子的5 端所编码。大多分泌的i g 重链c 端片段或称尾端 ( t a i lp i e e e ) 是由最后一个c 一外显子的3 端所编码，而8 链的尾端是由一个单独的外 显子所编码。小鼠c 日基因约占2 0 0 0 k b ，其外显予从5 端到3 端的排列是5 一c 。一cs c ， 。一c r c , 2 b - c ，r c 。一c 。一3 。人类c h 基因中有功能的片段为九个，其排列顺序是5 一c 。弋s c ，a c _ c 。，- cyz - cv4 - c 。一c 2 - 3 。每个c 基因包括几个外显子，编码c 医中相应的结构域。 啊l v 斗豳 l h 水f l 蛳”j h l j 水c * i 矗 铷l孙呷“ 镪- h | 彬q 争_ 鞠静溅翟渤麟鼯穗蕊露擎嘲麴嘴麓绷露麓 孟菇篡落墨鬟。1 4 譬 图1 3 小鼠免疫球蛋白重链基因结构模式围 f i g 1 3t h es t r u c t u r eo f m o u s ei m m u n o g l o b u l i nh e a v yc h a i n l 、k i lm 茹 l v k 坤 氟c k v _ i | 善一l | 卜p 锢莲睡卜塌露， z ，2 辱 k hk b 图1 4 小鼠免疫球蛋白x 轻链基因结构模式图 f i g 1 4t h es t r u c t u r eo f m o u s ei m m u n o g l o b u l i nk a p p al i g h tc h a i n 洼：图13 和14 来自免疫学信息i s l 1 2 2 i gk 链基因 人类k 基因座位于2 号染色体，v 。基因片段有8 5 个，其中5 0 个是有功能的，编码v 区n 端 的l 9 5 个氨基酸，包括c d r l 、c d r 2 和部分c d r 3 。根据核苷酸同源性，可分为7 个家族或亚群 ( s u b g r o u p ) 。j 。片段有五个，位于v 。基因的3 端，编码v 区靠近c 端的第9 6 1 0 8 氨基酸。c 。只有个，编码c 。区( 1 0 9 2 1 4 氨基酸) ，所有k 轻链具有同一结构的c 区。j 。与v 。基因间插 入序列中有增强子。 1 2 3 i g 链基因 人类 基因座位于2 2 号染色体，舍5 0 1 0 0 个vx 基因片断，可分为1 0 个家族，其中v 、l 4 中国农业大学博上学位论文第一章文献综述 vx 3 是主要的家族，在进化上比较保守。j 一和cx 成对排列，构成7 个j c 一基因组，其中4 个基 因组( 1 、2 、3 、7 ) 有转录功能。j t 和cx 之间仍有插入序列。 l lkkv 玉 c u s ，- i - 、广 心、- d 图m 苣卜叫 s 图1 5 人免疫球蛋白x 轻链基因结构模式图 f i g 1 , 5t h es t r u c t u r eo f h u m a ni m m u n o g l o b u l i nl a m b d al i g h tc h a i n 1 3 免疫球蛋白基因的重排 i g 胚系基因中重链v 、d 和j 基因片段，以及轻链v 和j 基因片段是通过基因片段的重排 ( r e a r r a n g e m e n t ) 而形成v 基因的。b 细胞发育过程中，h 基因先发生重排，先d j 重排，后v d j 重排。在重链基因重排开始时，两条染色体上的d 基因片段移位到j 基因片段而发生d j 基因的 连接。此后，只有一条染色体上的v 基因片段与d j 基因片段发生重排。在一条染色体上重排成 功后产生u 链。b 细胞发育便进入前b 细胞( p r e bc e l l ) 阶段，此时轻链基冈开始重排。只要 有一条染色体重排成功表达k 轻链，b 细胞膜上就出现单体模型i g m ( m i g m ，u2k2 ) ，进入未成 熟b 细胞( i m m a t u r e1 3c e l l ) 阶段。如果两条染色体上的k 链基因都重摊失败，则启动 轻链 基因的重排。 重排过程主要由一组萤组酶识别v 、( d ) 、j 基因片段两侧的重组信号序列，再通过切断和修 复d n a 而实现的。重组信号序列( r e c o m b i n a t i o ns i g n a ls e q u e n c e ，r s s ) 由寡核苷酸形成的七 聚体( h e p t a m e r ) 5 c a c a g t g 3 、九聚体( n o n a m e r ) 5 a c a a a a a c c 3 ，以及两者之间较 少保守性的问隔序列( s p a c e r ) 所组成。间隔序列的碱基数为1 2 或2 3 ，此跃度恰好允许d n a 螺 旋绕成一圈或两圈，得以将七聚体和九聚体靠近在一起。 重链v n 基因片段3 端和j h 基因片段的5 端都是带有2 3 b p 间隔序列的r s s ，而d h 基因片 段在5 和3 端都为带1 2 b p 间隔序列的r s s ，这种结构特点不允许重链v 、j 基因片段直接发生 重排。重链v 、d 、j 片段重排的顺序是：先a r j h 重排，然后v - i ) 1 t j n 重排。而轻链无论x 链还是 k 链，其v 基因片段3 端的r s s 带有2 3 b p 间隔序列，j 基因片段5 是台有1 2 b p 间隔序列的 r s s 。因此轻链基因的v 、j 片段可实现直接的连接。 重组酶( r e c o m b i n a s e ) 是一组参与v 、( d ) 、j 基因片段重组的酶，包括以下几种。( 1 ) r a g 一1 和r a g 一2 重组激活基因( r e c o m b i n a t i o na c t i b a t i n gg e n e ) 编码的重组激活酶r a g 1 和r a g 一2 形成的复合物是一种内切酶。r a g 一1 r a g 一2 以二聚体方式特异性识别r s s 和切断七聚体的一侧。 ( 2 ) 末端脱氧核苷酸转移酶( t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e ，t d t ) ，表达于b 细胞 前体，可将数个核苷酸通过不需要模板的方式加到d n a 的断端。在v d j 重排中，r a g t r a g 一2 复 合物识别重组信号序列，先切断双股d n a 中的一个单涟七聚体的一侧，随后将互补链也切断，在 d 片段的3 端和j 片段的5 端分别形成发夹结构。两个七聚体连接形成信号连接( s i g n a l j o i n t ) 。内切酶切开发夹结构形成了单股d n a 的一端。在末端脱氧核督酸转移酶( t d t ) 作用下， 中国农业人学博士学位论文第一章文献综述 数个核苷酸连接到d 和j 片段p 一核苷酸的游离侧，由于加入的这些核苷酸是通过非模板 ( n o n t e m p l a t e d ) 方式，故这些加入的核苷酸称为n _ 核萤酸。然，l i 彳两个单股的d n a 进行配对， 外切酶修剪掉未配对的核苷酸，最后通过d n a 合成酶补齐编码的连接点。 1 4v ( d ) j 与c 基因片段的重排和免疫球蛋白类别转换 1 9 6 4 年n o s s a l 等发现b 淋巴细胞存在着类别的转换。i g 类别转换( c l a s ss w i t c h ) 或称同 种型转换( i s o t y p es w i t c h ) 是指一个b 淋巴细胞克隆在分化过程中v 一基冈( v d j ) 保持不变， 而按一定顺序与不同的。基因片段分别发生重排。即可从i g m 转换成l g g 、i g a 或i g e 等类别或 亚类。与前面提到的v j 或v d j 重排不同，类别转换依赖与细胞的抗原刺激和t 细胞释放的细胞 因子。 重链基因的转换发生在其编码序列的5 端，在一段明显的内部重复序列上，称为s 区，即 转换区( s w i t c h r e g i o n ) ，是重链基因组内含子中的一段重复性d n a 序列。除cs 外，各个恒定区 基因片段上游都有s 区，分别命名为s ，、s l 、s 。和s 。等。s 区内含有众多串联的高度保守的d n a 重复序列，如s 。的结构为 ( g a g c t ) 。g g g g t 。，其中n 一般为2 5 ，通常为3 ，有时多达7 ，m 可达1 5 0 。 当b 细胞合成i g g l 时，s 。与sx 】首先发生结合，在两者之间的c ，、cs 和c ，3 基因片段被环 出( 1 0 0 p i n go u t ) ，由先前重排好的v 区基因( v d j ) 与c 。1 基因片段重排。转录成初级r n a 转 录本，剪切成m r n a ，翻译为y1 重链。在小鼠，b 淋巴细胞经t 细胞非依赖性活化常发生s 。s 。3 或s 。s ，2 b 的重组，因而l p s 活化小鼠b 淋巴母细胞，分泌i g 从ig i 转换为i g g 3 和i g g 2 b 。而 且在b 细胞类别转换时可以不止一次，通过分别转换到不同的c 基冈，从而表达相应不同的i g 类或弧类。 除d n a 水平缺失模型使i g 类别发生转换外，r n a 水平的可变剪接也可产生不同的t g 类型。c 。 和cs 基因片段之间无s 区，ig l l 和i g d 共表达的b 细胞系d n a 分析表明，c 。和cs 基因片段没有 发生重排，相同的出现在编码u 或8 的m r n a 上，表明它们可能有一个共同的m r n a 前提，通 过不同或差异剪接分别形成p 链m r n a 和8 链m r n a 。 t 细胞对b 细胞i g 重链基因转换有重要影响。人类t 细胞c d 4 0 l 基因突变是，重链类型转换 受阻，血清中i g m 量高，并缺乏i g d 、i g h 、i g e 。t 细胞分泌的多种细胞因子也可调节免疫球蛋 白的类型转换，如i l - 4 ，可促进i 州转换成i g e ，抑制i g g 3 和i g g 2 产生；t c f - e 对i g a 的产生 具有促进作用。 1 5 免疫球蛋白基因的表达调控 免疫球蛋白基因的表达受到多方面因素的调节，主要有转录因子和细胞因子的调节，前者主 要调节i g 基因表达的水平，后者主要与i g 类和亚类的转换有关。此外，i g 基因表达过程中存在 着等位排斥和同型排斥的规律。 1 51 核因子对i g 基因转录的调节作用 6 中国农业大学博士学位论文第章文献综述 i g 基因转录活性是由两个顺式作用元件( c i s a c t i n ge l e m e n t ) 即启动子( p r o m o t e r ，p ) 和增强子( e n h a n c e ，e ) 来凋节的。而启动子和增强子的功能又由反式作用的核因子( t r a n s a c t i n g n u c l e a rf a c t o r ) 所控制。这些核因子也称为d n a 结合蛋白( d n a b i n d i n gp r o t e i n ，d b p ) 结 合到启动子或增强子内特异的核苷酸序列，从而抑制或刺激启动子和增强子的活性。d b p 又称转 录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ) 。转录因子通常是细胞受到某些枣激后所诱导表达的，起到连 接细胞外刺激和基因表达调控的作用。 l 、a t g c a a a t 序列及其结合的转录因子 靠近每个i g v 基因转录位点的上游有一个含有t a t a 盒的启动子，控制r n a 多聚酶i i 作用的 转录过程，大多数i g 启动子含有转录因子结合的d n a 序列。i g 重链启动子含有8 个保守的核苷 酸序列a t g c a a a t ，这个序列也存在于k 轻链的启动子、重链增强子以及许多非i g 的启动子中。b 细胞i g 基因的转录依赖于启动子中这完整的a t g c a 从t 序列的存在。哺乳动物细胞中至少存在 三种特异性结合a t g c a a a t 的蛋白质即o c t i 、o c t 2 ( o t f 2 a ，和o t f 2 b 。o c t l 义称八聚体转录因 子1 ( o c t a m e rt r a n s c r i p t i o nf a c t o rl ，0 t f t ) ，广泛存在于哺乳动物的细胞中；0 t f 2 a 和0 t f 2 b 为淋巴细胞特异性转录因子，活化i g 基因的转录。 2 、g g g a ( 1 t t c c 序列和n f kb 在人和小鼠的重链和x 轻链中发现有增强子，位于j h 3 端侧，其作用在细胞内是特异性的。 当重链v d j 或x 链v j 重排厉，v 基因上游的启动予靠近增强子，使v ( d ) j c 基因重排后开始更 为有效的转录。增强子作用方式与启动于不同，呈方向非依赖方式( o r i e n t a t i o n i n d e p e n d e n t m a n n e r ) ，即增强子可作用于被转录基因的上游或下游。 1 ) n f - kb 结合靶序列的分布n f xb 结合的d n a 序列存在丁多种淋巴细胞、非淋巴细胞、病 毒基因增强子和启动予以及h i v l l 的长末端重复序列中，如某些m h c i 类基因、i l - 2 ra 链、 t c r b 链、i l 一2 、i l 一3 、i l 一6 、l f n 一、i f n 一8 、i f n 调i i 了因子、g m c s f 、s v 4 0 基因等。在 不转录k 基因的前b 细胞( p r e - bc e l l ) 系中无n p x b 活性，这些细胞用l p s 处理后可诱 导出有功能的n f - xb ，随之也刺激k 链基因的转录。 2 ) n f kb 结构及作用特点n f kb 是一个异源四聚体复合物，包含两条与d n a 结合的5 0 k d a 多肽链和两个不与d n a 直接结合的6 5 k d a 多肽链。n f kb 解离常