（生物物理学专业论文）纳米银海藻酸钠复合薄膜的制备及其性能研究.pdf

_ 1 2 010s c h o o ly e a rm a s t e r sd e g r e et h e s i s c o d e ：10 2 6 9 n u m b e r ：510 7 0 6 0 2 0 58 e astc h n an o 刭m a lu n i v e r si t y p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fn a n o a g s o d i u m a l g i n a t ec o m p o s i t e f i l m d e p a r t m e n t ： m a j o r ： r e s e a r c hd i r e c t i o n ： s u p e r v i s o r ： n a m e ： d e p t p h y s i c s b i o p h y s i c s b i o m a t e r i a l a s s o c i a t ep r o f w a n gx i a n g h u i h u a n gr u i c o m p l e t e di nm a y ，2 0 10 s h a n g h a i c h i n a 一一 华东师范大学学位论文原创性声明 y 1742477ji l li i i lll li i i iillj 郑重声明：本人呈交的学位论文和牡碾膨藩磁加黔嗣如堠友寥性硒砷， 是在华东师范大学攻读硕士博士( 请勾选) 学位期间，在导师的指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或 撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说 明并表示谢意。 作者签名：盟e l 期：- ) _ , 1 0 年钥e l 华东师范大学学位论文著作权使用声明 栖拣：淑牺蒎碳和黔两收俐瞒识呷m 钰系本人在华东师范大学攻读 学位期间在导师指导下完成的硕士博士( 请勾选) 学位论文，本论文的研究成果归华东 师范大学所有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使用此学位论文，并向主管 部门和相关机构如国家图书馆、中信所和“知网 送交学位论文的印刷版和电子版；允 许学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查阅、借阅；同意学校将学位论文加入 全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版， 采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) () 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部 或“涉密 学位论文宰， 于够月日解密，解密后适用上述授权。 ( v ) 2 不保密，适用上述授权。 导师签名嫁本人签名杰盏 如t o 年b 窍| e l + “涉密”学位论文应是已经华东师范大学学位评定委员会办公室或保密委员会审定过的学位 论文( 需附获批的华东师范大学研究生申请学位论文“涉密”审批表方为有效) ，未经上 述部门审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用 上述授权) 。 华东师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文 黄蕊硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 乔登江院士华东师大物理系主席 陈树德教授华东师大物理系 夏若虹教授华东师大物理系 华东师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文 摘要 纳米银优良的抗菌性能和潜在的选择性抑制细胞增生性能引起了人们的关注，希望 除现有的体外应用外，还能够用于人体植入体如血管支架等，预防植入后局部细胞过度 增生的问题。为了使纳米银粒子能应用于各种不同的植入材料表面，并且避免过多的自 由粒子与人体接触后带来的安全隐患，本研究拟采用海藻酸钠作为载体，将纳米银固化 在其中，制备出纳米银海藻酸钠复合薄膜，通过缓控释作用将纳米银逐步释放出来，在 局部维持一定的作用浓度，达到持续抑制细胞增生的同时，减轻纳米银的团聚和迁移带 来的危害。 本文采用机械混合匀胶凝胶法制备出均匀完整，与玻片基底问具有一定结合强度的 纳米银海藻酸钠复合薄膜，采用x 射线衍射( x r d ) 、x 射线能谱分析( e d s ) 、扫描电 子显微镜观察( s e m ) 、原子力显微镜观察( a f m ) 、紫外分光光度法测量、电化学法 曲线测量等手段，对薄膜中纳米银的成份与分布，薄膜的表面形貌、电学性能、缓 释性能等进行了研究；同时采用m t t 、l d h 法研究了复合薄膜对体外细胞培养增殖性 能的影响，对纳米银海藻酸钠复合薄膜的缓释机制以及对细胞增殖产生影响的原因进行 了分析和讨论。 实验结果表明：采用凝胶匀胶法，利用含有不同浓度纳米银的2 5 的海藻酸钠溶 胶，匀胶机转速为4 0 0 0r m i n 条件下，可在玻璃基底上制备出厚度约为1 阻完整均匀的 纳米银海藻酸钠复合薄膜。复合薄膜具有欧姆特性，其电阻值随纳米银掺杂量的增加而 增加，符合麦克斯韦的有效介质模型。薄膜表面不平整，均布着直径约为1 岬左右的 凹坑，纳米银以这些凹坑为分布形态，以物理混合的方式总体均匀地存在于薄膜中。复 合薄膜以侵蚀作为主要的缓释机制，银的缓释量与掺入银的浓度、缓释液体环境有关。 纳米银的掺杂量越大，在相同时间内释放出来的纳米银越多，其中部分银是包含在海藻 酸钠碎屑中的。在类体液中薄膜的缓释速率最小，在无血清的培养基中薄膜的缓释速率 次之，在有血清培养清中薄膜的缓释速率最大。纳米银海藻酸钠复合薄膜对细胞具有显 著的抑制作用，其作用主要来自于被释放出来的银粒子与细胞间的交互作用，以及侵蚀 碎屑给细胞生长带来的影响。 关键词：纳米银海藻酸钠缓释细胞增殖表面性能 华东师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文 a bs t r a c t t h ee x c e l l e n ta n t i b a c t e r i a lp r o p e r t yo fn a n o - a g ，a sw e l la si t ss e l e c t i v e - r e s t r a i ne f f e c to n c e l l p r o l i f e r a t i o n c a u s e di n t e r e s t so fa p p l y i n gi to nh u m a ni m p l a n t sb e s i d e sp r e s e n t a p p l i c a t i o no fe x t e r n a la n t i m i c r o b i a l f o re x a m p l e ，a p p l yi t o nh u m a nv a s c u l a rs t e n tt oa v o i d r e s t e n o s i s i nt h es a k eo fa p p l yn a n o a go nd i f f e r e n tk i n d so fi m p l a n ts u r f a c e ，a n dr e d u c et h e s e c u r i t yp r o b l e mc a u s e db yt h eu s eo fn a n op a r t i c l e s ，s o d i u ma l g i n a t e ( a g s ) w a sc o n s i d e r e d t ob eu s e da s t h ec a r r i e ro fn a n o - a gi nt h i ss t u d y v i ac o n t r o l l i n gt h er e l e a s i n gr a t eo fn a n o - a g f r o mt h ef i l m ，t h el o c a lc o n c e n t r a t i o no fa gc a nb ec o n t i n u o u s l ym a i n t a i n e dt oac e r t a i nl e v e l ， w h i c hi sb e n e f i tt or e d u c i n gt h eh a r mo fa g g r e g a t i o na n di m m i g r a t i o no fn a n o a gw h i l e i n h i b i t i n gt h ee e l lp r o l i f e r a t i o n i nt h i sp a p e r , n a n o - a g a g sc o m p o s i t ef i l mi sp r e p a r e do ng l a s ss u b s t r a t eb ys p i nc o a t i n gm e t h o d ， u s i n gt h en a n o - a ga n d2 5w t a g sm i x t u r ea st h es 0 1 b yu s i n gx - r a yd i f f r a c t i o n ( x r d ) ， x - r a ye n e 礓s p e c t r a ( e d s ) ，s c a ne l e c t r o n i cm i c r o s c o p y ( s e m ) ，a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a r m ) ， u v - s p e c t r o p h o t o m e t r y , a n di vm e a s u r e m e n tm e t h o d ，t h ed i s t r i b u t i o no fn a n o - a g i nt h ef i l m ，t h es u r f a c e m o r p h o l o g yo ft h ef i l m ，t h ee l e c t r o n i cp r o p e r t ya n dr e l e a s i n gp r o p e r t yo ft h ef i l m sa r es t u d i e d m e a n w h i l e ， t h ec e l lp r o l i f e r a t i o nb e h a v i o r0 1 3t h ef i l m sw a ss t u d yb ym t ta s s a y , a n dt h ea c u t ec y t o t o x i c i t yo ft h ef i l m s w a ss t u d i e db yl d ha sw e l l t h er e l e a s i n gm e c h a n i s ma n dt h ei n h i b i t i o ne f f e c to ft h ef i l ma r ed i s c u s s e di n d e t a j 】 t h er e s u l t ss h o wt h a t ：t h en a n o - a g a g sc o m p o s i t ef i l m sp r e p a r e dh e r ea r eu n i f o r m ，w i t ht h e t h i c k n e s so f1 “m t h ef i l m sh a v eo h m i cc o n t a c tp r o p e r t y , w h o s er e s i s t a n c ei si n c r e a s i n gw i t ht h ei n c r e a s e o fa gd o p i n gc o n c e n 拄a f i o n w h i c hm a t c h e st h em o d e lo fm a x w e l l st h e o r yo fe f f e c t i v em e d i a t h es u r f a c em o r p h o l o g yi sr o u g hw i t hc o n c a v i t i e s t h ed i s t r i b u t i o no fa gi sg e n e r a l l y u n i f o r ma n df o l l o w st h es h a p eo ft h ec o n c a v i t i e s t h er e l e a s i n gm e c h a n i s mo ft h ef i l m si s e r o s i o n ，a n dt h er e l e a s i n gr a t ei sr e l a t e dt ot h ec o n c e n t r a t i o no fn a n o - a ga n dt h es o l u t i o n t h e r e l e a s e dn a n o - a gp a r t l ye x i s t si nt h ec h i p sp e e l e df i o mf i l m ，a n di t st o t a la m o u n ti si n c r e a s i n g w i t hi t sd o p i n gc o n c e n t r a t i o n t h er e l e a s i n gr a t eo fa gi sd i f f e r e n ta m o n gs i m u l a t eb o d yf l u i d ( s b f ) ，e e l lc u l t u r em e d i u mw i t h o u tb o v i n ea l b u m i n ，a n dm e d i u m w i t hb o v i n ea l b u m i n , w h i c h i sl o wi ns f ba n dh i g hi nm e d i u mw i t hb o v i n ea l b u m i n n a n o - a g a g sf i l m sh a v es i g n i f i c a n t e f f e c to nt h er e s t r a i no fc e l lp r o l i f e r a t i o n , a n dt h er e a s o nc a nb ea t t r i b u t e dt ot h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nt h er e l e a s e dn a n o - a gp a r t i c l e s ，a n dt h ei n f l u e n c eo ft h ep e e l e dc h i p s k e y w o r d s ：n a n o - a g ；a g s ；r e l e a s e ；c e l lp r o l i f e r a t i o n ；s u r f a c ep r o p e r t y i i 华东师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t 。i i 第一章绪论1 1 1 研究背景1 1 1 1 生物材料研究进展概述l 1 1 2 纳米银与细胞相互作用概述5 1 1 3 海藻酸钠的生物应用概述7 1 2 前期工作8 1 3 本课题的研究目的和研究内容9 第二章纳米银海藻酸钠复合薄膜制备工艺研究1 0 2 1 试剂与设备10 2 1 1 试剂1 0 2 1 2 实验仪器及原理介绍1 0 2 2 实验步骤13 2 2 1 纳米银海藻酸钠溶胶的配制1 3 2 2 1 纳米银海藻酸钠溶胶粘度的测量1 4 2 2 3 纳米银海藻酸钠溶胶在不同基底上的浸润性测量1 4 2 2 4 纳米银海藻酸钠复合薄膜厚度的测量1 5 2 2 5 纳米银海藻酸钠复合薄膜与基底间结合力的定性测量1 5 2 3 实验结果1 6 2 3 1 纳米银海藻酸钠溶胶粘度的测量结果1 6 2 3 2 纳米银海藻酸钠溶胶在不同基底上的浸润性测量结果1 7 2 3 3 纳米银海藻酸钠复合薄膜的厚度测量结果1 8 2 3 4 纳米银海藻酸钠复合薄膜与基底间的结合力分析结果2 l 2 4 讨论2 2 2 5 小结2 4 第三章纳米银海藻酸钠复合薄膜的物理化学性能研究2 5 3 1 试剂与设备2 5 3 1 1 试剂2 5 3 1 2 实验仪器及原理介绍2 5 3 2 实验方法2 8 3 2 1 纳米银海藻酸钠复合薄膜物相结构的测量2 8 3 2 2 纳米银海藻酸钠复合薄膜表面形貌分析2 9 3 2 3 银在纳米银海藻酸钠复合薄膜中的分布2 9 3 2 4 纳米银海藻酸钠复合薄膜的电学性能测试2 9 3 2 5 纳米银海藻酸钠复合薄膜缓释性能的测试2 9 3 3 实验结果与分析3 0 华东师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文 3 3 1 纳米银海藻酸钠复合薄膜中银的结构、含量与分布3 0 3 3 2 纳米银海藻酸钠复合薄膜的电学性能测量3 4 3 3 3 纳米银海藻酸钠复合薄膜的缓释规律研究3 6 3 4 讨论4 2 3 5 小结4 4 第四章纳米银海藻酸钠复合薄膜的生物相容性研究4 5 4 1 试剂与设备4 5 4 1 1 试齐u 4 5 4 1 2 实验仪器及原理介绍4 5 4 2 实验方法4 6 4 2 1h u v e c 细胞培养4 6 4 2 2l d h 急性细胞毒性检测4 6 4 2 3h u v e c 在纳米银海藻酸钠复合薄膜表面的增殖4 7 4 2 4h u v c e 在复合薄膜缓释溶液中的增殖4 8 4 3 实验结果与分析4 9 4 3 1l d h 急性细胞毒性实验4 9 4 3 2h u v e c 在纳米银海藻酸钠复合薄膜上的增殖5 0 4 3 3h u v c e 在复合薄膜缓释溶液中的增殖5 2 4 4 讨论5 4 4 5 小结5 5 第五章总结与展望。5 6 5 1 总结5 6 5 2 展望5 6 参考文献5 8 致谢。6 2 华东师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 生物材料研究进展概述 当人体组织或器官受到损伤或功能退化时，往往需要植入人工假体进行修复或功能 替代。例如植入人工心脏瓣膜替代病变瓣膜，用以治疗风湿性心脏病；植入骨钉替代病 变脊椎骨起支撑作用，用于治疗椎间盘突出钙化；植入人工关节以替代病变关节行使功 能：植入各类支架用于支撑病变管道如食道、气管、血管等。 这些植入体或短期或长期地存留于人体，不可避免地与人体组织和血液接触，会与 人体产生一系列的反应，主要由免疫反应、血液反应、生物化学反应和组织反应等内容 组成。早期的生物材料研究认为材料与细胞间的交互作用会产生不利的宿主反应，如与 血细胞作用造成血细胞的损伤与激活，从而引起溶血或凝血；与周围组织中细胞交互作 用，造成细胞损伤或是激发细胞过度增生。因此早期用于植入的生物材料均为惰性生物 材料( 如金属、合金、不可降解高分子材料、惰性陶瓷等) ，尽量避免与人体组织发生 交互作用。随着研究的深入发现，材料与人体组织之间的交互作用也可以合理利用，并 由此发展出了生物活性材料( 如生物活性玻璃陶瓷和可降解高分子材料等) ，这些材料 具有一定的生物活性，能参与机体的生理活动。例如p 磷酸三钙陶瓷( t r i c a l c i u m p h o s p h a t e ，p - t c p ) 可以与骨结合并且随着新骨的生成，t c p 能够逐渐被降解并最终被 新骨所替代 1 】。如今，有细胞外基质作用，能与活体细胞产生相互作用，有特殊的细胞 响应，能够诱导组织或器官发展成有生命力的新组织或器官的组织工程材料已成为生物 材料的研究热点之- - 2 】。 1 1 1 1 避免与人体组织发生交互作用的生物材料生物惰性材料 为了避免材料与细胞问的交互作用会产生不利的宿主反应，早期植入人体的生物材 料以惰性生物材料为主。所谓“惰性”是指这类材料在人体内的化学成份相对稳定，不 易分解或生物降解；具有良好的生物相容性和理想的免疫反应性；其力学强度和物理性 能适宜，能与人体环境很好地相匹配，保证植入材料与生物组织的形变相协调 3 】；能够 在人体内长期留存，材料本身不受环境的影响，也不会给周围环境带来不利影响。这类 生物材料主要包括三类：以不锈钢、钛及其合金、钴及其合金等为代表的金属生物材料； 以碳素、金属氧化物陶瓷、金属化合物陶瓷等为代表的生物惰性陶瓷材料；以硅橡胶、 聚乙烯等为代表的不可降解高分子材料。 金属生物材料应用最早，而且在临床中的应用也最为广泛，具有力学性能优良，来 华东师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文 源广泛，易加工成型，制造成本低，易消毒等特点，常被用来制造高负载或承重的人体 植入器件 4 。例如，3 1 6 l 不锈钢和钛合金常被用作关节柄和关节头材料【5 ；锻造 c o - c r - m o 合金和锻造c o n i c r - m o 合金被广泛用于膝关节和髋关节假体的制造 6 ，以及 齿科的骨钉。钛及钛合金于2 0 世纪5 0 年代开始用于人体植入 7 】，因其生物相容性较好而 有替代其他金属之势，目前也被大量地用于人工关节及骨钉等的制造。从最初的 t i 一6 a 1 - 4 v n 随后的t i 5 a 1 2 5 f e 和t i 6 a 1 - 7 n b 合金，以及近几年发展起来的新型b 钛合金 8 】，钛合金在人体植入材料方面获得了较快的发展。金属生物材料最大的缺点是其生物 相容性不够理想，这也是制约其临床应用的主要因素。 生物惰性陶瓷主要是指化学性能稳定，生物相容性好的陶瓷。这类陶瓷材料的结构 都比较稳定，具有较高的机械强度、耐磨性和化学稳定性。在众多的惰性陶瓷中，a 1 、 m g 、t i 、z r 的氧化物陶瓷应用最为广泛 9 。早在1 9 6 9 年t a l b e 就将不同孔隙率的颗粒状 a 1 2 0 3 陶瓷作为永久性可移植骨假体，植入成年杂种狗的股骨中进行试验，发现多晶氧 化铝陶瓷对包括生物环境在内的任何环境都呈现惰性及其优越的耐磨损性和高的抗压 强度，使氧化铝材料成为最早获得临床应用的生物惰性陶瓷材料 1 0 。氧化锆陶瓷由于 其优良的力学性能，尤其是其远高于氧化铝瓷的断裂韧性，使其作为增强增韧第二相材 料在人体骨骼修复方面取得了较大的研究进展。h e n c h 报道，部分稳定氧化锆陶瓷的抗 弯强度可达1 0 0 m p a 1 1 】。二氧化钛具有良好的血液相容性，通常以表面涂层的形式出现 在人工心脏瓣膜、骨材料的应用研究中1 2 1 3 。惰性陶瓷生物材料在应用过程中遇到的 最大问题是韧性较低，机加工性能较差，弹性模量与人体组织不匹配。 不可降解高分子生物材料是指在生理环境中使用，但不能被生理吸收或降解的高分 子材料。我国古代利用天然纤维缝合人体肌肤是天然高分子材料在医学中应用的最早实 例，而1 9 3 7 年医生利用工业聚甲基丙烯酸甲酯制造假牙的牙床是工业高分子材料在医学 中自发应用的最早实例。随后研究者根据生命科学的需要，在分子水平上设计和实现对 现有高分子工业品种在组成、配方和工艺上的优化及新的高分子生物材料品种的开发。 目前用于制造半永久性内植物的体内不可降解高分子材料主要有聚乙烯、聚丙烯，聚氯 乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚氨酯、硅 橡胶、天然橡胶、碳纤维、聚砜纤维、聚丙烯中空纤维、吸附树脂等。由于高分子材料 具有良好的生物相容性，被广泛用于齿科修复，眼部假体、各类导管和血袋、缝合线等 的制造。不可降解高分子生物材料的缺点在于其机械强度、耐用性和机械加工性能 1 4 】 不如金属和陶瓷材料。 1 1 1 2 与人体组织之间存在交互作用的材料生物活性材料 由于生物系统的复杂性，植入人体的惰性生物材料并不是完全“惰性”的。例如金 2 华东师范人学2 0 1 0 局硕t ：9 位论文 属生物材料在植入人体后，在体液环境中金属离子的释放会引起血液中该金属离子浓度 的升高，从而对人体造成危害；此外，当生物惰性材料与组织之间的界面呈现非化学或 生物学结合时，材料在软、硬组织中的相对运动会引起植入界面处纤维被膜的形成。因 此，要达到完全的“惰性”是不可能的，材料与组织之间的交互作用不可避免。基于材 料一组织之间的交互作用，发展出了一类新的生物材料生物活性材料。 生物活性材料介于可再吸收生物材料和生物惰性材料之间。生物活性材料是一种在 材料界面处引起特定的生物学响应，导致组织与材料间某种结合形成的材料。主要是指 生物活性玻璃、生物活性玻璃陶瓷( 如c e r a v i t a l ，a w 玻璃陶瓷，或可加工的玻璃陶瓷) ； 致密的羟基磷灰石或方解石；以及生物活性复合物如h a 聚乙烯，h a 生物玻璃等。所 有这些材料与相邻组织都会形成一个界面结合层。图1 所示为不同的生物与人体骨组织 之间形成的界面层情况。惰性材料( 致密的a 1 2 0 3 ) 的外部会形成一层纤维包囊，而活 性材料( 如羟基磷灰石h a ，4 5 s 系列的生物活性玻璃) 会与骨组织发生响应，界面向 材料内推移，骨向材料内部生长。 魏i t | a l i , t a t e 糯l 讯协孵童o 8 0 r 皤 1 瀚 舀 o 1 0 1 0 0，o 。4 s s 5b l l 童；i r ：；：；o ：二- 。_ m - _ h 敬咚g 猫哆邕三= = ：j ：i j j ： 孙磁澎秘矧参锭，一一 卜叫删l 。一 l 秘皂鬯煞卿终土一 卜。 _ 黼虿毒碰乞鑫诤鼍乞；棚i 强。， 卜殳嗡燮一：一 i - - 一一- 。_ 一。，。酾渤鸽0 3 彬嘲o 。铷嘞蓐敞饼从0 ， ”：蚍e 一一一一一一 卜。+ 。“。粤- - 一- _ _ “ 1 0 0 0 1 0 01 00 lo1 0 0 1 0 0 0 图l 植入骨组织中生物活性和1 卜活性陶瓷的反应界面层厚度( 肛m ) 比较 1 5 】 f i glc o m p a r i s o no ft h i c k n e s sb e t w e e nb i o l o g i c a la c t i v ea n dn o n b i o l o g i c a la c t i v ec e r a m i cr e a c t i o n i n t e r f a c et r a n s p l a n t e di nb o n e 材料的生物活性通常用生物活性指标i b 来表征。 i b - ( 1 勋。) i b 式中，( t o 5 b b ) 指的是材料与组织界面之间的结合达到5 0 时所花的时间。 3 华东师范大学2 0 10 届硕i ：学位论文 i b 的大小与材料的成分有关。以4 5 s 5 系列的二氧化硅活性玻璃为例，如图2 所示， 图中部( 区域a ) 中的玻璃为活性玻璃，与骨形之间形成结合界面层。区域a 中的曲线 为生物活性相同的i b 等高线。处于区域b 的二氧化硅玻璃( 如窗户或瓶子玻璃，或显 微镜玻片) 为惰性材料，在植入体和组织界面处形成纤维包囊。在区域c 内的玻璃是可 再吸收的活性玻璃，在植入人体后的1 0 到3 0 天内消失。区域d 内的玻璃无法被制造出 来。 s i 0 2 a | w gc(highp 2 0 5 ，屈磊4 翼 夤b i o g l a s s 4 s s 5 弩c e r a v i t a l 5 5 s 4 3 一一s o t lt i s s u e 臻 b o n d i n g ；嚣岽蠹 o 图2 取决于成分的生物活性玻璃与玻璃陶瓷与骨及软组织的结合 1 5 】 f i g 2c o m b i n a t i o no fb i o g l a s sa n dc e r a v i t a ld e p e n d so nc o m p o n a n t sw i t hs o f tt i s s u eb o n d i n g 活性生物材料中最具有代表性的材料是羟基磷灰石( h y d r o x y a p a t i t e ，简称h a ) * d 4 5 s 系列的活性玻璃。羟基磷灰石是脊椎动物骨和齿的主要无机成分，生物相容性较好， 无毒副作用，在生物硬组织的修复和替换材料中得到广泛的应用 1 6 1 7 。但是羟基磷灰 石本身脆性高、抗折强度低的限制，很难应用于承重材料。生物活性玻璃植入人体骨缺 损部位后，能与骨组织直接结合，起到修复骨组织、恢复其功能的作用。生物活性玻璃 化学稳定性差，机械强度低，多用于承力不大的体位，如耳小骨、指骨等的修复。 可在体内降解的高分子生物材料也可视作活性生物材料，因为材料和人体组织之问 也会发生交互作用。可降解高分子材料是指材料植入人体后，可降解为单体并排出体外 的一类材料。这类材料不会在人体内长期留存，不会带来并发症，是药物的良好载体。 目前所报道的体内可吸收线性高分子生物材料已超过2 0 多种 1 8 】。但可用于临床的只有 聚乙醇酸( p g a ) ，聚乳酸( p l a ) 和聚原酸脂( p d s ) 等，被用于手术缝合线、药剂输 送胶囊、临时支架、粘合材料、阻粘材料以及止血材料等。目前可降解高分子生物材料 已成为分子工程研究中一个十分重要的内容 1 9 】。可降解高分子生物材料的缺点是消毒 和保存困难，机械强度不如金属。 4 仁东师范人学2 0 1 0 届硕i ：学位论文 1 1 1 3 能与活体细胞产生相互作用，有特殊细胞响应的生物材料组织工程材料 由于组织或器官的修复与再建的医学要求，组织工程逐渐发展起来。组织工程是指 应用生命科学和工程学的原理和方法来设计、组建、维护人体细胞和组织的生长，以恢 复受损伤的组织或器官的功能 2 0 。随着组织工程的发展，产生了第三代生物医用材料， 即具有生物活性的可降解吸收的生物医用材料。其在生物体内能被降解，最终为机体所 吸收，同时材料本身又具有生物活性，能参与机体的生理活动，在分子水平上激活基因， 刺激相关细胞，产生响应，从而诱导组织和器官的形成，是细胞和基因的活性化材料 2 1 。 作为组织工程中的基体，组织工程材料的细胞兼容性显得非常重要。很多研究都围 绕着材料三维骨架结构的设计与制造，细胞在基体材料表面的附着、生长和分化，材料 物化性能和降解性能等展丌。国家基金委也增加了对细胞材料交互作用机理研究的支 持力度，以期从机理上掌握组织工程中关键技术。近期研究结果表明，材料表面的理化 性能及材料表面的拓扑结构会显著地影响细胞的黏附、铺展、生长、繁殖和生化活性 2 2 。 例如，材料表面的电荷性质会对细胞的附着和形态产生影响：s h e l t o n 等人对聚合物表 面的电荷状况与游走成骨细胞问的相互作用进行研究，结果表明细胞在不同性质电荷的 材料表面都能生长，但是细胞形貌有显著区别。生长在带正电荷材料表面的细胞形状扁 平，与材料黏附紧密，而生长在带负电荷的材料表面的细胞与材料之间出现较明显的间 隙。当材料表面所带的负电荷电量较多时，细胞也呈扁平状；但所带负电荷电量较少时， 细胞呈直立状。表明材料表面的电荷密度和电荷性质对细胞的形态有显著影响 2 3 。材 料的表面能也是影响细胞附着的因素之一：l e e 等人用射频等离子体放电处理技术将聚 合物膜持续暴露于等离子体中，使其表面发生氧化，处理时间不同可以得到一系列不同 亲水性的聚合物膜，研究表明处理后的表面细胞的黏附性能得到提高 2 4 2 5 】。材料表面 的化学成份也对细胞的生长有一定的影响：c l a u d ek l e i n s o y e r 将表面带正电荷的p s 材 料上以共价键引入含氮基团，在其上培养细胞发现细胞生长良好，可替代表面与土f n 的组织培养级p s 2 6 】。 组织工程材料的研究已经取得了很大进展，有望在临床中加以应用。例如p e r r y 等 在p g a 和p 4 h b 多聚体支架材料上种植骨髓f 日j 充质干细胞，构建了组织工程化三叶心 脏瓣膜，其机械性能和形态与自然生长心脏瓣膜相似 2 7 ；组织工程和基因转导肌腱有 望用于外科手术 2 8 】。但是，在组织工程材料研究中，仍然存在着很多的问题，需要进 一步研究。 1 1 2 纳米银与细胞相互作用概述 纳米银是以纳米技术为基础研制的新型生物材料。随着科学医疗技术的不断发展， 华东师范人学2 0 1 0 届硕i j 学位论文 纳米银很快被广泛应用在医疗产品中用于抗菌治疗，如纳米抗菌辅料、纳米银眼药、纳 米银织物、纳米银导尿管、纳米银骨水泥、含纳米银的心脏瓣膜、纳米银隐形避孕套等 等 2 9 - 3 1 。纳米银材料由于其表面积大，粒径小，容易跟病原微生物发生密切接触，是 优良的抗菌剂，极少量的纳米银就可以产生很强力的杀菌作用。而且纳米银具有比同类 常规无机抗菌材料更强的抗菌活性 3 2 。这是因为纳米银微溶于水后能释放出浓度为 7 0 p p m 的a g + 和a g o ，而其他形式的银( 如硝酸银和磺胺嘧啶银) 只能释放出a 矿。a ， 的灭菌活性比a g + 更持久。 纳米银的抗菌性能源于其尺寸效应，被广泛用作抗菌剂。但也j 下是因为纳米银的尺 寸效应，引发了人们对其人体使用安全性的担忧。尽管人们对纳米银的细胞毒性、遗传 毒性做了大量的研究，但研究结果却有一定的争议性。部分研究结果认为纳米银在被用 于烧伤敷料时，不具有细胞毒性，甚至会加速伤口的愈合【3 3 3 8 。而另一部分研究结果 则认为纳米银具有毒性，由于纳米银的尺寸远小于人体细胞尺寸，能够通过细胞吞噬等 方式进入细胞并与细胞器相互作用3 9 ，使生物大分子和生物膜的正常立体结构发生改 变，导致体内一些激素和重要酶系失活，遗传物质产生突变，肿瘤发病率升高或促进老 化 4 0 4 1 ，同时还可以通过细胞的内吞和外释作用，穿过一些特定细胞组成的生理屏障， 进入人体循环系统，并在人体肝、肾等部位处沉积，对该部位的组织及细胞造成损伤 4 2 4 4 。例如，熊玲等人的研究表明，体外培养细胞的培养液中加入纳米银粒子的量到 达一定浓度时，给细胞的内吞和代谢带来了困难，从而对细胞的生命活动有了明显的影 1 1 l a j 4 5 。蒋学华等人研究银材料的粒径分布对体外培养b m v e c 和a c 原代细胞毒性实 验结果显示，纳米银能通过胞饮进入到b m v e c 和a c 细胞内引发细胞水中，损伤细胞 问紧密连接，造成b b b 的完整性丢失，进而跨越进入中枢神经系统 4 6 】。j a n s s o n 等人 研究发现，纳米银在溶液中释放出的a 矿在细胞表面引发趋化肽极其受体反应，从而在 人体内产生超氧自由基 4 7 1 。h u s s a i n 等人的研究表明，粒径为1 5 n m 和1 0 0 n m 的纳米银 颗粒对b r l 3 a 细胞能产生毒性，使细胞形状程不规则变化，产生皱缩，细胞线粒体的 功能也显著降低，同时培养基中乳酸脱氢酶浓度明显升高，这说明有大量细胞的细胞膜 破裂 4 8 。t a k e n a k a 等人将约为1 5 n m 的纳米银颗粒以及a g n 0 3 溶液加入p c 2 1 2 细胞的 培养基，使其与之相互作用，发现纳米银颗粒和a g n 0 3 溶液都会使细胞的体积减小、 细胞膜边界模糊、线粒体功能指标下降 4 9 1 。 尽管纳米银在人体内的使用安全性受到一定程度的质疑，但由于银能够对植入体 感染形成的生物膜( b i o f i l m ) 的有较好的防治作用 5 0 1 ，能达到传统的抗体治疗所不能 达到的效果 5 1 】，且不易产生抗药性，因此仍然被希望用于植入体抗菌治疗。为此，人 们致力于研究将纳米银掺杂或载带在其它材料( 如羟基磷灰石、聚酰胺、生物活性玻璃 5 2 - 5 4 、苯基三乙烷氧化硅p h e n y l t r i e t h o x y s i l a n e 等) 上，希望银能被用于骨修复材料 6 。导东师范人学2 0 1 0 届顾十学位论文 及骨固定装置，人工心脏瓣膜，牙科修复 5 5 5 9 等方面，以减少医用植入体或医疗器械 在人体内留置所引起的感染并发症。然而，被掺杂在其它材料中的纳米银是否能同样达 到抗菌的效果，会否从材料中被释放出来，释放出来的银以何种形式存在，与细胞间存 在怎样的交互作用，其使用的安全剂量范围是多大? 诸如此类的问题都需要通过研究加 以回答，进而寻找到一种安全的使用方式。 1 1 3 海藻酸钠的生物应用概述 海藻酸钠( s o d i u ma l g i n a t e ，a g s ) 分子式( c 6 h 7 0 6 n a ) n ，是一种从褐藻类的海带或马尾 藻中提取的聚阴离子多糖( 海藻酸) 的钠盐。自1 8 8 3 年由海带中发现海藻酸钠以来， 直至1 9 2 9 年开始在美国应用与工业生产，1 9 4 4 年用于食品工业，但用于医药工业不过 近3 0 年的时间。a g s 的单位结构分子量理论值为1 9 8 11 d a ，平均真实值2 2 2 0 0 d a ，大 分子3 2 0 0 0 2 5 0 0 0 0 d a 6 0 】，是由1 ，4 聚b d 甘露糖醛酸和0 【l 古罗糖醛酸组成的一 种直链多糖，整个分子由3 中片段即聚甘露糖醛酸片段、聚古罗糖醛酸片段和甘露糖醛 酸甘露糖醛酸杂合段通过1 4 一糖苷键链接而成线性嵌段共聚物。化学结构见图3 。 图3 海藻酸钠的化学结构式 6 1 f i g 3c h e m i c a ls t r u c t u r ef o r m u l ao f a g s a g s 吸湿性强，持水性能好，易溶于水，微粒的水合作用使其表面具有粘性，然 后微粒迅速粘合形成团块，再缓慢完全溶解，形成粘性胶状溶液。水溶液粘度因聚合度、 浓度、p h 值和温度而异。2 0 。c 时1 的水溶液粘性变化范围为o 0 2 - - - - 0