（细胞生物学专业论文）凤凰河人工湿地中主要细菌的分离筛选、生理生化特性鉴定及分子鉴定.pdf

四川师范大学硕士论文 凤凰河人工湿地中主要细菌的分离筛选、 生理生化特性鉴定及分子鉴定 细胞生物学专业 研究生邓景韬指导教师宗浩 摘要本课题从四川成都凤凰河人工湿地中分离筛选出1 6 株细菌，分别定 名为n i - - 一，1 1 、x l 、l 1 - 4 。通过对其培养特征、菌落形态特征和个体形态特征 的研究，以及生理生化特性的测定，再通过1 6 s r d n a 的p c r 测序鉴定，判定所 属类别。 经过初步鉴定，并依据伯杰细菌鉴定手册进行分类，判定n l 、n 4 、 n 5 、n i o 、n 1 1 为菌株芽孢杆菌( b a c i l l u s ) ；n 3 、n 8 为芽孢乳杆菌 ( s p o r o l a c t o b a c i l l u s ) ；n 2 、n 9 为乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s ) ；n 6 、n 7 为链球菌 ( s t r e p t o c o c c u s ) ；x l 为硝化杆菌( n i t r o b a c t e r ) ：l 1 为产碱杆菌( r a l s t o n i a ) 、 l 2 为假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) ；l 3 为分枝杆菌( m y c o b a c t e r i u m ) ；l 4 为红 球菌( r h o d o c o c c u s ) 其中通过分子鉴定，能判断到种的是：n i o 、n 11 短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) 、l 1 青枯病产碱杆菌( r a l s t o n i ae u t r o p h a ) 、l 3 恶臭假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s p u t i d a ) 。 本课题分离筛选出了一些在人工湿地净化作用上具有潜在应用价值的细 菌，这对优化人工湿地中微生物的结构，以进一步提高人工湿地的净化效果有 一定的参考价值。 关键词人工湿地；分离；筛选；培养；生理生化鉴定；1 6 s r d n a ；测序； 分子鉴定；分类 四川师范大学硕士论文 t h e i s o l a t i o n ，s e l e c t i o n ，b i o l o g i c a la n dm o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o no fl e a d i n gb a c t e r i ai nf e n g h u a n g h e c o n s t r u c t e dw e t l a n d m a j o r ：c e l lb i o l o g y g r a d u a t e ：d e n gj i n g t a o s u p e r v i s o r ：z o n gh a o a b s t r a c t ：16b a c t e r i as t r a i n sw e r ei s o l a t e da n ds e l e c t e df r o m f e n g h u a n g h e c o n s t r u c t e dw e t l a n di nc h e n g d u s c t h e yw e r en a m e dn 1 11 、x 1 、l l - 4 r e s p e c t i v e l y b ys t u d y t h e i rc u l t i v a t i o n f e a t u r e s ，c o m m u n i t ya n di n d i v i d u a l c o n f i g u r a t i o n , i n d e n t i f i c a t et h e i rb i o l o g i c a lf e a t u r e s ，a n dc o m b i n e 谢1t h er e s u l to f 16 s r d n ap c r s e q u e n c i n g , t h e nd e t e r m i n e dt h e i rc a t e g o r y a c c o r d i n gt o t h eb e r g e y sm a n u a ld e t e r m i n a t i v eb a c t e r i o l o g y , t h er e s u l t p r o v e dt h a t ：n l ，n 4 ，n 5 ，n 1 0 , n l lw e r eb a c i l l u s ；n 3 , n 8w e r es p o r o l a c t o b a c i l l u s ； n 2 , n 9w e r el a c t o b a c i l l u s ；n 6 , n 7w e r es t r e p t o c o c c u s ；x 1w a sn i t r o b a c t e r ；l 1w a s r a l s t o n i a ；l 2w a sp s e u d o m o n a s ；l 3w a sm y c o b a c t e r i u m ；l 4w a sr h o d o c o c c u s b ym o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n , t h ef o l l o w sb a c t e r i as t r a i n sc a nc l a s s i f i e dt o s p e c i e s ：nio , n11 - b a c i l l u sp u m i l u s ；l1 一r a l s t o n i ae u t r o p h a ；l 3 - p s e u d o m o n a s p u t i d a s o m eb a c t e r i ao fa p p l i a c a t i o nv a l u et ot h ep u r i y i n ge f f e c to fc o n s t r u c t e d w e t l a n dw e r ei s o l a t i e da n ds e l e c t e di nt h i ss t u d y , w h i c hw i l l g i v er e f e r e n t i a lv a l v e t o o p t i m i z e t h e m i c r o o r g a n i s ma n df u r t h e ri m p r o v e t h ep u r i y i n ge f f e c t o f c o n s t r u c t e dw e t l a n d k e y w o r d s ：c o n s t r u c t e dw e t l a n d ；i s o l a t i o n ；s e l e c t i o n ；c u l t i v a t i o n ；b i o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o n ；16 s r d n a ；s e q u e n c i n g ；m o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n ；c l a s s f i c a i o n 四川师范大学硕士论文 图形目录 图1l6 株细菌的个体形态18 图2 菌株n 9 1 1 的1 6 s r d n ap c r 产物电泳图2 4 图3 菌株l 1 4 的1 6 s r d n ap c r 产物电泳图2 4 图4 菌株n 10 的16 s r d i n a 部分序列一2 5 图5 菌株n 1l 的1 6 s r d n a 部分序列一2 5 图6 菌株l 1 的1 6 s r d n a 部分序列2 6 图7 菌株l 2 的16 s r d n a 部分序列2 6 图8 菌株l 3 的16 s r d n a 部分序列2 7 图9 菌株l 3 的16 s r d n a 部分序列一2 7 表格目录 表1 固体培养基配方4 表2 菌落群体形态统计表17 表3 细菌个体形态统计表18 表4 糖发酵试验结果2 1 表5 细菌的理化性质2 3 表6n 1 0 1 l 、l l - 4 菌株1 6 s r d n a 序列鉴定结果“3 0 v 四川师范大学学位论文独创性及 使用授权声明 本人声明：所呈交学位论文，是本人在导师室渣指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何 其他个人或集体己经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 本人承诺：已提交的学位论文电子版与论文纸本的内容一致。如因不符而 引起的学术声誉上的损失由本人自负。 本人同意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学拥 有学位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生必须按学校规定提交印 刷版和电子版学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库供 检索；2 ) 为教学、科研和学术交流目的，学校可以将公开的学位论文或解密 后的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所或在有关网络上供阅读、浏览。 本人授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文 全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：唧梁韬 签字日期：川年孓月土7 日 新躲宝c 、彩 婵醐珈缈月7 日 四川师范大学硕上论文 引言 人工湿地污水处理技术是二十世纪七八十年代发展起来的一种新型污水 生态处理技术，具有投资少、抗冲击、景观生态相容性好等诸多优点n 3 。一般 由人工基质和生长在其中的水生植物( 如芦苇、香蒲等) 组成，是一个独特的基 质一植物一微生物组成的生态系统。当污水通过系统时，其中污染物质和营养 物质被系统吸收、转化或分解，从而使水质得到净化。它利用生态系统中物种 共生、物质循环再生原理，结构与功能协调原则，在促进废水中污染物质良性循 环的前提下，充分发挥资源的生产潜力，防止环境的再污染，获得污水处理与资 源化的最佳效益，是一种同时具有环境效益、经济效益及社会效益的废水处理 技术，适合于水量不大、水质变化不大、管理水平不很高的城镇的污水处理嘲。 湿地基质微生物在人工湿地对污水的处理中起重要作用，近年来对基质微 生物的研究逐渐深入，包括微生物种群时空分布口4 1 ，微生物酶活性口1 ，遗传多样 性肺卅等。微生物是生态系统中的分解者，在自然界的物质循环和转化过程中起 着重要的作用。它们把有机质作为丰富的能源，将其转化为营养物质和能量。 人工湿地在处理污水之前，各类微生物的数量与自然湿地基本相同。但随着污 水不断进入人工湿地系统，某些微生物的数量将逐渐增加，并逐渐达到稳定。 人工湿地中微生物的活动是湿地净化污水的最主要因素。现有研究已经发现在 b o d 。、c o d 以及氮等降解的过程中微生物都发挥了重要作用。微生物的作用机 制主要是利用寄生于根系中的微生物的代谢作用，微生物的代谢能将凝聚性固 体、可溶性固体颗粒进行好氧、厌氧分解，最终降解成无机物，微生物还能通 过硝化一反硝化作用去除氮、通过有机磷的矿化作用沉淀基质中的无机盐，达 到去除重金属的目的呻，。 而细菌在人工湿地主要的微生物类群中占主导地位，所以，近年来人工 湿地中的细菌已成为世界上研究的重点。人工湿地中的优势菌种主要是一些芽 孢杆菌，这些菌对环境的适应能力很强，它们在污染物的处理过程发挥着一定 的作用，这些细菌的具体功能尚有待进一步研究蹭1 。其中假单胞杆菌属、产碱 杆菌属和黄杆菌属，均为生长快速的微生物，其体内含有降解质粒，是分解有 机物的主体微生物种群，。 四川师范大学硕士论文 成都凤凰河人工湿地是目前成都最大的人工治污湿地，也是成都市规划的 一座污水处理厂。这块人工湿地旨在净化由市周边城镇流入市内的生活污水、 工业污水及畜禽养殖污水。目前这里已设置有游乐设施，为人们提供了一个集 休闲、旅游、环境教育多功能为一体的生态乐园。经过近两年的使用，其净化 效果表现卓越。根据规划，这样的人工湿地将在成都市的排水规划中被推广到 更多的适宜地区。 为此，本课题对这块人工湿地中细菌的多样性进行了初步研究，旨在筛选 分离出一些具有潜在应用价值的细菌种类，对其进行鉴定和分析，为构建更有 效的人工湿地污水处理系统奠定一定的基础。 2 四川师范大学硕士论文 材料与方法 1 供试材料 1 1 取样源 成都凤凰河人工湿地生态池 1 2 取样记录 时间：2 0 0 8 年3 月1 0 日1 6 ：2 0 温度：1 8 取样位置：人工湿地生态池植物根系附着土壤 土质：土壤湿润，深灰色，砾石较多 1 3 取样方法 采样深度：l o 一- - 1 5 c m 。 采样工具：直尺、皮尺、小铲、7 5 7 , 醇。每测量土深和采样一次，直尺 和小铲都要灭菌。所取土样立刻放入灭菌袋中备用。也可暂时于冰箱中4 。c 保 存。 2 培养实验 2 1 混菌的筛选、分离与培养 2 1 1 土壤悬液的制备与梯度稀释 制备土壤悬液 称取土样l o g ，迅速倒入无菌水( 1 0 0 m 1 ) 瓶中，振荡5 1 0 m i n ，使土样 充分打散，即制成稀释度1 0 。2 的土壤悬液n 0 1 。 稀释 用无菌移液管吸稀释度1 0 。2 的土壤悬液0 5 m l ，注入4 5 m l 无菌水中即为 1 0 。3 的稀释液。如此重复，依次制成1 0 4 - - 一1 0 6 稀释液。操作时管尖不能接触液 面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土壤悬液后，要将移液管插入液 面下，吹吸3 次n 0 1 1 。 四川i 师范大学硕士论文 2 1 2 混菌的培养 培养基制作n 2 1 4 1 明 培养基3 类，分别为：牛肉膏蛋白胨培养基、氨氧化细菌选择培养基、解 磷( 无机磷) 细菌选择培养基( 各培养基配方见表1 ) 。 表1 固体培养基配方 t a b 1i n g r e d i e n t so fs o l i dc u l t u r em e d i u m s 4 四川师范大学硕士论文 各种培养基分别按配方配好后，调p h 为7 2 7 4 ，分装于5 0 0 i l 三角瓶 中，塞好棉塞，用牛皮纸包好，放入高压灭菌器中于压力1 5m p a 、1 2 1 灭菌2 0 m i n ，自然冷却至室温，4 冷藏备用。用时融化，并在无菌条件下倒入已灭菌 平板中，每个平板用量约1 5 , - 一2 0 m l 。 倒平板 按无菌操作要求，取熔化并冷却至不烫手( 约5 0 ) ，倒入无菌培养皿中， 倒量以铺满皿底为限，平放桌上待其充分凝固后，放入3 7 c 恒温箱中，2 4 h 后观察平板表面，若无菌长出，可备用j 创。 土壤悬液的接种 采用涂布法。待固体培养基平板凝固后，分别用l m l 无菌吸管加0 1 m 1 1 0 。5 、 1 0 咱稀释度的土壤悬液于培养基平板表面，然后用无菌玻璃耙将悬液均匀地涂 抹于琼脂表面。用同一吸管接种同一样本不同稀释度的悬液于培养皿时，应从 高稀释度开始，然后依次接种较低稀释度的悬液n 训。 培养 将接种后的培养皿倒置入3 6 恒温箱中培养2 - - 3 天。 2 1 3 混菌的分离 用接种环将具有不同特征的孤立的单个菌落一一挑出，移接到含有相应培 养基的试管斜面上并编号。 2 2 纯化培养 将分离得到的原始培养物，用适量无菌水做成稀薄的菌悬液，按上述涂布 法进行平板分离。只有反复进行二、三次，在平板上都没有出现异样菌落，才 可以确认为纯化培养。 2 3 菌种保存 将得到的纯培养菌接种于斜面培养基中，置于3 6 。c 恒温箱中培养4 - - 5 天， 待菌种富集后，放入4 低温冰箱中保存，以待鉴定。 5 四川师范大学硕士论文 3 纯化菌种的形态特征研究 3 1 群体形态的研究 对上述步骤得到的单一纯化菌种，在无菌操作条件下，以无菌蒸馏水进行 适当的稀释，吸取0 1 m l 移放到分别注入固体培养基平板上，并用无菌玻璃耙涂 布均匀，倒置于3 6 c 恒温培养箱中培养至单菌落长出。对得到的单菌落分别进 行外观的大小、形态、颜色、光泽度、粘稠度、隆起形状、透明度、边缘特性、 水溶性色素、质地等方面的详细观察研究并记录结果u 副。 3 2 个体形态的研究 3 2 1 革兰氏染色鉴定 涂片：在洁净的载玻片上滴1 d 蒸馏水，用接种环挑取菌落，混匀，涂片成薄 膜； 干燥：于空气中自然干燥； 固定：将涂片膜向上，通过火焰2 3 次( 以热而不烫为宜，防止菌体变形) ； 初染：滴加结晶紫染液，染色l 一2 m i n 后水洗； 媒染：碘液冲去残留的水，并覆盖l m i n ，水洗； 脱色：白色背景下，滴管流加9 5 的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色为止， 立即水洗； 复染：滴加石炭酸番红液复染2 m i n ，水洗； 镜检：干燥后油镜观察菌体颜色和细菌形态( 菌体呈蓝紫色为革兰氏阳性菌； 呈红色为革兰氏阴性菌) 3 2 2 芽孢观察 采用芽孢染色法( 孔雀绿染色法) 。 染色剂配制：5 孔雀绿水溶液；0 5 番红溶液 染色步骤：涂片，干燥，固定；于载片上滴入3 , - - , 5 滴5 孔雀绿水溶液； 用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时( 冒烟，但 未沸腾) ，开始计算时间约4 5 m i n 。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可 添加少许染料；倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为 6 四川师范大学硕士论文 止；用0 5 碱性复红( 番红) 复染2 - 3 m i n ，水洗； 镜检：制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。 3 2 3 荚膜观察 采用荚膜染色法( 背景染色) 。 染色剂配制：绘图墨汁；0 5 番红溶液；纯甲醇 染色步骤：在载玻片一端滴一滴无菌水，取少许菌苔在水滴中制成悬液。 取一滴墨汁与菌悬液混合，并用另一载玻片之一端将此水滴在载片上刮成薄 膜，风干。用纯甲醇固定l m i n 。加0 5 番红液数滴滴于涂片上，冲去残余甲 醇，并染3 0 s ，然后倾去染液，立即吸干备镜检。 镜检：背景黑色，荚膜无色，细胞红色。 4 纯化菌种的理化特性研究 4 1 糖发酵试验 根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作鉴定的依据。具体 操作是可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲基紫( b c p 指示剂，其p h 在5 2 以下呈黄色，p h 在6 8 以上呈紫色) 经过培养后根据指示剂的颜色变化来判断。 是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察u 。 4 1 1 培养基的制作 蛋白胨2 9 ，n a c l 5 9 ，k s h p 0 , 0 2 9 ，加水1 0 0 0 m l ，溴麝香草酚蓝( 1 水溶 液) 3 m l ( 先用少量9 5 乙醇溶解后，再加水配成1 水溶液) ，糖( 葡萄糖、乳 糖) l o g 。分别称取蛋白胨和n a c l 溶解于热水中，调节p h 至7 4 ，再加溴麝香草 酚蓝1 水溶液，加入糖，分装试管，装量4 - 5 c m 高，并倒放入一杜氏小管( 管 口向下，管内充满培养液) ，1 1 5 ，湿热灭菌2 0 m i n 。灭菌时注意适当延长煮 沸时间，尽量把冷空气排尽以使杜氏小管内不残存气泡。 4 1 2 试管标记 取分别装有葡萄糖、乳糖培养液试管，每种糖发酵中均分别标记空白对照。 7 四川师范大学硕士论文 4 1 3 接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上个相应试管中，每种糖发酵的空白对 照均不接种细菌。将装有培养液的杜氏小管倒置放入试管中，置3 7 。c 恒温培养， 分别在2 4 h ，3 6 h 和7 2 h 观察结果。 4 1 4 观察记录 与对照管比较，若接种管培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明 该细菌不能利用该种糖，记录用“一表示；如果培养液成黄色，反应结果为 阳性表明该菌能够分解该种糖类产酸，记录用“+ 表示。培养液中的杜氏小 管内有气泡为阳性反应，表明该细菌能分解该种糖类产酸并产气，记录用“+ 表示，如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“一 表示。 4 2 甲基红试验( m r ) 4 2 1 培养基的制作 蛋白胨 葡萄糖 、 n a c l 水 p l t7 0 7 2 每管分装4 - - 5 m l ， 4 2 2 甲基红指示剂的配制 甲基红 9 5 乙醇 蒸馏水 5 9 5 9 5 9 1 0 0 0 m l 1 1 5 。c 蒸气灭菌3 0 m i n 。 0 1 9 3 0 0 m l 2 0 0 m l 4 2 3 试管标记 取装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，分别标记各菌种和空白对照。 8 四川师范大学硕士论文 4 2 4 接种培养 接种试验菌于以上培养液中，置3 7 。c 恒温箱中，培养2 4 - - - 4 8 h 。 4 2 5 观察记录 在培养液中加入2 3 滴甲基红试剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液 上层，若培养液上层变成红色，即为甲基红试验阳性反应，记录用“+ 表示； 黄色为阴性反应，记录用“一表示( 因甲基红变色范围4 4 红至6 0 黄) 。 4 3 甲基乙酰甲醇试验( v 。p ) 4 3 1 培养基的制作 与甲基红实验同。 4 3 2 试剂配制 肌酸 n a o h 0 3 或原粉 4 0 4 3 3 试管标记 取装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，分别标记各菌种和空白对照。 4 3 4 接种培养 与甲基红实验同。 4 3 5 观察记录 取出以上试管，振荡2 m i n 。取培养液和4 0 氢氧化钠等量相混。加入少许 肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入。放入3 7 恒温箱中保温1 5 - - - 3 0 m i n 后，如培养液出现红色，即为v p 试验阳性反应，记录用“+ 表示；若不呈 红色，则为v p 试验阴性反应，记录用“一 表示。有时需要放置更长时间才 出现红色反应。 9 四川师范大学硕士论文 4 4 吲哚试验 4 4 1 培养基的制作 蛋白胨l o g ，n a c l 5 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 7 2 7 4 ，1 2 1 湿热灭菌2 0 m i n 。 4 4 2 吲哚试剂配制 对二甲苯氨基苯甲醛 乙醇( 9 5 ) 浓h c l 8 9 7 6 0 m l 1 6 0 m 1 4 4 3 试管标记 取装有1 蛋白胨水培养基的试管，分别标记并且加入空白对照。 4 4 4 接种培养 以无菌操作技术分别接种少量菌苔到以上相应试管中，留一管做空白对照 不接种，置3 7 。c 恒温箱中培养2 4 4 8 小时。 4 4 5 观察记录 取出培养液，沿管壁缓缓加入3 5 n u n 高的吲哚试剂于培养液表面，在液 层界面发生红色，即为阳性反应。若颜色不明显，可加4 5 滴乙醚至培养液， 摇动，使乙醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚 试剂。如培养液中有吲哚时，吲哚可被提取在乙醚层中，浓缩的吲哚和试剂反 应，则颜色明显。如有吲哚存在，乙醚呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应， 记录用“+ 表示；如没有吲哚存在，乙醚呈现原色，此为吲哚试验阴性反应， 记录用“一表示。 4 5 氧化酶鉴定 在洁净的培养皿上放上一张滤纸，滴上等量的1 盐酸二甲基对苯二胺水 溶液和1 a _ 酚酞酒精( 9 5 ) 溶液( 混匀) 。滴入量以使滤纸湿润为适宜，用 白金丝接种环( 不可用镍铬丝) 挑取少量培养了1 8 - - 2 4 h 的菌苔，涂抹于滤纸 1 0 四川师范大学硕士论文 上。观察。( 如在l o s 内涂抹的菌苔呈现玫瑰红或者蓝色为阳性；l o s - - - 6 0 s 现 色为延迟反应；在6 0 s 后显色仍按阴性处理) 。 4 6 接触酶鉴定 4 6 1 试剂配制 3 - - - 1 0 过氧化氢。 4 6 2 接种与结果观察 将2 4 h 培养的斜面菌种，以铂丝接种环取- d , 环涂抹于已滴有3 过氧化 氢的载玻片上，静置l 3 m i n 观察，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。 4 7 产氨试验 4 7 1 培养基的制作 蛋白胨5 9 蒸馏水1000ml p h7 2 ，分装试管，1 2 1 c 灭菌1 5 - - 一2 0 m i n 。 4 7 2 试剂配制 将2 0 9 碘化钾溶于5 0 m l 水中，并在此溶液中加碘化汞小粒至溶饱和为止 ( 约3 2 9 ) 此后再加4 6 0 m l 水和1 3 4 9 氢氧化钾，将上清液贮于暗色瓶中备用。 4 7 3 接种 以幼龄种子接种，置适温培养1 ，3 ，5 天。 4 7 4 结果观察 取培养液少许，加入试剂数滴，出现黄褐色沉淀为阳性。 四川师范大学硕士论文 5 纯化菌种的分子鉴定 5 1 细菌基因组d n a 的提取与纯化 5 1 1d n a 的提取 采用细菌基因组d n a 提取试剂盒( 离心柱形) 提取测试菌的d n a 。 试剂盒药品组成：缓冲液g a 、缓冲液g b 、去蛋白液g d 、漂洗液p w 、洗 脱缓冲液t e 、蛋白酶k 、吸附柱c b 3 、收集管( 2 m 1 ) 操作步骤： 取细菌培养液1 ，- - 5 m l 于洁净的离心管中，1 0 0 0 0 r p m 离心1 分钟，尽量吸 净上清； 向菌体沉淀中加入2 0 0l al 缓冲液g a ，振荡至菌体彻底悬浮； 向管中加入2 0u1 蛋白酶k 溶液，混匀； 加入2 2 0 pl 缓冲液g b ，振荡1 5 s ，7 0 c 放置1 0 分钟，溶液应变清亮，简 短离心以去除管盖内壁的水珠； 加入2 2 0l a1 无水乙醇，充分振荡混匀1 5 s ，此时可能会出现絮状沉淀， 简短离心以去除管盖内壁的水珠； 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱c b 3 ( 吸附柱放入收集管 中) ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，倒掉废液，吸附柱c b 3 放入收集管中； 向吸附柱c b 3 中加入5 0 0p1 去蛋白液g d ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，吸附柱放 入收集管中； 向吸附柱c b 3 中加入7 0 0l al 漂洗液p w ( p w 使用前加入适量无水乙醇， 1 5 m l p w 中加入6 0 r a l 无水乙醇) ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，倒掉废液，吸附柱c b 3 放入收集管中； 向吸附柱c b 3 中加入5 0 0u1 漂洗液p w ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，倒掉废液； 吸附柱c b 3 放入收集管中，1 2 0 0 0 r p m 离心2 分钟，目的是将吸附柱中的 残余漂洗液去除。将吸附柱c b 3 置于室温或5 0 c 温箱放置数分钟，以彻底晾 干吸附材料中残余的漂白液； 将吸附柱c b 3 转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 5 0 2 0 0i il 经6 5 - - - 7 0 。c 水浴预热的洗脱缓冲液t e 中( 洗脱缓冲液体积最好不 少于5 0ul ，体积过小影响回收率) ，室温放置2 5 分钟，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ； 1 2 四川师范大学硕士论文 离心得到的溶液再加入吸附柱c b 3 中，室温放置2 分钟，1 2 0 0 0 r p m 离心2 分钟。 将得到的d n a 产物保存于一2 0 ，以防d n a 降解。 5 1 2d n a 的纯化n 6 1 加l m l 7 0 的乙醇( 4 ) ，洗涤一次，4 c ，1 2 0 0 0 g 离心5 m i n ，弃去上 层乙醇，在3 7 c ，使沉淀干燥l h 。再将d n a 溶解于2 0 0 l al 无菌蒸馏水中，振 荡，贮存于- 2 0 c 备用。 5 2 细菌16 s r d n a 的p c r 扩增 1 6 s r d n a 基因的p c r 扩增以所提取的细菌总d n a 为模板，采用细菌1 6 s r d n ap c r 通用引物( 正向引物p 1 和负向引物p 2 ) ，在p c r 扩增仪上进行1 6 s r d n a 基因扩增。 5 2 1 反应体系的建立 反应体积：5 0l a1 组成：5 x b u f f e r 弓l 物p l 、p 2 d n t p t a qd n a 聚合酶 d d h 2 0 n 1 - n i o 的引物序列： l 1 - l 4 的引物序列： 1 0ul 1ul ( 各) 4u1 0 5pl 3 3 5ul p 1 ：5 一a g ag t tt g at c ct g gc t ca g - 3 p 2 ：5 一g g ta c tt a ga t gt t tc a gt t c - 3 p 1 ：5 一a g ag t tt g at c ct g gc t ca g 一3 p 2 ：5 一a c gg c ta c ct t gt t ac a gc t t - 3 1 3 四川师范大学硕士论文 反应物加入0 2 5 m l e p 管中，反应体系建立完全后，于3 0 0 0 r p m 离心3 m i n ， 再进行p c r 扩增。 5 2 2p e r 循环反应参数设定及程序 将待扩增的反应物置于p c r 扩增仪中，设置好扩增反应参数。 n 1 - n i o 的反应参数：将未加入酶的反应体系在9 4 预变性4 m i n ，使模板 d n a 充分解链；再加入t a qd n a 聚合酶进行循环反应，循环参数设定为9 4 变 性1 5 m i n ，5 5 退火l m i n ，7 延伸1 5 m i n ，3 0 个循环，最后7 2 延伸l o m i n l 1 - l 4 的反应参数：将未加入酶的反应体系在9 6 预变性6 m i n ，使模板 d n a 充分解链；再加入t a qd n a 聚合酶进行循环反应，循环参数设定为9 4 变 性l m i n ，5 6 退火l m i n ，7 延伸2 m i n ，3 0 个循环，最后7 2 延伸l o m i n 。 5 2 3p c r 扩增产物的清洁纯化回收 向扩增产物中加入于p c r 反应体积4 - 5 倍的b u f f e r c p ( c y c l e p u r ek i t ) ； 用v o r t e x 彻底混匀并简短离心； 收液体到吸附柱上，1 0 ，0 0 0 g ，离心l m i n ； 弃废液，重新将吸附柱放入收集管中； 加入d n aw a s hb u f f e r7 0 0 i il ，1 0 ，0 0 0 x g ，离心l m i n ； 弃去废液，加入d n aw a s hb u f f e r7 0 0ul ，1 0 ，0 0 0 g ，离心l m i n ； 弃去废液，空甩2 m i n 后，1 3 0 ，0 0 0 x g ，离心l m i n ； 将吸附柱放入一支洁净的1 5 m l 离心管中，加入1 5 3 0 m 1 e b ( w a t e r ) ， 室温放黄1 - - - 2 m i n 后，1 3 0 ，0 0 0 g ，离心l m i n v ； 重复上一步的操作。 5 2 4p c r 扩增产物的检测分析 5 2 4 1p c r 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳1 8 1 琼脂糖凝胶的制作 取干净电泳槽、制胶板和样品梳，用酒精擦洗，晾干后，备用； 称取0 2 9 琼脂糖于三角瓶中，加入0 5 t b e 稀释电泳缓冲液2 0 m l 。即制备 1 4 四川师范大学硕士论文 1 琼脂糖凝胶； 在微波炉中加热熔化至完全溶解或无颗粒状凝胶： 冷却至6 0 6 5 ，加入i o o m l e b 溶液( 1 m g m 1 ) ； 摇匀，轻轻倒入制胶槽中，使之形成均匀的胶面，尽量避免产生气泡； 待凝固( 3 0 - 4 0 m i n ) 后，取出样品梳，剥出胶带，根据槽的大小倒入适量 0 5 t b e 稀释电泳缓冲液，以完全浸没胶面0 2 c m 为宜； 电泳 每个样品分别以6ul 加样，d n am a r k e r 按使用说明进样。采用d y y i u 一6 b 型稳压稳流电泳仪。接通电流，样品进胶前电流控制在l o m h ，样品进入后控 制在2 0 - 4 0 m a ，4 0 - 6 0 v 。当溴酚蓝染料移动到胶板进样端的另一端约卜2 c m ， 即可停止电泳。 5 2 4 2p c r 扩增产物的检测 琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶成像系统观察电泳条带图谱，分析p c r 扩增 片段的大小和特异性。 5 3p c r 产物测序 将清洁纯化回收后的p c r 产物送往成都英骏生物有限公司进行测序。 5 416 s r d n a 的基因序列分析 把所测得的序列提交到g e n b a n k 数据库，利用n c b i 中的b l a s t n 工具 ( h t t p ：n c b i n l m n i h g o v b l a s t ) 与g e n b a n k 数据库中已知微生物的 1 6 s r d n a 序列进行同源性比对，根据相似度，对各菌株进行鉴定。 1 5 四川师范大学硕士论文 实验结果 1 筛选分离培养结果 牛肉膏蛋白胨培养基从稀释度1 0 。6 土壤悬液中分离出单茵落1 1 个，分别编 号为n l 、n 2 、n 3 、n 4 、n 5 、n 6 、n 7 、n 8 、n 9 、n i o 、n 1 l ； 氨氧化细菌选择培养基从稀释度l o 。4 土壤悬液中筛选出单菌落1 个，编号 为x 1 ； 解磷细菌选择培养基从稀释度1 0 。5 土壤悬液中筛选出单菌落4 个，分别编 号为l 1 、l 2 、l 3 、l 4 2 纯化菌种的形态特征观察结果 2 1 群体形态特征 即单菌落在平皿培养基上生长的形态特征。分别从直径大小、形状特征、 颜色、光泽度、粘稠度、隆起形状、透明度、边缘特性和质地这9 个方面进行 观察和描述。观察描述结果见表2 。 2 2 个体形态特征 2 2 1 革兰氏染色鉴定结果 通过革兰氏染色观察，x l 、l 1 、l 2 菌株为革兰氏阴性细菌，其余菌种均 为革兰氏阳性细菌；在光学显微镜油镜下( 目镜1 0 x 2 0 ，物镜1 0 0 x 1 2 5 ) 观察其个体形状特征见表3 。 2 2 2 芽孢观察结果 通过芽孢染色实验，可观察到n 1 、n 3 、n 4 、n 5 、n 8 、n i o 和n 1 1 有芽孢， 1 6 四川师范大学硕士论文 其余菌株无芽孢。统计结果见表3 。 2 2 3 荚膜观察结果 通过荚膜染色实验，可观察到l 1 和l 4 含有荚膜，其余菌株不含荚膜。 统计结果见表3 。 表2 菌落群体形态统计表 慧鬻颜色茗絮簇鬻鬟质地 1 7 表3 细菌个体形态统计表 革兰氏染色形状芽孢荚膜 2 24 显微镜下细菌的个体形态见图1 。 图116 株细菌的个体形态 f i g 1i n d i v i d u a lf o r mo f1 6b a c t e r i as t r a i n s _ ， 7，一。乇 ，i ， 鼙 、 - 香， ， 露 川j l _ | j 范大学硕i 地文 ，姆 3 纯化菌种的理化研究结果 31 糖发酵试验结果 表4 糖发酵试验结果 3 擘璃 城誉；蓠 x ! ! ! ：! ! ! 坠坚壁! ! ! ! ! ! ! g ! ! ! ! 竺! ! 塑! ! ! ! 葡萄糖 乳糖 2 4 h3 6 h4 8 h 2 4 h3 6 h4 8 h 产酸产气产酸产气产酸产气产艘产气产醴产气产醴产气 篾 一麓u 黔萝一 - 一 - _ ， - - 一 + - _ 一 _ _ _ - 一 一 t - - - - - - - - - 一 十 - - 一 _ 一 一 - 一 一 一 _ 一 - 一 一 _ + - 一 一 一 _ - 一 一+ - + 一 一 _ - + + + 一 十 十+ - - + 十 - + + + 十 + 一 + - 一+ + + - + - + - - + + + 十+ + - - 一 - _ - 一 一 - 一 - + - - - + + + + - + _ m m m m m mm川u比 四川师范大学硕士论文 由表4 所示，n 1 、n 2 、n 6 、n 7 、n 9 、n i o 、n 1 l 、x 1 和l 2 菌株能利用葡萄 糖产酸，其中n l 、n 9 、n i o 、n l l 和l 2 菌株能同时产酸产气；n 6 和n l l 菌株 能利用乳糖产酸，其中n l l 菌株能同时产酸产气。n 6 和n l l 能利用两种糖( 葡 萄糖和乳糖) 。 3 2 甲基红试验( m r ) 结果 于培养液中加入甲基红试剂后，n 9 、n l l 、l 1 和l 2 培养液上层变为红色， 为阳性反应；其余培养液上层变为黄色，为阴性反应。记录见表5 。 3 3 甲基乙酰甲醇试验( v p ) 结果 只有n l 培养液显红色，为阳性反应；其余培养液无显色，为阴性反应。 记录见表5 。 3 4 吲哚试验结果 全为吲哚试验阴性反应。记录见表5 。 3 5 氧化酶鉴定结果 只有n 1 和l 2 菌苔呈玫瑰红，为阳性反应；其余菌苔不显色，为阴性反应。 记录见表5 。 。 3 6 接触酶鉴定结果 n l 、n 4 、n 5 、n i o 和l 2 测试菌产生气泡，为阳性反应；其余测试菌无气 泡产生，为阴性反应。记录见表5 。 3 7 产氨试验 四川师范大学硕士论文 x 1 、l 4 产生褐色沉淀，为阳性反应；其余无颜色变化，为阴性反应。记 录见表5 。 表5 细菌的理化特征 t a b 5p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r so fb a c t e r i a n l n 2 n 3 n 4 n 5 n 6 n 7 n 8 n 9 n 1 0 n 1 1 x 1 l l l 2 l 3 l a 4 分子鉴定结果 4 1 1 6 s r d n a 的p c r 扩增产物电泳结果 待测菌株的1 6 s r d n ap c r 扩增产物经1 琼脂糖凝胶电泳可见： n 9 、n 1 0 、n 1 1 分别在大约2 0 0 0 b p 、1 9 5 0 b p 、1 9 0 0 b p 处出现明亮条带，即 扩增d n a 片段分别约为2 0 0 0 b p 、1 9 5 0 b p 、1 9 0 0 b p ，见图2 。 l 1 、l 2 、l 3 、l 4 均在大约1 6 0 0 b p 处出现明亮条带，即1 6 0 0 b p 左右的扩 增d n a 片段，见图3 ； - - - - - - + - + + - - + + - + - + + - - - - - - 十 - - + + + 十 - - - + - - - - + - + - - - + + + + + + - + + + + + + + - - 竖删苎煎占兰丝! 堡苎 图2 菌株n 9 1 1 的16 s r d n ap c r 产物电泳图 f i g , 2 e l e c t r o p h o r e t i c p r o f i l eo f p c rp r e d u c to f n g 一1 1s t r a i n m a bc m ：2 0 0 0 b p d n a m a r k e r a ：p a s s a g e i ，i b ：p a s s a g el 2cp a s s a g el 3d ：p a s s a g el 4 四川师范大学硕士论文 4 21 6 s r d n a 测序结果分析 4 2 1p c r 产物序列 n 0 、n i t 、l 1 、l 2 、l 3 、l 4 菌株的p c r 产物序列分别见图4 - - 一9 。 图4 菌株n 1 0 的1 6 s r d n a 部分序列( 8 0 5 b p ) f i g 4p a r ts e q u e n c eo ft h e1 6 s r d n a o fn l o c a t g c 从g t cg a g c g g a c a ga u a g g g a g c t tg c t c c c g g a tg 1 v r a g c g