（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕类核质蛋白基因的研究.pdf

浙江理= 人学硕+ 学位论文 摘要 核质蛋白( n u c l e o p l a s m i n ) 是高等真核生物卵母细胞和卯细胞核中重要的分子 伴侣，体外实验证明核质蛋白在核小体的装配、精了染色质重建以及细胞凋亡的 染色质聚缩过程中具有重要的调节作用。在对家蚕蛹期c d n a 文库测序中，我 们获得一条c d n a 序列长度为1 1 8 3b p ，其编码的氨基酸序列与已知的核质蛋白 序列共有一个保守的结构域。该保守结构域有约1 0 0 个氨基酸残基，同源性达 6 1 1 。我们将它命名为家蚕类核质蛋白b m n l p ( n u c l e o p l a s m i n l i k ep r o t e i nf r o m b o m b y x m o r i ) ，g e n b a n k 髓录号为e f 2 1 0 3 1 8 。该基因的丌放阅读框全长4 8 6 b p ， 编码的蛋白有1 6 1 个氨基酸残基，预测分子量为1 8 2k d a ，等电点为4 3 3 。将其 o r f 克隆到原核表达载体p e t - 2 8 a 中，构建重组质粒，双酶切签定及序列测定正 确后转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，经1 p t g 诱导，该基因得以成功表达。表达的重 组蛋白以可溶形式存在，经过镍柱亲和层析纯化后，以纯化的重组蛋白为抗原免 疫兔获得该蛋自的多克隆抗体，经e l i s a 检测，抗体效价可达1 ：2 5 6 0 0 以上。 e l l s a 和w e s t e r nb l o t 检测蚕蛹蛋白，反应都呈阳性，进一步证实了b m n l p 的 存在。利用该抗体以w e s t e r nb l o t 检测家蚕三个发育阶段和五龄幼虫四种组织或 器官中b m n l p 蛋白的表达和分布，发现在卵、五龄幼虫、蛹三个发育阶段均有 表达，表达量比较接近；各个组织或器官中，在头部表达最少，其次是中肠，而 丝腺巾表达最多。利用抗体的免疫荧光标记对家蚕b m 5 细胞定位，观察到荧光 集中分布存细胞内一个近似圆形的区域，以d a p i 复染后确定为细胞核，从而证 实b m n l p 定位在细胞核中；利用激光断层扫描发现间期细胞中b m n l p 分布更 靠近核膜，而分裂细胞中整个核都有分布。此外，以该基因的o r f 为模板体外 转录d s r n a ，琼脂糖凝胶电泳检测后，脂质体法转染b m 5 细胞，4 8h 后以m t t 法检测干扰前后细胞活力，i 司时提取细胞总蛋白作e l i s a 检测，r n a 十扰后的 细胞活力下降，总蚩白中目的蛋白含量明硅低于阴性对照：将细胞用p t 染色后 流式细胞仪分析，与i f 常细胞相比，十扰后的绌胞在s 期出现个检测峰，表明 皇刚胞被阻滞住这时期。 关键词b 。，h b $ ，xm o r i ；核质蚩白；b m n l p ；亚细胞定位；r n a i ；细胞周期 浙江理【人学硕+ 学位论文 a b s t r a c t n u c l e o p l a s m i ni so n e o ft h em o s ti m p o r t a n tc h a p e r o n e si nt h en u c l e io fo o c y t e s a n de g g so fh i g h e re u k a r y o t e s e x p e r i m e n t si nv i t r os h o wt h a t n u c l e o p l a s m i n r e g u l a t e s n u c l e o s o m ea s s e m b l y , c h r o m a t i nc o n d e n s a t i o nd u r i n g a p o p t o s i s ，a n d r e m o d e l ss p e r mc h r o m a t i nd u r i n gf e r t i l i z a t i o n h o w e v e r , t h e r ei sl e s se v i d e n c e s u p p o r t i n gi t sf u n c t i o ni nv i v o t h ee d n al i b r a r yo fp u p a ep h a s eo fs i l k w o r mh a s b e e nc o n s t r u c t e di no u ri n s t i t u t e a c c o r d i n gt ot h el a r g e s c a l es c a n n i n go ft h el i b r a r y , a1 18 3b pe d n aw a si d e n t i f i e dw h i c he n c o d e sap r o t e i np o s s e s s i n gac o n s e r v a t i v e d o m a i nc o n s i s t e n tw i t hak n o w nn u c l e o p l a s m i n t h e i rh o m o g e n e i t yo ft h ed o m a i n r e a c h e s6 1 1 w en a m e dt h i sg e n eb m n l p ( f o rn u c l e o p l a s m i n l i k ep r o t e i nf r o m b o m b y xm o r i ) ，a n di t sa c c e s s i o nn u m b e ri ng e n b a n ki se f 2 1 0 318 t h i sg e n eh a sa n o p e nr e a d i n gf r a m eo f4 8 6b p ，e n c o d i n g1 6 1a m i n oa c i dr e s i d u e sw i t ht h ep r e d i c t e d m o l e c u l a rw e i g h to f18 2k d aa n di s o e l e c t r i cp o i n to f4 15 t h eo r fo ft h eg e n ew a s c l o n e di n t ot h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 2 8 aa n dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d w a st r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) a f t e rb e i n gi n d u c e dw i t hi p t gt h i sg e n e w a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di ns u p e r n a t a n to ft h ec e l ll y s a t e a f t e rb e i n gp u r i f i e dw i t h n i 2 + a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a sa sa n t i g e na g a i n s tw h i c h t h ea n t i b o d yw a sr a i s e db yi m m u n er a b b i t t h et r i e ro ft h ep o l y c l o n a la n t i b o d i e s r e a c h e s1 ：2 5 6 0 0m e a s u r e db ye l i s a w e s t e r nb l o ta n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h ep r o t e i n w a se x p r e s s e di na l l4s i l k w o r mt i s s u e sa n d3d e v e l o p m e n t a lp h a s e se x a m i n e d ，w i t h t h eh i g h e s te x p r e s s i o ni ns i l kg l a n da n dl o w e s ti nh e a d u s i n gf l u o r e s c e n ta n t i b o d yf o r s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o na s s o c i a t e dw i t hd a p ic o u n t e r s t a i n ，w ep r e l i m i n a r i l yl o c a l i z e d t h ep r o t e i ni nt h en u c l e u s f u r t h e ro b s e r v a t i o ns h o w e dt h a ti ni n t e r p h a s ec e l l st h e p r t e i nl o c a l i z e de x a c t l yc l o s e rt ot h en u c l e a rm e m b r a n e sw i t h i nt h en u c l e u s ，w h i l ei n d i v i d i n gc e l l sd i s t r i b u t e di nt h ew h o l en u c l e i w h a t sm o r e ，r n ai n t e r f e r e n c ew a s a p p l i e dt os i l e n c et h et a r g e tm r n a f o l l o w e db yd e t e c t i n gt h ec e l lc o n d i t i o nw i t hf l o w c y t o m e t e r t h er e s u l t ss u g g e s tt h ei n t e r f e r e dc e l l sw e r eb l o c k e di nt h es - p h a s eo ft h e c e l lc y c l em e a n w h i l e ，w i t h i nt h eg e n eo v e r e x p r e s s c d ，c e l l ss e e m e dl i k e l yt ob e p r o m o t e dt og 2 mp h a s e s 浙江理上= 人2 浮硕十学位论文 k e yw o r d s ：b o m b y xm o r i l n u c l e o p l a s m i n ；b m n l p ；s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n ；r n a i n t e r f e r e n c e 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，足本人在导师 的指导下，独立进行研究】作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本沦文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到奉声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：么彩坳 日期：砷年弓月哆日 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密一 学位论文作者签名：铆鼢秋 日期：矿1 7 年专月z 弓日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名 日期： 浙江理i = 大学硕士学位论文 1 1 核质蛋白的生化特性 第一章核质蛋白综述 核质蛋白最初是在1 9 7 8 年从非洲爪蟾卵和卵母细胞中分离出来，当时的描 述是：一种酸性，热稳定性蛋白，在体外能促进纯化的组蛋白和d n a 装配成核 小体i 也1 。它是爪蟾卵母细胞核中含量最丰富的蛋白，大约构成整个核蛋白的7 至1 0 p 1 。 爪蟾核质蛋白0 0 ) 由2 0 0 个氨基酸残基组成，在溶液中形成五聚体结构 4 1 。 蛋白水解分析、交联分析( c r o s s l i n k i n g ) 和序列比较 5 , 6 3 1 揭示，每个单体折叠成两 个结构域。其一，n 端保守的抗蛋白酶解的结构域，有1 2 0 个氨基酸残基和一段 短的酸性带( a 1 ) ，即“核心”。其二，8 0 个残基的蛋白酶敏感的c 端结构域或者 叫尾巴，包括碱性的双向核定位序列和两条酸性带：2 0 氨基酸的多聚谷氨酸带 a 2 ，和较小的h 3 ( 图1 1 ) 。 图1 1 核质蛋白线性结构示意图( 引自d u h a ，2 0 0 1 ) 核心使n p 产生寡聚化作用并赋予蛋白极强的稳定性【5 , 8 , 9 1 。重组爪蟾n p 五 聚体的核心结构域和果蝇中同源的类核质蛋i ；i ( n u c l e o p l a s m i n l i k ep r o t e i n ，n l p ) 的 核心结构域的x 射线结构已经分别在2 3a 和1 5a 分辨率下测定1 8 , 1 0 。这些晶 体结构数据展示出n p 的三个结构要点。一，爪蟾n p 核心五聚体平均直径6 0a ， 高4 0a ，与早期电镜2 】和沉降速率分析l - 致。它可以分为三个结构层面：横侧 面，纵侧面，和寡聚化作用表面。二，单体折叠成8 条链的b 桶形结构。每个单 体有一个由1 3 发夹组成的特征结构，在亚基间的分界面形成，它可以使横侧面的 构象具有一定的弹性。三，五聚体内保守的非极性残基形成连续环形结构，由单 体的疏水性核心通过非极性的亚基接触面相互作用形成，很可能是使五聚体具有 热稳定性的关键结构【8 , 1 0 】。非极性分界面由高度带电的相同亚单位组成，在n p 家族中很保守，被认为与它们的组蛋白结合功能相关；h i e n o 等认为它可能也是 浙江理1 = 大学硕士学位论文 对维持单体的稳定性所需要的【”。 用重组的n p 分子进行液体动力学分析显示，五聚体蛋白可以用一个扁形的 椭圆球束模拟1 1 i 】。光谱学和预测方法 7 】表明，c 端尾巴主要折叠成环和转角，这 对结构域的可塑性很重要。经沉降速率分析，c 端尾巴具有延展性构象【1 1 】。i - i i e r r o 等f 9 】对三种无磷酸化的重组蛋白进行了研究：全长的重组n p ( r n p ) ；切掉c 末端 8 0 个氨基酸残基的突变体( 相当于重组蛋白的核心，a c 8 0r n p ) ，缺失c 末端5 0 个残基但保留多聚谷氨酸带的c 5 0r l 岬。这些研究提供了证据表明，最长的多 聚谷氨酸a 2 带和碱性残基之间有相互作用存在。这些相互作用阻止了电负性区 域的接近，调节它的染色质解聚活性、构象和热稳定性。这暗示着有一种可能的 机制调节n p 活性，而这种机制很可能就是基于尾部不同电荷区域的相互作用。 s e a l y 12 1 ，c o t t o n 1 3 1 和h i 锄 7 1 各自进行的电泳研究揭示，卵母细胞和卵细胞 中的n p 不同源，c o t t o n 认为e n p 和o n p 是彼此独立的基因产物，而不是同一 个基因翻译后加工的结果。卵细胞的n p ( e n p ) 酸性更强，等电点4 2 5 ，而卵母细 胞的n p ( o n p ) 等电点为4 7 ，展示了更大的分子异源性，而且迁移在更大的表观 分子量位置。这些差异是因为磷酸化程度的不同，这也影响着各自的生物学功能 【1 4 】。为了估计e n p 和o n p 的磷酸基团数量，将它们用磷酸酶解后，用a c i d u r e a 胶检测。结果表明，e n p 每个单体包含2 0 个磷酸基团，而o n p 少于十个【l3 1 。用 化学分析和质谱检测，每个单体的平均磷酸基团数量为o n p3 个，卧口7 一l o 个 7 1 。但磷酸化残基的一致性仍然未知【7 1 。利用光谱学技术( 圆二色性和红外光谱) 进行的功能和结构研究显示，n p 的磷酸化相关活性并不显著影响其二级结构【7 】， 但是显著降低了其热稳定性【9 】。 蛋白酶消化研究 1 2 , 1 3 , 1 5 】表明，卵细胞和卵母细胞的n p 在n 末端存在结构差 异，这可能是磷酸化程度不同的原因。 1 2 早期n p 的功能研究和多聚谷氨酸带( a 2 ) 的角色 1 2 i n p 与核小体的装配 无论是从爪蟾卵细胞还是卵母细胞中分离出来的核质蛋白都有将纯化的组 蛋白和d n a 在体外装配核小体的活性1 6 ，1 捌。 在l a s k e y t ”，e a r n s h a w 2 1 ，k l e i n s c h m i d t 1 8 ，1 9 1 ，以及d i l w o r t h l 2 0 1 的早期工作 2 浙江理工大学硕十学位论文 中，n p 是在体内从组蛋i ：i ( h 2 a h 2 b ) 2 二聚体复合物中分离出来，并且能分别与 ( 1 4 3 h 4 ) 4 四聚体和组蛋白核心八聚体形成复合物。 早期研究【2 】还显示，n p 一组蛋白复合物不结合到电负性的表面，但在中性 p h 下能结合到带正电荷的树脂上，这表明n p 能屏蔽组蛋白的正电荷。这些数据 连同n p 在卵母细胞核中的丰富程度提示出，n p 的作用之一就是屏蔽组蛋白库 的正电荷，( 爪蟾卵母细胞含有足够大的组蛋白储备，以装配染色质) 为受精和早 期胚胎发生过程的核小体装配提供需要。 当电负性的d n a 与正电荷的组蛋白在生理离子强度下混合到一起，他们会 发生不可逆的沉淀作用【2 l 】。n p 的酸性很好地屏蔽了组蛋白的高度电正性，从而 介导逐步有序的装配。因为这个过程可以被多聚阴离子模仿，例如多聚谷氨酸和 r n a l 2 2 1 ，表明核小体的装配可能与n p 的酸性带有关，从而可能是通过组蛋白或 碱性蛋白与a 2 的相互作用来介导4 0 3 1 。 k l e i n s c h m i d t ”】，d i n g w a l l l 4 1 等测定n p 一组蛋白复合物的化学算法( 即一个或 者两个组蛋白，n p 五聚体) 提供的数值表明，每个单体的多聚谷氨酸带一起构成 一个结合位点。不同实验室对n p 一核心组蛋白结合的化学计量所获得的数据存 在很大差异。早期通过柱层析分析显示n p 五聚体能结合一个核心组蛋白的八聚 体【2 】 0 3 年a r n a n 2 4 1 利用分析型超速离心技术确证了上述结果。然而，他们的数 据显示，n p 五聚体能结合组蛋白八聚体，而同时他们的模型又暗示h 2 a h 2 b 二聚体和h 3 h 4 四聚体可能结合在不同的位点。以n a p i 建立的类似的模型也 认为是结合核心组蛋白八聚体1 2 5 2 6 1 。d u t t a l 8 1 等基于晶体结构分析提出的模型认 为，爪蟾n p 五聚体叠加形成十聚体，里五角形结构，能结合五个组蛋白八聚体 ( 图1 2 ) 。不过在溶液中却从未观察到十聚体的存在f 1 1 0 7 0 8 瑚1 。晶体学分析显示 s a o , 3 0 1 ，十聚体的横侧面可能是组蛋白结合位点，每个单体的b 发夹调节这种结 合。a k e y 等【3 0 1 认为是通过h 2 a h 2 b 折叠的相互租用结合。组蛋白和n p 的尾巴 都不是形成复合物所必要的，这说明，相互作用主要靠立体结构专一性喁，1 0 j m 。 然而，相互作用的精确机制仍然未知。 浙江理工大学硕士学位论文 图1 2 n p 十聚体模型 在这个模型中，两个n p 五聚体形成一个十聚体，十聚体形成一个中心轮轴，在其侧 面容纳五对h 2 a h 2 b 二聚体的装配或五个八聚体。 1 2 2n p 与精子染色质的重建 用微球菌核酸酶对爪蟾精子染色质消化后的电泳图谱表明，在该染色质中常 规的核小体可能缺失【1 4 , 3 1 3 2 。而且，爪蟾精子染色质的h 2 a h 2 b 含量相对h 3 h 4 少，染色质的包装很大程度依赖于其他精子核碱性蛋白( s nb p s ) 的存在，在爪蟾 中被称为精子特异性碱性蛋i 刍( s p 2 s p 6 ) 3 3 1 。爪蟾的s p 的分子特性已有报道 3 4 3 5 ，并且认为它包括在类鱼精蛋白家族中【3 6 1 。在爪蟾卵或卵母细胞抽提物存在 下的精子解聚后，核小体开始出现，n p 已被证实是这一过程的必须分子伴侣【3 7 】。 p h i l p o t ta n dl e n o 3 8 惶出了精子解聚的模型，在这个模型中，n p 将s p 从d n a 上 移除，代之以h 2 a h 2 b 二聚体。又是n p 的a 2 带，在精子染色质重建过程中 起结合s p 的作用。 两个不同的实验数据表明，a 2 多聚谷氨酸带提供了n p 对s p 的亲和力。一 个是，c 端缺失8 0 个残基从而缺失多聚谷氨酸带的突变体不能使精子染色质解 聚：相比之下，c 端缺失5 0 个残基但是保留了多聚谷氨酸带的突变体具有解聚 和结合s p 的活性【9 】。二，o n p 和o n p 核心结构域的解聚能力显著低于它们的全 长蛋白。 4 浙江理工大学硕十学位论文 然而，值得注意的是，a 2 单独参与整个精子染色质重建过程这一点已经受 到其他实验结果的质疑，那些结果显示，过磷酸化的e n p 核心也能使精子染色 质解聚【l5 1 ，并且订帅的核心，即使缺失这两个较大的酸性带，也能结合组蛋白 八聚体 s , l o , 2 4 。p r i c t o 1 1 1 等也发现，在n p 的a 2 带和a 3 带都缺失的情况下，依 然还有使精子染色质解聚的活性，尽管a 2 带能增强这种活性。而且，有证据显 示，核心组蛋白的高度碱性尾巴并不是结合n p 所需要的，表明在这个过程中还 有静电作用以外的相互作用【2 4 i 。所有这些信息表明，多聚谷氨酸带a 2 并不单是 核质蛋白生物活性的唯一结构。 s a l v a n y 等【3 9 】重新将注意转移到n p 核心结构域中的a 1 带。他们将a 1 突变， 发现不仅是缺失a 2 、a 3 带的突变体r n p l 2 1 ( - a 1 ) 其精子染色质解聚活性显著降 低，就连含有完整a 2 、a 3 的全长n p 的突变体r n p ( - a 1 ) 其解聚活性也显著降低。 1 3 n f 与细胞凋亡 细胞凋亡即程序性细胞死亡，不仅在多细胞生物的发育和组织内环境稳态的 维持中起着重要作用，还与许多疾病如神经退化和癌症密切相关【删。细胞凋亡 的起始和进程受到胱天蛋白酶( c a s p a s e ) 家族的调控【4 ”。染色质聚缩是凋亡的主要 标志，l u 等【4 2 】研究表明，n p 调节了这一过程。高度磷酸化的n p 具有染色质解 聚活性【1 4 1 ，在细胞凋亡过程中，活化的c a s p a s e 3 激活了凋亡特异性蛋白酪氨酸 磷酸化酶( p t p ) ，而后者将n p 第1 2 4 位的酪氨酸脱磷酸化，使得n p 丧失染色质 解聚活性，从而调节染色质的聚缩。 1 4 n p 与核转运 n p 的尾部结构域包含核定位信号m l s ) 。将部分酶解的n p 微注射到卵母细 胞质中，发现其在核内的积累是由一段短的多肽介导f 5 1 。对n p 核定位信号进行 测序发现，是两个彼此独立的碱性结构域组成的长序列使得n p 从胞质转运到核 4 1 。运用蛋白质的克隆和测序技术确定了一类含有两个碱性结构域的双向核定位 序列【4 , 4 3 1 。这是迄今为止描述的第一个双向核定位序列。近年来更多的研究指出， 核定位序列是结合到转运蛋白i m p o r t i nu b 二聚体上 4 4 , 4 5 1 。n p 也被用来研究蛋 白是如何通过核孔复合体的选择性通道进入核内1 4 4 。已知只要有一个尾部结构， 浙江理工大学硕士学位论文 就可将全部的头部带入细胞核。 1 5 磷酸化与n p 的生物学活性 核质蛋白出现在爪蟾卵母细胞的第二阶段，在卵母细胞生长过程中广泛分布 于生发泡中，随着卵子的成熟，生发泡的破裂，核质蛋白均匀地分布于动物极半 球并环绕植物极及皮层呈带状分布【4 “。并且能在卵母细胞成熟为卵细胞过程中 以及早期胚胎阶段转变为中胚层时检测到i ”1 。 在卵母细胞成熟过程中，n p 被高度磷酸化【1 3 1 ，这大大增加它的电负性，并 且提高它的染色质重建活性。在卵母细胞核中，积累了大量的组蛋白以满足形成 新的受精卵后d n a 快速复制的需要，o n p 被认为是储存因子。而且，卵母细胞 生发泡含有大量的另一种酸性核内分子伴侣，n 1 n 2 储存h 3 h 4 t 1 7 , 1 8 ，4 8 1 。在 体外n p 和n 1 n 2 都能独立地结合h 2 a h 2 b 或者h 3 h 4 2 4 ，1 9 】。 卵母细胞n p 的磷酸化至少受两种蛋白激酶调节，酪蛋白激酶1 1 ( c a s e i n k i n a s e ，c k i i ) 4 9 1 和c d c 2 周期蛋白【1 2 i ，并且在核膜破裂时被释放到胞质。而，e n p 是在受精时，在爪蟾卵细胞胞质中结合到h 2 a h 2 b 二聚体上。将去膜的精予核 加入到卵细胞抽提物中时，先是经历染色质膨胀的快速起始阶段，然后是缓慢的 膜依赖的核膨胀和蛋白输入阶段【3 1 i 。起始阶段中精子的解聚伴随着s p 的流失和 核小体阵列的置换。从卵细胞抽提物中将n p 免疫耗竭( i m m u n o d e p l e t i o n ) 抑制了 染色质膨胀的起始，而重新加入n p 后精子解聚活性又得到恢复。在体外纯化的 n p 单独就能起始解聚的第一阶段，这说明n p 在精子解聚过程中既是必要又是 充分【”】。早期发现，n p 既不结合染色质丝又不结合裸露的d n a 2 1 ，从而，n p 介导的染色质重建活性必然发生在蛋白之间的相互作用中。其他的多聚阴离子分 子也有n p 的这种活性，如多聚谷氨酸和r n a ，但是在生理水平只有n p 能解聚。 1 6 n p 模型 p h i l p o t t 和l e n o 3 8 1 提出的精子染色质重建模型认为，在这个过程中，n p 以 一种能量有利的反应将s p 从d n a 上移除并沉积h 2 a h 2 b 二聚体。在替换之后， 染色质进一步的修饰，例如组蛋白的乙酰化、磷酸化、以及与类h 1 接头蛋白 b 4 和h m g l 结合，都是染色质有序装配所需的5 0 j 1 1 。很可能n p 的大规模磷酸 6 浙江理工大学硕士学位论文 化正是促进精子解聚，为雄原核的染色质融合和复制做准备。在原核融合后， d n a 才开始快速复制。 在真核生物中，d n a 复制的起始发生在基因组的多个起始位点【5 2 1 。在爪蟾 无细胞系统中核小体d n a 的复制受到两个不同的细胞周期信号调节。其一，复 制验收因子( r e p l i c a t i o nl i c e n s i n gf a c t o r ) ，结合到复制起始位点以确定能否起始。 其二，s 期促进因子，诱导验收后的起始位点开始复制，并且移除验收因子。 g i l l e s p i e l 5 3 , 5 4 j 和b l o w f 5 3 1 认为，在去膜的精子核中，有效验收需要n p ，并且n p 在复制验收中的作用就是使精子染色质解聚。的确，从不同体细胞中分离的休眠 核( 高度聚缩) 在爪蟾抽提物中培养后能重新获得全能性，能复制，还能重新起始 分化2 9 j 5 鄢1 。将爪蟾的红细胞核在卵细胞抽提物中培养，接头组蛋白h 1 和h 1 0 就被核质蛋白移除了。这些研究表明，hl 的移除，通过增加起始频率和促进复 制前体复合物的装配，激活了核的复制【5 ”。与此相比，n p 在体细胞中的转录增 强子活性仍然充满争议，并且不同实验室的结果互相矛盾【5 7 j 8 j 9 1 。 现行的核小体装配模型表明，先是尾部特异性乙酰化的h 3 h 4 四聚体沉积 到d n a 上，然后h 2 a h 2 b 二聚体才加入形成核小体核心结构【5 2 , 6 0 , 6 1 1 。新合成的 组蛋白和之前存在的组蛋白是随机结合到d n a 链上的。尚未证明，在早期胚胎 分裂阶段中n p 作为分子伴侣是否参与了核小体的装配。然而，n p 应该在h 3 h 4 沉积之后起到了向它们传递h 2 a h 2 b 的作用。 正如我们所提及，不同的多聚阴离子分子，如n p ，n 1 n 2 蛋白，多聚谷氨 酸，以及r n a ，能作为组蛋白转移分子。非特异性多聚阴离子分子介导的染色 质重建显示，核小体的分配是随机的，并且不形成天然染色质的间隔规律。因此 认为，在生理条件下，核小体装配过程需要多种因子的作用3 0 , 3 7 ，6 2 】。这些因子能 被分为两类：核或组蛋白伴侣，a t p 依赖的染色质重建因子。 核或组蛋白伴侣的主要作用是将组蛋白沉积到d n a 上。核质蛋白、d n l p ( 果 蝇胚胎的类核质蛋白) 、n 1 n 2 蛋白已经得到鉴定。其他核小体装配因子已在体 细胞中发现，包括染色质装配因子l ( c a f - - i ) ，核小体装配蛋白1 ( n a p - - i ) 3 0 6 3 1 ，模 板激活因子( t a f d m , 6 5 1 ，以及抗沉默因子l ( a s f l ) t 6 2 , 6 5 。 a t p 依赖的染色质重建因子中有一个利用a t p 的染色质装配和重建因子 ( a e 0 ，能与n a p i 或c a f i 一起，介导核小体的规律性排列。核小体重建因子 浙江理工大学硕士学位论文 n u r f 和染色质可达性复合物( c h r o m a t i na c c e s s i b i l i t yc o m p l e x ，c h r a c ) 已经从果蝇 胚胎中分离得到【6 7 1 。 在向中胚层转变过程中n p 过磷酸化被解除，这个阶段转录被初次激活，细 胞周期延长6 8 1 。据推测，在中胚层之前n p 必然是最大程度磷酸化的，这样才能 维持早期胚胎发育中染色质的开放构象，以满足d n a 的快速复制和细胞分裂。 1 7 n p 研究新进展 1 7 1 体细胞染色质解聚 n p 在精子染色质解聚的中的作用之前已经被证实，通过移除精子特异性碱 性蛋白并替换成核心组蛋白而完成。但是在体细胞中，没有其他特异性的碱性蛋 白，不存在组蛋白置换，其染色质解聚知之甚少。0 6 年h i r o s h i 等研究发现，n p 在小鼠未分化细胞中具有广泛的染色质解聚活性，既能使常染色质解聚，又能使 着丝粒的异染色质解聚，不过不是通过组蛋白置换而是通过特异的遗传后修饰 ( e p i g e n e t i cm o d i f i c a t i o n ) ，包括组蛋白h 3 的多位点磷酸化，第1 4 位赖氨酸的乙 酰化，以及异染色质蛋白h p l1 3 和t 1b 等【6 9 1 。 1 7 2n p m 家族的分子进化与功能划分 目前认为在核内的分子伴侣中n p 与核磷蛋i 刍( n u c l e o p h o s m i n ) 一起是一个 n p m 蛋白家族，主要包括n p m l 、n p m 2 、n p m 3 三种类型。n p m l 即核磷蛋白， 又叫b 2 3 、n u m a t r i n ( 哺乳类) 、n 0 3 8 ( 两栖类) ；n p m 2 即核质蛋白，不多赘述； n p m 3 则是一类了解不多的蛋白( 爪蟾的n 0 2 9 ) 。e i r i n l o p e z 等将n p m 家族蛋白 作了长期进化关系分析认为，与n p m 2 相比，n p m l 和3 在进化上关系密切， 都定位在核内7 1 i ，在许多组织中都有分布7 2 1 。此外，在细胞中n p m l 和n p m 3 形成复合物，并且通过这种相互作用n p m 3 帮助调节n p m l 在核糖体发生中的 作用【7 1 1 。 1 8 展望 核质蛋白与核小体的装配、精子染色质的重建以及细胞凋亡中染色质聚缩都 8 浙江理工大学硕士学位论文 有密切关系。从1 9 7 8 年发现核质蛋白至今2 8 年，这期间对核质蛋白的研究和认 识越来越深入，越来越详细，为全面认识该蛋白的生物学特性积累了大量的信息。 同时，核质蛋白作为第一个被命名的分子伴侣和第一个被发现具有双向核定位序 列的蛋白，对它的不断认识还将有利于我们深入了解生物大分子b j 的相互协作以 及生物大分子跨膜转运的分子机理。此外，最近报道的核质蛋白在未分化的体细 胞内也具有广泛的染色质解聚活性【6 9 】向我们展示，核质蛋白将有可能作为新的 指示器帮助我们探究体细胞分化过程中染色质是如何重新编程( r e p r o g r a m m i n g ) 的，从而能使我们对核移植和再生有更进一步的了解，这在医疗中将有广泛前景。 然而，对核质蛋白与碱性蛋白复合物中的化学计量关系仍未达成一致，核质 蛋白上的组蛋白结合位点与精子特异的碱性蛋白结合位点是否一致，核质蛋白在 体内的活性如何，仍然需要进一步的研究，并且，在无脊椎动物中，尤其是完全 变态昆虫中，该类蛋白作用如何，仍然有许多问题尚待研究。 9 浙江理工大学硕士学位论文 1 实验的目的、意义 第二章实验设计 我们研究所构建了家蚕蛹期e d n a 文库，分离得到2 4 0 0 余条e d n a 序列，部 分已登录n c b i 的g e n b a n k 中，其中大部分基因尚属未知，对这些基因展开功能 研究对家蚕的功能基因组研究将具有重要意义。 在对家蚕蛹期e d n a 文库测序中，筛选到一条e d n a 序列长度为1 1 8 3b p ， 其编码的氨基酸序列与已知的核质蛋白序列同源。这是在家蚕蛹中首次发现的一 个新的类核质蛋白，我们将它命名为b m n l p 。对它进行的原核表达、组织分布、 亚细胞定位及r n a 干扰的初步研究将为揭示其在家蚕中的功能特性提供了条件 和数据，也为家蚕功能基因组学的研究提供了一定条件。 2 实验内容 生物信息学分析该b m n l p 的信息特征，包括推测蛋白的疏水性、潜在功能 位点、信号肽、模拟的三维空间结构以及与同源序列的多重比对； 将b m n l p 基因的o r f 插入到表达载体p e t - 2 8 a 的多克隆位点，构建重组表 达质粒，进行原核表达： 纯化表达的重组蛋白并鉴定重组蛋白的分子量； 以该蛋白为抗原免疫兔子获得多克隆抗体，测定抗体的效价； 免疫印迹进一步验证b m n l p 在家蚕蛹中的存在并初步分析其在家蚕不同发 育时期和组织器官中的表达； 免疫荧光法进行亚细胞定位研究，分析b m n l p 蛋自在家蚕b m 5 细胞中的分 布： 以b m n l p 基因的o r f 为模板体外转录合成d s r n a ，转染家蚕b m 5 细胞， 进行基因沉默的初步研究。 1 0 浙江理工大学硕十学位论文 l 序列与工具 1 1 序列 第三章生物信息学分析 b m n l p 基因的电子版c d n a 序列( 登录号：e f 2 1 0 3 1 8 ) 非洲爪蟾的核质蛋白序y 0 ( 登录号：c a a 2 8 4 6 0 ) ，人的n p m 3 蛋白序列( 登录 号：a y 0 4 9 7 3 7 ) 、鼠的n p m 3 蛋白序列( 登录号：n p _ 0 3 2 7 4 9 ) ，果蝇的n l p 蛋白序列( 登录号：q 2 7 4 1 5 ) 1 2 工具和软件 g e n b a n k 中的b l a s t 工具( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t ) ； 生物软件网( h t t p ：w w w b i o - s o f t n e t 0 的s m s 在线工具； s w i s s m o d e l ( h t t p ：s w i s s m o d e l e x p a s y o r g ) 三级结构预测； p r o t s c a l et o o l ( h t t p ：w w w e x p a s y o r g e g i - b i n p r o t s e a l e p 1 ) 疏水性分析； p r o s i t e t o o l s ( h t t p ：a u e x p a s y o r g p r o s i t e ) 功能区预测； s i g n a l p 3 0s e r v e r ( h t t p ：w w w c b s d t u d k s e r v i c e s s i g n a l p ) 信号肽预测： 软件：b i o e d i t ，d n a s t a r ，d n a m a n 。 2 方法 将b m n l p 基因序列在g e n b a n k 的家蚕基因组数据库中比对，以确定该序列 在家蚕中的存在。然后利用b l a s t n 工具进行核苷酸序列同源性比对。 用生物软件网的s m s 在线工具，进行o r f 的查找与可能的编码序列分析， 将推测的氨基酸序列用b l a s t p 工具进行蛋白序列同源性比对。 利用瑞士生物信息研究院( s w i s si n s t i t u t eo fb i o i n f o r m a t i c s ，s m ) 的专业蛋白 分析系统( e x p e r tp r o t e i na n a l y s i ss y s t e m ，e x p a s y ) j 务器进行蛋白功能区、疏水 性、信号肽等信息的在线分析，均采用默认配置。 利用b i o e d i t 软件的c l u s t a l w 程序进行蛋白的多序列同源性分析，采用 浙江理工大学硕士学位论文 默认参数，选取的序列有爪蟾的n p 序列，人和鼠的n p m 3 ，果蝇的n l p 。 将推测的b m n l p 氨基酸序列在线提交到s w i s s m o d e l ，模拟出三位结构。 3 结果 3 1b m n l p 的信息 b m n l p 在家蚕基因组数掘库中比对后，匹配率达到9 9 ，确认为家蚕的基 因序列。b m n l pc d n a 长度为1 1 8 3b p ，o r f 长4 8 6 b p ，编码的蛋白有1 6 1 个氨 基酸残基。 3 1 1b m n l p 蛋白的疏水性 我们用e x p a s y 的p r o t s c a l et o o l 预测了该蛋白的疏水性( 图3 1 ) 。结果显示， b m n l p 蛋白的疏水性最大值为2 0 3 3 ，最小值为一3 6 1 1 ；在6 5 7 2 区域的氨基酸 残基疏水性最强，在8 1 2 、3 6 - 4 0 、5 3 5 8 以及9 0 1 1 2 区域的氨基酸残基多形成 疏水区域。而在1 1 3 残基以后的区域分值非常低，表现出强亲水性，此外在1 8 2 7 区域也有较强的亲水性。 p e a l 川 p o ，i t i 图3 1b m n l p 蛋白的疏水性预测 横坐标表示蛋白氨基酸残基位置，纵坐标表示的是预测的分值，0 以上表示疏水性，分 值越高疏水性越强；0 以下表示亲水性，分值越小亲水性越强。 1 2 浙江理工大学硕士学位论文 3 1 2 功能位点分析 利用p r o s i t et o o l 进行了蛋白功能位点预测( 表3 1 ) ，结果显示，在第8 1 3 个残基之间为潜在的n 肉豆蔻酰基化位点；第3 1 3 3 残基为蛋白激酶c ( p k c ) 的 磷酸化位点：第5 9 6 2 残基为酪蛋白激酶i i ( c k i i ) 磷酸化位点；第1 4 7 1 5 0 残基 为酰胺化位点。 表3 1b m n l p 蛋白的功能位点预测 3 1 3 信号肽分析 利用s i g n a l p 3 0 t o o l 进行了蛋白信号肽的存在预狈0 ( 图3 2 ) ，结果显示，该蛋 白为非分泌型蛋白( n o n s e c r e t o r y p r o t e i n ) ，存在信号肽的概率为o 0 1 1 ，锚定蛋白 的概率为o 0 0 0 ，表明b m n l p 蛋白不太可能存在信号肽。 图3 2b m n l p 蛋白信号肽预测 浙江理工大学硕士学位论文 3 2 蛋白序列多重比对 将b m n l p 的蛋白序列与非洲爪蟾n p 序列、人的n p m 3 序列、鼠的n p m 3 序列以及果蝇的n l p 序列进行多重比对( 图3 3 ) 。可以看到，它们都含有一些高 度保守的氨基酸序列，如g s g p ，v t f ，p i ( v ) a x l k 等，这些序列很可能就是核 质蛋白家族的标记