（发酵工程专业论文）酪蛋白酶解肽谱对树突状细胞成熟的影响.pdf

酪蛋白酶解肽谱对树突状细胞成熟的影响t h ee f f e c to fp o l y p e p t i d e sf r o m c a s e i no nt h em a t u r a t i o no fd e n d r i t i cc e l l s专业：发酵工程研究生：张郢指导教师：庞广昌教授生物技术与食品科学学院2 0 1 0 年5 月摘要酪蛋白经水解制得的多肽是重要的生物活性肽，具有免疫调节能力。本研究分别利用胰蛋白酶及胃蛋白酶的酶解酪蛋白，经乙醇、超滤以及s e p h a d e xg 2 5 两次分离纯化后，制备两种不同的酪蛋白水解多肽。一方面以b a l b c 小鼠为实验动物，分别将同一浓度的胰蛋白酶水解的酪蛋白多肽通过口服，腹腔注射和静脉注射给药。利用悬浮液体芯片系统，检n d , 鼠外周血血清中2 4 种细胞因子的浓度变化，研究胰蛋白酶酪蛋白水解多肽对小鼠细胞因子网络的影响并推测产生的先天免疫应答。结果灌胃组中，大部分细胞因子的水平是升高的，抗炎细胞因子i l 5 ，i l 9 ，i l - 1 0 ，m i p 1 仅是降低的，说明酪蛋白水解多肽促进发炎细胞因子的合成，具有刺激免疫升高的作用。腹腔注射组与此类似。静脉注射的酪蛋白水解多肽对细胞因子水平的影响与灌胃组、腹腔注射组相比明显不同。因为多肽不经过肠粘膜免疫系统直接进入血液，推测通过激活多种免疫细胞内部不同的信号途径影响了细胞因子的基因表达。另一方面诱导培养c 5 7 b l 6 雄性小鼠骨髓源的树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l s ，d c s ) 用不同浓度的水解多肽刺激d c s ，在4 8 h 后进行流式细胞仪检测，鉴定d c s的成熟程度，并将成熟后的d c s 与t 细胞共孵育9 6 h ，c c k 8 检测t 细胞增殖。结果表明：两种酶水解酪蛋白多肽均能够刺激d c s 的成熟，但刺激程度低于阳性对照l p s 。而且成熟的d c s 能够刺激t 细胞增殖，说明d c s 具有对这些多肽的抗原递呈能力。其上清液中的细胞因子i l 。1 仅、i l d 、i l 2 、i l 6 、i l 1 2 的分泌提高，t n f 0 l 、i f n 吖浓度降低，促使幼稚t 细胞向t h 2 极化。说明酪蛋白水解多肽对获得性免疫具有信号传递作用。关键词：牛乳酪蛋白；水解多肽；先天性免疫；肠粘膜免疫系统；树突状细胞；获得性免疫a b s t r a c tt h ep o l y p e p t i d e sd e r i v e df r o mc a s e i na r ei m p o r t a n tb i o l o g i c a la c t i v ep e p t i d e s ( b a p ) ，w h i c hh a v eo b v i o u si m m u n o s t i m u l a t i n gp r o p e r t i e s p o l y p e p t i d e sw e r es e p a r a t e df r o mt r y p t i ca n dp e p t i cc a s e i nh y d r o l y s a t e sb ye t h a n o ls e d i m e n t a t i o n ，u l t r a f i l t r a t i o na n dt w or o u n d so fs e p h a d e xg 一2 5c h r o m a t o g r a p h y f i r s t ，u s em i l l i p o r em o u s ec y t o k i n ek i t st ot e s tt h ec o n c e n t r a t i o n so f2 4c y t o k i n e si ns e r u mo fm o u s e ，w h i c ht r e a t e dw i t hp o l y p e p t i d e sw e r es e p a r a t e df r o mt r y p t i cc a s e i nh y d r o l y s a t e s ( t c h ) t h r o u g ho r a la d m i n i s t r a t i o n ，i n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n ，i n t r a v e n o u si n j e c t i o nt os t u d yt h ee f f e c t so fp e p t i d e so nt h ee y t o k i n en e t w o r ka n dt h ei m p a c t so fi n n a t ei m m u n er e s p o n s e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ，t h ec o n c e n t r a t i o n so fm o s to fc y t o k i n e si ns e r u mo fm o u s ew e r eg r o w nb e s i d e st h ea n t i i n f l a m m a t o r yc y t o k i n e sa si l 一5 ，i l 一9 ，i l - 10 ，m i p law e r er e d u c e di nt h eo r a la d m i n i s t r a t i o ng r o u p ；s i m i l a rt ot h ei n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o ng r o u p t h er e s u l t so fi n t r a v e n o u si n j e c t i o ng r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tc o m p a r e dw i t ht h eo t h e rt w og r o u p s ，w h i c hs h o wt h a tt h ep e p t i d eg ot ob l o o dd i r e c t l yb u tn o tt h o u g h tm u c o s a li m m u n es y s t e m ，a n da c t i v a t eav a r i e t yo fd i f f e r e n ts i g n a l i n gp a t h w a y si ni m m u n o c y t et h e nc h a n g et h eg e n ee x p r e s s i o no fc y t o k i n e s e c o n d ，b o n em a r r o w d e r i v e dd e n d r i t i cc e l l s ( d c s ) ，w h i c hw e r eg e n e r a t e df r o mm a l ec 5 7 b l 6m o u s ew e r es t i m u l a t e db yc a s e i n d e r i v e dp o l y p e p t i d e s ，a n d2 4h o u r sl a t e r , c e l l sw e r et e s t e do nf l o wc y t o m e t r y t h es t i m u l a t e dd c sa n dtc e l l sw e r ec o - c u l t u r e d9 6h o u r s ，a n dtc e l l sp r o l i f e r a t i o nw a sa s s a y e du s i n gc c k 一8k i t t h er e s u l ts h o wt h a tt w ok i n d so fc a s e i n d e r i v e dp o l y p e p t i d e sw e r ea b l et os t i m u l a t ed c st om a t u r e ，b u tt h es t i m u l a t i o nw a sl o w e rt h a nt h el p sw h i c ha sap o s i t i v ec o n t r 0 1 a n dm a t u r ed c sc a ns t i m u l a t etc e l lp r o l i f e r a t i o n , i n d i c a t i n gd c sh a dt h ea b i l i t yt op r e s e n to ft h ep o l y p e p t i d e t h ec o n c e n t r a t i o n so fi l - la ，i l - p ，i l 一2 ，i l 一6 ，i l 一12i nc l e a rs u p e m a t a n tl i q u i dw e r ei n c r e a s e d ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft n f - 0 l ，i f n - 7w e r ed e c r e a s e d ，i n d i c a t i n gt h et h 2p o l a r i z a t i o no fn a i v et t h er e s u l ts h o w st h a tt h ec a s e i n - d e r i v e dp o l y p e p t i d e sh a v ear e g u l a t i n gf u n c t i o no nt h ea c q u i r e di m m u n ef u n c t i o n k e yw o r d s ：b o v i n ec a s e i n ；p o l y p e p t i d e s ；i n n a t ei m m u n i t y ；i n t e s t i n a lm u c o s a l i m m u n i t ys y s t e m ；d e n d r i t i cc e l l s ；a c q u i r e di m m u n i t y目录第一章前言11 1 引言11 2 酪蛋白源免疫活性肽概述31 2 10 【s 酪蛋白源免疫活性肽41 2 2b 一酪蛋白来源免疫活性肽51 2 31 ( 酪蛋白来源免疫活性肽61 3 肠粘膜免疫71 3 1 肠粘膜免疫系统71 3 2 肠粘膜系统在抗微生物肽免疫调节中的关键性作用91 4d c s 的概述一91 4 1d c s 的简介l o1 4 2d c s 的分化1 01 4 3d c s 的发育一101 4 4d c s 的先天免疫控制及其抗原呈递1 11 4 5d c s 对获得性免疫信号通路的作用1 21 4 6d c s 与t h 细胞的分化1 41 5d c s 主要的信号途径及p r r s 一151 5 1t l r s 家族成员的基本分子特征和功能1 51 5 2c l r s 家族成员基本分子特征和功能1 61 5 3n l r s 家族成员基本分子特征和功能l61 5 4 以t l r s 为核心的信号传递途径171 5 4 1m y d 8 8 依赖途径1 71 5 4 2t r i f 依赖途径1 81 5 5 以c l r s 为核心的信号传递途径181 5 6 以n l r s 为核心的信号传递途径1 91 5 7j a k s t a t 信号途径1 91 6 开展本课题的依据和意义2 0第二章材料和方法2 22 1 酶解酪蛋白制备水解多肽2 22 1 1 材料一2 22 1 2 仪器2 22 1 3 方法一2 32 1 3 1 酶解酪蛋白一2 32 1 3 2 甲醛滴定法测水解度2 32 2 酶解产物的初步分离2 42 2 1 材料2 42 2 2 仪器2 42 2 3 方法2 42 3 酪蛋白水解多肽的分析2 42 3 1 毛细管区带电泳分析酪蛋白水解多肽2 42 3 1 1 材料2 52 3 1 2 仪器一2 52 3 1 3 方法【1 0 3 】2 52 3 2 高效液相色谱法分析酪蛋白水解多肽2 52 3 2 1 材料2 62 3 2 2 仪器2 62 3 2 3 方法2 72 4 同一浓度的酪蛋白多肽不同途径对小鼠细胞因子的作用2 72 4 1 材料2 72 4 2 实验动物2 72 4 3 仪器2 72 4 4 动物分组、给药和取样：一2 72 4 5 细胞因子的检测方法2 82 4 6m i l l p o r e 小鼠试剂盒检测细胞因子一3 02 4 7 结果处理分析及统计方法3 22 5d c s 的培养3 22 5 1 材料3 22 5 2 实验动物3 22 5 3 仪器一3 32 5 4 方法。3 32 5 4 1d c s 培养所用试剂的准备3 32 5 4 2 小鼠骨髓源d c s 诱导培养3 42 6d c s 的流式鉴定3 42 6 1 材料一3 42 6 2 仪器3 52 6 3 方法3 52 7 不同浓度酪蛋白水解多肽对d c s 的作用一3 52 7 1 材料3 52 7 2 仪器一3 52 7 3 方法3 62 8 同型混合淋巴反应一3 62 8 1 材料3 62 8 2 实验动物3 62 8 3 仪器3 62 8 4 方法3 72 9 酪蛋白水解多肽刺激d c s 分泌细胞因子的测定。3 72 9 1 材料一3 72 9 2 仪器一3 72 9 3 方法3 72 9 4 结果处理及统计分析3 7第三章结果4 53 1 毛细管电泳：一4 53 2 高效液相色谱4 63 3 胰蛋白酶水解多肽同一浓度不同途径对小鼠细胞因子的影响4 73 5 小鼠d c s 的诱导培养5l3 5 1 小鼠骨髓源d c s 的形态学观察一5 13 5 2d c s 流式细胞仪鉴定5 13 5 同型混合淋巴反应5 53 7 酪蛋白水解多肽刺激d c s 与t 细胞混合后分泌的细胞因子一5 6第四章分析与讨论6 l4 1 同一浓度的酪蛋白多肽不同途径对小鼠先天免疫反应的调节6 l4 2 酪蛋白水解多肽对d c s 成熟的影响一6 24 3 酪蛋白水解多肽对获得性免疫的调节6 24 4 酪蛋白水解多肽离体和在体实验的比较6 5第五章结论6 75 1 酪蛋白水解多肽的制备和分析6 75 2d c s 的诱导培养6 75 3 酪蛋白水解多肽可以通过d c s 发挥获得性免疫信号传递作用一6 75 4 酪蛋白水解多肽发挥先天免疫和获得性免疫的细胞生物学基础6 75 5 创新点。6 85 6 尚存在的问题及进一步工作设想6 8参考文献6 9论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明7 9致谢8 0第一章前言1 1 引言第一章前言中国人很早就发现食品除了营养作用以外，对人类的健康也有很大的影响。我们的祖先甚至从阴阳学说出发将常用食品进行系统分类。并在此基础上发展出成熟的中医中药理论。药食同源，并以食调为主一向是中医保健的传统原则。但食品进入胃肠道系统后如何发挥保健功能一直是食品科学界很重要的一个研究方向。近些年，从免疫学的角度发现，食品可能是通过对细胞因子网络的调节，进而影响机体的健康。本实验室检测了多种食品对动物血清中的细胞因子浓度的影响，总结结果见表一：表1 食品在肠粘膜中对细胞因子的影响t a b l e1t h ee f f e c to ff o o d so nc y t o k i n e si ng a s t r o i n t e s t i n a lm u c o s a食品调节螺旋藻蛋白酸奶普洱茶山药苦荞麦苦瓜酪蛋白酸枣仁皂苷t i l 一1 0 ，i l - 6 ，t n f q ，i f n y ，i l lb ； i l - 4 ；t i l 一1 0 ，i l _ 4 ，t g f a ，i l - 6 ，i f n - y ；j , i l - 11 3 ，t n f a ；t i l 一1 0 ，i l _ 4 ，6 ，i f n y ；j ，i l 11 3 ；t i l 6 ，i l 一1 0 ，i l 11 3 ；j ，i l - 4 ，i l ly ，t g f - b ，t n f - q ，i l - 1 2 ，i f n - y ；t i l 6 ，i l 1 0 ，i l 1 2 ；, l i l - ly ，i l _ 4 ，t g f - 8 ，i l l1 3 ，t n f - a ，i f n y ；t i l 4 ，i l 一6 ，i l - 1 0 ，i l 一1 2 ；土i l - ly ，t g f 1 3 ，i l 11 3 ，t n f - q ，i f n y ；t i l _ 4 ，t n f a ，t g f b ；【i l - 1b ，i l 一1 2 ，i l l o ，l l - 6 ，i f n y ，i l ly ；t i l 6 ，i l - 4 ，l i l - lb ，i f n y ，t n f - a ，i l - i o ；早在1 9 9 6 年，h a r v e y 就对学生进行过饮食和细胞因子的关系方面的调查。到目前为止，已经有越来越多的研究结果证明蛋白质及其水解物、脂肪、乙醇、淀粉、糖类都对机体的细胞因子网络有作用。尤其近年来从食物蛋白中获取的具有免疫调节活性的小肽更成为研究热点。但围绕小肽的吸收却发现了一个有趣的命题。在最初的研究中，科学家认为消化系统将蛋白质降解为生物的基本组成单第一章前言位氨基酸直接吸收进入血液循环，运送到身体其他部位作为基本材料被利用。然而随着生物活性肽的发现，小肽能被吸收进入机体从而被组织利用的观点逐渐被人们接受。但随之而来的问题是这些小肽是否可以到达靶位点发挥其生理作用?已有许多报道发现，小肽进入机体后将很快从血液循环中被消除。这似乎在小肽是否进入体内发挥功能的问题上绕了一大圈又回到起点。近期大量研究表明小肽的生理功能是通过胃肠道免疫和信号传递途径实现的。调节细胞因子网络就可能是它对机体起作用的主要方式。生物活性肽( b i o l o g i c a la c t i v ep e p t i d e s ，b a p ) 是一类具调节机体新陈代谢、参与生命活动调节的肽类物质。其中乳源活性肽更是近年来研究的重点之一。到目前为止，人们已经发现了多种生物活性肽，如：免疫活性肽能够增强机体免疫力，刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨嗜细胞的吞噬功能，提高机体抵御外界病原物质感染的能力，降低机体发病率，并具有抗肿瘤功能【l 】；酪蛋白糖肽能够抑制胃酸分泌，并影响肠道激素的释放【2 】；酪蛋白磷酸肽能与多种矿质元素结合形成可溶性的有机磷酸盐，充当许多矿质元素特别是钙离子在体内运输的载体，促进小肠对钙离子和其他矿质元素的吸收【3 ，4 】；抗菌肽是近年来发现并开始研究的一类生物活性肽，体外条件下能抑制细菌的生长，在体内具有类似抗生素的活性，能抑制小鼠感染致病的金黄色葡萄球菌【5 】；抗血栓转化酶抑制剂是一种多功能肽，具有调节血压、免疫防御和调节神经系统功能的活性【6 】。此外，近几年还有抗高血压肽、抗遗忘肽、抗血栓活性肽、抗氧化肽、抗爱滋病、降脂肽、减肥肽、降糖肽、激素肽等多种生物活性肽的报道f j 7 1 。除了上述生物学功能外，酪蛋白酶解物还具有调节人体情绪、体温、脉搏，诱导睡眠、镇痛( 静) 、促进垂体细胞增殖、影响朗格罕细胞( l a n g e r h a n sl c d c ) 和t 细胞的分泌，抑制血液凝固及血栓形成等功能。乳源活性肽具有人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素、酶抑制剂、抗菌、抗病毒、降血脂等作用，食用安全性及高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。随着乳源生物活性肽研究的不断深入，人们又渐渐认识n - 蛋白及其酶解物的小肽的多种生物学功能的重要性。酪蛋白是哺乳动物乳中最主要的蛋白质，它不仅具有重要的营养功能，其组成和等电点都很特别，例如它含有异常多的酪氨酸、丝氨酸，暗示它可能在体内酶的消化后通过和胃肠粘膜系统相互作用，发挥信号传递作用，因为这两种氨基酸都2第一章前言是细胞信号传递中磷酸激酶作用的靶位点。目前，用酪蛋白进行酶解已经获得3 0多种分别具有抗细菌、酵母菌、阿片肽、免疫活性肽、矿物质在体肽和抗血压升高肽等b a p 。可见酪蛋白源b a p 的研究与开发已经成为该领域的热点之一。研究证实，胃肠粘膜系统通过树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l s ，d c s ) 和其它抗原呈递细胞( a n t i g e np r e s e n t i n gc e l l s ，a p c ) 接受外来抗原，传递信息给免疫细胞。例如通过这些细胞上t o l l 样受体( t o l l l i k e r e c e p t o r s ，t l r s ) ，作用于由多种炎症和抗炎细胞因子所组成的复杂细胞因子网络。细胞因子是很多免疫系统的细胞和其它细胞相互作用诱导产生的可以作用于其它细胞的蛋白质。它们和相应的靶细胞外膜上的受体结合，依赖于细胞和所作用的细胞因子产生某种反应。而且经常是靶细胞在刺激下产生另外的细胞因子，这种复杂的关系网称为细胞因子网络。这就是免疫系统，特别是肠粘膜系统对复杂的来自各方面的挑战，包括病毒、真菌、细菌甚至肿瘤所作出复杂响应的最重要的方式。细胞因子网络控制着免疫细胞网络、代谢网络、激素和生理系统直至神经网络。本课选取酪蛋白酶解多肽为对象，通过研究其对树突状细胞成熟的影响，可以解释其在胃肠道系统的信号传递和免疫机理，并为其在功能性食品、医药或其它领域的应用方面奠定理论基础。1 2 酪蛋白源免疫活性肽概述酪蛋白是乳中的主要蛋白质，乳源活性肽主要来源于酪蛋白，乳本身又在哺乳动物的进化中起到了重要的作用。据报道，牛乳中蛋白质的含量为3 0 3 3 9 l ，酪蛋白大约占所有乳蛋白质的8 0 ，酪蛋白包括1 和啦酪蛋白，b 酪蛋白以及k - 酪蛋。近年研究发现，酪蛋白的氨基酸序列中隐藏着大量具有独特生理和药理作用片段，可在适当酶的作用下释放出来，在胃肠道被完整吸收，发挥多种生物学功能。据郑华报道酪蛋白水解物能提高小鼠的体重，增强免疫功斛8 1 。口服酪蛋白的胰蛋白酶水解物可以增强小鼠腹腔巨噬细胞和血液中吞噬细胞的吞噬作用。第一章前言图1 - 1 来自酪蛋白的生物活性肽的功能f i g l 一1 c a s e i nd e r i v e di m m u n o p e p t i d e sa n df u n c t i o n s1 2 1 ( i s 酪蛋白源免疫活性肽0 c s 酪蛋白在体内或体外水解能释放出多种b a p ，主要包括阿片激动活性肽、免疫调节肽、酪蛋白磷酸肽、抗高血压肽、抗菌肽等。研究表明，从0 【一酪蛋白的胰蛋白酶酶解液中分离得到的肽段t h r - t h r - m e t - p r o l e u t y r ，相当于0 【s l 一酪蛋白c 末端1 9 4 - - 一1 9 9 序列，该肽具有促进小鼠巨噬细胞的吞噬活性，增强小鼠对k l e b s i e l l a p n e u m o n i a 感染的抵抗能力【l 。在p h 值为中性条件下，经凝乳酶处理的0 【s 1 酪蛋白水解物中分离纯化得到一个具有免疫增强作用的短肽片断，氨基酸排列顺序与c c s l 酪蛋白n 末端1 2 3 残基序列相同，并命名为拟杀细胞粒体。体外条件下能抑制葡萄球菌、枯草杆菌、肺炎克氏杆菌、八叠球菌、肺炎链球菌等。在体内条件下，具有类似抗生素活性，能够保护小鼠免受致死性的金黄葡萄球菌感染【1 0 1 l 】。该肽既有预防感染的作用，又能通过刺激胞吞作用和免疫反应使动物产生长效的免疫抵抗能力。另外还发现，将该肽注射入牛或羊的乳腺，可保护小鼠免受c a n d i d aa l b i c a n s 感染，也可预防乳腺到1 1 】。a r g - t y r - l e u g l y - t y r - l e u g l u( 9 0 - - 一9 6 ) 和a r g - t y r - l e u - g l y - t y r - l e u ( 9 0 - v 9 5 ) 是经胃蛋白酶处理分离纯化得到的。这两个短肽，具有阿片样活性，且在五肽的时候的类吗啡活性较强。研究证明，两短肽也具有免疫调节活性，可增强淋巴细胞增殖，提高自然杀伤细胞( n a t u r a lk i l l e rc e l l s ，n kc e l l s ) 活性，促进嗜中性白细胞的移动【1 2 1 。自从发现t 淋4第一章前言巴细胞上具有阿片受体以来，阿片受体及其不同亚型已在许多免疫细胞中被分离提取出，研究发现除t 、b 淋巴细胞外，人类外周血n k 细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞和多形核白细胞等细胞表面都具有阿片受体或受点，这些存在于免疫细胞上的阿片受体同阿片样活性物质结合后，具有增强t 、b 淋巴细胞的功能、提高n k 细胞的细胞毒作用等功效【1 3 j 。p h e - p h e v a l a l a - p r o p h e p r o g l u p h e g l y - l y s ( 2 3 - - 3 4 ) 具有增强巨噬细胞吞噬作用，静脉注射具有抵抗k l e b s i e l l ap n e u m o n i a 感染的能力。该肽也是血管紧张素转换酶抑制剂( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r ，简称c e i ) ，c e i具有抗高血压的生理功能，另外，血管紧张素转换酶i ( a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m e i ，a c e i ) ，能起到活化血管紧张素转换酶i i ( a c e i i ) 及钝化舒缓激肽的作用，而舒缓激肽是急性炎症反应的调节因子，能够刺激吞噬作用，增强淋巴细胞向炎症部位迁移，诱导淋巴细胞分泌淋巴因子【1 1 】。0 【s l 一酪蛋白中免疫活性肽及其功能见表1 。1 。表1 - 1a 。1 酪蛋白源免疫活性肽及其功能t a b l e l 1i m m u n o p e p t i d e sd e r i v e df r o m0 【s l - - - c a s e i na n df u n c t i o n s肽免疫功能t h r - t h r - m e t - - p r o l e u - t y r( 1 9 4 1 9 9 )、r g p r o - l y s - h i s p r o - i l e - l y s h i s g l n - g l y -l e u - p r o - g l n g l u v a 1 l e u - a s n l e u - g l u - a s n l e u - l e u - a r g - p h e( 1 2 3 )a r g - t y r - l e u g l y - t y r l e u - g l u( 9 0 9 6 )钯_ t 归l e u - g l y - t y r - l e u( 9 0 一9 5 )p h e - p h e - v a l - a l a - p r o p h e p r o g l u p h e - g l y - l y s( 2 3 3 4 )促进巨噬细胞吞噬活性增强鼠抗k l e b s i e l l an e u m o n i a 感染能力抗菌，预防乳腺炎增强淋巴细胞增殖，提高自然杀伤细胞活性，促进嗜中性白细胞移动同上促进巨噬细胞吞噬活性，增强鼠抗k l e b s i e l l ap n e u m o n i a 感染能力，c e i1 2 2p 酪蛋白来源免疫活性肽从胃凝乳酶的p 酪蛋白酶解液中分离纯化得到一个短肽，它位于p 一酪蛋白c5第一章前言末端1 9 3 - - 一2 0 9 残基，该肽在分裂原和抗体均不存在的情况下，也可明显得直接刺激鼠淋巴细胞增殖【1 4 】。而且六肽p r o g l y - p r o i l e p r o a s n ( 6 3 - - - 6 8 ) 和三肽l e u l e u t y r ( 1 9 1 - - 1 9 3 ) 都具有明显促进抗体形成，增强鼠巨噬细胞吞噬作用，增强小鼠对k l e b s i e l l ap n e u m o n i a 的抵抗能力。另外，三肽还可增强抗体依赖型t 细胞增殖【12 1 。p 酪啡肽是人或牛d 一酪蛋白经胰蛋白酶酶解处理的产物，其氨基酸组成与b 酪蛋白6 0 - - - , 7 0 片断的残基序列相同，具有类吗啡活性，也具有调节免疫系统的功斛b 】。这类肽可能直接作用于消化道中的阿片肽受体以影响胃肠道的运动，也可能在小肠刷状缘降解成更小的疏水性阿片肽，穿过肠粘膜进入外周血液再透过血脑屏障与脑中的阿片肽受体结合，即使是成年人在大量饮用牛奶后，在其小肠中也能检测到显著量的该种阿片肽的免疫反应物。牛p 一酪啡肽在低于1 0 肛m 剂量情况下，就具有明显抑制人淋巴细胞增殖的作用【1 6 】。另外还发现，这种肽具有增强鼠抵抗k l e b s i e l l ap n e u m o n i a 感染的能力1 7 1 。d 酪蛋白中免疫活性肽及其功能见表1 2 。表1 - 21 3 酪蛋白源免疫活性肽及其功能t a b l e l 一2i m m u n o p e p t i d e sd e r i v e df r o m1 3 - c a s e i na n df u n c t i o n s肽免疫功能1 弘。g h l 如n p r o 。v a l 。l 舢g 1 y 。j m v a l 。?刺激淋巴细胞增殖g l y - p r o p h e - p r o 1 1 e i l e v a l ( 19 3 - 2 0 9 )p r o g l y - p r o i l e - p r o - a s n ( 6 3 - 6 8 )l e u l e u - t y r ( 1 9 1 1 9 3 )t y r - p r o - p h e - p r o - g l y - p r o - i l e - p r o - a s n - s e r - l e u( 6 0 7 0 )t y r - g l n - g l n p r o - v a l l e u - - g l y - p r o - - v a l - a r g( 1 9 3 - 2 0 2 )a l a p r o - t y r - p r o - g l n - a r g ( 1 7 7 18 3 )促进抗体形成，促进巨噬细胞吞噬活性促进抗体形成，促进巨噬细胞吞噬活性，刺激抗体依赖型t 细胞增殖抑制淋巴细胞增殖增强鼠抗k l e b s i e l l ap n e u m o n i a 感染能力c e ic e i1 2 3k - 酪蛋白来源免疫活性肽静酪蛋白的胰蛋白酶酶解液具有明显刺激分裂原处理的人淋巴细胞增殖作6第一章前言用的短肽。k - 酪蛋白胰蛋白酶酶解得到p h e - p h e - s o - a s p l y s ，它相当于k - 酪蛋白1 7 2 l 氨基酸残基，具有促进抗体形成，增强人和鼠巨噬细胞吞噬活性的能力。t y r - g l y ( 相当于3 8 3 9 氨基酸残基序列) 是另一个免疫调节肽，可直接通过小肠壁到达淋巴细胞，可刺激人外周血淋巴细胞( p e r i p h e r a lb l o o dl y m p h o c y t e ，p b l )增殖，功能类似于伴刀豆蛋白a 。k - 酪蛋白中免疫活性肽及其功能见表1 3 。表1 3 妊酪蛋白源免疫活性肽及其功能亿l b l el 一3i m m u n o p e p t i d e sd e r i v e df r o ml ：- c a s e i na n df u n c t i o n s肽免疫功能p h e p h e s e r - a s p - l y s ( 17 - 21 )t y r - g l y ( 3 8 - 3 9 )促进抗体形成，促进巨噬细胞吞噬活性刺激淋巴细胞增殖1 3 肠粘膜免疫1 3 1 肠粘膜免疫系统肠粘膜淋巴组织属于消化道相关淋巴组织( t h eg u t - a s s o c i a t e dl y m p h o i dt i s s u e ，g a l t ) 。该淋巴组织主要由肠系淋巴结( m e s e n t e r i cl y m p hn o d e s ) 、派尔氏结( p a y e r sp a t c h e s ，p p ) 、分散的淋巴囊泡( i s o l a t e dl y m p hf o l l i c l e s ) 、和大量的散布在固有层( t h el a m i n ap r o p r i a ) 中的淋巴细胞和肠道上皮细胞组成。p p 主要集中在小肠粘膜内和粘膜下层。它们主要通过和肠腔内淋巴细胞环流中的抗原接触后激活免疫细胞从而发挥免疫功能。p p 通过一个单层上皮细胞和肠腔隔开，它含有特殊的上皮细胞称为微皱褶细胞( t h em i c r o f o l dc e l l s ，mc 圮l l s ) 。m 细胞是专门用来提取肠腔中的颗粒型抗原，并把它们跨粘膜运送到上皮细胞下的圆屋顶形区域( 参见图1 2 ) 【1 。7 1 。有一系列的a p c 提取抗原，经过加工以后提呈给p p 中的t 细胞。接着，他们在达到胸导管之前通过输出淋巴腺迁移到肠系淋巴结，最终进入循环系统。这些激活的t 细胞在粘附分子的帮助下，从血液循环中再返回到肠道免疫应答的效应部位、固有层和上皮内的间隔区。在这里，他们发挥效应细胞功能，分泌细胞因子，介导特异性免疫防御 1 8 】。7第一章前言进入循环和血流抗原捉呈l中t 细胞i肠系并奉巴结l山胸寻管绒毛上皮细胞4 2 他= 统争系统循环。( 由主覃特瞳系统图1 - 2 抗原和t 细胞在消化道相关淋巴组织( g a l t ) 中的作用f i gi - 2 t h er o l eo fa n t i g e na n dtc e l li ng a l t在上皮细胞或m 细胞中的抗原首先被提取，加工并提呈给p p 中的t 细胞，从而导致t 细胞的激活，接着是b 细胞的激活。这些激活的细胞通过输出淋巴液到达肠系淋巴结，在进入胸导管之后获得授权进入系统循环。接着，它们再归巢到固有层和粘膜和非粘膜位点。t 细胞重新回到消化道足f l q t f l t l 胞表面的a 4 1 3 7 一整合素和肠秸膜的内皮细胞上的粘附分子帮助其寻址介导的。有些可溶性抗原可以由上皮细胞提取，也可以通过g a l t 直接通过入口进入循环的和血流。肠绒毛上皮含有淋巴细胞、多数激活的c d 8 + t - 细胞都是管道独有的【1 引。肠粘膜在外来异物，即抗原入侵后，通过分布于肠粘膜系统的网状d c s 和其它a p c 进行抗原的吞噬处理和递呈作用，传递信息给免疫细胞，从而激活机体的先天性免疫系统，产生发炎细胞因子和细胞趋化因子，通过发炎和体温升高来对付入侵者。目前所了解的发炎细胞因子主要是：i l 1 p 、i l 6 、i l 8 、i l 1 2 、i n f 吖、t n f 一0 【。如果机体在清除入侵者之后持续发炎，就会造成严重的疾病。抗炎细胞因子可以对发炎细胞因子作出响应。主要的抗炎症细胞因子包括：i l 1受体拮抗剂，i l 4 ，i l 6 ，i l 1 0 ，i l 1 1 ，和i l 1 3 。人类免疫应答是一个高度复杂的调节系统和复杂的控制因子网络。在生理条件下，这些细胞因子及其抑制因子用作是免疫调节的基础，以限定持续的或者过头的炎症反应。在病理条件下，可能正是由于这些抗炎症的介导者没有提供对疾病所产生的炎症足够的控制，或者过度抑制了疾病所引起的发炎活性和免疫应答，从而造成机体抗感染能力的下第一章前言降，引起反复感染。1 3 2 肠粘膜系统在抗微生物肽免疫调节中的关键性作用肠粘膜系统是整个机体免疫细胞最丰富的部分，某些免疫细胞可以合成和分泌大量的抗微生物肽，来清洗粘膜表面，这也构成了宿主防御微生物入侵的第一道防线。一旦粘膜屏障被潜在的微生物打破，先天免疫细胞如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞就会被招募过来，从而加强对微生物的先天控制。在这种病原体的先天免疫识别引发快速的防御作用并启动获得性免疫应答过程中，分布在肠粘膜表面的大量d c s 在感受和处理微生物信息和直接将原态淋巴细胞分化为特异性应对感染的效应细胞中发挥着关键性的作用。因为d c s 是仅有的可以激活原态t 淋巴细胞的a p c ，他们还可以与n k 、巨噬细胞以及b 淋巴细胞相互交谈，从而连接先天免疫和获得性免疫。1 4d c s 的概述随着细胞生物学和生物化学及分子生物学研究手段的不断突破，尤其是医药科学的不断发展，人们已经认识到食品不仅能为生命活动提供营养、能量，更重要的是食品可以通过调节细胞因子网络来调节免疫网络、信息传递网络以及代谢网络，从而控制着机体的健康和生命活动。肠粘膜系统则是食品调节细胞因子网络的最主要的系统【1 9 2 0 】。在肠粘膜系统中，特别是在肠粘膜的p p 中和肠道单层柱状上皮细胞连接处，分布着许多非成熟的d c s 。这类细胞具有最强抗原呈递能力，不断地对肠道各种抗原进行取样，经加工迁移至引流淋巴结，通过主要组织相容性( 抗原) 复合物( m a j o rh i s t o c o m p a b i l i t yc o m p l e x ，m h c ) 呈递给原态t 细胞，从而视情况启动获得性免疫系统，包括产生免疫耐受性【2 1 1 。他们犹如肠道系统中无数的传感器，经常通过各种细胞因子不断地向机体免疫系统传递肠内腔的各种信息。细胞因子是一种信号分子，在机体内传递着先天免疫和获得性免疫方面的信号。因此，在肠粘膜系统中，机体与周围环境除了物质和能量交换之外，还存在着信息的交换，即存在着一个复杂的信号传递系统。但是，d c s 是如何接受外界的刺激，如何把外界的刺激信号一步一步的传导到细胞内部，相应的d c s 又是如何处理和如何转化刺激信号的，以及最终的效果如何，这一系列的问题，都引9第一章前言起了广泛的关注。1 4 1d c s 的简介d c s 是机体免疫系统中最强有力的一种专职的a p c ，在免疫应答的启动、调控上起着关键的作用而且d c s 在免疫平衡中还起着重要作用。一方面d c s 能启动免疫反应对抗入侵的病原体，另一方面d c s 还阻止过度的炎症反应和组织病变 2 2 1 。d c s 最初是s t e i n m a n 和c o h n 等1 9 7 3 年从小鼠脾组织中分离发现的，因其形态具有树突样而命名【2 3 1 。此后d c s 的研究得到迅猛发展。尤其是2 0 世纪9 0 年代后，d c s 体外培养获得成功，可以获得大量d c s 来研究其生物学特性，于是d c s逐渐成为免疫学研究领域的热点之一。并且大量的研究表明，d c s 在移植排斥、抗肿瘤、抗病毒感染和自身免疫疾病中发挥着重要作用【2 4 】。1 4 2d c s 的分化在过去的2 0 年中，对d c s 的研究主要集中在接种疫苗和对肿瘤的免疫治疗方面。随着对d c s 的深入研究，d c s 在免疫学上的起源和分化也越发显得重要。目前对d c s 起源的问题认识仍不统一。现有的文献表明，d c s 可以在体外培养的条件下由骨髓源性前体或淋巴源性前体经多条途径分化而来。其中细胞因子起着关键的作用。例如i l - 1 、g m 。c s f 、t n f a 均能诱导小鼠d c s 的成熟，而i l 1 0 n起抑制作用。目前研究较多的是鼠和人d c s 的分化，二者的分化十分类似。第一步都是由骨髓一淋巴双源型前体分化成为骨髓源性前体、普通d c s 前体和淋巴源性前体。而骨髓源性前体和淋巴源性前体都可以向普通d c s 前体分化，然后在经第二步的分化形成各种细胞如单核细胞、l c d c ) 、c d 8 n 和c d 8 “d c ( 鼠) 、c d ll b + c d 3 3+ d c ( 人) 和浆细胞。其中骨髓源性细胞可以向多种细胞分化，包括向普通d c s 前体和淋巴源性前体的分化【2 习。鼠d c s 在实验条件下的分化主要依赖于细胞因子。在此条件下，调节细胞因子的组成就可以调控d c s 的分化。1 4 3d c s 的发育目前认为，d c s 的发育可分为未成熟和成熟两个阶段，同时伴随着对抗原的1 0第一章前言加工过程。未成熟的d c s 在捕捉抗原后向外周淋巴组织的t 细胞区迁移并成熟，成熟的d c s n g 表达丰富的m h c 分子和协同刺激分子。未成熟的d c s 通过诱导无能的和调节性t 细胞导致免疫耐受，而成熟d c s 具有超强的激活初始t 细胞能力 2 6 1 。在免疫应答过程中，进入机体的外源性抗原首先被d c s 摄取，加工，以抗原肽m h ci i 复合物方式提呈给c d 4 + t 细胞，引起后续的一系列免疫反应。d c s 摄取抗原的方式主要有巨胞饮、受体介导的内吞、及吞噬三种。d c s 通过巨胞饮方式非特异、非饱和地摄取大量的可溶性抗原，由于d c s 缺乏特异性抗原受体，故这种方式能有效地弥补其不足。受体介导的内吞方式，具有高效性、选择性和饱和性，d c s 虽没有特异受体，但能表达某些抗原受体，最终使之对抗原抗体复合物摄取。吞噬是d c s 摄取大颗粒或微生物的一种内吞方式。在摄取抗原后，d c s在相应的趋化因子的作用下趋向t 细胞，同时在d c s 高表达的i c a m 1 等黏附因子的作用下，d c s 与t 细胞进一步结合，结合后d c