（发育生物学专业论文）uvb照射对中华大蟾蜍早期胚胎蛋白质表达的影响.pdfVIP

东大学硕士学位论文 中文摘要 紫外线( u l t r a v i o l e t ，u v ) 是一种非电离辐射光物理因子，其中的中波段紫外 线即u v b 对生物体有很重要的作用。为了研究u v b 对两栖类动物早期胚胎发 育的影响，本论文以中华大蟾蜍早期胚胎为实验材料，采用3 0 2n n l 中波紫外线 ( u l t r a v i o l e tr a d i a t i o nb 。u v 8 ) 照射不同发育时期的中华大蟾蜍胚胎，在发育形 态、蛋白质谱和组织表达水平检测了u v b 照射前后胚胎蛋白质表达的变化。1 ) 以3 0 4 i - t w c m 2 强度的u v b 照射不同发育时期的中华大蟾蜍胚胎，观察记录胚胎 的发育过程、统计存活率和畸变率与照射时期的关系。结果表明，u v b 照射并 不显著影响受精卵的孵化率；对较早时期胚胎( 2 细胞期囊胚期) 存活率的影响 较复杂，可明显降低较晚时期胚胎( 原肠胚神经胚) 的存活率；u v b 照射后在 不同发育时期，较早时期胚胎的畸变率也不同，而较晚时期胚胎的畸变率有明显 的上升。2 ) 提取u v b 照射前后的中华大蟾蜍囊胚和神经胚总蛋白质进行双向凝 胶电泳，胶体考马斯亮兰染色后成像，利用i m a g e m a s t e r2 dp l a t i n u m6 0 图像分 析软件进行分析。结果表明，u v b 照射对胚胎蛋白质点的个数和分布都有显著 影响：照射后囊胚变化的点1 2 9 个，包括表达上调的点1 7 个，表达下调的点1 1 个，照射后消失或增加的点1 0 2 个；神经胚照射后变化的点8 4 个，包括表达上 调的点l o 个，表达下调的点1 1 个，照射后消失或增加的点6 3 个3 ) 根据二维 电泳分析结果，选取差异显著的点进行m a l d l t o f 质谱分析，并利用软件 m 嬲c o td i s t i l l e r 过滤基线峰、识别信号峰并搜索n c b i n r 数据库，寻找匹配的相 关蛋白质，同时查询其功能。结果鉴定出来的有明确功能阐述的蛋白，包括照射 后表达量减少的7 种蛋白：6 7 k d 层粘连蛋白受体前体、过氧化物酶2 、烯醇化 酶l 、类似热休克同源蛋白7 0 、m g c 8 2 6 0 2 蛋白、t r n a 核苷酸转移酶前体、核 蛋白a l b ，以及照射后含量减少的4 种蛋白：含缬酪肽蛋白、糖原磷酸化酶( 脑 型) 、微管蛋白5 6 d 和c 嬲p 弱e 7 。这些蛋白都是参与细胞活动的重要蛋白，在 u v b 照射前后差异表达显著。4 ) 以3 0 4 p w c m 2 强度的u v b 照射中华大蟾蜍囊 胚、原肠胚和神经管期胚胎，制作石蜡切片，并进行c 舔p 懿e 3 的免疫组织化学 染色。结果表明u v b 照射后，c a s p a s e 3 在囊胚动物极表达加强而在植物极表达 l i | 东大学硕二t 学位论文 减弱。在原肠期胚胎中，表达c a s p a s e 3 的阳性细胞数量增多。在神经管期胚胎 中，胚胎头部c a s p a s e 一3 表达加强而腹部表达减弱。本论文中所讨论的u v b 这一 环境因子对两栖类胚胎影响的研究，有助于揭示生物体发育过程中光物理因素对 其物种演化、变异所起的作用，以及特定光物理因素条件下生物的遗传适应性和 胚胎发生的分子机理，并对环境保护和健康维护提供借鉴。 关键词：u v b ；中华大蟾蜍；蛋白质表达；双向电泳；c a s p a s e 3 2 【i 东大学硕七学位论文 a b s t r a c t u l t r a v i o l e tf t j v ) i san o n - i o n i z i n gr a d i a t i o np h o t o p h y s i c a lf a c t o r , a n du l t r a v i o l e t r a d i a t i o nb ( u v b ) h a sav e r yi m p o r t a n tr o l eo no r g a n i s m s i no r d e rt os t u d yt h e e f f e c t so fu v bo ne a r l yd e v e l o p m e n te m b r y o so fa m p h i b i a n s ，w eu s ee a r l ye m b r y o s o fa u f o b u f og a r g a r i z a n s a se x p e r i m e n t a l m a t e r i a l e m b r y o s a td i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a ls t a g e sw e r ei r r a d i a t e db y3 0 2a mu v b r a d i a t i o n t h ec h a n g e so f p r o t e i ne x p r e s s i o no fe m b r y o sw e r es t u d i e do nd e v e l o p m e n tp a t t e r n s ，p r o t e i n e x p r e s s i o na n do r g a n i z a t i o nl e v e l sb e f o r ea n da f t e ru v bi r r a d i a t i o n 1 ) d i f f e r e n t s t a g e so fb u f o6 咖g a r g a r i z a n s se m b r y o sw e r ei r r a d i a t e db y3 0 4 1 t w c m 2u v b t h e n w eo b s e r v e dt h ed e v e l o p m e n to ft h ee m b r y o sa n dc a l c u l a t e dt h el i v a b i l i t ya n d a b n o r m a lr a t e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ，t h ee f f e c t so fu v bo nh a t c h i n gr a t ew a sn o t r e m a r k a b l e ；t h el i v a b i l i t yo ft h ee m b r y o sc h a n g e da n o m a l o u sa f t e rt r e a t e db yu v b ； t h ea b n o r m a lr a t ec h a n g e da n o m a l o u sd u r i n gt h ee a r l i e rs t a g e s ，b u tr i s e de v i d e n t l ya t t h el a t e rs t a g e s 2 ) t o t a lp r o t e i no fb l a s t u l a sa n dn e u r a le m b r y o sb e f o r ea n da f t e ru v b i r r a d i a t i o nw e r es e p a r a t e db yi m m o b i l i z e dp hg r a d i e n tb a s e dt w od i m e n s i o n a lg e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 2 一d e ) a f t e rc o l l o i d a lc o o m a s s i eb r i l l i a n ts t a i n i n g ，e x p r e s s i o n p r o t e i n sw e r ea n a l y z e db yi m a g e m a s t e r2 dp l a t i n u m6 0i m a g ea n a l y s i ss o f t w a r e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，u v bi r r a d i a t i o na f f e c t e ds i g n i f i c a n t l yo nt h ea m o u n ta n d d i s t r i b u t i o no fe m b r y o n i cp r o t e i n s ：i nb l a s t u l a , t h ee x p r e s s i o no f2 7p r o t e i ns p o t s c h a n g e da f t e ri r r a d i a t i o n ，a sw e l l 嬲1 0 2p o i n t sd i s a p p e a r e do ri n c r e a s e d ；i nn e u r u l a ， 21p r o t e i ns p o t sw e r ee x p r e s s e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s ，a n d6 3p o i n t sd i s a p p e a r e do r a p p e a r e d a f t e r i r r a d i a t i o n 3 ) a c c o r d i n g t ot h er e s u l t so ft h e a n a l y s i s o f t w o d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ，1 6s p o t so fb l a s t u l aa n d2 5s p o t so fn e u r u l aw e r e a n a l y s e db ym a l d i - t o f m s a l t o g e t h e r11s p o t sw e r ei d e n t i f i e dc l e a rf u n c t i o n s ， i n c l u d i n g7k i n d so fp r o t e i n sw h i c he x p r e s s i o nr e d u c e da f t e ri r r d a i t i o n ：6 7 k dl a m i n i n r e c e p t o rp r e c u r s o r , p e r o x i d a s e2 ，e n o l a s e1 ，as i m i l a rh o m o l o g o u sh e a ts h o c kp r o t e i n 7 0 ，m g c 8 2 6 0 2p r o t e i n ，t r n an u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s ep r e c u r s o ra n dr i b o n u c l e o p r o t e i n 3 东大学硕士学何论文 alb ；a n d4k i n d st h a td e c r e a s e da f t e ri r r a d i a t i o n ：v a l o s i nc o n t a i n i n gp r o t e i n ，g l y c o g e n p h o s p h o r y l a s e ( b r a i n ) ，t u b u l i na t5 6 da n dc a s p a s e 一7 t h e s ep r o t e i n sw h i c hw e r e i n v o l v e di ns t r e s sr e s p o n s e ，c y t o s k e l e t o n ，i n f l a m m a t i o n ，e n e r g ym e t a b o l i s m ，p r o t e i n s y n t h e s i s aa n dd e g r a d a t i o n ，c e l l sp r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i se x p r e s s e dd i f f e r e n t i a l l y b e f o r ea n da f t e ru v bi r r a d i a t i o ns i g n i f i c a n t l y 4 ) t h eb l a s t u l a s ，g a s t r u l a sa n dt h e n e u r u l a so fb u f o6 咖g a r g a r i z a n sw e r ei r r a d i a t e db y3 0 4 l x w c m 2u v b ，t h e nt r e a t e d w i t h i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys t a i n i n g t h e r e s u l t s s u g g e s t e dt h a t ，a f t e ru v b i r r a d i a t i o n ，t h ee x p r e s s i o no fc a s p a s e 一3e n h a n c e di na n i m a lp o l eo fb l a s t u l ab u t w e a k e n e di np l a n tp o l e i ng a s t r u l a ，t h ee x p r e s s i o no fc a s p a s e 一3i n c r e a s e di nt h e n u m b e ro fp o s i t i v ec e l l s a n di nn e u r a le m b r y o s ，t h ee x p r e s s i o no fc a s p a s e 一3 s t r e n g t h e n si nt h er e g i o no fh e a d ，h o w e v e rw e a k e ni nv e n t e r t h i sb a s i cr e s e a r c hc o u l d h e l p t or e v e a lt h e o r g a n i s m sd u r i n gt h e d e v e l o p m e n to fs p e c i e se v o l u t i o na n dv a r i a b i l i t y ，a sw e l la sg e n e t i ca d a p t a t i o n a n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fe m b r y o g e n e s i su n d e rt h ec o n d i t i o n so fs p e c i f i c b i o l o g i c a lf a c t o r s ，a n do f f e r e dr e f e r e n c et oe n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na n dh e a l t h m a i n t e n a n c e k e yw o r d s ：u v b ；e u f ob u f og a r g a r i z a n s ；p r o t e i ne x p r e s s i o n ；2 - d e ；c a s p a s e - 3 4 i i i 东大学硕七学位论文 符号说明 5 i i i 东大学硕i e 学位论文 p i c b b m p f l s o e l e c t r i cp o i n t c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u e m a t u r a t i o np r o m o t i n gf a c t o r v c pv a l o s i nc o n t a i n i n gp r o t e i n l r pl a m i n i nr e c e p t o rp r e c u r s o r r o sr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s t n ft u m o rn e c r o s i sf a c t o r m a p sm i c r o t u b i u l ea s s o c i a t ep r o t e i n s 6 等电点 考马斯亮蓝 促成熟因子 含缬酪肽蛋白 层粘连蛋白受体前体 活性氧簇 肿瘤坏死因子 微管结合蛋白 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：二牝 e l 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：毕导师签名：遮瞳红日期：迦桦 “l 东大学硕七学位论文 1 前言 近半个多世纪是人类社会高度发展的时代，科技进步、工业发达、经济发展、 物质产品极大丰富，但同时我们也付出了昂贵的代价，人类生活的生态环境正遭 受着越来越巨大的负面压力。由于环境污染衍生的环境效应具有滞后性，发现污 染时，其程度也已经发展到了相当严重的地步，例如给生态系统造成沙漠化、森 林破坏等直接影响，而危害更大的是给生态系统和人类社会造成的间接危害，如 日趋严重的全球性气温升高，大气层中臭氧被破坏，平流层臭氧日渐减少【l 】，这 些结果带来的危害往往是更深远的。由于臭氧空洞导致的紫外线辐射程度增加就 是一个明显的例子。由于到达地面的紫外线辐射强度增加，对地球生态圈造成了 严重危害：促使植物死亡、南北极冰山以及陆地生态圈中产生了更多c o 、n o 和卤代物【2 】。更加严重的是氯和溴的扩散又会导致臭氧层进一步变薄【3 4 1 ，形成恶 性循环，自然环境产生更加恶劣的破坏。据国家气象中心提供的报告显示，1 9 7 9 年以来我国大气臭氧层总量逐年减少，在2 0 年间臭氧层减少了1 4 。而臭氧层 每递减l ，皮肤癌的发病率就会上升3 。因此，研究u v 对生物体的作用具 有重要的理论和现实意义。 1 1 阳光中的紫外线 阳光是具有多种光子效应的物质，是地球上一切生命活动的能量来源，在生 命的起源与演变、生物结构形态的变异与功能的进化中起着不可替代的作用，地 球上所有的生命形式的维持都直接或间接地与光辐射有关。地球表面阳光光线的 光谱由紫外区的2 0 0 n m 到红外区的1 8 0 0 n m 构成。阳光辐射主要分为可见光部分 ( 4 0 0 h m s - - 7 6 0 a m ) ，波长大于可见光的红外线( 7 6 0 r i m ) 和小于可见光的紫外线 ( 4 0 0 n m ) 的部分，其中紫外( u l t r a v i o l e t ，u v ) 辐射约占3 5 1 ，是电磁波谱 中介于最软的电离辐射和可见光辐射之间的部分。 1 1 1 紫外线的分类 物理学上一般将紫外线分为真空紫外区( 1 9 0 h m ) 、远紫外区( 1 9 0 3 0 0r i m ) 和近紫外区( 3 0 0 4 0 0r i m ) 。真空紫外区的辐射被空气所吸收，所以除非所用光 源很强，一般不会引起生物效应。而根据生物学差异，紫外线又可分为三个不 7 山东大学硕士学位论文 同的波段：u v c ( 1 0 0 - 2 8 0 n m ) 、u v b ( 2 8 0 3 2 0 n m ) 、u v a ( 3 2 0 4 0 0 n m ) 。u v a 又 称为黑斑效应紫外线或“黑斑区”，可诱发许多物质发出荧光；u v b 又称红斑效 应紫外线或“皮肤红斑区”【6 ，7 】；u v c 又称“杀菌区”。阳光辐射到达地球表面的紫 外线波长范围为2 8 6 3 9 0 n m ，这说明u v c 不能穿透大气层，对地球生物生长发 育起效应的紫外线类型是u v a 和u v b 。其中u v a 占9 5 以上，而u v b 所占 比例不足5 。 虽然到达地球表面的u v b 相对于u v a 只占很小的比例，但是它的生物学 作用却很重要。例如波长3 0 0 n m 的u v b 对ec o l i 的损伤作用和对小鼠的致癌作 用较波长为3 3 0 n m 的u v a 高4 0 0 0 - 5 0 0 0 倍【8 】。有研究发现，u v b 只占u v a 的 o 8 ，却可造成7 5 的环丁烷嘧啶二聚体( c y c l o b u t a n ep y r i m i d i n ed i m m e r , c p d ) 的生成和5 0 的d n a 氧化损伤【9 】。u v b 辐射对鱼、虾、蟹、以及一些两栖动物 的早期发育阶段都有危害作用，最严重的影响是繁殖力下降和幼体发育不全。 b l a u s t e i n 等认为，大气中u v b 的增加是致使两栖类种群减少的原因之一，其 对两栖类胚胎有致死和亚致死作用。他们用u v b 照射长脚蝾螈并观察其发育情 况，发现未经u v b 照射的一组卵孵化率高，并且畸胚数量少【1 1 1 。另外，在对小 鼠的光致癌作用中发现，如果u v b 能占整个紫外辐射的2 ，则u v a 对生物的 效应可忽略不计。 1 1 2 紫外线与臭氧层 大气中的臭氧约有9 0 是通过太阳发射的高能量紫外辐射而在距地面较高 的大气层中形成，紫外辐射将氧气分子分解成氧原子再和其他氧分子结合而形成 臭氧，主要存在于距离地球表面1 5 3 0 千米的平流层部分，因而称之为“臭氧层”。 包围地球的臭氧层含量不到同高度空气体积的十万分之一，有效厚度3 m m 左右， 但是对紫外线具有强有力的吸收作用，否则地球上的大多数生物都会由于紫外线 的照射而不能生存。臭氧层能吸收太阳光中所有的u v c 和9 0 的u v b ，在核酸 和蛋白质吸收谱带的2 6 0 n m 和2 7 8 n m 处，射到地面的阳光分别减弱了1 0 4 0 和1 0 1 7 倍，对u v a 影响较d , t 1 2 1 。 一些人工合成的含氯和溴的化合物对臭氧层具有很强的破坏作用，如氯氟 烃、一氧化氮、甲基溴、四氯化氮和甲基氯仿等。随着释放到大气层中的这类消 耗臭氧层的物质的不断增加，臭氧层的破坏也在不断加速。例如，1 9 8 5 至1 9 9 1 8 i i i 东大学硕士学位论文 年间，臭氧层在全世界范围内以平均每年0 1 5 的速率减少，现己增加到了接近 每年l 的水平。随着纬度的增高臭氧层受到的破环也在增加。破坏最严重的地 区就是南极。当臭氧层的臭氧减少一半以上之后，就会形成所谓的臭氧层空洞， 并且近年来有逐步扩大的趋势。1 9 9 6 年南极上空的臭氧层空洞比1 9 9 5 年扩大了 近1 6 倍，在1 9 9 6 年l o 月7 日达到了2 6 0 0 万平方公里，已经发展到了由人类 居住的地方。欧洲、北极和其他高纬度地区的臭氧层破坏也达到了5 至3 0 。 平流层臭氧含量减少的一个主要后果就是照射到地球表面的阳光中的紫外 线，尤其是u v b 大量增加，对地球上的动、植物及人类的危害也因此而大幅度 增加。臭氧水平降低1 ，照射到地面上的紫外线就要增加2 ，其中u v b 的生 物学作用就会增加1 3 - , 2 o ，皮肤癌的发生率将增加3 ，而白内障的发生率 就会增加0 3 。除此之外，紫外辐射的增加还会通过直接和间接的作用使农作 物减产或营养价值改变；改变植物形态和生物量分配，改变植物中可防治昆虫损 害的化学成分，改变植物的抗病虫害能力；损害可以吸收大量c 0 2 的浮游生物 从而影响全球气温；对渔业生产力带来影响；加速某些材料的老化等，进而对人 类的健康、生产和生活带来负面影响 5 1 。 1 1 3 紫外线的生物学作用 紫外线对生物体的有害效应已有充分资料证明，这种有害效应主要是通过紫 外线对d n a 的作用造成的。最有害的效应是细胞致死，其他的效应则包括致突 变，致癌，d n a 、r n a 和蛋白质合成的干扰，细胞分裂的延迟，以及细胞膜在 通透性和能动性上的变化【1 2 1 。紫外线是一种非电离辐射，它与物质相互作用的 主要方式是使物质分子的电子从基态跃迁到激发态，紫外线光子则作为能量被物 质的原子或分子吸收【5 】。许多生物大分子的最大吸收波长是处于紫外线波段，因 此在紫外线照射下，在生物大分子内会发生相应的光化学反应，从而引起各种生 理变化。紫外线对生物大分子和细胞的主要作用如下： 1 ) 紫外线对核酸的作用。紫外线可使某些分子的共价键断裂，发生光化学 反应，生成含有未成对电子的自由基。自由基是作用核酸引起变异的重要因素， 通过自由基的直接间接作用导致碱基损伤、或糖基损伤、链的断裂以及嘧啶二聚 体的形成和核酸与蛋白质的交联等损伤；引起生物分子的生理、遗传变异【1 4 1 5 1 。 如果用5 一溴尿嘧啶取代d n a 的胸腺嘧啶，再用紫外线对其进行照射，就会发生 9 东大学硕十学位论文 脱溴效应而产生尿嘧啶自由基，进而导致尿嘧啶的产生和脱氧核糖的破坏，最后 导致d n a 链的断裂【l 引。而在有敏化剂酮存在的情况下，采用3 1 3 n m 的紫外线照 射会导致羟基自由基的产生，它会攻击d n a 并产生链断裂【l7 1 。嘧啶的光化学敏 感性比较高，在受到紫外线照射时容易发生变化，产生嘧啶水合物，进而形成各 种嘧啶二聚体。最常见的是环丁烷嘧啶二聚体和嘧啶( 6 4 ) 嘧啶酮光产物 p y r i m i d i n e ( 6 - 4 ) p y r i m i d o n ep h o t o p r o d u c t s ，6 - 4 p p 1 8 1 9 1 。其中c p d 的形成是由于 d n a 受紫外线照射后，相邻的嘧啶碱基共价交联形成环丁烷四元环，两个碱基 的5 、6 位键饱和，此时b 型d n a 结构强烈地旋转、扭曲，以致两个嘧啶环充 分靠近而形成了二聚体。因此，易于解旋和弯曲的序列更易形成c p d ，d n a 双 螺旋的柔性和弯曲角度成为影响c p d 形成的重要参数。c p d 常在5 - t t ，5 - t c ， 5 - c t 和5 - c c 二嘧啶d n a 序列中形成，其中5 - t t 最易形成c p d ，而5 - c c 最不易形成【2 0 】。通常可用d n a 测序凝胶电泳技术能够确定受紫外线照射的d n a 序列中c p d 的分布状态：用紫外线照射经末端标记的d n a ，然后用能够特异地 识别c p d 序列的酶( 如紫外线内切酶或t 4 内切酶切割d n a 链中的c p d 位 点，形成长短不一的d n a 片段，通过测序凝胶电泳即可确定c p d 的位置。c p d 可在有氧或厌氧条件下由所有波长的紫外线照射产生，它对光解酶、切除修复酶 及各种重组修复都是敏感的。除c p d 外，另一种常见嘧啶二聚体6 - 4 p p 则是通 过5 嘧啶的5 和6 位碳原子或3 嘧啶的4 位碳原子和位于4 位的氧原子或亚氨 基异构体间形成的二氧己烷或氮杂丁烷4 元环而形成的，这种环能够自发断裂， 导致羟基或氨基转移到5 嘧啶和第5 位碳原子上，在相邻嘧啶的6 位和4 位形 成稳定的化学键。6 - 4 p p 的形成率由d n a 序列和染色体的环境决定，是c p d 形 成率的2 0 3 0 。它主要在5 - t c 和5 - c c 序列中产生，特别是当3 碱基中有 一串嘧啶相连时，否则如果一段序列里的嘧啶位点被嘌呤分开了，则其形成6 - 4 p p 的能力就很弱了。与c p d 一样，6 4 p p 的形成同样需要d n a 解旋和碱基的旋转， 而6 - 4 p p 的嘧啶平面几乎是垂直的，因此刚性的d n a 双螺旋结构形成6 4 p p 时 它的d n a 双螺旋可能产生比c p d 更显著的结构扭曲，在一定程度上刚性的d n a 双螺旋是抑制6 - 4 p p 形成的。6 4 p p 光产物对碱不稳定，在六氢吡啶中加热后能 够产生d n a 链断裂。此外，尿嘧啶一胞嘧啶、尿嘧啶胸腺嘧啶，胞嘧啶胸腺嘧 啶以及尿嘧啶一胞嘧啶之间都可以形成环丁烷型的天然嘧啶二聚体。对于嘌呤而 1 0 f i f 东大学硕士学位论文 言，虽然嘌呤吸收紫外线并不引起嘌呤环高效的化学变化，但它吸收的能量的一 部分可能会传递给嘧啶或d n a 的糖磷酸主链，并因此而导致化学变化，胸腺嘧 啶自由基的形成和多聚脱氧腺苷脱氧胸苷中胸腺嘧啶的磷光都与来自腺嘌呤的 能量传递有关【2 l 】。 2 ) 紫外线对蛋白质的作用。紫外线对于蛋白质和酶的作用主要在于它可以 断裂氢键。已经证明芳香族氨基酸由于被击出一个水和电子而发生光电离，阳离 子自由基能够分解而产生一个中性自由基和一个氢离子。然后中性氨基酸自由基 和水和电子可以进行相互反应，也可以与其他分子反应产生多种产物【2 2 】。紫外 线照射能引起组成酶的特异氨基酸残基的破坏和维系酶的活性中心空间完整性 的氢键断裂，使酶的活性丧失，从而引起酶的光化学钝化【2 3 】。例如核糖核酸酶 在紫外线的照射下，组分中的胱氨酶受到破坏，某些氢键断裂，酶的分子构象发 生变化，使酶失活幽】。照射胰蛋白酶和溶菌酶时，也会发生同样的情况。 3 ) 紫外线的致突变作用。紫外线是一个很有效的致突变因素，可诱发受照 射组织和生物体的基因突变。在低剂量紫外线的照射下，细菌的突变频率可能会 增加到自然突变水平的1 0 3 到1 0 4 倍，而在高能量紫外线照射情况下，几乎所有 存活下来的细胞都可能是突变型。因为紫外线的穿透性很弱，所以它很少被用作 高等植物的诱变剂，而多用于微生物、生殖细胞、花粉粒以及培养的细胞等。紫 外线诱发突变是由于它的能量被d n a 吸收，改变了d n a 结构，因而造成d n a 损伤：碱基损伤，如形成甲酰胺基嘧啶等；生成嘧啶二聚体使d n a 发生链内交 联；导致d n a 两条链上的碱基以共价键结合产生链间交联；d n a 和蛋白质以共 价键形式结合形成d n a - 蛋白质交联；还可能导致碱基脱落形成无嘌呤或无嘧啶 位点，进一步导致d n a 链断裂；造成d n a 单链断裂等。其中由于紫外线照射 而产生的各种嘧啶二聚体使d n a 双螺旋的两链间的键减弱。d n a 结构局部变 形，严重影响d n a 的复制和转录。当d n a 发生了这些损伤后，如果得不到修 复，或者被错误的修复，突变就产生了。 4 ) 紫外线的免疫抑制作用。免疫抑制在阻止皮肤癌发生过程中起重要作用。 近年的研究表明，紫外线能够通过免疫抑制等机制影响肿瘤的发生和发展【2 5 1 ， u v b 照射能起到免疫抑制剂相同的作用，代替免疫抑制剂防止小鼠外源性肿瘤 的排斥反应。紫外线照射2 4 h 内主要由u v b 诱发免疫抑制，7 2 h 时发生的免疫 i l i 东大学硕士学位论文 抑制则同u v b 和u v a 共同诱发引起2 6 ，2 7 1 。紫外线引起免疫抑制的机制为：紫 外线照射后，其能量为细胞内的生基团所吸收，然后将能量转化为化学信号，这 些信号激活细胞或胞内一些生物分子的表达，这些细胞或分子进一步调节免疫系 统的功能，如紫外线可激活抑制性c d 4 + t 细胞，在c d 4 + t 细胞介导下阻止抗 原特异性c d 8 + 效应t 细胞的增殖，从而最终抑制细胞的免疫功能 2 8 1 。u v b 还 可抑制巨噬细胞、中性粒细胞、朗格汉斯细胞( l c ) 、树突状细胞的免疫功能， 也可抑制体液免疫2 9 1 。 5 ) 紫外线导致细胞凋亡。紫外线辐射除了会导致d n a 链的断裂，还可以活 化多种基因，其中有些基因的表达在紫外辐射诱导的细胞凋亡的发生发展中起着 十分重要的作用。g i l l a r d o n f 等的研究表明，紫外辐射诱导的细胞凋亡和细胞过 度增殖过程中，c - j u n 和c f o s 这两个基因都有参与【3 0 1 。s h r e i b e rm 等的研究工作 认为，c f o s 的表达在哺乳动物细胞对紫外辐射的反应中起着关键作用，因为有 c 1 0 s 缺陷的小鼠3 t 3 成纤维细胞受到u v c 照射后细胞的克隆形成及增殖都显著 降低而死亡包括凋亡增加【3 l 】。紫外辐射通过细胞膜、线粒体膜或细胞内某些组 分的作用产生自由基、活性氧等，继而发生脂质过氧化反应，在通过使一些蛋白 质包括酶类的过氧化或者经一系列信号的转导激活一些活性分子如n f 1 c b 等， 最终影响细胞功能。紫外辐射还能在数分钟内激活磷脂酶c ，它可以水解鞘磷脂 产生神经酰胺，并从而诱导细胞的凋亡【3 2 1 。 1 2 中华大蟾蜍概况 中华大蟾蜍学名为大蟾蜍中华亚种z 咖6 咖g a r g a r i z a n sc a n t o r ) ，在动物分 类学上隶属于脊索动物门、脊椎动物亚门、两栖纲、无尾目、蟾蜍科，是蟾蜍类 的典型代表，广泛分布于中国大陆，见于东北、华北、华东、华中、西北、西南 各省区。 1 2 1 中华大蟾蜍研究概况 中华大蟾蜍为水陆两栖动物，主要表现为繁殖期的抱对、产卵、排精、受精、 受精卵的孵化及蝌蚪的生长发育都必须在水中进行，只有变态后的蟾蜍才开始水 陆两栖生活。中华大蟾蜍排出的卵排列成带状，卵外被有卵胶膜，幼体称为蝌蚪， 形似小鱼，其颜色较深、尾较短。成体无尾，颈部不明显，只可明显地区分为头、 躯干、四肢三部分，体长约1 0 厘米以上，雄性比雌性略小，皮肤裸露，富含腺 1 2 l i i 东大学硕士学位论文 体惊蛰前后，水温回升至l o 以上时，性成熟的雌雄蟾蜍开始抱对，同时产 卵排精，精卵在水中受精形成受精卵，在适宜的温度条件下经过一系列胚胎发育 过程便孵化出蝌蚪。蝌蚪经2 个月左右的时间将变态为幼蟾蜍，幼蟾蜍可以上岸 活动，行水陆两栖生活，再经过1 6 个月的生长发育就可以达到体成熟和性成熟 3 3 1 o 对中华大蟾蜍早期胚胎发育的研究始于我国杰出的生物学家朱洗先生早年 及回国之后的开创性工作。朱洗先生于1 9 8 2 年师从于法国著名的生物学家蒙伯 利埃大学的b a t a i l l o n 教授进行动物早期胚胎发育的研究。b a t a i l l o n 教授首创以针 刺带进一个白血球引起人工单性发育的方法，结合杂交授精技术，研究引起两栖 类动物和蚕、海胆等卵子分裂的原因，各种细胞期的行为，分裂过程的扰乱以及 细胞质成熟程度对发育的影响，获得了一系列开创性的研究成果【3 4 1 ，这些实验 也为朱洗先生回国后从事中华大蟾蜍早期胚胎发育的研究奠定了良好的基础。朱 洗先生的工作主要在卵子成熟与早期胚胎发育方面的研究，中华大蟾蜍各级卵细 胞的成熟程度( 不成熟或过度成熟) 都会导致早期胚胎发育不能正常进行。 中华大蟾蜍长足的卵母细胞必须经过低温的冬眠阶段才具备成熟和受精后 进一步发育的潜能。长年在高温环境( 2 8 ) 中饲养的蟾蜍，其卵巢受垂体前叶 提取物的刺激不敏感，孕酮也不能诱使这类高温卵成熟【3 5 】；接受垂体前叶提取 物注射的冬眠前蟾蜍不能排卵，在体外卵巢块与垂体前叶提取物共培养，也不能 使卵巢跌卵；而人为冷藏蟾蜍或卵巢块体外低温培养均能替代自然的冬眠效应 f 3 5 3 刀。一系列实验有力地证明了，低温是卵母细胞成熟的关键所在。此后左嘉 客等对这种现象的机制进行了一系列的研究，发现孕酮诱发蟾蜍卵母细胞成熟分 裂的启动既可不依赖于卵表质膜，也不依赖于细胞核，而是细胞质自身活动的结 果【3 8 】。卵子成熟必须的促成熟因子( m a t u r a t i o np r o m o t i n gf a c t o r , m p f ) 需要经过 低温条件才会被诱发出来。 中华大蟾蜍还是医学实验中常用的一种动物，特别是在生理、药理等实验中 更为常用。其心脏常被用来研究心脏的生理功能、药物对心脏的作用等；腓肠肌 和坐骨神经可以用来观察外周神经的生理功能、药物对周围神经、横纹肌或神经 肌肉接头的作用；还常用作脊髓休克、脊髓反射和反射弧的分析实验、肠系膜上 的血管现象和渗出现象实验、下肢血管灌注方法观察肾上腺素和乙酞胆碱等药物 1 3 东大学硕七学位论文 对血管作用的实验材料【3 3 】。 1 2 2 自然环境对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响 由于中华大蟾蜍的水陆两栖特性以及其生理结构特征，多种环境条件都会对 其生长发育产生影响，因此关于中华大蟾蜍的生长发育状况方面的研究对多种环 境状态也有一定的指示作用。 中华大蟾蜍早期胚胎发育受温度条件的影响，在6 - - 2 9 范围内均能发育， 最适温度为1 7 , - - 2 3 ( 2 ，最高限温3 2 ，l 时不能发育。原肠胚期和神经胚期是 胚胎发育中对温度最敏感的时期【3 8 1 。 水质条件会影响中华大蟾蜍蝌蚪期的发育。利用中华大蟾蜍变态前蝌蚪的血 细胞微核和核异常法进行生活污水诱变效应的研究结果表明，生活污水对蝌蚪红 细胞有明显的致突变效应，微核率及核异常率与对照组相比差异极为显著【3 9 4 0 。 将中华大蟾蜍早期不同胚胎发育时期的胚胎在水中用一定功率的微波处理 一定时间，结果发现微波辐射使胚胎外层细胞受损，从而导致外胚层所分化的器 官如表皮、神经管等的异常发育【4 1 1 。 由于各种因素导致的大气中紫外辐射的增加会对中华大蟾蜍早期胚胎发育 产生何种影响的相关研究还未有详细报道。鉴于中华大蟾蜍的环境指示作用，开 展这方面的研究也具有重要的理论和应用意义。 1 3c a s p a s e 3 和细胞凋亡 细胞凋亡即程序性细胞死亡，是受基因调控的主动性细胞死亡过程。参与凋 亡的基因按功能可分为两类，一类是抗凋亡基因，其中最重要的是b c l 2 家族， 另一类是促凋亡基因，其中最重要的是c a s p a s e s 家族。 c a s p a s e s 是一个具有天冬氨酸特异性的半胱氨酸酶家族，受到一定的信号 刺激后通过蛋白酶级联反应顺序激活，在细胞凋亡过程中起关键作用f 4 2 1 。迄今 已发现该家族至少存在1 4 个成员，根据n 端前域的长度，可将c a s p a s e s 家族成 员分为两种类型：调控e a s p a s e s ，即启动型；效应c a s p a s e s ，即执行型。启动型 c a s p a s e s 有较长的前域，接受死亡信号，启动凋亡，参与打靶和激活调控，包括 c a s p a s e 1 、2 、4 、5 、8 、9 、1 0 、1 1 、1 2 和1 3 ；执行型含有较短的前域， 作为凋亡的效应因子，在级联下游进行底物酶切，降解细胞骨架、蛋白质、核酸 等，包括c a s p a s e 3 、6 、7 和1 4 【4 2 4 7 1 。其中c a s p a s e 一3 作为c a s p a s e 级联反应中 1 4 山东大学硕士学位论文 最关键的效应酶，在凋亡执行过程中起重要作用【4 8 , 4 9 。 细胞凋亡的途径主要有死亡受体途径和线粒体途径，每种途径的发生均可以 分为诱导、效应和降解三时期，c 嬲p 嬲e 3 同时参与了两种途径而且是效应阶段 的最终执行蛋白【蚓。其作用底物有4 0 多种，主要有结构蛋白、持家蛋白和调节 蛋白等。是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，是导致细胞凋亡的最强大的最 终效应因子，被称为凋亡的“执行者”。【4 2 4 7 1c a s e p a s e 3 被激活后，作用于胞质成 分，而使细胞发生凋亡。 c 嬲p 勰e 3 通常以无活性的酶原的形式存在于多数细胞中，m a r y l a t 5 1 】等用免 疫组化方法检侧了以原酶形式存在的c a s p a s e 3 在多种人体正常组织的表达情 况，发现c 嬲p 懿e 3 主要分布于胞浆，少数在胞核，在不同的细胞类型中选择性 地表达。凋亡启动后，c 懿p 嬲e 3 经两条不同的途径分别由c 嬲p 嬲e 9 或c a s p a s e 一8 激活【5 2 ，”】。第一条是线粒体依赖性途径，线粒体释放的细胞色素连接到凋亡蛋 白酶活化因子l ( a p a f q ) 上，使该蛋白通过存在于胞质中的d a t p 来活化前 c a s p a s e 一9 ，进而裂解前c a s p a s e 3 使之成为具有活性的c 淞p 勰e 3 ；第二条途径通 过死亡区包含的受体激活，主要通过细胞因子受体中的肿瘤坏死因子家族经 c a s p 弱e 8 活化。活化后的c a s p 嬲e 3 作用于许多底物，包括细胞骨架等，最终引 起细胞凋亡。 c 弱p 弱e 3 在活化时产生两个亚基，通过检测其亚基，可以判断c a s p a s e 3 活 性高低，评价凋亡水平【1 4 1 。已有研究表明，c 嬲p 嬲e s ，包括c 懿p 嬲e 3 在内，在 u v 照射后会产生活性【7 ，8 ，们。因此检测