（纺织化学与染整工程专业论文）漆酶对染料降解的研究.pdf

漆酶对染料降解的研究摘要 漆酶对染料降解的研究 捅要 针对漆酶对染料的独特降解作用，对n o v o 公司的漆酶( d i l i t e i i s ) 作用于不 同结构的染料( 酸性、活性、直接) 降解进行了研究。对l o 种染料进行了脱色实验， 确定了最适脱色条件并分析探讨了不同添加剂( 酸根离子、金属离子、表面活性剂) 对染料溶液脱色的影响。实验发现这1 0 种染料均表现出一定的脱色性能：在最佳反 应条件下5 种染料( m o d 锄l 蓝f b r 、e v e m c i 蓝h e r d 、m 0 d e r z d l 蓝h e g n 、 m o d 沁i d 绿g 、m o d 锄c i d 黄a 4 r ) 的脱色率在9 0 左右，其中e v e r i o n 蓝h - e r d 的脱色率最高可达9 5 以上。通过c o d 的测定，除m o d e m c i d 黄a 4 r 的c o d 去除 率稍低，其它染料的c o d 去除率均有7 5 以上。另外，根据1 0 种染料与酶反应的 最佳条件，分别得出了米氏方程和动力学参数：米氏常数( k 。) 和最大反应速率( v 。) 。 此外，还研究了添加剂对染料( m o d 锄c i d 绿& 活性艳蓝k 3 r 、直接蓝b 2 l 也) 脱色率的影响。结果表明，c u 2 + 和a i ”对脱色起明显的促进作用，而p 0 4 3 、c 0 3 玉、 f 于+ 和离子型表面活性剂均对脱色起较强的抑制作用 根据染料溶液的脱色，从中筛选出3 种染料( m 0 d e b i d 黄a 4 r 、e v e m c i 蛐蓝 h e r d 、直接蓝b 2 r l ) 对织物染色后用漆酶处理，确定了脱色的最适反应条件 关键词：漆酶；染料；脱色；降解 作者：丁莉 指导老师：陈国强 邢铁玲 2 0 0 7 年3 月 漆酶对染料降解的研究 摘要 s t u d y o nd e c o l o r a t i o no f d y e s t u f f sb yl a c c a s e a b s t r a c t n e d e g 随d a t i o no f d i 侬糯n ts m 】【c 缸聪d y 蚓墙i n c l u d i n g i d ，r e t i v ea n dd i r 鳅d y 嚣 b yl a c c a ( d e 吲沁i is ) w l l j c h 髓s 丘o mn o v oc o m p 龃y 啪ss n i d i c di nt l 他p a p e r t h eo j 坩i n 啪d c c o l o r a t i c o n d i t i o n sw e r e 山= t e 棚蝴觚dt h ee 丘b c t so fd i 丘b 佗m a d d 砌v 酷( s l l c h 笛踮i di o n ，m e t a li o i l ，锄d 舢渤c t a i i t s w e 佗a i l a i y z 。d 觚dd i 屿s 缸t h e 删l 协s h o w e d 岫l a c c a l l a dd i s t i i l c td e c o l o r a t i o n e 丘b c t s t h e d y e s ，锄dt l i 砒 u n d 盯o p t i m 啪d e a c t i o c o n d i t i o 珊t h ec o l o rr e m o v a lm t e so ff i v e n so fd y e s ( m o d 锄l b l mf b re v e r i b l i l eh e r d ，m o d 彻lb l mh e ( n ，m o d 盯i dg r e g m o d 啪c i dy b l l o wa 4 r ) w e 他a ：b o l i t9 包t l l e 地i m o ，e 、，e m c i o nb l 鹏h - e r ds h o w e dt l l e h i g l l e s td c c o l o t a t i 叩r a t c ，o v 盯9 5 b a s c d c o dv a i ，c e p tm o d 啪c i dy c l l o wa 4 r c o d 他m o v a lf a c c so fo t h 盯d y 嚣嘲m o 他t l i 7 5 a c c o r d i i i gt ot h eo 面m 哪 抵1 0 栅c o n d i 廿o n so ft e n r t so fd y ，m i c h l i s - m 盯峋斟孙l a d o 璐w e 他o b 忸i i i c d a n dd y n 龇n i c s 弘玳m l 咖( k 哪，v m “) c o l l l db ec a l c u l a t c d ，他s p 吧c t i v e l y a m o n g 地d y 鹤，也ee 位c t so fa d d i t i v 部t l l e l o rr 咖v a lo fd y e s ( m o d m c i d g 赋ngr e a c t i v cb l u ek - 3 rd i r e c tb l b 2 r l ) w 眦i n v e s t i g a t e d n e 咖l t ss h o w e d d o l o 眦i o nw 豁s i g n j f i c a 甜yp f o m m c d 也r o u g hn 圮a d d m o no fc u 2 + a n d 灿扣，w h i 】ei t w 笛i 加面v a t c d 、i l l lp o c 0 3 2 jf 矿a n di o n 辄】m c t a n 协 f l l n l l 锄。砖，t h ef 捌cd ) r c dw i 也吐l i 髓r t so fd y 船( m o d 啪c i dy e l l o wa 4 k e v e m c i b l u ch e r d ，d i r e c tb l u e b 2 r l ) w e 陀订e 砷泊埘t l l 【丑c c 雠，a n dt l 忙o p t i m 啪 d e c o i o r a t ；o nc o n d 狐o n sw 1 eo b s a v e d 。 k e y w o r d s ：ia c ，d y e s t i l 噩d e c o l o m t i ，d e g m d a _ t i o n w r i n 如b y ：d 抽gl j s u p e i s e db y ：c h 既g q i a l l g x i n g 面e l i i l g m a r c h2 0 0 7 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所 取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体己经发表或 撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材 料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承 担本声明的法律责任 研究生签名：丁羞日期：壶固点：乡 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、中国 社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采 用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一 致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论 文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名： 导师签名： 圆：兰：拿 漆酶对染料降解的研究 第一章序言 第一章序言 1 1 印染废水处理的国内外研究现状 1 1 1 染料的性质 随着染料工业的迅速发展，染料的品种和数量不断增加。从1 8 5 6 年至今，染料 品种已多达上万种，各国最常生产使用的约2 0 0 0 种，它们不仅具有特定的颜色，而 且结构复杂。按化学结构分类可分为偶氮染料、蒽醌染料、靛族染料、硫化染料、酞 菁染料、三芳甲烷染料和含有杂环结构的染料等；按应用分类则可分为直接染料、硫 化染料、还原染料( 士林染料) 、酸性染料、酸性络合染料、活性染料( 反应性染料) 、 冰染染料( 纳夫妥染料) 、分散染料和阳离子染料等【旧 所有染料的一个共同特点是具有不饱和结构的发色基团，该基团引入共轭体系 后，能参与共轭作用，使共轭体系中电子流动性增加，结果是分子激发能降低，主要 是缩小了电子由非键轨道跃迁到反键轨道的能量。化合物吸收向长波方向转移，导致 颜色加深。主要的发色基团有偶氦基、亚硝基、硝基、氧化偶氮基、硫代羰基等。染 料分子中的助色团特点是含有未共用电子对的原子，作用原理与发色基团类似。主要 助色基团有o h 、卧h 、撇等i 孙 1 1 2 含染料废水的特点及其危害性 印染废水主要包括以下污染物：染料悬浮物、有机物、重金属离子等。一般p h 值 为6 - 1 0 ，c o d c r ( k 2 c r 2 0 7 法测得的化学需氧量) 为4 0 0 1 0 0 0 i i 虮，b o d 5 ( 生物需 氧量) 为l o o 4 0 0 m g ，l ，s s ( 固体悬浮物) 为l o o _ 姗g ，l ，色度为l o o - 4 倍【4 l 。 其中还含有残余的漂白剂，硫代硫酸钠等。但当印染工艺及采用的纤维种类和加工工 艺变化后，废水水质将有较大变化，特点是有机物含量高、成分复杂、色度深、水质 水量变化大。加上，印染工艺中p v a 浆料、人造丝皂化物以及大量新型助剂的广泛 应用，使大量难降解的有机化合物进入废水，增加了废水处理难度p 】。 含染料废水对环境有很大的影响，处理的关键是颜色的去除。纺织废水的色泽深， 严重影响受纳水体的外观，而造成水体有色的主要因素是染料。目前世界每年生产的 染料有1 0 万种，产量为7 0 万吨【6 l 。中国是染料生产大国，每年生产的染料达1 5 0 万 吨【7 l 。其中5 0 以上用于纺织品染色，而在纺织品加工过程中，有1 0 缸2 0 的染料作 为废物排出嗍。据报道，某些染料在自然水体中的浓度超过1 p g l 时，就会影响水体 的透明度、破坏水体的景观、降低水体的溶氧量。许多合成染料( 如偶氮染料) 还具有 漆酶对染料降解的研究 第一章序言 较高的生物毒性【9 】。同时，由于染料是一类结构稳定的有机化合物，具有抗酸、抗碱、 抗微生物等特性，在环境中有较长的滞留期，因而具有潜在的健康危害【所以染料 废水的处理，尤其是色度的去除是废水治理的当务之急。 另外，纺织废水大部分偏碱性，进入农田，会使土地盐碱化；染色废水的硫酸盐 在土壤的还原条件下可转化为硫化物，产生硫化氢。 1 1 3 含染料废水处理方法简介 常用的印染废水处理的物化技术有吸附脱色技术、混凝沉淀技术、化学氧化技术、 离子交换技术、超滤膜脱色技术、光催化技术、高压脉冲电解技术等，见表1 1 岫。 表1 1 染料废水的处理方法 吸附法、沉淀法、浮选法、絮凝法、凝结法、泡沫分馏法、反渗透法、超滤法、 物理法 电离辐射法、焚化法 化学法化学中和法、化学还原法、氧化法，电解法、离子交换法、臭氧氧化法 生物法 稳定池、氧化塘、滴滤法，活性污泥法、厌氧消化法 虽然这些方法通过长期的应用和实验证明对染料废水的处理的确具有一定的效 果，但它们各有利弊，均不能称为最佳方法物化方法比较有效，但存在处理费用高， 产生大量难处理的污泥等问题【i q 。目前，国内外染料废水处理以生物技术为主，但是 活性污泥和生物膜等生物技术在废水处理中，存在的问题也是色度去除率不高，而且 活性污泥法对活性染料的脱色率也相对比较低仅2 5 ，其中有9 帆的染料结构未发生 变化就排放到环境中去l 】。所以通过传统的物理化学方法无法使目前使用的全部染料 得到降解或去除，有时降解产物的毒性甚至更大。生物酶作为一种生物制剂，无毒无 害，并且具有专一性、高效性、温和性三大特性，在染料废水处理中能有效地去除色 度以及染料的降解，因而具有良好的应用前景“4 。 应用到废水处理中生物酶，大多是氧化还原酶，有辣根过氧化物酶( h r p ) 、 木质素过氧化物酶( l i p ) 、酪氨酸酶、漆酶等，这些酶最常应用在含酚废水的处理 和造纸废水的脱色中i 。其中木质素过氧化物酶( l i p ) 、锰过氧化物酶( m n p ) 、 漆酶( i 舭c a 蹁) 这三类酶对芳香环没有强的专一性。有可能降解各种不同的芳香化 合物，因而越来越受到人们的关注。但是前两者需加入h 2 0 2 才能启动催化反应，漆酶 不需加入h 2 0 2 而只要在0 2 存在下就能参与反应，并且有着更为广阔的底物范围。所 以在2 0 世纪末受到更为积极的关注。 2 漆酶对染料降解的研究 第一章序言 由于白腐真菌是漆酶的高产菌株。人们对漆酶的研究大多集中在白腐真菌上，已 经分离得到了许多高效的可以对多种染料有脱色能力的自腐真菌，国外的研究报道较 多。a m 出e k 等人【”】将t r 龃l e t e sm o d e s t a 产的漆酶对4 0 种不同结构的常用纺织染料进 行脱色研究，发现5 0 的染料通过非固定化酶都有不同程度的脱色效果，将酶固定化 后，有9 0 9 6 的染料可被脱色。p l l a 豫o c h a e t e 姗s p o d 啪经过3 0 d 的处理，低浓度的 l0 i l l g i 崩刚果红、活性翠蓝k n g 的脱色率达9 2 9 9 。t r a m e t e sv e r s i c o l o ，c 嘶o l 吣 v e i s i c o l o 和f u n a l i a 台_ o 画也对多种染料有脱色能力，但持续时同都需要l o d 左右【1 阍。 而且，目前采用白腐真菌降解染料都是将染料与真菌建立共培养体系，但是有些染料 本身有毒性，会抑制真菌分泌有效酶，并且其脱色能力也受多种因素的限制，单一的 菌株对废水的脱色效果往往难以奏效，且作用对象种类也有限。日本有研究将n o v o 公司生产的虫漆酶( 酶制剂) 对3 1 6 种染料的脱色筛选中，可脱色的有1 7 8 种( 5 6 3 ) ， 几乎没有变化的有9 9 种( 3 l - 3 ) ，而且显示变化的染料几乎都在3 0 m i n 内变色，再 经2 4 h 也不复色i 忉。因此，采用酶制剂的漆酶从脱色时间和脱色效果上看均有着明显 的优异性，现在已得到工业开发的漆酶也来自于微生物，日本有来自于丝状( t r 如l e i e s u i u o 豫) 的商业化产品，将漆酶纯化、基因表达、克隆，通过基因改性的方法生产成 酶制剂，为工业化的应用开辟了广阔的前景。 1 2 漆酶的来源 漆酶首次发现是在1 8 8 3 年，由日本学者吉田( y 0 s h j d a ) 从漆树( j a p a 雎i a c q u 盯 慨s ，r h 璐v e r i l i c i f i 弧) 的渗出物中发现的，以后证明它广泛的存在于真菌中。最近有 报道。在细菌s 嘞叫，sg a l b 惦和生脂固氮螺菌衄o s p i r i l l 岫n p o f 朗蛐同样发现有 漆酶存在【。现在认为，漆酶是一种普遍分布于植物、昆虫、真菌和细菌中的重要酶 种，大部分漆酶来自植物和真菌【j 】。按漆酶来源可分为漆树漆酶( r h 屿l a c c a 辩) 和真菌 漆酶( f i l i l g a ll c a 辩) 两大类。 漆酶广泛存在于担子菌b 雒i d i o n l yc c _ c c s 、多孔菌p o l y p o m s 、子囊菌a m y 魄、 脉孢菌n e u m s p o m 、柄孢壳菌p o d o s p o m 和曲霉菌舢辨晒u l l s 等【l 】本论文所采用的 是n 0 v o 公司通过基因工程改造，用黑曲霉( a i 嗍i i l 璐) 经深层发酵制的漆酶 ( d e r i i l i t e s ) 1 3 漆酶的特性 1 3 1 漆酶的理化性质 漆酶( l a c c a ，e c l 1 0 3 2 ) 是一种含铜的多酚氧化酶，对于不同来源的漆酶， 藩酶对染料降解的研究第一章序言 其碳水化合物的含量不同，铜的含量也不同，一般都含有四个铜离子。典型的【越 分子质量为6 0 8 0 k d a ，其中约1 5 2 0 的碳水化合物，大小为7 5 4 5 帆【i 】。漆酶 一般以单蛋白体的形式存在等电点p i 为3 6 【1 9 1 。酸性p h 催化效率较高，适宜反应 温度较低的环境。大多数的漆酶为一条多肽链组成的单聚体，酶分子多肽链上大约含 有5 0 0 个氨基酸。 1 3 2 漆酶的底物 漆酶属于单电子氧化还原酶，初步统计它可催化氧化2 5 0 种不同类型的底物。早 期研究漆酶的催化氧化反应是以二酚及芳香胺作为底物。随着研究的深入，发现漆酶 的作用底物具有一个宽广的范围【2 l 】 按底物结构可归纳为六类：( 1 ) 酚及其衍生物：约占漆酶底物总数一半，主要是 多元酚及其衍生物和a 一萘酚及其衍生物，后者取代基多在酚羟基的邻、对位，随着 取代基的种类、数目和在芳环位置的不同，反应活性也有差异；( 2 ) 芳胺及其衍生物： 其结构特点与酚类底物相似，主要是多氨基及其衍生物；( 3 ) 羧基及其衍生物：一般 指芳环羧酸基邻或对位连有羟基、烷氧基或胺基等的芳香酸，碳链上连有酚或非芳胺 基因的非芳香酸；( 4 ) 淄体激素和生物色素：如雌淄二醇、o 一卵胞激素、几烯雌酚、 胆红素、苏木色精等：( 5 ) 金属有机化合物：如二茂铁( f e h ) 及其衍生物 f e r ( r = c h 2 0 h ，c o o 。，c h 2 f c 等) ；( 6 ) 其它非酚底物：除了早期发现的亚铁氰化 钾、抗坏血酸等外，近年来还发现了卜苯基一2 一( 3 ，4 一二甲基苯基) 乙二醇掣硐。 在还原介体物质存在下，漆酶的底物可进一步的扩大。在中间氧化调节物存在的 情况下，与更广泛的底物作用，如a b t s 作为一个可扩散的木质素氧化中间调节物田】 1 9 9 0 年，b o u r b o n n a i s 和p a i 首次报道了漆酶与a b t s 共存时能氧化非酚型木素模 型化合物，还可以用于脱除纸浆中的残余木素【2 0 l 。c a l i 报道漆酶和加班作用于纸浆， 能脱除5 0 的残余木素。漆酶和介体( a b t s 、胁等) 构建的漆酶介体系统( 简称 i m s ) 具有替代传统含氯漂白的潜在可能性。国内外都在进一步研究l 惦用于纸浆的 生物漂白【冽 合成染料根据发色基团的不同主要有蒽醌类染料、偶氮类染料、靛菁类染料等。 据报道，对目前常用的有代表性的3 0 0 多种染j ；毒，在溶解状态下，用漆酶处理，确认 约有5 6 的染料基本可以脱色，或色泽变得相当浅。如果将色泽变得稍浅的染料也 计算在内的，那么利用漆酶可使7 0 的染料被分解【2 ，】。对于不同的染料结构可将染 料分为漆酶底物类染料和非酶底物类染料蒽醌类染料可作为漆酶的底物被直接氧 4 漆酶对染料降解的研究 第一章序言 化；对于偶氮和靛蓝类分子质量小于8 l ( d a 的小分子染料，则不能被直接氧化。在小 分子染料和酶分子之间，需要还原介体的存在( 如a b t s 、h 眦等) ，才能介导漆酶 与非酶底物染料之间的氧化作用。 1 3 3 漆酶的活性中心 来自植物和真菌的部分漆酶已被测序，它们与其它已知含铜氧化酶的序列同源性 很低，但结构上的类似却是非常明显的，铜结合区域被高度保留下来，在几乎所有含 铜氧化酶中得到证实。铜原子位于漆酶的活性中心，在漆酶的催化氧化过程中起决定 性作用；若除去铜原子，漆酶将失去催化功能。 漆酶是一种最简单的多铜过氧化酶，一般含有4 个铜原子( p 捌1 i a l e 漆酶除外，仅 含有2 个铜原子) 。根据光谱特征和顺磁特征，可划分为3 种：i 型铜为蓝色蛋白质。a b s ( 紫外可见光谱) = 6 0 0 n m ，在e p r ( 电子顺磁共振) 谱上有一个小的平行超精细耦合结 构，它参与分子内的电子传递，把电子从底物传递到其它铜原子上；型铜没有明显 的可见吸收光谱，有e p r ( 电子顺磁共振) 信号；型铜由两个铜原子通过一个0 l 桥配位连接起来，组成双核铜区，具有抗磁性，在e p r 上无谱带，在3 3 0 玎m 处有最大 吸收峰。i 型铜与两个组氨酸( h i s ) 和一个半胱氨酸( c y s ) 配位；l i 型铜与两个组氨 酸( h i s ) 和一个水分子配位，形成t 型几何结构：型铜与三个组氨酸( 1 l i s ) 和一个 旬h 桥配位，形成四面扭曲的四方立体结构。一个型铜和两个型铜形成三核铜簇， 其中两个i i 型铜通过羟基相连，铜原子之间的距离是o 3 8 m ，三核铜簇是双氧还原 的点【2 1 捌。 为了确定4 个铜原子在催化活性中心的功能，蚀e s h is 等人用抑制剂处理漆酶 后，发现漆酶的i 型铜在e p r 上有裂分峰出现，表明外源性配体与型铜发生了配 位，当外源性配体与i 型铜配位后，型铜有5 个配体，这种结构对c u ”比c u + 更有 利，从而导致m 型铜的还原受到限制，氧化性降低，同时也抑制0 2 进入三核中心区 另据m e 鼬r c h i i l i d t 等人报道，在已被完全还原了的漆酶晶型结构中，i 和i i 型铜的配 位环境不变，而i i l 型铜的一0 i h 桥配体丢失了，两个型铜之间距离也增至0 5 1 锄， 所有这些都说明i i i 型铜与漆酶的催化作用密切相关1 2 ”。 1 ，3 。4 漆酶的催化机理 漆酶催化不同类型底物氧化反应的机理主要表现在两方面。一方面是底物自由基 中间体的生成。漆酶可催化氧化酚类和芳香胺类化合物，同时分子氧被还原为水。在 这一过程中，漆酶从被氧化的底物分子中提取一个电子，使之形成自由基，该自由基 漆酶对染料降解的研究第一章序言 不稳定，可进一步发生聚合或解聚反应。在0 2 存在下，还原态漆酶被氧化，0 2 被还原 为水。另一方面，漆酶催化底物氧化和对0 2 的还原是通过四个铜离子协同传递电子和 价态变化来实现的。漆酶催化4 个连续的单电子转移氧化还原性底物，将分子氧还原 为水还原性底物结合于i i 型铜位点。i 型铜从中提取1 个电子，该电子通过c y s - h i s 途径传递到和i i i 型铜的三核中心位点，该位点结合了第二底物分子氧，接受i 型铜 的电子，并传递给氧，使之还原为水。完成反应的漆酶中的4 个c u 都氧化成c i l 2 + ，整 个反应过程需要4 个连续的单电子氧化作用来使漆酶充分还原，所以漆酶被称为。分 子电池”，通过单个的氧化反应来积累电子，还原分子氧。氧的还原可能分两步进行， 两个电子转移产生过氧化氢中间体，该中间体再被另两个电子转移作用还原成水该 酶催化底物氧化和对0 2 的还原过程可用下式表示【加捌： c u 2 + c u 毛u c u + c u + c u + 詈焉c u 2 1 3 u 气毒i 荔一 ii ii i iii i i ii c 名麓等c 气c u 2 。产 i i i ( 还原态) h h 2 0 慢 c u 2 c u 2 + c u ： ii ( 氧化态) 漆酶能菲专一性地催化氧化许多结构不同的底物。如高毒性的酚化合物和偶氮染 料，许多研究者对其作用方式进行了充分的研究。漆酶催化的第一步是从有机底物传 递1 个电子给它的一个专门的含铜位点以形成自由基，这些自由基能进行重捧，从而 使烷基一苯基裂开，苯基醇氧化及支链和芳香环分裂。质谱得到的资料可以得到漆酶 的催化机制，氧气还原为水的最初步骤包括从还原型型铜离子传递两个电子形成 0 2 2 。，在这之后从i 型铜传递1 个电子给氧中间物而形成水分子和0 。基，第4 个电子 从u 型铜离子传给o 基以形成第2 个水分子p j 。 对于非酶底物，需介体系统起介导氧化作用，降解机制如图【1 1 】。漆酶底物即介 体( m ) 被漆酶氧化形成阳离子自由基( m + ) ，自由基不稳定自动分解为酶氧化反应 产物( p m ) 或者氧化其它非酶底物染料( d ) ，返回到它的最初状态( m ) 。被氧化 的非酶底物染料也是不稳定的，会分解成最终产物( po ) 被漆酶吸收的电子最终传 递给双氧形成水【1 4 】这也说明小分子介体物质对非酶底物染料的降解起到介导的作 用。 6 漆酶对染料降解的研究第一章序言 p - 一p d 图1 1 非酶底物染料的降解机理 0 2 中的氧( o 。) 和水中的氧( o 。) i 漆毒( b ) 和还原态漆醇( e 一) l 介体物质( m ) 和其阳离子自由 基( m + ) ；非酶底物染料( d ) 和其氧化态( d + ) f 介体物质的氯化降解产物( p m ) 和非酶底物染料的氯 化降解产物( p d ) 1 4 漆酶的主要用途 1 4 1 生物漂白 漆酶在应用研究中的一个潜在的方面是纸浆的生物漂白。生物漂白是利用微生物 或者其分泌的酶处理纸浆，达到脱除木素或有利于脱木素，并改善纸浆的可漂性或提 高纸浆自度的过程。1 9 9 8 年联邦德国电化学有限公司申报了一种嗜热漆酶的开发应 用专利，该专利介绍了漆酶的d n a 序列及漆酶在纸浆去木素、高分子聚集物解聚、 废纸脱墨、废水处理，尤其是纸浆漂白后含木素废水中芳香化合物聚合、染料氧化以 及在有机合成等方面的应用。近年来，国际上不断有真菌漆酶价体系统应用于纸浆 脱木素和生化漂白的新报道，酶法制浆和漂白正在革新传统造纸工艺 1 4 2 环境治理 生物整治包括染料脱色、工业废水处理和土壤修复等领域。因漆酶是一种次级代 谢酶，对底物的专一性要求不高，含介体的酶催化系统能氧化大范围的化合物，所以 在环境污染控制中有广泛的应用。 漆酶，介体系统能对酚型污染物进行脱毒和脱色，近几年，这方面的专利已经被 报道，一些专利技术已被采用或被改进漆酶介体系统在处理多环芳烃( 队h ) 方 面也具有很大的潜力。漆酶能在体外氧化p a h ，如葸、苊、苯并芘、二氢苊、芘等， 加入介体h b t 能显著的提高漆酶对葸、苊、苯并芘、二氢苊的氧化。 目前多采用固定化漆酶进行纺织染料的处理，固定化漆酶与游离酶相比，酶活有 7 漆酶对染料降解的研究第一章序言 所下降，但所适应的温度及p h 值范围更加广泛，稳定性更好。经固定化漆酶处理的 大多数染料废水。脱色可达8 0 以上。试验表明，染料的脱色与脱毒无直接的对应关 系，在某些情况下染料的降解产物仍然有毒蒽醌类染料经固定化的1 h m e t h i f 苫u 把 漆酶处理，可以脱毒8 0 ：在某些情况下，漆酶可将偶氮染料中偶氦转化为分子氮， 使偶氮染料完全脱掣。 1 5 本论文主要研究内容及意义 酶制剂是一种高效的生物催化剂，在纺织加工中应用的酶制剂品种不多，主要为 水解类酶制剂，但近来的研究表明氧化还原酶在纺织中也有很大的应用前景。酶制剂 有着良好的储藏稳定性，高的处理效率，现通过基因改性等手段，有的酶制剂产品已 经可以从酸性到碱性，温度从中温到高温等宽领域范围内保持高活性n o v o 公司 的漆酶( d t 蚵l i t c i i s ) 对靛蓝染料的分解效率很高，而且对纤维素纤维没有作用，不 会对织物造成损伤，因而被广泛的应用在牛仔布的脱色返旧整理上而将它应用于其 它染料废水的脱色研究，以及其它染料染色织物的脱色研究，在国内这方面报道很少， 仍有许多工作要做。 本论文首先对6 0 种酸性、活性、直接、分散染料与漆酶进行脱色反应后，7 3 的染料发生降解，其中9 0 的酸性、活性、直接染料都有脱色效果，但对于分散染料 这类漆酶仅对杂环类结构的有脱色能力，因而从酸性、活性、直接染料中根据不同的 染料发色基团选出十种染料作为研究对象。因不同来源的漆酶有不同的性质，所以对 此类漆酶的最适p h 值、p h 值稳定性、最适温度、热稳定性及其酶活力的稳定性进 行了研究观察。 采用漆酶对所选出的十种染料进行处理，对反应温度、p h 值、反应时间和酶浓 度进行了选择，以期该酶能达到最佳的脱色能力；并比较了在不同的染料浓度下各染 料的脱色程度。从酸性、活性、直接染料中各选出一类脱色效果较好的染料进一步探 讨了不同添加剂( 如酸根离子、金属离子、表面活性剂) 对染料脱色的影响。在酶与 染料最佳条件下反应，比较脱色前后的c o d 值，通过c o d 的去除来考察染料的降 解情况 根据染料溶液的脱色情况，选出酸性、活性、直接染料中各一类对棉、真丝织物 染色，进而用漆酶处理，观察漆酶对于织物的脱色效果。同样，对温度、p h 值、处 理时间和酶浓度进行了选择，筛选出最佳工艺。 0 滦酶对染料降解的研究 第一章序言 最后参照十种染料的最佳脱色工艺，得出了漆酶与各染料反应的 m i c h 扯l i s m 钮t c n 方程，计算出了动力学参数：v 。和k 。值。 1 6 参考文献 1 李慧蓉白腐真菌生物学和生物技术北京：化学工业出版社，2 0 0 5 2 郑光洪，冯西宁染料化学北京：中国纺织出版社，2 0 0 1 3 李家珍染料、染色工业废水处理北京：化学工业出版社，1 9 9 7 4 黄川，刘元元，罗宇印染工业废水处理的研究现状重庆大学学报( 自然科学 版) ，2 0 0 1 ，6 ( 2 4 ) ：1 3 9 1 4 2 5 杨书铭，黄长盾纺织印染工业废水处理技术北京：化学工业出版社，2 0 0 2 6y u z h uf u ， t v i r a r a g h a v a n f u n g a l d e c o l o r i z a t i o no fd y e 帆s t e w a t e r s ：a r e v i e w b i o r e s o u r c et e c h n o l o g y ，2 0 0 1 ，7 ：2 5 卜2 6 2 7 吴国宾国内外活性染料的现状和发展趋势江苏化工，1 9 9 9 ，1 ( 2 7 ) ：1 2 1 4 暑0 z f e ry e s i l a d a ， d i l e k s 蚰，s e v a lc i n g d e c o l o f i z a t i o no ft e x t f l 七d y e sb y f u n g a lp e l l e t s p r o c e s sb i o c h e m is t r y ，2 0 0 3 ，3 8 ：9 3 3 9 3 8 9 王忠华白腐真菌生物反应器降解染料的效果及机理分析研究华东师范大学，优秀 硕士论文2 0 0 6 1 0 徐文东，文湘华微生物在舍染料废水处理中的应用环境污染治理技术与设 备，2 0 0 0 ，2 ( 1 ) ：9 1 6 1 1 王朝霞印染废水的生物酶脱色国外纺织技术，2 0 0 1 ( 2 ) ：4 0 - 4 2 1 2 周文龙酶在纺织中的应用北京：中国纺织出版社，2 0 0 2 1 3 n d r e a sk a n d e l b e a u e r ，0 1i v e r m a u t e ，r u d 0 1 fw k e s s l e r s t u d yo fd y e d e c o l o r i z a t i o ni na ni 姗o b i l i z e dl a c c a s e e n z y m e r e a c t o ru s i n g o n l i n e s p e c t r o s c o p y b i o t e c h n 0 1 0 9 ya n db i o e n g i n e e ri n g ，2 0 0 4 ，4 ( 8 7 ) ：5 5 4 5 6 3 1 4 w o n g y l a c c a s e c a t a l y z e dd e c 0 1 0 r i z a t i o n 0 f s y n t h e t i cd y e s w a t e r r e s ，1 9 9 9 。1 6 ( 3 3 ) ：3 5 1 2 3 5 2 0 1 5k n b p pj s ，n e w b yp s t h ed e c o l o r i z a t i o no fac h e m i c a li n d u s t r y e f f l u e n tb y 劬i c er o tf u n g 舰t e rr e s 1 9 9 9 ，2 ( 3 3 ) ：5 7 5 5 7 7 1 6y e s i l a d a t h eu s eo fw h i t er o tf u n g u sf u n a l i at r o g i if o rt h ed e c o l o r i z a t i o n a n dp h e n o lr e m o v a lf r o mo l i v em i l lw a s t e w a t e f e n o i r o n 9 漆酶对染料降解的研究第一章序言 t e c h n o l ，1 9 9 5 ，1 6 ：9 5 1 0 0 1 7 何中琴译染料用虫漆酶脱色印染译丛，1 9 9 8 ，1 1 ：2 2 2 7 1 8 闰文超，黄峰，高培基木质素生物降解过程中木质素一介体反应系统的研究进展 林产化学与工业，2 0 0 3 ，1 ( 2 3 ) ：8 3 8 8 1 9 张敏，肖亚中，龚为民真茵漆酶的结构与功能生物学杂志，2 0 0 3 ，5 ( 2 0 ) ：6 8 2 0 张丽白腐真茵产漆酶对染料废水降解的研究南京理工大学，优秀硕士论文，2 0 0 4 2 1 堵国成，赵政，陈坚真菌漆酶的酶活测定及其在织物染料生物脱色中的应用，江 南大学学报( 自然科学版) ，2 0 0 3 ，1 ( 2 ) ：8 3 9 0 2 2 缪静，姜竹茂漆酶的最新研究进展烟台师范学院学报( 自然科学 版) ，2 0 0 1 ，2 ( 1 7 ) ：1 4 6 1 5 0 2 3 刘尚旭，赖寒木质素降解酶的分子生物学研究进展重庆教育学院学 报，2 0 0 1 ，1 4 ( 1 4 ) ：6 4 6 7 2 4 何为，詹怀宇，王习文，伍红一种改进的漆酶酶活检测方法华南理工大学学报( 自 然科学版) ，2 0 0 3 ，1 2 ( 3 1 ) ：4 6 5 0 2 5 陈颖生物酶在染整加工中的应用( 二) 印染，2 0 0 3 ，1 2 ：3 7 4 0 2 6 季立才，胡培植漆酶结构，功能及应用氨基酸和生物资源，1 9 9 6 ，1 8 ：2 5 2 9 2 7 侯红漫白腐茵p l e u r o t u s o s t r e a t u s 漆酶及对蒽醌染料和碱木素脱色的研究大连 理工大学，优秀博士论文，2 0 0 4 2 8 卢蓉c o r i o l u sv e r i c o l o r 产漆酶及其对染料脱色的研究浙江大学，优秀硕士论 文2 0 0 4 2 9 王华，金大勇，赵建夫真茵漆酶及其在环境污染控制中的应用环境科学与技 术，2 0 0 3 ，4 ( 2 6 ) ：5 8 6 0 3 0 b a d u l l ae d e c o l o r i z a t i o na n dd e t o x i f i c a t i o no f t e x t i l ed y e sw i t hal a c c a s e f r o mt r a m e t e sh i r s u t e p p le n v i r o nm i c r o b i o l ，2 0 0 0 ，6 6 ：3 3 5 7 3 3 6 2 l o 漆酶对染料降解的研究 第二章环境对漆酶活力影响的研究 第二章环境对漆酶活力影响的研究 漆酶( l a c c a ，e c1 1 0 3 2 ) 是一种含铜的多酚氧化酶。通过多铜体系还原分子 氧为水，催化大量酚类化合物和芳香胺的氧化，而且在还原介体物质存在下，漆酶的 底物范围可进一步的扩大【l j 。近年来的研究发现，白腐菌漆酶对芳香族化合物的独特 降解特性，使白腐菌成为环境科学研究的又一热点之一。国内外的研究工作主要针对 漆酶对环境中的异生芳香化合物的降解而展开，如：氯代芳香化合物、氯代苯胺化合 物、硝基苯、氯代酚、多氯联苯、多环芳香化合物等。 目前有关漆酶的分子特性、基因测序以及纯化过程，国外已有资料报道，但不同 来源的漆酶的性质、作用的底物范围以及氨基酸序列相似性并不高，本论文所采用的 是n o v o 公司通过基因工程改造，用黑曲霉经深层发酵制得的漆酶( d l 面l 沁s ) 因此，本实验建立了以a b t s 为底物测定漆酶酶活的方法：用u v - 2 5 5 0 型紫外分光 光度计的t i r m 喇瑚臀程序连续记录酶反应的时间历程曲线，并求取最初部分的斜率 以计算酶活。并由此来确定它的最佳反应参数和条件( 最适p h ，最适温度) ，进一步 了解它的性质和特点，有利于将其用于染料脱色的研究闭。 2 1 材料与方法 2 1 1 实验材料 酶样：d e i l i l 沁s ( 漆酶，e c l 1 0 3 2 ) ，粉末状，由诺维信公司( n o v o z y l l m 器，c h i m ) 提供。 药品：正磷酸，冰乙酸，硼酸，氢氧化钠，均为分析纯。 2 1 2 实验仪器 表2 1 实验仪器名称、型号及生产厂家 2 1 3 常用储存液及配法 漆酶对染料降解的研究 第二章环境对漆酶活力影响的研究 2 1 3 1 缓冲液 b r i t i o n _ r o b i n n 缓冲液由a 液和b 液按比例配成，其中a 液为o 0 4 m o 儿混合 酸2 7 l m l 8 5 ( w ) 正磷酸，2 3 6 m i ，冰乙酸，2 4 7 叽硼酸，b 液为0 2 m o l i ，n a 0 h ， 配制方法见文献【3 】，再用p h 计较准其p h 值。 2 1 3 20 5 咖o i l 旭t s 溶液 a b t s 【2 ，2 - a z i n o b i 3 枷y l b e l l z n l i 锄l m 岳s i l l p h o n a t c ) 】，s i 舯a 公司分装，要求避 光在氦气下保存。因条件限制，将装有a b t s 粉状的试剂瓶放入冰箱冷冻室保存。称 取o 0 1 3 7 9 a b t s ，充分溶解，定容至5 0 m l 后即为o 5 咖l l a b t s 溶液，置于棕色 瓶中放入冰箱冷藏室低温保存 2 1 4 漆酶活力测定h 1 取2 9 ，l 的酶液稀释1 0 倍后，放入具塞试管a 中，作为样品管； 在另一具塞试管b 中，加入已煮沸灭活的酶液，其余操作同，作为空白管； 将a 、b 管、缓冲液与o 5 蚴。扎的a b t s 放在恒温水槽中，于3 0 预热5 m i n ； 1 m l 的酶液、1 m l 的缓冲液分别加入到两个1 c m 的比色皿中，再加入l m l 的 a b t s 溶液启动反应。反应5 m i n ，测定在4 2 0 n m 处吸光度随时间的变化 在上述条件下，取吸光值变化的线性部分，每分钟吸光值变化一个单位定义为一 个漆酶酶活单位，以u m i ，表示由于酶液经过稀释，所以酶活力为2 加l 乘以 相应的稀释倍数。 2 1 5 酶活计算方法嘲 u ( i 7 m i 户旦坠墨一 、 。t 占1 0 _ o v 蠢 0 d ：吸光度增加值；t ：反应时间( m m ) ；v ：反应体积( m l ) ；：消光系数 ( a b t s ：。= 3 6 0 0 0 盯c m l ) ；v 栅：酶液体积( m l ) 2 1 6 漆酶的最适p h 值研究嘲 分别测定酶反应液的p h 值从2 o 8 0 之间酶活的变化；以酶活最高的酶活力为对 照( 1 0 0 ) 相对酶活( ) = ( 各p h 条件下的酶活力最高酶活力) x1 0 0 2 1 7 漆酶的p h 值稳定性 将酶液在不同p h 条件下，保持4 h 后，再测定活力，计算相对活力 2 1 8 漆酶的最适温度 漆酶对染料降解的研究 第二章环境对漆酶活力影响的研究 将o 5 m m o l ，l 的a b t s 在3 0 8 0 下与酶液反应，在4 2 0 i 吼下测定活力；以酶活 最高的酶活力为对照( 1 0 0 ) 相对酶活( ) = ( 各温度条件下的酶活力，最高酶活 力) x1 0 0 2 1 9 漆酶的热稳定性h 1 在3 0 - 7 0 温度范围内，将酶液置于不同温度下保持1 h 后，立即取出放入冰浴中， 在3 0 下测定剩余活力，以最初保温前3 0 下的酶活力为对照( 1 0 0 l ) ，剩余酶活 ( ) = ( 各温度条件下的剩余酶活力，最初酶活力) x1 0 0 。 2 2 结果与讨论 2 2 1 漆酶的最适p h 值 p h 对酶反应的速度有显著的影响，每一种酶都有一个特定的最适反应p h 。p h 对酶活性的影响除了通过酶分子作用外，也可以通过对底物分子的解离作用，或其它 间接的作用影响酶的反应速度 选用不同成分的缓冲液往往对酶活性有不同的影响。本实验所要调整的p h 值范 围较广( d