（环境科学专业论文）硝酸盐还原菌对硫酸盐还原菌的竞争抑制及生态关系初步研究.pdf

摘要 酸盐还原菌的动力学方程为：n r b 的动力学方程为：v = 2 2 6 5 c c m c o o h ，当底 物浓度在本实验范围内时，硫酸盐还原反应速度、硝酸盐还原菌反应速度和底 物浓度成正比，增加底物浓度，n r b 、s r b 的生长速度加快，所以在s r b 和 n r b 共存的体系中，同一浓度下，n r b 的反应速度始终大于s r b 。有利于n r b 和s r b 争夺营养。 该研究为进一步通过生态调控的方法进行s r b 抑制研究进而解决管道腐蚀 问题提供了理论基础。 关键词：s i 氇；n i 出；驯化；鉴定；抑制率 i i a b s t r a c t a b s t r a c t s u l f a t e - r e d u c i n gb a c t e r i a ( s r b ) i sat y p eo fa n a e r o b i cm i c r o o r g a n i s m s ，a r e w i d e s p r e a di nt h eo i le x p l o r a t i o n , s t o r a g ea n dt r a n s p o r ts y s t e m s ，s e w a g et r e a t m e n t p i p e s ，w a t e rp i p e s ，p a p e rm i l l sa n do t h e re q u i p m e n t i ti st h ec o r r o s i v eh y d r o g e n s u l f i d e ，p i p e l i n ec o r r o s i o na n dc o n t a i n e r s ，r e s u l t i n gi nl e a k a g e ，r e s u l t i n gi nt h el o s s o rp o l l u t i o n s r bi sm i c r o b i a lc o r r o s i o na n de n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o no n eo ft h e m a i nf a c t o r s t h i sa r t i c l ei s o l a t e ds u l f a t e - r e d u c i n gb a c t e r i aa n dn i t r a t e r e d u c i n g b a c t e r i af r o mb o i l e rb a c k w a t e pc h a n n e l so fw a t e r , a n a e r o b i c s l u d g eb yt h e e x p e r i m e n t s ，t h em a i nc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) s u l f a t e ，n i t r a t ea n ds c r e e n i n gm e t h o do fc o u n t i n go ns r b ，n r b ，c h o o s et h e a d v a n t a g es t r a i n , b yi m p r o v i n gt h ec o a t i n gd i l u t e d s t a c k e dd i s hc u l t u r ei ng e n e r a l i nt h ei n c u b a t o rf o ra n a e r o b i ct r a i n i n g ，o b s e r v a t i o nc o l o n y , p r e l i m i n a r yi d e n t i f i c a t i o n o f s r b ，n r b ( 2 ) s c r e e n e ds u p e r i o r i t ys r b ，t h en r b m o l dm u s h r o o ms p a w nc a r r i e so nt h e e c o l o g yr e l a t i o n se x p e r i m e n t , d i s c o v e r e dw h e nt h ei n c r e a s en i t r a t et h en r b h a st h e i n h i b i t o r ya c t i o nt os r b sg r o w t h ；t of u r t h e ru n d e r s t a n dt h a tb e t w e e nb o t h s c o m p e t i t i o nr e l a t i o m ，t h e nc h a n g e de x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ，i n c r e a s e dt h ed i f f e r e n t d o s a g es e p a r a t e l yt h e n r b ，t h ed i f f e r e n tn i t r a t e ，t h ed i f f e r e n td e n s i t yn i t r a t e ，t h e d i f f e r e n tp r o p o r t i o nn i t r a t ea n dt h en i t r i t e ，t h ed i f f e r e n tm e t a ls a l t , t h ed i f f e r e n t c a r b o ns o u r c et ot h ec o e x i s t e n ts y s t e m ，t h r o u g ht h ed e t e r m i n a t i o ns y s t e mi nt h e s u l f a t er a d i c a la n dt h en i t r a t er a d i c a ld e n s i t yc h a n g ea n dc o m p u t a t i o ng r o w t h s u p p r e s s i o nr a t e ，o b t a i n e dt h es r ba n d t h en r bg r o w t hr u l e ，f i n a l l yi n d i c a t e dt h a t t h en r bc o n t e n ti sb i g g e rt os r bi n h i b i t o r ya c t i o ni ss t r o n g e r ；t h ea m m o n i u m n i t r a t e ，a n ds oo np r o p o r t i o nn i t r a t ea n dt h en i t r i t em i x t u r ea r es t r o n gt ot h es r b s i n h i b i t o r ya c t i o n ；t h ei n c r e a s ew a ss m a l l e rt h a nt h e6 0 0 m e d ln i t r a t ei sa d v a n t a g e o u s i ns u p p r e s s e st h es r bt h eg r o w t h ；t h ei n c r e a s ec a d m i u mc h l o r i d e ，t h es o d i u ml a c t a t e a r ed i s a d v a n t a g e o u st os r bg r o w t h ； ( 3 ) i nn r ba n ds r bt h e r m o d y n a m i c s ，d y n a m i c sr e s e a r c hs e l e c t e dt h ef r e e i t t e n e r g yc h a n g e sc o n d u c t st h er e s e a r c hw i t hk mv a l u et h e s et w ot a r g e t s ，c o m p a r e d b o m sf r e ee n e r g yt h r o u g ht h ec o m p u t a t i o nc h a n g e s ，f i n a l l yi n d i c a t e dt h a ts r ba n d t h en r br e s p o n s ec a nc a r r yo ns p o n t a n e o u s l y , a sar e s u l to fn i t r a t ee l e c t r o n a t i o n r e a c t i o nf r e ee n e r g y sa b s o l u t en i g h t w a t c hb i gs o m e w h a t ，t h ee n e r g yw h i c ht h e n r e l e a s e sa r em o r e t h e r e f o r e ，n r bc o m p e t e sf o rt h ee t h a n o i ca c i ds t r o n g l ya b i l i t yi n s r b ；t h r o u g hc o m p a r e sb o t h sk mv a l u e ，t h en r bk mv a l u et e a c h e st ob es m a l l ， f i n a l l yi n d i c a t e dt h a tn r b h a st h es t r o n ga f f i n i t yt ot h es u b s t r a t ee t h a n o i ca c i d ； t h e r e f o r en r b sr e s p o n s ee a s yt oc a r r yo nc o m p a r e dt ot h es r b sr e s p o n s e ( 4 ) i nt h en r ba n dt h es r bc o e x i s t e n c es y s t e m ，i no t h e rc o n d i t i o n su n d e r c e r t a i nc i r c u m s t a n c e s ，i n c r e a s et h ec o n c e n t r a t i o no fc a r b o n ，w h i c hh a di n c r e a s e dt h e s p e e do fr e s p o n s e s u l f a t e - r e d u c i n gr e a c t i o nt o t h ed y n a m i c so ft h a ti n t h i s e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，s u l f a t e - r e d u c i n g r e a c t i o nt ot h e d y n a m i ce q u a t i o n ： v = 2 0 4 9 8 c c m c o o a n i t r i t e - r e d u c i n g r e a c t i o n t o t h e d y n a m i c e q u a t i o n ：v = 2 2 6 5 c c m c o o h s u l f a t e r e d u c i n g r e a c t i o n s p e e d，n i t r i t e - r e d u c i n g r e a c t i o ns p e e da n dc o n c e n t r a t i o na tt h ee n do fp r o p o r t i o n a li n c r e a s ei nc o n c e n t r a t i o n a tt h ee n d , n r b ，s r bs p e e du pt h eg r o w t hr a t e ，t h e r e f o r e ，i nt h i se x p e r i m e n ts r b a n dt h en r bc o e x i s t e n c es y s t e m , u n d e rt h ei d e n t i c a ld e n s i t y , t h en r br e a c t i o nr a t ei s b i g g e rt h a ns r bt h r o u g h o u lt ti sa d v a n t a g e o u sf o rn r bt oc o m p e t ef o rt h en u t r i t i o nw i t hs r b 硼1 es t u d yr e s e a r c hp i p e l i n ec o r r o s i o nt ot r yt os o l v eat h e o r e t i c a lp r o b l e mb a s i s f u r t h e rt h r o u g he c o l o g i c a lc o n t r o lm e t h o d ss r bi n h i b i t k e yw o r d s ：s u l f a t e r e d u c i n gb a c t e r i a ，n i t r a t e - r e d u c i n g b a c t e r i a ， d o m e s t i c a t e ，a u t h e n t i c a t e ，t h ei n h a b i t a t i o nr a t e i v 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：听小习麸 璐年j 肌1 日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： r 一一飞 内部5 年( 最长5 年，可少于5 年)l l 秘密l o 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) ；机密- k 2 0 年( 最长2 0 年，可少于2 0 年)； 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： 年月 第一章绪论 第一章绪论 第一节硫酸盐还原菌概述 1 1 1 硫酸盐还原菌生理生化特性 硫酸盐还原菌【1 2 l ( s u l f a t er e d u c i n gb a c t e r i a ，简称s r b ) 是一类形态各异、 营养类型多样、能利用硫酸盐或者其他氧化态硫化物作为电子受体来异化有机 物质的厌养菌，广泛存在于发电厂冷却水循环系统、热交换系统，石油开采、储 存和输运系统、污水处理管道，饮用水管道，飞机燃油储存罐，造纸厂等设备中。常 见属有脱硫弧菌属( d e s u l f o v i b r i o ) ，脱硫肠状菌属( d e s u l f o t o m a c u l u m ) 。因其参与 自然界中的多种反应，所以愈来愈得到人们的关注。 ( 一) s r b 的种属 1 9 8 4 年出版的第一版伯捷系统细菌学手册第一卷中提出了s r b 的属检索 表，把所有的能还原硫酸盐和元素硫的细菌归结为8 个属。此后，又有一些新 属陆续被分离和命名。因此，据不完全统计s r b 已有1 2 个属近4 0 多个种p j 。 表1 1s r b 的种属及特性吲 t a b l e1 1c h a r a c t e r i s t i ca n ds p e c i e so fs r b 属特性dnamoigc i 类s r b ：不能氧化乙酸盐的 脱硫弧菌属极生鞭毛，弯曲杆菌，无芽孢；革兰氏阴性：含有脱4 6 - - - 4 1 d e s u l f o v i b r i o硫绿胶霉素；1 2 种，其中一种为嗜热菌： 脱硫微菌属运动杆菌，无芽孢，革兰氏阴性；无脱硫绿胶霉素： 5 3 d d s u l f o m i c r o b i u m 两个种 d e s u l f b o l l u s弧形：革兰氏阴性：运动，无脱硫绿胶霉素：一个种 脱硫肠状菌属垂直或弯曲杆菌，通过绿毛或极生鞭毛运动：革兰氏3 7 4 6 d e s u l f o t o m a c u l u m 阴性：无脱硫绿胶霉素，产生内孢子：两个种，其中 一个为嗜热菌，一种为可以乙酸盐为能量来源 脱硫念珠菌属 ， 杆菌：能将3 氯氨甲酸酯还原为苯甲酸酯 4 9 d e s u l f o m o n i l e d e s u l f o b a c u l a卵圆形细胞，海洋的：可氧化各种芳香族化合物包括4 2 芳香族硫氰甲苯为二氧化碳：一个种 第一章绪论 属特性dnamoigc 古生球菌属 a r c h a e o g l o b u s 脱硫叶菌属 d e s u l f o b u l b u s i i 类s r b ： 脱硫菌属 一些独特的甲烷营养菌所具有的辅酶，生长时产生少4 1 - 4 6 量甲烷，氢气；甲酸，糖，乳酸和丙酮酸是电子供体， 碳酸根，硫代硫酸根或亚硫酸根是电子受体：两个种 卵圆形或柠檬星系报：无芽孢：革兰氏阴性：不含有5 9 - - - , 6 0 脱硫绿脱霉素：可通过单极生鞭毛运动( 如果能够) ： 可利用丙酸为电子供体，产物为乙酸盐和一氧化碳： 三个种 能氧化乙酸盐的 d e s u l f o b a c t e r 脱硫杆菌属 d e s u l f o b a c t e r i u m 脱硫球菌属 d e s u l f o c o c c u s 脱硫线菌属 d e s u l f o n e m a 脱硫八叠球菌属 d e s u l f o s a r c i n a d e s u l f o a r c u l u s 脱硫状菌属 d e s u l f a c i n u m d e s b t l f o r h a b d u s t h e r m o d e s u l f o r h a t x i u s 杆菌：无芽孢，革兰氏阴性：没有脱硫绿脱霉素：如4 5 4 6 果可以运动是通过单极生鞭毛：只利用乙酸盐为电子 供体并通过柠檬酸循环将其氧化为二氧化碳：四个种 杆菌：有些含气泡，海洋的，通过乙酰c o a 途径可自4 1 - 5 9 养生长：三个种 球形细胞：不运动：革兰氏阴性：存在脱硫绿脱霉素，5 7 无芽孢，利用c 1 到c 1 4 脂肪酸作为电子供体并完全 氧化为二氧化碳：可通过c o a 途径可营养生长：两个 种 大，丝状滑行细菌：革兰氏阳性，无芽孢：有或没有3 5 4 2 脱硫绿霉素：利用c 2 到c 1 4 脂肪酸作为电子供体并 完全氧化为二氧化碳；通过乙酰c o a 途径可自养生长 ( 甲基为电子供体) ：两个种 细胞成堆积状( 八叠球的排列) ：革兰氏阴性：无芽孢： 5 1 没有脱硫绿胶霉素：可利用c 2 到c 1 4 脂肪酸作为电 子供体并完全氧化为二氧化碳；通过乙酰c o a 途径可 自养生长( 甲基为电子供体) ：两个种 弧形：革兰氏阴性：可运动没有脱硫绿胶霉素，可利6 6 用c 1 到c 1 8 脂肪酸作为电子供体 球形或卵圆形细胞，革兰氏阴性：不运动：可利用c 16 4 到c 1 8 脂肪酸，营养型多样，可以自养生长：嗜热 杆菌：无芽孢，革兰氏阴性：不运动；可利用脂肪酸5 2 并将其完全转化为二氧化碳 革兰氏阴性可运动杆菌：嗜热，可利用c 1 8 以下的脂5 l 肪酸 ( - - ) s r b 的生活环境和条件 自然界中最常见的s r b 是嗜温的革兰氏阴性、单细胞、无色、不产芽孢， 以单根鞭毛运动的类型。它分布广泛，s r b 可以存在于土壤、水稻田、海水、盐 水、自来水、温泉水、地热地区，油井和天然气井，含硫沉积物，河底污泥、污水， 绵羊瘤胃、动物肠道等。还可以从一些受污染的环境中检测到它的存在，如厌氧 2 ， 第一章绪论 的污水处理厂废物，被污染的食品中。 ( 1 ) 基本环境因子 4 1 表1 2s r b 基本环境因子表 仉l b l e l 2t h eb a s i ce n v i r o n m e n t a lf a c t o ro fs r b ( 2 ) s r b 生长所需要的碳源和氮源 s r b 的不同菌属生长所利用的碳源是不同的，最普遍的是利用c 3 、c 4 脂肪 酸，如乳酸盐、丙酮酸、苹果酸；此外还可以利用一些挥发性脂肪酸，如乙酸盐、 丙酸盐、丁酸盐；醇类，如乙醇，丙醇等；氮源：铵盐是大多s r b 生长所需的氮源。 据一些报道，某些s r b 还能够固氮。一些菌种能够利用氨基酸中的氮作为氮源， 少数菌种能通过异化还原硝酸盐和亚硝酸盐提供氮。 ( 3 ) s r b 在硫循环体系中的地位和作用 元素硫是构成生物细胞的基本成份之一( 生物体内c ：n ：s = 1 0 0 ：1 0 ：1 ) ， 自然界中的硫循环是一个重要的地球化学循环，其中各个环节都有微生物参 与，s r b 在这个体系中起着不可缺少的作用。 ( 4 ) s r b 还原硫酸盐过程中所涉及的酶系【5 6 】 s r b 还原硫酸盐主要有以下3 个过程： a 因为s 0 4 2 s 0 3 2 。对的氧化还原电位太低而使硫酸不能直接接受电 子。在硫酸腺苷转移酶的作用下，以a t p 为代价将硫酸激活。 b 腺苷酰硫酸还原酶( a p s 还原酶) 催化a p s 2 。还原为亚硫酸，a p s 酶 是一种寡聚铁硫黄素蛋白( m r 2 2 0 ，0 0 0 ) ，含有一分子f a d 和1 2 个原 子的铁和不稳定硫。 c 亚硫酸盐的进一步还原是由各种属间特异性的亚硫酸盐还原酶催化 的。此反应除了亚硫酸还原酶外，还需要三硫酸还原酶和硫代硫酸还 3 第一章绪论 原酶参与。 ( 5 ) 影响s i m 还原硫酸盐的因子【7 1 0 】 影响s r b 还原硫酸盐的因子有如下几种：温度和矿化度、p h 值、重金属： ( 6 ) s r b 和其他微生物之间的作用i s l a 共生作用：既存在于同一体系中的s r b 和产甲烷菌等利用不同的电子供 体。某些特定的底物，如甲胺，甲醇，只可被产甲烷菌利用，即使在富含硫酸盐的沉 积物中也是如此。绿硫细菌在光照下，同化有机物质如乙酸盐等，必须有c 0 2 的 存在和无机电子供体，所以依赖于s r b 提供的h 2 s 。同样，绿硫菌产生的硫酸盐 很快被s r b 在异化有机物时利用，被还原成h 2 s 。硫作为两种微生物之间的电 子传递体，参与了s r b 和绿硫菌的共养作用。 b 协同作用：即s r b 和产甲烷菌等竞争一种电子供体。这涉及种间氢传递， 既在保持低氢分压下的混合培养物中，分子氢在产氢微生物和耗氢微生物间的 传递m 卅。 c 竞争作用：s r b 和产甲烷菌竞争同一种电子供体【1 。 1 1 2s i 也的运用 ( 一) 在水处理中的应用： s r b 具有吸附和絮凝作用，可以降低b o d ，使工业废水得到净化。硫酸盐还原 菌对偶氮染料、三苯甲烷等都有脱色作用，用其处理印染废水，城市生活污水和含 铬的电镀废水都有很好的效果【1 2 】。葛长海等【1 3 】利用光合细菌与s r b 配合使用， 处理含高浓度硫酸盐的城市垃圾渗滤液，不仅转化了硫酸盐，没有硫化氢二次污 染的产生，而且还降低了废水中的c o d 。程林波等【1 4 】发现硫酸盐还原菌对聚丙 烯酰胺有着某种特殊的降解作用，水解工艺可以获得3 5 - - 4 5 的去除效率。罗 一菁等【1 5 】进行聚合物驱采油污水处理的研究，表明硫酸盐还原菌在油藏环境条 件p h 为7 左右时大量繁殖生长，可使聚丙烯酰胺大幅度降解。 ( - - ) 烟气脱硫中的应用： l e e 和s u b l e t t e t 1 6 j 认为用s r b 中的脱硫脱硫弧菌进行烟气脱硫从技术上是 可行的。万海清等【l l 】对燃煤烟气和城市垃圾渗沥液的互补体系进行了研究，硫酸 盐还原菌使脱除烟气中s 0 2 的垃圾渗沥液q b s 0 4 2 。还原为s 2 ，再用硫细菌将s 2 氧化为单质硫。在s 0 24 还原为s 2 。的过程中，这种垃圾渗沥液中高浓度的有机物 能够充分作为电子供体【1 7 ，硫酸盐作为有机物异化作用的电子受体；同时城市生 4 第一章绪论 活垃圾填埋厌氧发酵自然产生大量有机酸，这既使渗沥液p h 降低，又是s r b 的 良好碳源，从而实现了烟气与垃圾渗沥液两种环境污染物的联合转化。 ( 三) 生物修复方面的应用： 由于所生成的金属硫化物的溶解度较低( 范围为1 0 刁1 0 巧l ) ，可以利用 s r b 的这个性质来处理被重金属污染的湿地、池塘以及废水等，或者在被污染的 区域人为构造湿地，将反应生成的重金属硫化物收集起来集中处理，既利于环境 的改良，又可以回收贵重金属。 ( 四) 炼油技术【2 1 】 1 1 3 s r b 局限性及解决方法优缺点 ( - - ) s r b 的局限性及危害性 2 2 1 s r b 在无氧或极少氧条件下，能够利用附着于金属表面的有机物作为碳源， 并利用细菌生物膜内产生的氢，将硫酸盐还原成硫化氢，从氧化还原反应中获 得生存的能量。由它产生的h 2 s 具有腐蚀性，会腐蚀管道和容器，导致泄漏， 造成生产损失或环境污染。s r b 腐蚀是微生物腐蚀及环境污染的主要因素之一， 据估计，在美国，油井的腐蚀7 7 以上由s r b 造成，其特征是点蚀；由于s r b 的作 用，钢的腐蚀速率可增加1 5 倍。在油田注水系统中，硫酸盐还原菌( s r b ) 是微生 物腐蚀( m i c ) 的主要因素之一， m i c 广泛存在于土壤、海水供水系统及油田环 境，而且已经造成了程度不同的腐蚀破坏。据统计，许多严重的腐蚀破坏，7 0 - 8 0 直接由细菌引起或者与细菌有关，其中特别重要的是s r b 、铁细菌、腐生 菌和硫细菌等。科学工作者经过研究和分析认为腐蚀破坏的很大一部分是由 s r b 引起的。目前，我国多数油田已进入高含水期，这将对原由的集输管线， 回注水管线及污水处理系统带来严重的腐蚀危害。s r b 所造成的腐蚀一般呈局 部腐蚀。它们的主要特征是，其腐蚀产物是黑色带有难闻气味的硫化物，可产 生较深的腐蚀坑，在坑的上部望望有结疤覆盖，坑内还有输送的腐蚀产物。如 果材料是生铁，这种腐蚀引起生铁的石墨化，使生铁转变为由碳和铁晶格结构 组成的输送多孔物质。如果腐蚀部分在大气中暴露时间不长，刺破钢铁表面形 成的易随黑色瘤壳，腐蚀坑中往往有黑水流出，并可刮出粘性黑渣将其进行 s r b 培养时，可检出大量的s r b 。在油田生产的过程中，硫酸盐还原菌的繁 殖会造成很多危害，如：地面系统中腐蚀产物导致污水发黑、悬浮固体含量增 加，使处理后水中悬浮固体含量超标；据近几年的不完全统计，由s r b 等微 5 第一章绪论 生物造成的损失，美国高达2 0 0 0 亿美元，英国达1 0 亿英镑，而我国每年由 于腐蚀对油田的损失高达2 亿元人民币，并且逐年上升。据中国石油天然气总 公司统计显示，每年由于腐蚀给油田造成的损失约为数亿元，其中s r b 腐蚀占相 当大的部分。另一方面h 2 s 还具有毒性，会影响工作人员的健康和安全，h 2 s 气体浓度为8 0 0 一- , 1 0 0 0 p p m 时3 0 r a i n 内能致人死亡，浓度再高，则人会立即死 亡，比氰化物的致死作用还迅速。h 2 s 可使呼吸系统麻痹，麻痹嗅觉神经，人 嗅不到其独有的“臭鸡蛋”气味，失去防范，因而更具有危险性。 ( 二) 解决办法及优缺点 方法优缺点列于下表 表1 2s r b 腐蚀防治方法优缺点比较 t a b l e l 2a d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so fc o r r o s i o nc o n t r o lm e t h o d sc o m p a r a t i o n 1 1 4 硫酸盐还原菌的鉴定方法 国内外科技人员在硫酸盐还原菌的检测方法上进行了探索研究，开发了多 6 第一章绪论 种检测技术。从原理上讲，主要可分为：( 1 ) 培养法；( 2 ) 显微镜直接计数法；( 3 ) 细菌构成物定量法；( 4 ) 代谢物的检测等瞄】。 ( 一) 培养祛 我国各油田多年来一直采用这一方法检测s r b ，该方法是迄今为止应用最 多也是最好的方法，可靠性高。石油天然气总公司行业标准s 5 3 2 9 一- 9 4 中 就是采用这种方法，但培养法试验周期长，需半月以上才能得到结果；另外， 由于培养基等方面的原因，该方法还有培养菌种不全面的缺陷。 ( 二) 显微镜直接计数法 一般认为显微镜只能测出系统细菌的总数，不能检出s r b 的数量。， 显微镜计数最大的特点是快速，但需特定的染料及受过培训的操作人员； 由于该技术不能分辨细菌的死活，一些死菌体也被计入，故显微镜计数往往偏 - ：l 局。 ( 三) 通过细菌构成物的定量分析 ( 1 ) a t p 测试仪 该方法只能测出微生物总数。用于厌氧系统s r b 的检测具有一定的实际意 义。a t p 仪的检测范围一般要求在5 0 0 0 个菌m l 以上。 ( 2 ) s r b 快速检测系统 该系统是由美国休斯顿的c o n o c o 公司开发生产的，它是通过专性抗体测定 硫酸盐还原菌中的r i p s ( 腺苷一5 磷硫酸酐) 还原酶来确定水样的含菌量。由干 采用了先进的样品处理方法，排除了矿化度、有机残碴的干扰及某些s r b 菌种 培养困难等不利因素；并且，使用此方法检测s r b 只需2 0 m i n 。 ( 四) 通过代谢产物定量分析 ( 五) 固着菌检测 1 1 5 硫酸根测定方法及优缺点 根据实验室条件，决定从代谢物方面着手测定硫酸盐还原菌的生长情况， 选择硫酸根作为测定物。通过查阅1 9 8 5 年水中硫酸根测定方法综述一文，对水 中s 0 4 2 测定方法，根据s 0 4 2 。和所加试剂的化学反应分为直接测定法和间 接测定法两大类，现列表如下瞰】： 7 第一章绪论 表1 3 硫酸根测定方法表 t a b l e l 3t h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o dl i s to fs u l f a t e ( 一)重量法 但由于重量法操作繁琐费时，在例行的常规分析中逐渐为其它分析方法所取 代。 ( 二) 吸光比浊法 水q b s 0 4 2 。浓度在1 0m g l 1 以下时，宜用吸光比浊法，它也是测定s 0 4 2 。的 标准方法之一。该法是根据s 0 4 2 与a a ：+ 反应生成b a s 0 4 的细微颗粒，当有保护 剂存在时，悬浮在溶液中，在光度计上测定其吸光度，以确定s 0 4 2 。的含量。 ( 三) 直接滴定法 直接滴定法是在一定酸度介质中，适当掩蔽剂存在下，用氯化钡标准溶液直 接滴定水s 0 4 2 。，由指示剂颜色突变确定滴定终点，计算s 0 4 2 。含量。但长期以来 r 第一章绪论 分析工作者一直没有寻找到合适的专属指示剂。而且能直接和s 0 4 2 反应进行地 比较完全、反应速度又足够快的滴定剂也甚少。b a 2 + 和p b 2 + 均能和s 0 4 2 直接 反应，但反应生成沉淀影响终点的观察。因此，1 0 4 2 。直接滴定法的应用受到限制。 ( 四) 间接滴定法 水s 0 4 2 。的测定由于重量法繁琐费时，直接滴定法又无专属指示剂，故间接 滴定法是目前测定水, s 0 4 2 。最常用方法。 ( 五) 光度法 能够直接与s 0 4 2 。反应生成可溶性的有色化合物，并用于光度法测定的试剂 很少。因而，光度法测定s 0 4 2 。一般也采用间接方法。铬酸钡光度法是常用的方 法，已被列为饮用水中硫酸盐测定的国家标准方法( g b 5 7 5 0 8 5 ) 。本法适于饮用 水q b s 0 4 2 的测定。 。 ( 六)火焰原子吸收法 化学反应原理与上述光度法相同，只是改用原子吸收光谱仪测定。有原子吸 收光谱仪的单位可以选用，但操作手续不如滴定法方便。 综上所述，前言中已提到由于各种类型的水，所处地球化学环境不同，其1 0 4 2 含量悬殊极大，而各种分析方法，又有定的测定范围，这就不可能以一种固定的 测定方法进行各种含量范 i s 0 4 2 。的定量测定，应根据具体情况灵活地选择测疋 方法。 第二节硝酸盐还原菌概述 1 2 1硝酸盐还原菌生理生化特性 微生物和植物吸收利用n 0 2 和n 0 3 为呼吸作用的最终电子受体，把硝酸还 原成氮( n 2 ) ，称为反硝化作用或脱氮作用。能进行反硝化作用的只有少数细 菌，这个生理群称为反硝化菌( n i t r i t er e d u c i n gb a c t e r i a ，简称n r b ) 【2 5 1 。 ( - - ) n r b 的种属 反硝化细菌在分类学上没有专门的类群，它们分布于原核生物的众多属中。 这些包含反硝化细菌的属绝大多数分布于细菌界，少数分布于古生菌界。 ( - - ) n r b 的生活环境和条件 9 第一章绪论 n r b 在自然界中分布广泛，可以存在于土壤、水稻田、海水、油井，含氮 沉积物，河底污泥，污水等。可以从一些受污染的环境中监测到它的存在，如 污水处理厂废物，富营养化的水体中。n r b 是好气的，但是在缺氧时为了生长， 用硝酸盐作为电子受体。因此，这种作用中，在没有硝酸盐存在时是好气性生 长，有硝酸盐存在时是厌气性生长。在没有氧气和硝酸盐的情况下很少发育。 ( 三) nrb 在氮素循环体系的地位和作用 元素氮是构成生物细胞的基本成分之一( 生物体内c ：n ：s = 1 0 0 ：1 0 ：1 ) ， 自然界中的氮循环是一个重要的地球化学循环，其中各个环节都有微生物的参 与，n r b 在这个体系中起着不可缺少的作用。 ( 四) nrb 还原硝酸盐过程中涉及到的酶裂2 6 】 n i m 还原硝酸盐主要有以下几个过程： ( 1 ) 硝酸还原酶：在异化硝酸还原酶( d n r ) 或硝酸还原酶a 的作用下将硝 酸根还原成亚硝酸根。 ( 2 ) 亚硝酸还原酶：一般有两种类型。一种是含有铜蛋白质，另一种是亚硝 酸还原酶，是一种细胞色素c d ，较为常见。 ( 3 ) 一氧化氮还原酶：对这种酶的研究尚未得到高度纯化和广泛的研究。因 为一氧化氮分子具有高度反应性的特点造成了一氧化氮还原酶分离和鉴定上的 困难。 ( 4 ) 一氧化二氮还原酶：由于不稳定性和细胞破裂时电子传递链的损失，因 此对于该酶的提纯工作尚未完成。 ( 五) 影响n r b 还原硝酸盐的影响因子 能够活跃使氮素挥发的只限于细菌，而且只局限于某些属的细菌，这暗示 n r b 作用的大小和速度显著得受环境的影响。这些起作用的微生物彼此具有某 些生理学的类似性，所以生境的变化可以明显得刺激或大大抑制这些经济上重 要的微生物。在环境的影响中，主要的是有机质的性质和数量、通气性、水分 状况、酸度和温度。 ( 六) n r b 在环境中的反应： ( 1 ) 土壤中的n r b ：一方面认为根区的反硝化作用是有害的，除去了基本的 植物养料，而且已经找出化学抑制剂以减少表层的这种损失。而另一方面，在 根区所占有的区域以下的硝酸盐，对于农业来说，已经不再有利而且它有时候 造成重大的环境危害。 1 0 第一章绪论 ( 2 ) 大气中氮素循环：一般认为在地面出现的低浓度的一氧化二氮是无害的， 但是大气自然科学家已经发现，这种反硝化作用的产物的确有一个重要的生态 影响，这种影响会减少大气中的臭氧成分，使人们暴露在有害射线下。 ( 3 ) 参与金属腐蚀：n r b 在通气不良的环境中，能把硝酸还原成亚硝酸。 在环境中积累一定量的硝酸和亚硝酸，从而对金属造成腐蚀。 1 2 2 硝酸盐还原菌的运用： ( 一) 土壤生物修复：利用硝酸还原菌将硝酸盐还原，促进土壤中的氮素循环， 改变土壤成分，增加土壤肥力，特别是在硝酸盐含量大p h 值高的地区。附着 在植物根系，加强植物根系对土壤中的氮素的吸收，改良土壤性质【2 7 1 。 ( - - ) 废水处理：许多家工业，如采矿业、造纸业等产生的废水中都含有大量 的硝酸盐，加入水体后会引起不同程度的富营养化，对环境和人类产生危害。 所以这类废水必须在排入自然界之前进行处理。利用n r b 的特性，可以设计工 艺取出硝酸盐。 ( 三) 解决石油管道腐蚀问题i l l 】 1 2 3 硝酸盐还原菌的鉴定方法 用酒石酸钾钠培养基，配方如下：酒石酸钾钠2 0 9 ，k n 0 3 2 9 ，k 2 h p 0 4 0 5 9 ， m g s 0 4 7 h 2 0o 2 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h7 2 - 7 5 或柠檬酸钠钾培养基：柠檬酸钠 5 0 9 ，k n 0 32 9 ，k 2 h p 0 4o 5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ，蒸馏水10 0 0 m l ，p h7 2 - 7 5 接 种一定菌种2 8 恒温下培养1 5 d 以上，每天观察生长状况。检查试管是否浑浊， 用g r i e s s 试剂检查亚硝酸盐，呈桃红或红色说明生成亚硝酸盐正反应或负反应。 还要检查是否含n 0 3 ，白瓷盘凹涡中加入浓硫酸和二苯胺各两滴，滴入待测液， 出现蓝色有n 0 3 , 无蓝色说明n 0 3 。、n 0 2 完全消失，反硝化菌大量存在。 1 2 4 硝酸根测定方法及优缺点 在环境监测中，硝酸盐和亚硝酸盐是重要的分析项目。光谱法测定n 0 3 - n 、 n 0 2 - n 是最常用、最普通的方法，容易满足测定要求，且限制较少。本文通过 对多种硝酸盐、亚硝酸盐的光谱测定法( 分光光度法、化学发光法、荧光法、 催化动力学法、红外线法、电子顺磁共振法等) 进行评价，指出了不同光谱法 的优点及其适用范围的限定【2 8 】。 1 1 第一章绪论 ( 一) 分光光度法 ( 1 ) 可见分光光度法 ( 2 ) 紫外分光光度法 ( 三) 荧光光度法 荧光光度法灵敏度高，近年来对荧光光度法测定n 0 2 。和n 0 3 的研究逐渐增 多。 ( 四) 化学发光法 ( 五) 催化动力学法 ( 六) 其他一些特殊的光谱方法 综上所述，硝酸盐和亚硝酸盐光谱测定法日益增多。吸光光度法所用仪器 设备简单、价廉，灵敏度也较高，其研究方法具有实用性和可操作性，易于在 基层单位使用。近年来连续流动分析技术的发展，分光光度法与连续流动分析 技术相结合，大大提高了方法的灵敏度，可同时测定硝酸盐和亚硝酸盐，操作 更为简便、快速，消耗的反应液和样品量小，已成为光谱分析法研究的一个新 热点，具有广泛的前景。紫外分光光度法的优点是不经分离可直接同时测定硝 酸盐和亚硝酸盐，具有较好的选择性，操作简便。一阶导数紫外分光光度法和 第二衍生光波紫外可见光谱法已成为近年来紫外分析法中研究的新热点，拓宽 了紫外分光光度法研究的领域。催化动力学法近年来发展较快，应用广泛，检 测限一般可达1 0 2 n g m l ，可直接测定样品中痕量硝酸盐和亚硝酸盐。荧光法、 化学发光法、红外线法、分子腔释放法、电子顺磁共振法对仪器的要求较高， 但其测定的灵敏度高，在某些方面的开发应用也具有良好的前景。 第三节生物竞争排斥概述 生物竞争排斥方法是一种生态学处理技术，利用自然原地有益微生物来抑 制另一微生物的生长，达到预期效果。 目前，我国生物竞争排斥方法运用得最多的是在饲料方面，利用生物竞争 排斥现象预防沙门氏菌病；如蜡样芽胞杆菌( d m4 2 3 ) 、乳酸杆菌、粪链球菌等 制剂。利用生物竞争排斥法改造养禽场微生态等等。国外，已经将生物竞争排 斥法应用于石油工业中，通过向石油管道中添加硝酸盐积极代替硫酸盐成为电 子受体，促使天然硝酸盐还原菌群生长。来自加利福尼亚、俄克拉何马、中国 1 2 第一章绪论 和加拿大的矿场资料表明这种方法是有效的。但是目前国内对这种机制研究较 少。 1 3 1 生物抑制概述 微生物防治方法就是利用微生物的方法一生物竞争淘汰法，即通过微生物 群的替代，将油田微生物问题变为有利因素，可替代生物群在就地生产天然气， 聚合物，表面活性剂，同时防止和除去硫化物，既可提高油层采收率，又能防 止油层酸化的方法。微生物防治方法机理其一是所细菌在生活习性上与s r b 非