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上海交通大学博士学位论文井冈霉素的生物合成及途径改造 井冈霉素的生物合成及途径改造 摘要 井冈霉素是一类氨基环醇类抗生素，包含一个有效烯胺结构，在 亚洲被广泛应用于水稻纹枯病的防治，同时也用于有效烯胺的化学合 成，有效烯胺进而作为治疗二型糖尿病药物伏格列波糖的前体。井冈 霉素的生物合成途径的阐明对于更加有效的利用这一化合物有重要 的意义。在前期工作中，井冈霉素的生物合成基因簇已得到克隆并测 序。测序的区域共4 5k b ，通过b l a s t 分析确定了2 7 个开放阅读框。 为确定此基因簇的正确性及完整性，我们将分别包含v a 朋b c 和 v a l k l m n 的两个操纵子克隆到一个整合型载体p s e t l 5 2 上，并转入 异源宿主变铅青链霉菌1 3 2 6 中。在整合了以上七个基因的变铅青链 霉菌衍生菌株的发酵液中检测到了有效氧胺a 。进一步将编码糖基转 移酶的基因v a l g 转入此衍生菌株中，发酵后检测到了井冈霉素a 的 产生。此结果说明v a m b c k l m n 这七个基因能够满足有效氧胺a 的 合成，而v a l g 是负责最后一步将有效氧胺a 糖基化合成井冈霉素a 的糖基转移酶。 在井冈霉素a 的合成途径中，前期研究证实v a l a 是负责催化磷 酸戊糖途径中的7 磷酸景天庚酮糖转化为2 表5 表有效醇酮的环化 5 上海交通大学博士学位论文 井冈霉素的生物合成及途径改造 酶，是井冈霉素a 合成途径中的第一步。而在本研究中通过体外酶 活实验确认功能基因v a l d 是表异构化酶，负责催化2 表5 表有效醇 酮异构化生成5 表有效醇酮。当以7 磷酸景天庚酮糖为底物，v a l a 单独存在时，只生成2 表5 表有效醇酮；当v a l a 与v a l d 同时存在 时生成5 表有效醇酮。序列分析发现它属于v o c 家族。类似于此家 族的其它成员，v a l d 的每个活性位点分别由两个p c c p p p 模块构成； v a l d 的单聚体具有两个活性位点，且以二聚体的形式存在，因此它 是v o c 家族中目前发现的最大的成员。 前期工作证实有效烯酮和有效酮是反应的中间产物，激酶v a l c 可以将这两个化合物磷酸化。但是其他中间产物没有被分离到或经过 严格的体外酶活实验证实。氧化还原酶基因v a l n 的缺失突变株发酵 可产生l ，l 双有效烯胺和有效烯霉素，分别比有效氧胺a 和井冈霉 素a 多了一个双键，表明v a l n 负责催化井冈霉素a 中c 5 c 6 位的 双键的还原，以有效烯酮或者7 磷酸有效烯酮为底物催化合成有效酮 或者7 磷酸有效酮。 唯一负责编码转氨酶的基因v a l m 的缺失突变株发酵不能产生井 冈霉素a 或者有效氧胺a ，表明它和井冈霉素合成相关，推测它负 责井冈霉素a 中氮原子的引入，以7 磷酸有效酮为底物催化合成7 磷酸有效胺。 b l a s t 分析表明v a l b 是a d p 转移酶，本研究中以化学合成的 6 上海交通大学博士学位论文井冈霉素的生物合成及途径改造 不同底物做酶活分析。结果表明v a l b 以a t p 为核苷供体，负责催化 1 磷酸有效烯醇生成a d p 有效烯醇，所以1 磷酸有效烯醇和a d p 有效烯醇都是合成途径中的中间产物。与v a l b 有6 0 同源性的来自 阿卡波糖合成途径的n t p 转移酶a c b r 以a t p 或者g t p 作为核苷供 体，也利用1 磷酸有效烯醇作为底物，生成a d p 有效烯醇或者g d p 有效烯醇。 在糖基转移酶v a l g 的体外酶活实验中发现它除了u d p 葡萄糖 之外，还可以利用非天然的糖基供体u d p 半乳糖催化合成新的化合 物4 ”表井冈霉素a ，该化合物具有一定的抗真菌生物活性。 本工作对井冈霉素生物合成途径有进一步的阐明，并通过遗传和 生化手段得到了三种新的井冈霉素衍生化合物，对井冈霉素更广泛更 有效的应用具有启发意义。 关键词井冈霉素a ，生物合成基因簇，异源表达，基因敲除，体外 酶活分析 7 上海交通大学博士学位论文井冈霉素的生物合成及途径改造 b i o s y n t h e s i sa n dp a t h ，a ye n g i n e e r i n g o fv a l i d a m y c i n a b s t r a c t v a l i d a m y c i n s a r e a m i n o c y c l i t o la n t i b i o t i c s ，c o n s i s t i n g o fa v a l i e n a m i n em o i e t y , w i d e l yu s e di na s i aa sr i c ep r o t e c t a n t b i o s y n t h e t i c g e n ec l u s t e ro fv a l i d a m y c i nh a sb e e nc l o n e d a n ds e q u e n c e di n o u r p r e v i o u sw o r k , i n c l u d i n g4 5k ba n d2 7o r f sd e f i n e df r o mb l a s t s e a r c h t oc o n f i r mt h ei n v o l v e m e n to ft h i sg e n ec l u s t e ri nv a l i d a m y c i n b i o s y n t h e s i s ，w er e a r r a n g e dt w oo p e r o n s ，o n ec o n t a i n sv a l a b ca n dt h e o t h e rc o n t a i n sv a l k l m n , o nav e c t o rn a m e dp s e t l5 2a n dt h e ni tw a s t r a n s f o r m e di n t o h e t e r o l o g o u s h o s t s t r e p t o m y c e s l i v i d a n s13 2 6 v a l i d o x y l a m i n ea w a sd e t e c t e df r o mt h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho ft h em u t a n t w i t hs e v e na b o v e g e n e si n t e g r a t e d i n t ot h ec h r o m o s o m e f u r t h e r i n t r o d u c t i o no fv a l gw h i c hc o d e sf o rt h eg l y c o s y l t r a n s f e r a s el e dt ot h e p r o d u c t i o no fv a l i d a m y c i na t h i sr e s u l ts u g g e s t e dt h a tv a l i d o x y l a m i n ea c o u l db e s y n t h e s i z e db y v a l a b c k l m na n d ，v a l gw a st h e 8 上海交通大学博士学位论文 井冈霉素的生物合成及途径改造 g l y c o s y l t r a n s f e r a s ec o n v e r t i n gv a l i d o x y l a m i n ea t ov a l i d a m y c i na a st h e l a s ts t e p i nt h eb i o s y n t h e t i c p m h w a yt ov a l i d a m y c i na ，v a l ah a s b e e n c h a r a c t e r i z e dt ob ea c y c l a s ew h i c hc a t a l y z e dt h e c o n v e r t i o nf r o m s e d o h e p t u l o s e7 - p h o s p h a t e i n p h o s p h a t ep e n t o s ep m h w a y t o 2 - e p i - 5 - e p i - v a l i o l o n e i nt h i ss t u d y , v a l dw a sc h a r a c t e r i z e dt ob ea n e p i m e r a s ew h i c hc o n v e r t e d2 - e p i - 5 - e p i - v a l i o l o n et o5 - e p i - v a l i o l o n e f r o mt h er e s u l to fe n z y m ea s s a yi nv i t r o ，s e d o h e p t u l o s e7 - p h o s p h a t ew a s c o n v e r t e di n t o2 - e p i 5 - e p i - v a l i o l o n ew i t hv a l ao n l ya n df u r t h e rc o n v e r t e d i n t o5 - e p i - v a l i o l o n ew i t hb o t hv r a 认a n dv a l d v a l db e l o n g st ot h ev o c f a m i l ya c c o r d i n gt ot h es e q u e n c ea l i g n m e n t s l i k et h eo t h e rm e m b e r so f t h i sf a m i l y , e a c ha c t i v es i t eo fv a l dw a sf o r m e db yt w o1 3 a 1 3 1 3 1 bm o t i f s v a l de x s i t sa sd i m e r sa n dm o n o m e r so fv a l dh a dt w oa c t i v es i t e s ，w h i c h s u g g e s t e dt h a tv a l di st h el a r g e s tm e m b e ro fv o cf a m i l yt od a t e a n di nt h ef o l l o w i n gs t e p s ，v a l i e n o n ea n dv a l i d o n eh a v eb e e np r o v e d t ob ei n t e r m e d i a t e sa n dc o u l db ep h o s p h o r y l a t e db yk i n a s ev a l c b u t i n t e r m e d i a t e sf u r t h e rd o w n s t r e a mh a v e n tb e e np u r i f i e do ri d e n t i f i e db y e n z y m ea s s a yi nv i t r o m u t a n tw i t ht h ed e l e t i o no fv a l nf r o mv a l i d a m y c i nb i o s y n t h e t i cg e n e c l u s t e rp r o d u c e d1 ，1 - b i s v a l i e n a m i n ea n dv a l i d i e n a m y c i n ，w h i c hh a so n e 9 m o r ed o u b l eb o n dt h a nv a l i d o x y l a m i n eaa n dv a l i d a m y c i na ，r e s p e c t i v e l y t h i si n d i c a t e dt h a tv a i nw a sr e s p o n s i b l ef o rt h er e d u c t i o no ft h ed o u b l e b o n db e t w e e nc - 5a n dc 一6o fv a l i d a m y c i na i ti sp r o p o s e dt ou s e v a l i e n o n eo rv a l i e n o n e7 - p h o s p h a t ea ss u b s t r a t et op r o d u c ev a l i d o n eo r v a l i d o n e7 - p h o s p h a t e m u t a n tw i t ht h ed e l e t i o no fv a t m , t h eo n l y g e n et h a tc o d e s a m i n o t r a n s f e r a s e ，c o u l d n tp r o d u c e dv a l i d a m y c i na o rv a l i d o x y l a m i n ea ， w h i c hs u g g e s t e dt h a tv a l mw a sa l s oi n v o l v e di nt h eb i o s y n t h e s i so f v a l i d a m y c i n sa n dt h ep u t a t i v ef u n c t i o ni st oi n t r o d u c et h en i t r o g e no f v a l i d a m y c i na a n di ti sp r o p o s e d t oc a t a l y z e dt h er e a c t i o nf r o mv a l i d o n e 7 - p h o s p h a t et ov a l i d a m i n e7 - p h o s p h a t e v a l bw a ss u g g e s t e dt ob ea l la d pt r a n s f e r a s ef r o mb l a s tr e s e a r c h a n dt h e a c t i v i t y w a sc h e c k e dw i t hd i f f e r e n tc a n d i d a t es u b s t r a t e s c h e m i c a l l ys y n t h e s i z e di nv i t r o a n dt h er e s u l ts h o w e dt h a tv a l bu s e d a t pa sn u c l e o t i d y ld o n o r ，w h i c hc a t a l y z e dt h ec o n v e r s i o nf r o mv a l i e n o l 1 - p h o s p h a t e t oa d p v a l i e n 0 1 t h i sa l s o s u g g e s t e d t h a tv a l i e n o l 1 - p h o s p h a t ea n da d p - v a l i e n o la r eb o t hi n t e r m e d i a t e si nt h ep a t h w a y v a l i e n o 1 - p h o s p h a t ew a sa l s ot h e s u b s t r a t e f o ra c b r , ah o m o l o g o u s p r o t e i no fv a l bw i t h6 0 i n d e n t i t i e s ，f r o ma c a r b o s eb i o s y n t h e t i cp a t h w a y a c b ru s e da t po rg t pa sn u c l e o t i d y ld o n o ra n dp r o d u c e da d p v a l i e n o l 1 0 o rg d p v a l i e n 0 1 g l y c o s y l t r a n s f e r a s e v a l gc o u l da l s ou s eu d p g a l a c t o s ea ss u g a r d o n o ri na d d i t i o nt ou d p g l u c o s e ，a n dp r o d u c et h en e wc o m p o u n d 4 - e p i v a l i d a m y c i na ，w h i c hh a da n t i f u n g a la c t i v i t y k e yw o r d sv a l i d a m y c i na ，b i o s y n t h e t i cg e n ec l u s t e r , g e n ek n o c k o u t ， e n z y m ea s s a yi nv i t r o ，h e t e r o l o g o u se x p r e s s i o n 1 1 上海交通大学博士学位论文井冈霉素的生物合成及途径改造 a a a a c ( 3 ) v a d h q a h b a a m a m p 口t l b a t t p b l a b p b s a c a t c c c c 0 $ d a m d c m d h b d d h q d h q s d m s o e d 呵a g g + g 屺 h h p l c l c m s l y s m a t m l n m t k b 符号说明 ( a b b r e v i a t i o n s ) a m i n oa c i d a p r a m y c m r e s i s t a n c eg e n e 5 - d e o x y 5 a m i n o - 3 d e h y d r o q u i n i ca c i d 3 - a m i n o - 5 - h y d r o x y b e n z o i ca c i d a p r a m y c m a m p i c i l l i n a t t a c h m e n ts i t eo f b a c t e r i a ic h r o m o s o m e a t t a c h m e n ts i t eo fp h a g e 3 - 1 a c t a m a s eg e n e b a s ep a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n g e n ee n c o d i n gc h l o r a m p h e n i c o l a c e t y l t r a n s f e r a s e c o v a l e m l yc l o s e dc i r c u l a rd n a c o h e s i v ee n d g e n ee n c o d i n gd n aa d e n i n em e t h y l a s e g e n ee n c o d i n gd n ac y t o s i n em e t h y l a s e d i h y d r o x y b i p h e n y ld i o x y g e n a s e d e h y d r o q u i n a t e d h qs y n t h a s e d i m e t h y ls u l f o x i d e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d g r a m - n e g a t i v e g r a m - p o s i t i v e p e r c e n t a g eo fg + cc o n t e n t h o u r h i g l lp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 1 1 i g l lp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r u m l y s i n e m e t h ，r l m a l o n a t e s p e c i f i ca c y l t r a n s f e r a s e m i n u t e g e n ee n c o d i n gf o ri n t e g r a s eo fp h a g e k i l o b a s e s ( p a i r s ) 1 2 氨基酸 阿泊拉霉素抗性基因 5 脱氧5 氨基3 脱水奎尼酸 3 氨基5 羟基苯甲酸 阿泊拉霉素 氨苄青霉素 细菌染色体上噬菌体附着位点 噬菌体d n a 上的附着位点 d 内酰胺酶基因，编码氨苄青霉素 抗性 碱基对 牛血清白蛋白 氯霉素酰基转移酶基因，编码氯霉素 抗性基因 共价闭合环状d n a 九噬菌体包装位点 d n a 腺嘌呤甲基化酶基因 d n a 胞嘧啶甲基化酶基因 二氢联苯双氧酶 脱水奎尼酸 脱水奎尼酸合成酶 二甲基亚砜 乙二胺四乙酸 革兰氏染色阴性 革兰氏染色阳性 g + c 百分含量 小时 高效液相色谱 高效液相色谱质谱联用 赖氨酸 甲基丙二酰特异性的酰基转移酶 分钟 噬菌体整合酶基因 千碱基对 上海交通大学博士学位论文井冈霉素的生物合成及途径改造 k d a k m m b 删 m m c e m s n a d 刀p d n l o d o r f o r ! d r p a g e p c r p e g p e p p l p p k s p m s f r r e c r e p r p m s s d s s m s p c s t t a e t e t e t t i l i o t l c t s r t y r l 【i l o d a l t o n k a n a m y c i n m e g ab a s e ( p a i r s ) m i n i m a lm e d i u m m e t h y l m a l o n y l c o ae p i m e r a s e m a s ss p e c t r u m n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e g e n ee n c o d i n gf o rk a n a m y c i n n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d 堍f r a m e o r i g i no fr e p l i c a t i o n o r i g i no ft r a n s f e r p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y e t h y l e n eg l y c o l p h o s p h o e n o l p y r u v a t e p y r i d o x a l5 - p h o s p h a t e p o l y k e t i d es y n t h a s e p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e r e s i s t a n t e g e n ee n c o d i n gf o rr e c o m b i n a s e r e p l i c o n r o t a t i o n sp e rm i n u t e s e m i t i v i t y s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s t r e p t o m y c i n s p e c t i n o m y c i n s t r e p t o m y c i nr e s i s t a n c eg e n e t r i s a c e t a t e e d t ab u f f e r t r i s e d t ab u f f e r t e t r a c y c l i n er e s i s t a n c eg e n e t h i o s t r e p t o n t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y t h i o s t r e p t o nr e s i s t a n c eg e n e t y r o s i n e 1 3 千道尔顿 卡那霉素 百万碱基对 基本培养基 甲基丙二酰辅酶a 表异构酶 质谱 烟碱腺嘌呤二核苷酸 卡那霉素抗性基因 核磁共振 光密度值 开放阅读框架 复制起始位点 转移起始位点 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 聚乙二醇 磷酸烯醇式丙酮酸 5 磷酸吡哆醛 聚酮合酶 苯甲基磺酰氟 抗性 重组酶基因 复制子 辕| 食 敏感性 十二烷基硫酸钠 链霉素 壮观霉素 链霉素抗性基因 t r i s 乙酸e d t a 缓冲液 ir i s e d t a 缓冲液 四环素抗性基因 硫链丝菌素 薄板层析 硫链丝菌素抗性基因 酪氨酸 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 绳甏 日期：h 年6 月譬e l 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密囱。 ( 请在以上方框内打“) 学位论文作者签名：指导教师签名： 日期：如岬1 年6 月岔日 日期：年 ，够 芗 日 刁厂 月 上海交通大学博士学位论文井冈霉素的生物合成及途径改造 第一章文献综述 第1 节氨基糖苷类抗生素的研究背景 1 1 1 氨基糖苷类抗生素的概况 氨基糖苷类( a m i n o g l y c o s i d e s ) 抗生素，是由微生物产生或经半合成制取的一 类由氨基糖( 或中性糖) 与氨基环己醇以苷键相结合的易溶于水的碱性抗生素。由 于其结构中都含有氨基糖与非糖部分的苷元( 氨基环己醇) 两部分，故称为氨基糖 苷类或氨基环己醇类抗生素。按其来源可以分为两类：一类是由链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) 产生的抗生素，如链霉素( s t r e p t o m y c i n ) ，新霉素( n e o m y c i n ) ，卡那霉素( k a n a m y c i n ) ， 核糖霉素等；一类是由小单孢菌产生的抗生素，如庆大霉素( g e n t a m i c i n ) ，西索霉 素( s i s o m i c i n ) 和小诺霉素( m i c r o n o m i c i n ) 等。这类抗生素的特点有：( 1 ) 水溶性 佳，性质稳定；( 2 ) 抗菌谱广，对许多革兰阳性菌、革兰阴性菌及结核菌均具抗菌 作用；( 3 ) 作用机制主要是抑制细菌蛋白的合成；( 4 ) 脂溶性差，胃肠道吸收度低， 肌肉注射后大部分以原药经肾排泄；( 5 ) 对肾脏及第八对颅神经具有不同程度的毒 性及神经肌肉阻滞作用；( 6 ) 细菌与本类药物相互有部分或完全交叉耐药性。 氨基糖苷类抗生素很久以来因为它们具有重要的生物活性而被关注，如天然抗 生素庆大霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素、托普霉素( t o b r a m y c i n ) ，及半合成的 抗生素抗菌素b b k 8 ( a m i k a c i n ) 、n e t i l m y c i n 等一直作为临床抗微生物药物。而潮霉 素a ( h y g r o m y c i n a ) 和壮观霉素( s p e c t i n o m y c i n ) 则作为动物药物被广泛用于兽医 和农业领域，并且在分子遗传学研究中作为筛选标记【1 】。部分上述化合物的分子结 构如图1 1 。 1 4 上海交通大学博士学位论文井冈霉素的生物合成及途径改造 2 n h 2 素a 潮霉素a n h 2 图1 - 1 部分氨基糖苷类抗生素的分子结构 f i g u r e1 - 1s t r u c t u r e so fs o m ea m i n o g l y c o s i d ec o m p o u n d s 氨基糖苷类抗生素依据它们核心的氨基环醇的组成可以分为四类，包括由肌纤 维醇( m y o i n o s i t 0 1 ) 衍生的氨基环醇类，如链霉素和潮霉素a ；由2 脱氧青蟹肌糖 ( 2 d e o x y - s c y l l o i n o s o s e ) 衍生的氨基环醇类，如庆大霉素和卡那霉素；由2 表- 5 表 有效醇酮( 2 e p i - 5 e p i - v a l i o l o n e ) 衍生的含c 7 n 结构的氨基环醇类，如井冈霉素a ( v a l i d a m y c i na ) 和阿卡波糖( a c a r b o s e ) ：由环戊糖醇( c y c l o p e m i t 0 1 ) 衍生的氨基 环醇类，如p a c t a m y c i n ，t r e h a z o l i n 。 其中肌纤维醇衍生物和2 脱氧青蟹肌糖衍生物，它们的生物合成途径研究的较 为深入。第三类是由c 7 n 氨基环醇结构衍生的，后面我们将重点讨论这类化合物的 生物合成途径。 1 1 2 含c 7 n 结构的氨基糖苷类抗生素 含c 7 n 结构的氨基糖苷类抗生素由2 表5 表有效醇酮衍生而来，目前已知的这 类抗生素包括：抗真菌类抗生素井冈霉素a ，a 葡萄糖酶抑制剂阿卡波糖，抗细菌 1 5 上海交通大学博士学位论文井冈霉素的生物合成及途径改造 药物p y r a l o m i c i n s ，抗癌药物c e t o n i a c y t o n ea 以及人类硫氧还蛋白系统抑制剂 b e - 4 0 6 4 4 等，他们的化学结构如图1 2 所示【2 】。其中井冈霉素a 和阿卡波糖都有一 个有效烯胺的c 7 n 结构。 有效霉素a p y r a l o m i c nl c h o 怕唑o h s a l b o s t a t i n c h 3 c e t o n i a c y t o n ca 田1 2 部分由2 衷5 - 表有效醇酮衍生而来的c 7 n 氨基环醇化舍物 f i g u r e1 - 2s t r u c t u r e so fs o m ec t na m i n o g l y c o s i d ec o m p o u n d sd e r i v e df r o m2 - e p i - 5 - e p i - v a l i o l o n e f l o s s 3 和r i n e h a r t 4 研究小组的实验表明，井冈霉素和阿卡波糖的c 7 n 氨基环 醇结构来自磷酸戊糖途径中c 2 + c 2 + c 3 衍生的7 磷酸景天庚酮糖。随后通过喂养化学 合成放射性标记的化合物表明，2 表5 表有效醇酮是井冈霉素和阿卡波糖的前体化 合物。p i e p e r s b e r g 小组的工作在阿卡波糖的产生菌a c t i n o p l a n e ss p s e 5 0 11 0 中克隆 到了阿卡波糖的生物合成基因簇，并且发现了和d h qs y n t h a s c s 、a m i n o d h q s y n t h a s e s 以及d o is y n t h a s e s 同源的一个基因a c b c ，在体外酶活实验中证实这个基因 负责编码7 磷酸景天庚酮糖环化酶，催化其生成2 表5 表有效醇酮 5 】。随后虞沂等 以a c b c 为探针，在井冈霉素产生菌& h y g r o s c o p i c u s5 0 0 8 中钓出a c b c 同源的基因 v a l a ，进而克隆到了井冈霉素的生物合成基因簇。体外酶活的实验表明v a l a 编码的 蛋白v a l a 和a c b c 具有相同的功能，负责将7 磷酸景天庚酮糖环化为2 表5 表有 效醇酮 6 】。m a h m u d 小组最近的研究中发现，c e t o n i a c y t o n e 、p y r a l o m i c i n 和b e - 4 0 6 4 4 1 6 上海交通大学博士学位论文井冈霉素的生物合成及途径改造 的生物合成基因簇中也存在相同功能的酶，分别是c e t a 、e y l a 和b e o f f 9 ，并通过 系统分类学的方法把以上的同工酶定义为磷酸糖环化酶家族的一组成员【7 】。系统进 化树如图1 3 所示。 t a i f o ，m 硝a j n a t p r o d 2 0 0 7 7 0 ：1 3 8 4 1 3 9 1 图l - 3 磷酸糖环化酶家族成员的系统进化树 f i g u r e1 - 3p h y l o g e n e t i ct r e eo ft h es u g a rp h o s p h a t ec y c l a s es u p e r f a m i l y 1 1 3 阿卡波糖生物合成途径的研究进展 阿卡波糖和井冈霉素都含有相同的有效烯胺的c 7 n 氨基环醇结构，它具有q 具 糖苷酶抑制活性，因此被临床上用于i i 型糖尿病的治疗。早期对阿卡波糖合成途径 的研究是通过喂养同位素标记的化合物进行的，喂养实验得到的结论有以下几点： 阿卡波糖中的c 7 n 氨基环醇结构不是从草酸或其相关途径而来，而是从磷酸戊糖途 1 7 上海交通大学博士学位论文 井冈霉素的生物合成及途径改造 径中的7 磷酸景天庚酮糖而来；谷氨酸中的q 氮是阿卡波糖中氮原子最有效的来源， 阿卡波糖中的麦芽糖单位来自发酵培养基中的麦芽三糖；2 表5 表有效醇酮是其合 成途径中重要的中间产物。 c h 2 0 h c h 十h ” h 十o h 。 h + o hh h 十o h c h 2 0 p 0 3 2 o h h h o p 0 3 2 o p 0 3 2 。 慕蛰坐h ：袋c h 璃3 0 h h o “一h o 侧 o 咭m po h 占c r r d p h o h h o h o 二 o h o ；- a c b u j ? h o - 9 1 m o p 0 3 2 - h o o h i a d ：) n i h o o h 二一n c h 3 0idu a 僻c b q i s j ? a c b d ? 蝴 ，n ， 图l - 4 阿卡波糖的生物合成途径 f i g u r e1 - 4p r o p o s e db i o s y n t h e t i cp a t h w a yo fa c a r b o s e 在a c t i n o p l a n e ss p s e 5 0 1 1 0 中克隆到阿卡波糖的生物合成基因簇后，对于阿卡 波糖合成途径的研究有很大的进展。首先体外酶活确定了a c b c 将7 磷酸景天庚酮 糖环化为2 表5 表有效醇酮，是从初级代谢磷酸戊糖途径进入阿卡波糖合成途径的 第一步【5 】。然后p i e p e r s b e r g 等人又发现a c b m 是负责磷酸化2 表5 - 表- 有效醇酮生 成7 磷酸2 表5 表有效醇酮的激酶，表明阿卡波糖代谢途径中存在磷酸化的中间产 物 8 】。随后表异构化酶a c b o 将7 磷酸2 表5 表有效醇酮催化生成7 磷酸- 5 表一有 效醇酮【9 】。依赖于n a d h 的脱氢酶a c b l 进而还原c 1 位的酮基生成5 - e p i - v a l i o l o l 18 上海交通大学博士学位论文井冈霉素的生物合成及途径改造 7 - p h o s p h a t e 。其它的合成途径也通过对基因簇中各功能酶的b l a s t 分析预测。其代 谢途径如图1 4 所示。 第2 节井冈霉素的重要生物活性 1 2 1 井冈霉素的重要生物活性 抗真菌类抗生素井冈霉素a 具有重要的商业价值，它被广泛应用于防治由 r h i z o c t o n i a s o l a n i 引发的水稻真菌感染 1 0 1 。类似于一种商业化的有机坤，井冈霉素 a 在浓度为3 0p p m 的情况下即可有效的发挥作用并且对水稻没有任何毒害。它独特 的抗真菌活性是作为药物前体，可以在真菌细胞体内水解成为有效氧胺a 。有效氧 胺a 对负责降解海藻糖生成葡萄糖的海藻糖酶有强烈的抑制作用。海藻糖在很多真 菌体内有重要的生理作用，包括感染人类的真菌病原体c a n d i d aa l b i c a n s 、a s p e r g i l l u s s p 和c r y p t o c o c c u sn e o f o r m a n s 。海藻糖也是昆虫体内重要的碳源贮藏分子，并且在包 括m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s 等细菌中是细胞壁中的结构和毒性组分。海藻糖是在 真菌细胞中重要的贮藏类碳水化合物( 在r s o l a n i 中占细胞干重的8 一1 0 ) ，而且 被作为昆虫特有的血糖。降解酶海藻糖酶参予以上生物的初级代谢，为供应能量或 其他代谢途径提供葡萄糖。抑制海藻糖酶有可能破坏真菌的葡萄糖供应系统，进而 妨碍菌丝的延伸，改变真菌的形态。当被注射入烟草毛虫s p o d o p t e r al i t u r a 的二龄幼 虫时，井冈霉素会引起它的形态反常并且导致1 0 0 致死率。海藻糖还可能在病原生 物的潜伏期作为蛋白和生物膜的稳定剂和保护剂。更重要的是，海藻糖不存在于任 何哺乳动物细胞，和海藻糖相关的酶可以作为开发新的化疗药物的目标蛋白，以抵 抗肺结核等分枝杆菌和真菌引起的疾病。 体外实验表明，假二糖化合物有效氧胺a 是井冈霉素类化合物中最显著的海藻 糖酶抑制剂。有效氧胺a 与海藻糖酶的极高亲和力可能是由于有效氧胺a 结构中两 个环与海藻糖酶两个亚位点的协同交互作用。有效氧胺a 模仿反应的转变状态，研 究发现它比天然底物海藻糖的类似物d 葡萄糖基双氢有效氧胺a 显示出更强的亲 1 9 上海交通大学博士学位论文井冈霉素的生物合成及途径改造 和力。带有d 葡萄糖配基的有效氧胺a 化合物，例如井冈霉素a 、d 、g 组分和其 它合成的带有单b 分d 糖基的有效氧胺a 化合物，对海藻糖酶的抑制活性明显降低， 而假四糖化合物，例如井冈霉素c 、e 、f 组分，完全失去了对海藻糖酶的抑制活性。 有趣的是，体内实验表明在井冈霉素和有效氧胺化合物中，井冈霉素a 而不是有效 氧胺a 是最显著地抗真菌化合物。这个现象由后续的实验解释为井冈霉素a 能够更 有效的进入菌丝体然后被b 够葡萄糖苷酶水解生成活性更强的有效氧胺a 。 1 2 2 井冈霉素的化学性质 目前为止，共有8 种天然井冈霉素组分从& h y g r o s c o p i c u sv a r 1 i m o n e u s 的发酵液 中分离出来。井冈霉素a 、c f 、h 组分都含有有效氧胺a 作为核心基团，它们在 d 葡萄糖分子的数量、糖苷配基的位置，葡萄糖分子异头碳的构象上有所不同，如 图1 5 所示。有效氧胺a 由两个c 7 n 的氨基环醇分子，有效烯胺和有效胺组成，它 们通过一个氮桥相连。有效烯胺也是临床应用中糖尿病药物阿卡波糖的药效团。井 冈霉素b 以有效氧胺b 作为核心